nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân nhanh in vitro cho một số giống địa lan có giá trị Study on application of thin cell layer culture for in vitro prop
Trang 1nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong
nhân nhanh in vitro cho một số giống địa lan có giá trị
Study on application of thin cell layer culture for in vitro propagation of some valuable
cymbidium varieties
Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Thị Hoài
Summary The thin cell layer method was suggeted by Tran Thanh Van K We use this method to complete micropropagation of Cymbidium
Experiments were carried out on varieties Miss Kim, Xanh Chieu and Hong Bet originated from China and Viet Nam The tissue culture was done in artificial conditions (adjustable light, temperature, humidity) There ware 15-50 explants in each variant of experiments In optimal medium: MS + 150ml coconut water + 1mg kinetin + 10g sucrose + 6,5g agar per lit (for variety Miss Kim) and MS + 150ml coconut water + 1mg BA + 10g sucrose + 6,5g agar per lit (for variety Xanh chieu), the thin layers with size 0,3 – 0,5 mm gave best rate of protocorm formation Number of protocorms per thin cell layer ware 6,23 (Miss Kim) and 4,21 (Xanh Chieu)
Above results show that, the thin cell layer culture is successful method for rapid multiplication of Cymbidium
Key words: Cymbidium, thin cell layer, protocorm
1 Đặt vấn đề
Phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào đã được Trần Thanh Vân đề xuất (2000) và trở thành một trong những phương pháp nhân nhanh in vitro có hiệu quả Trong vài năm trở lại đây, phương pháp này được nghiên cứu ứng dụng tại một số phòng nuôi cấy mô ở Việt Nam và đã đem lại kết quả đáng kể trong quá trình nhân nhanh một số đối tượng như: phong lan (Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, 2000), dứa (Nguyễn Quang Thạch và CS, 2004) và các cây trồng khác (Dương Tấn Nhật, 2001)
Nhằm cải tiến và hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho cây địa lan, chúng tôi đã tiến hành “Nghiên
cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân nhanh in vitro cho một số giống địa lan
có giá trị.”
2 vật liệu, phương pháp nghiên cứu
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Các giống địa lan dùng trong nghiên cứu là: “ Miss Kim” (nguồn gốc từ Trung Quốc), Xanh chiểu, Hồng Bệt (2 giống được ưa chuộng và phổ biến ở Đà Lạt)
2.2 Ph ương pháp nghiên cứu
+ Điều kiện nuôi cấy: các thí nghiệm nuôi cấy in vitro được thực hiện trong điều kiện nhân tạo cho phép
chủ động điều chỉnh các chế độ ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ
+ Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi công thức theo dõi 15 - 50 cá thể
+ Thí nghiệm được quan sát, theo dõi thường xuyên 10 - 15 ngày/lần
+ Số liệu được xử lý thống kê theo chương trình IRRISTAT
3 Kết quả và thảo luận
3.1 Nghiên cứu ảnh h ưởng của kích thước lát cắt mỏng đến sự hình thành protocorm
Trang 2Với mục đích để tăng nhanh số lượng protocorm, chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu nuôi cấy lát mỏng cắt từ thể protocorm ban đầu với độ dày từ 0,1mm – 1mm trên môi trường MS +1% saccarose + 1ppm kinetin (K) + 0,65% agar Đây là môi trường phù hợp cho nhân nhanh các thể protocorm nguyên vẹn
đã được xác định được trong các nghiên cứu trước (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2000; 2004) Kết quả thí nghiệm trình bày trong bảng 1
Bảng 1 ảnh hưởng của kích thước lát mỏng đến khả năng tạo protocorm (sau 8 tuần )
Giống địa lan Kích thước
lát cắt (mm)
Tỷ lệ sống (%) Protocorm/lát
cắt
Xanh chiểu
Hồng bệt
Như vậy, kích thước của lát cắt có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ sống và sự hình thành protocorm Nếu
độ dày của lát cắt tăng thì tỷ lệ sống tăng nhưng tỷ lệ tạo protocorm lại giảm và ngược lại ở kích thước từ 0,3 - 0,5mm kết quả đạt được là cao nhất với tỷ lệ sống là 63,65 - 75,41% và số protocorm/lát cắt là 3,00 – 2,83 protocorm cho giống Xanh chiểu, còn đối với giống Hồng bệt các chỉ tiêu tương tự là: 57,61- 69,56%
và 3,33 - 3,00 protocorm Như vậy, các lát cắt với độ dày 0,3 - 0,5 mm là phù hợp cho việc nuôi cấy để tạo protocorm
3.2 Nghiên cứu ảnh h ưởng của phương thức nuôi cấy đến khả năng tạo protocorm
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy: MS +1% đường + 1ppmK + 0,65% agar/ 1lít môi trường Các lát mỏng tế bào đã được nuôi cấy tĩnh trên môi trường đặc, môi trường lỏng và nuôi cấy lắc trong môi trường lỏng
Bảng 2 ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy đến khả năng tạo protocorm (sau 8 tuần )
Phương thức
nuôi cấy
Kích thước lát cắt (mm) Tỷ lệ sống (%) Protocorm /lát cắt
Tỷ lệ sống (%) Protocorm /lát
cắt 0,3 63,65 3,00 57,61 3,33
Đặc
0,5 75,41 2,83 69,56 3,00 0,3 37,21 2,67 37,43 2,88 Lỏng + không
0,3 43,54 4,67 49,24 4,00 Lỏng + lắc
0,5 59,82 3,30 57,37 3,25
Số liệu thực nghiệm ở bảng 2 cho thấy: không chỉ độ dày của lớp cắt mà phương thức nuôi cấy cũng
là nhân tố tác động mạnh mẽ đến tỷ lệ sống và khả năng tạo protocorm của lát cắt nuôi cấy Trong cả ba phương thức nuôi cấy, lát cắt có độ dày 0,3mm đều có tỷ lệ sống thấp hơn nhưng số protocorm tạo thành /lát cắt nhiều hơn so với lát cắt dày 0,5mm Phương thức nuôi cấy tĩnh trong môi trường lỏng có hiệu quả kém nhất do tỷ lệ mẫu chết cao và số protocorm/lát cắt thấp nhất Phương thức nuôi cấy lắc trong môi trường lỏng tuy có số protocorm/lát cắt cao nhất nhưng tỷ lệ sống của lát cắt không cao nên tổng số protocorm tạo được vẫn ít hơn so với phương thức nuôi cấy tĩnh trên môi trường đặc Vì vậy, với các lát
Trang 3mỏng tế bào phương thức nuôi cấy tĩnh trên môi trường đặc là hiệu quả hơn cả Quy luật này thể hiện trên cả hai giống nghiên cứu (Xanh chiểu và Hồng bệt)
3.3 Nghiên cứu ảnh h ưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tạo protocorm
Khi đã xác định được độ dày lát cắt và phương thức nuôi cấy phù hợp, chúng tôi cũng đã bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau ở trạng thái riêng rẽ cũng như dạng tổ hợp vào môi trường nuôi cấy nhằm tìm ra tổ hợp và nồng độ thích hợp nhất vừa đảm bảo kích thích lát mỏng hình thành nhiều thể protocorm vừa đảm bảo được chất lượng của nguồn mẫu Nhưng kết quả khả quan nhất chỉ đạt được khi sử dụng riêng rẽ các xytokinin Điều này được trình bày ở bảng 3 và 4
Bảng 3 ảnh hưởng của Benzyl adenin (BA) đến khả năng tạo protocorm (sau 8 tuần)
Số protocorm / 1 protocorm ban
đầu
Giống
địa lan
Công thức
thí nghiệm
Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%)
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%)
protocorm /lát mỏng
Số protocorm % so với đối
chứng
Miss
Kim
Xanh
chiểu
Ghi chú: I (ĐC): MS + 15% nước dừa + 10g saccarosa + 6,5g aga /1 lít môi trường
Từ các kết quả bảng 3 và 4 cho thấy việc bổ sung chất điều tiết sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy
có khả năng kích thích sự phát sinh hình thái của lát mỏng rất rõ rệt Đối với giống “Miss Kim”, trên các môi trường có bổ sung BA tổng số protocorm tạo được/1 protocorm ban đầu cao hơn đối chứng từ 20,1-142,9% và khi bổ sung kinetin chỉ tiêu này là 41,6-144,5 % ở môi trường có nồng độ BA bằng 0,5ppm hay kinetin bằng 1ppm có thể thu được 27 hay 30 thể protocorm từ một protocorm ban đầu sau 8 tuần nuôi cấy Trên giống Xanh chiểu quy luật cũng diễn ra tương tự Nhưng với giống này nồng độ thích hợp của
BA và kinetin đều là 1mg/l Trên các môi trường có bổ sung BA và kinetin ở nồng độ 1mg/l, sau 8 tuần nuôi cấy có thể thu được 16-19 protocorm từ 1 protocorm ban đầu Vì vậy sau khi tạo được nguồn vật liệu khởi đầu (protocorm) từ đỉnh chồi hay các mắt ngủ của chồi bên, để tăng nhanh nguồn mẫu cho quá trình nhân tiếp theo thì việc sử dụng nuôi cấy lát mỏng tế bào là phương pháp tối ưu nhất
Trang 4Bảng 4 ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo protocorm (sau 8 tuần)
Số protocorm / 1 protocorm ban đầu
Giống
địa lan
Công thức thí nghiệm
Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%)
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%)
protocorm /lát mỏng
Số protocorm
% so với
đối chứng
Miss
Kim
Xanh
chiểu
Ghi chú: I(ĐC): MS + 15% nước dừa + 10g saccarosa + 6,5g aga /1lít môi trường
4 Kết luận
Các lát cắt protocorm có chiều dày 0,3- 05mm là thích hợp cho nuôi cấy lớp mỏng để nhân nhanh protocorm
Phương thức nuôi cấy phù hợp nhất để nuôi cấy lát mỏng protocorm là nuôi cấy tĩnh trên môi trường
đặc
Môi trường nuôi cấy cho hệ số nhân và số protocorm tạo thành cao nhất:
+ Đối với giống “Miss Kim” là: MS+ 150mlND + 1mgKinetin + 10g Saccaroza + 6,5g agar/lít Trên
môi trường này số protocorm/lát cắt đạt: 6,23 và tổng số protocorm/1 protocorm ban đầu đạt: 29,76 + Đối với giống Xanh chiểu là: MS+ 150mlND + 1mg BA + 10g Saccaroza + 6,5g agar/lít Trên môi trường này số protocorm/lát cắt đạt: 4,21 và tổng số protocorm/1 protocorm ban đầu đạt: 19,05
Tài liệu tham khảo
Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, 2000 “Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy lát mỏng trong nhân nhanh
các giống Vanda, Cattleya và Phaleanopsis” Tạp chí Nông nghiệp, Công nghiệp thực phẩm, số
12/2000, trang 546 – 548
Nguyễn Quang Thạch, Đinh Trường Sơn, Nguyễn Thị Hương, 2004 “Nhân nhanh giống dứa Đài nông 4
bằng kỹ thuật nuôi cấy mô” Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp
I Tập II , số 3/2004, trang: 185-190
Nhut D.T., Bui V.L., Teixeira da Silva J.A., Aswth C.R., 2001 Thin cell layer culture system in Lilium: regeneration and transformation perspectives In vitro Cell Dev Biol 37, p: 516-523
Tran Thanh Van K., Bui V.L., 2000 Curent status of thin cell layer method for the induction of organogenesis or somatic embryogenesis In: somatic embryogenesis in woodly plants Mohan S.J., Gupta P.K., Newton R.J (eds.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht 6, p: 51-92
