ELISA với kháng nguyên glycolipid đặc hiệu có thể dùng để chẩn đoán lao ngoài phổi và lao phổi BK -.. Từ thập kỷ 70, đã có nhiều công trình nghiên cứu của nhiều tác giả nước ngoài và gần
Trang 1TCNCYH 22 (2) - 2003
Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kháng nguyên glycolipid trong chẩn đoán
huyết thanh học bệnh lao
Trần Hồng Vân 1 , Văn Đức Hạnh 2 ,
Vũ Nguyệt Minh 3 và Lê Văn Phủng 1
1 Labo trung tâm, Đại học Y Hà Nội,
2 Sinh viên Y3 A, 3 Sinh viên Y3 D
Nghiên cứu này tìm hiểu độ nhạy, độ đặc hiệu và phản ứng chéo của 6 loại kháng nguyên glycolipid tinh chế từ vi khuẩn lao bằng kỹ thuật ELISA trên 168 bệnh nhân Số bệnh nhân này
được chia thành 3 nhóm: nhóm I gồm 62 bệnh nhân lao phổi BK (+); nhóm II gồm 53 người lành; nhóm III gồm 53 người bị các bệnh nhiễm trùng khác ngoài lao
Kết quả cho thấy: Ba loại kháng nguyên tốt nhất là cord factor (DT), trehalose monomycolate (MT) và phenol glycolypid (PA); độ nhạy từ 66,1%- 74,2%, độ đặc hiệu 69%- 73,6%, phản ứng chéo từ 22,6%- 39,6% Các kháng nguyên khác đều có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp hơn và phản ứng chéo cao hơn
ELISA với kháng nguyên glycolipid đặc hiệu có thể dùng để chẩn đoán lao ngoài phổi và lao phổi BK (-)
I Đặt vấn đề
Theo thông báo của Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) về mối nguy cơ bệnh lao đang quay trở
lại cùng với tốc độ gia tăng dân số và đại dịch
HIV/AIDS trên toàn thế giới Ước tính số
người mắc lao mới sẽ là 11,8 triệu vào năm
2005 (tăng 57,8% so với 1990) [2] Bệnh lao đã
thực sự trở thành mối đe doạ đến sức khoẻ, tính
mạng nhiều người Tử vong do lao chiếm 1/4
số tử vong do nhiễm khuẩn ở người lớn Việt
Nam là 1 trong 22 nước có bệnh lao trầm trọng
trên thế giới [10]
Chẩn đoán bệnh lao trên lâm sàng sẽ được
khẳng định khi tìm thấy vi khuẩn trong bệnh
phẩm bằng các phương pháp như nhuộm coi
trực tiếp, nuôi cấy phân lập Nhưng trong nhiều
trường hợp không tìm thấy vi khuẩn lao bằng
các phương pháp này do lấy, bảo quản và xử lý
bệnh phẩm không tốt Vì vậy các phương pháp
chẩn đoán gián tiếp như các xét nghiệm miễn
dịch, Mantoux, X quang đã góp phần đáng kể
vào chẩn đoán Ngày nay, miễn dịch học đã
được áp dụng cả trong theo dõi diễn biến bệnh lao, phòng bệnh và theo dõi khả năng dung nạp thuốc của cơ thể [4]
Một trong những kỹ thuật miễn dịch được ứng dụng ngày càng rộng rãi là kỹ thuật xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng vi khuẩn lao bằng kỹ thuật ELISA Từ thập kỷ 70, đã có nhiều công trình nghiên cứu của nhiều tác giả nước ngoài và gần đây có một số tác giả trong nước đã áp dụng kỹ thuật này để phát hiện kháng thể kháng lao; giúp cho chẩn đoán, phát hiện bệnh lao, đặc biệt là với các trường hợp lao ngoài phổi và lao phổi BK (-)
Tuy vậy, vấn đề quan trọng nhất trong huyết thanh học chẩn đoán lao là chất lượng kháng
nguyên; vì Mycobacterium tuberculosis có
nhiều loại kháng nguyên và có nhiều kháng
nguyên chéo với các Mycobacteria khác [1]
Nhờ những tiến bộ về kỹ thuật mà những kháng nguyên của vi khuẩn cũng dần dần được tinh chế tốt hơn để chẩn đoán bệnh lao
Trang 2TCNCYH 22 (2) - 2003
Đã có nhiều kháng nguyên được dùng để
chẩn đoán lao như: Protein 38 kDa, protein 30
kDa, lipoarabinomannan (LAM), glicolipid
LDS, DAT, PGL Tb1, kháng nguyên A60 vv
với độ nhậy và độ đặc hiệu rất khác nhau [7]
Các kháng nguyên protein có độ nhạy và đặc
hiệu cao hơn các kháng nguyên glycolopid
nhưng bảo quản khó khăn hơn, vì vậy không
được áp dụng rộng rãi trên thực tế
Gần đây, phòng nghiên cứu vaccine BCG ở
Nhật Bản đã đưa ra 6 loại kháng nguyên mới,
được tinh chế từ vi khuẩn lao, bản chất hoá học
là glycolipid Để đánh giá giá trị chẩn đoán lao
của kháng nguyên này, chúng tôi tiến hành đề
tài này nhằm 2 mục đích:
• So sánh giá trị chẩn đoán của 6 loại
kháng nguyên, tìm ra những kháng nguyên đặc
hiệu, có giá trị nhất trong chẩn đoán huyết
thanh học bệnh lao
• Đánh giá độ nhậy, độ đặc hiệu,
phản ứng chéo của kỹ thuật ELISA với kháng
nguyên glycolipid
II Đối tượng, vật liệu và phương
pháp nghiên cứu
1 Đối tượng
Tiến hành nghiên cứu trên huyết thanh của
168 người Việt Nam trong đó gồm:
• Nhóm I: 62 bệnh nhân lao phổi tuổi từ
15- 75 được chẩn đoán là lao BK (+) tại Viện
lao-Bệnh phổi Hà Nội và bệnh viện Lao Quảng
Ninh
• Nhóm II: 53 người lành tuổi từ 15- 75
Những người này được coi là lành nếu không
mắc bệnh nhiễm trùng nào vào thời điểm lấy
mẫu nghiên cứu
• Nhóm III: 53 bệnh nhân tuổi từ 15-75,
có mắc ít nhất một bệnh nhiễm trùng (không
phải lao)
2 Vật liệu
• Bộ sinh phẩm ELISA lao (BCG Lab, Tokyo, Nhật Bản) Phiến nhựa 96 giếng có gắn
6 kháng nguyên tinh chế, bản chất hoá học là lipid:
- Hàng A (P2): Phosphoinositomannoside
- Hàng B (DT): 6, 6’ -dimycolyltrehalose (cord factor)
- Hàng C (MT): Trehalose monomycolate
- Hàng D (PA): Phenol glycolipid
- Hàng E (MI): Glycolipid
- Hàng F (Co): Glycopeptide
- Hàng G: Làm nền (Background) cho kháng nguyên DT và PA (hàng B và D)
- Hàng H làm nền cho kháng nguyên P2,
MT, MI và Co (các hàng A, C, E, F)
Người làm xét nghiệm không được biết bản chất kháng nguyên của từng hàng
• Các hoá chất kèm theo: Đệm PBS (viên nén)-T (Tween 20), đệm citrate-phosphate; cộng hợp: (HRP- Goat Anti- Human IgG),
H2O2 và o-phenylendiamine (OPD)
3 Phương pháp
Huyết thanh: Lấy 2 ml máu tĩnh mạch,
không chống đông Tách huyết thanh rồi giữ trong tủ lạnh sâu -70° C cho đến khi làm phản ứng
Immunosorbent Assay):
Những giếng có sẵn gắn kháng nguyên lao cho tiếp xúc với kháng thể kháng lao có trong huyết thanh người bệnh, cho thêm chất cộng hợp (kháng kháng thể gắn enzyme peroxidase) tạo nên một phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể-Kháng kháng thể-Enzyme Kết quả được phát hiện nhờ màu sắc được tạo ra do phản ứng của enzyme với cơ chất cho thêm vào Trong
kỹ thuật này, dung dịch có mầu vàng, phổ hấp phụ màu của dung dịch đo được ở bước sóng 490/620 nm Cường độ màu tỷ
lệ với nồng độ kháng thể kháng lao trong huyết thanh người bệnh
Trang 3TCNCYH 22 (2) - 2003
Kỹ thuật tiến hành:
- Cố định kháng nguyên: cho 150 àL dung
dịch PBS-T vào mỗi giếng, để 10 phút ở nhiệt
độ phòng
- Huyết thanh bệnh nhân: cho 50 àl huyết
thanh bệnh nhân đã pha loãng 1/201 vào mỗi
giếng, để ở nhiệt độ phòng 1 giờ sau đó rửa 3
lần bằng dung dịch PBS-T
- Cộng hợp: thêm 50 àl cộng hợp (1/500)
vào mỗi giếng, để ở nhiệt độ phòng 1 giờ, sau
đó rửa 3 lần bằng dung dịch PBS-T
- Cơ chất: thêm 50 àl dung dịch OPD (1 mg/ml) có chứa sẵn H2O2 0,06%, để 30 phút ở nhiệt độ phòng
- Dừng phản ứng: thêm 50 àl H2SO4 1N
- Đọc kết quả ở bước sóng 490/620 nm
Xử lý số liệu:
Dùng chỉ số mật độ quang để so sánh (OD này đã được trừ đi OD chứng), sử dụng toán thống kê y học trên máy vi tính bằng chương trình Epi.Info 6.4 Công thức tính như sau:
Số dương tính thật (I) x 100
Độ nhậy = - (%)
Tổng số nhóm bệnh (I)
Số âm tính thật (II) x 100
Độ đặc hiệu = - (%)
Tổng số nhóm lành (II)
Số dương tính giả (III) x 100
Độ phản ứng chéo = - (%)
Tổng số nhóm (III) Giá trị ngưỡng dương tính được tính bằng giá trị OD thấp nhất trong bệnh lao (nhóm I) mà từ đó trở lên tập trung 95% bệnh nhân lao
III Kết quả
Bảng 1 phân bố OD ở 3 nhóm nghiên cứu
OD (min - max)
Nhóm
P2 DT MT PA MI Co
I (n=62) 0 - 3,092 0-3,392 0-2,733 0-1,961 0-2,130 0-0,882
II (n=53) 0- 1,767 0-0,753 0-0,805 0-0,535 0-0,884 0-0,963 III (n=53) 0-0,626 0-0,249 0-0,129 0-0,432 0-0,991 0-1,227
Nhóm I có OD cao nhất, trong số đó, kháng nguyên DT có OD tập trung nhiều nhất là từ 1 trở lên; trong khi đó, các kháng nguyên P2, MI và Co cũng có mẫu cho OD cao (3,092), nhưng chỉ có 1 mẫu duy nhất, số còn lại, tập trung ở khu vực OD thấp (0,2 trở xuống) ở nhóm II, các kháng nguyên DT, MT và PA cho kết quả OD thấp nhất so với các kháng nguyên còn lại ở nhóm III, các kháng nguyên DT, MT và PA cũng cho kết quả OD thấp nhất so với các kháng nguyên khác
Trang 4TCNCYH 22 (2) - 2003
Bảng 2 Độ nhậy, độ đặc hiệu và phản ứng chéo của từng kháng nguyên
%
Số (+) trong nhóm Kháng
nguyên
I (n=62) II (n=53) III (n=53)
Độ nhạy Độ đặc hiệu Phản ứng
chéo
P2 39 13 16 62.9 75.5 30.2
DT 46 9 21 74.2 83.0 39.6
PA 43 16 12 69.4 69.8 22.6
MI 19 15 23 30.6 71.7 43.4
Co 29 20 26 46.8 62.3 49.1
Ba kháng nguyên DT, MT và PA có độ nhạy
cao nhất, đặc biệt là kháng nguyên DT cả hai
chỉ số nhạy và đặc hiệu đều cao nhất
IV Bàn luận
Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng 6 loại
kháng nguyên lipid tinh chế vi khuẩn lao, theo
thông báo của cơ sở sản xuất kháng nguyên, có
3 kháng nguyên đặc hiệu cho M tubercubosis
(DT, MT và PA) và 3 kháng nguyên khác (P2,
MI và Co) thì ít đặc hiệu hơn Chúng tôi đã lưu
ý nhận xét này sau khi có kết quả nghiên cứu
1 Kết quả xét nghiệm ELISA với 3 nhóm
đối tượng nghiên cứu
Nồng độ kháng thể của nhóm I tăng hơn
hẳn (ξOD = 1,315) so với nhóm II (0,35) và
nhóm III (0,236) Mặt khác, số bệnh nhân cho
kết quả ELISA dương tính với từng loại kháng
nguyên cũng lớn và lớn nhất trong số 3 nhóm
nghiên cứu Điều đó cho thấy, mức độ dương
tính phụ thuộc vào kháng nguyên và kháng thể
dịch thể trong lao tuy không có vai trò tiêu diệt
vi khuẩn lao [1] nhưng có giá trị để chẩn đoán
bệnh lao
Bảng 2 đã chỉ ra 3 kháng nguyên có độ nhạy
cao nhất (DT, MT và PA) và các kháng nguyên
MI và Co có độ nhạy thấp nhất Như vậy, ba
loại kháng nguyên đầu có thể được chọn lọc
làm kháng nguyên cho chẩn đoán lao
Tuy nhiên, một số bệnh nhân nhóm I cho kết quả âm tính, đây là âm tính giả Điều này
có thể do đáp ứng miễn dịch kém ở các bệnh nhân này (suy giảm miễn dịch do quá yếu, do AIDS) Tuy vậy, trong nghiên cứu này, khi chọn bệnh nhân, chúng tôi chưa có điều kiện sàng lọc những bệnh nhân này
2 Xét nghiệm ELISA với nhóm bệnh nhân lành (nhóm II)
Nồng độ kháng thể (được biểu hiện thông qua OD) của nhóm II, III thấp hơn nhóm I Tuy vậy, đối với mỗi loại kháng nguyên, đều có một số lượng người lành cho kết quả dương tính (Bảng 2) Điều này có thể lý giải qua tỷ lệ nhiễm lao cao ở cộng đồng (1/3 nhân loại nhiễm lao), tuy không có biểu hiện bệnh, nhưng có kháng thể, đó là kết quả của những lần nhiễm lao trước Thứ hai là do phản ứng
chéo với các Mycobacteria không gây bệnh do
có cấu trúc kháng nguyên tương đồng Như vậy, tìm kiếm một kháng nguyên đặc hiệu hơn vẫn là cần thiết và chắc chắn là điều khó khăn
3 Xét nghiệm ELISA với nhóm bệnh nhân mắc nhiễm trùng khác ngoài lao (nhóm III)
OD trung bình của nhóm II và III thấp hơn nhiều so với nhóm I và số lượng bệnh nhân ở nhóm III cho kết quả dương tính cao hơn nhóm
II (người lành) Đó là do hiện tượng đáp ứng
Trang 5TCNCYH 22 (2) - 2003
miễn dịch chéo của cơ thể với các kháng
nguyên tương đồng với Mycobacteria hoặc là
do đáp ứng với nhiễm lao từ trước như trong
nhóm II (người lành) Trong sáu kháng nguyên
đã thử, các kháng nguyên DT, MT và PA có tỷ
lệ phản ứng chéo thấp nhất
4 So sánh độ nhậy, độ đặc hiệu của xét
nghiệm ELISA với các loại kháng nguyên
nghiên cứu
Kháng nguyên MI và Co có độ nhậy thấp
nhất (30,6-46,8%), độ phản ứng chéo cao nhất
(43,4%-49,1%) trong 6 loại kháng nguyên Hai
loại kháng nguyên này đặc hiệu hơn cho M
avium (thông tin cá nhân)
Kháng nguyên DT, MT và PA có độ nhậy,
độ đặc hiệu cao tương đối đồng đều, độ phản
ứng chéo có phần thấp hơn so với hai loại
kháng nguyên kể trên Nghiên cứu của Steel
B.A và CS (1991) đã sử dụng 3 loại kháng
nguyên glycolipid LDS, DAT và PGLTb1 của
vi khuẩn lao để chẩn đoán lao phổi bằng
ELISA được độ nhậy 50- 60%, độ đặc hiệu
98% [9]
Chiang L H (1996) nghiên cứu huyết thanh
của 507 bệnh nhân gồm lao BK (+), lao phổi có
vôi hoá, bệnh phổi không phải lao và nhóm
người khoẻ mạnh bình thường ở Đài Loan sử
dụng kháng nguyên 38 kDa đạt độ nhậy 51%
[8] Theo Sada E D (1990) khi dùng kháng
nguyên LAM (lipoarabinomannan) để chẩn
đoán lao phổi bằng kỹ thuật ELISA cho thấy,
độ nhậy 72% và độ đặc hiệu 91% [8]
Nghiên cứu của Bùi Đức Luận (1996) về
khả năng đáp ứng miễn dịch bằng xét nghiệm
ELISA để phát hiện kháng thể kháng lao trong
huyết thanh bệnh nhân lao phổi kết hợp lao
ngoài phổi bằng kháng nguyên siêu nghiền và
kháng nguyên tiết thô, tác giả cho thấy, độ
nhậy của các loại kháng nguyên này từ
90-95%, độ đặc hiệu từ 94-100% [3] Năm 1997,
Doãn Trọng Tiên, Trần Văn Sáng và các cộng
sự đã sử dụng kháng nguyên tiết và kháng
nguyên siêu nghiền của 2 chủng vi khuẩn lao
(M avium; M tubeculosis) đã rút ra kết luận:
nồng độ kháng thể ở người già và người trưởng thành mắc lao đều cao hơn so với người già không mắc lao; trong lâm sàng có thể dùng phản ứng ELISA chẩn đoán lao người già [5] Như vậy ứng dụng kỹ thuật ELISA trong chẩn đoán các thể bệnh lao ngày càng được phổ biến rộng rãi hơn, do có độ tin cậy cao Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho kết quả phù hợp với nghiên cứu kể trên
V Kết luận Với kỹ thuật ELISA dùng kháng nguyên glycolipid đã góp phần phát hiện sớm bệnh lao trên lâm sàng đặc biệt là các thể lao ngoài phổi
và lao phổi BK(-) Ba loại kháng nguyên glycolipid tinh chế từ vi khuẩn lao có thể sử dụng để làm xét nghiệm ELISA chẩn đoán bệnh lao là Cord factor DT, MT và PA Các kháng nguyên này có độ nhậy từ 66,1%- 74,2%, độ đặc hiệu 69,8%- 83,0% và phản ứng chéo 22,6%- 39,6% Hy vọng rằng, 3 loại kháng nguyên này sẽ được nghiên cứu sâu hơn
để có thể thực sự được ứng dụng trong xét nghiệm ELISA chẩn đoán bệnh lao
Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm
ơn Labo BCG (Tokyo, Nhật Bản) đã cung cấp các sinh phẩm cho phản ứng ELISA; Viện Lao
và Bệnh phổi, Bệnh viện Lao Hà Nội, Bệnh viện Lao Quảng Ninh đã cung cấp huyết thanh
các bệnh nhân lao phổi BK (+)
Tài liệu tham khảo
1 Lê Huy Chính (2001), Họ
Mycobacteriaceae Vi sinh y học Nhà xuất
bản Y học, 207-214
2 N.V Cồ, B.Đ Dương, H.S Dưỡng, Đ Hứa, N.T Hương, N.N Lan, P.D Linh, P.T Quang, P.T Thiệp, L.B Tung và L.N Vân (1996), Hướng dẫn thực hiện chương trình chống lao quốc gia Chương trình chống lao quốc gia Viện lao và bệnh phổi, Hà nội,
3 Bùi Đức Luận (1996), Nghiên cứu đặc
điểm lâm sàng và miễn dịch học ở bệnh nhân
Trang 6TCNCYH 22 (2) - 2003
lao phổi kết hợp lao ngoài phổi Luận án tiến sĩ
y học, Học viện Quân y, Hà Nội
4 Trần Văn Sáng (2000), Sinh học phân tử và
miễn dịch học trong bệnh lý hô hấp, Nhà xuất
bản Y học, 109
5 Doãn Trọng Tiên (1996), Nghiên cứu một
số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và khả
năng đáp ứng miễn dịch ở người già lao phổi
Luận án tiến sĩ y học, Đại học Y Hà Nội, 104
6 Chiang I.H, Bai K J., Suo J et al (1996),
Serological diagnosis of the tuberculosis by
ELISA with M tuberculosis antigen (38 kDa)
The 4th congress of the Asian Pacific Society of
respiratory Abstracts handbook, 72
7 Dautzenberg B (1994), Epidemiologie de
la tuberculose, present et futur proche, 11e
congres de pneumologie de langue Francaise (22-25 Jun 1994), Volume des rapports, Nancy- Frace, 165-168
8 Sada E.D., Daniel T.M., Ferguson L.E (1990), An ELISA for the serodiagnosis of tuberculosis using 30 kDa antigen of
Mycobacterium tuberculosis, J Infect Dis, 162:
928-931
9 Steel B., Daniel T.M (1991), Evaluation of the potential role of serodiagnosis of tuberculosis in clinic in Bolivia by decision analysis, Am Rev Respir Dis, 143: 713-716
10 World Health Organization (1998), Epidemiological Review of tuberculosis in the Western Pacific Region 1998 World Office for the Western Pacific, Manila, 2-
Summary
sensitivity and specificity of glycolipid antigens
in serodiagnosis of tuberculosis
To find out specific antigens to M tuberculosis, we searched for sensitivity, specificity and cross reactions of 6 glycolipid antigens which were extracted and purified from M tuberculosis with 168
sera by ELISA
The 168 samples were divided into 3 groups: Group I: 62 lung tuberculosis patients with AFB-smear positive; group II: 53 healthy persons and group III: 53 infectious other than tuberculosis patients
There were 6 glycolipid antigens were used in this study, they were Phosphoinositomannoside (P2), 6, 6’-dimycolyltrehalose (cord factor) (DT), Trehalose monomycolate (MT), Phenol glycolipid (PA), Glycolipid (MI) and Glycopeptide (Co)
The sensitivity and specificity of DT, MT and PA antigens were 74.2; 66.1; 69, 4% and 83,0; 69,8%; 73.6%, respectively; cross reaction ranging from 22,6% to 39,6% The sensitivity and specificity of other antigens were lower and its cross reactions were higher than DT, MT and PA antigens ELISA with specific glycolipid antigens can be used to diagnose extra-lung tuberculosis and lung tuberculosis with AFB (-)
