Nhưng để tạo được cây chuyển gen thì quy trình tái sinh in vitro là yêu cầu đầu tiên và có ý nghĩa quyết định đến sự thành công của phương pháp vì thường chỉ có thể chuyển gen vào các t
Trang 1Nghiên cứu sự tái sinh in vitro một số giống
khoai lang Việt nam Study on in vitro regeneration of some Vietnam sweetpotato varieties
Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Quang Thạch
Summary
A in vitro regeneration of sweetpotato for gene transfering was studed The experiments were carried out on some sweet potato varieties: Chiem dau (CD), Nong nghiep 31 (NN31) and Lim Research results show that:
+ The stem internodes were effective explants for shoot formation
+ Culture mediums for shoot induction from stem internodes were:
MS+1,2ppmkietin+0,5ppmIAA ( for CD variety), MS+2,0ppmkietin+0,1ppmIAA ( for NN31 variety) and MS+1,0ppmkietin+0,5ppmIAA ( for Lim variety)
+ There is no morphologically variation between the regenerated plants and the normal plants
Key words: sweet potato, in vitro regeneration, stem internode, explant
1 Đặt vấn đề
Khoai lang (Ipomoea batatas L.) là một trong những cây lương thực quan trọng và được trồng
tại hơn 100 nước trên thế giới (Faostat- FAO, 1999) ở nước ta, khoai lang được trồng phổ biến ở khắp các vùng vì không đòi hỏi thâm canh cao mà vẫn có thể cung cấp lượng lớn sinh khối làm lương thực, thực phẩm cho con người và thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên, các giống đang trồng chủ yếu là giống địa phương năng suất và phẩm chất không cao, năng suất trung bình của cả nước chỉ
đạt 6,5-7,0 tấn/ha (Niên giám thống kê, 2003) Do đó, việc nghiên cứu cải tiến hay bổ sung thêm một số đặc tính nông sinh học cần thiết cho các giống khoai lang Việt Nam là yêu cầu của thực tiễn sản xuất
Tuy nhiên, để có được những giống khoai lang mới với các tính trạng mong muốn thì phương pháp tạo giống truyền thống phải mất nhiều thời gian, công sức Trong khi đó, kỹ thuật chuyển gen
có thể khắc phục những hạn chế này Đặc biệt, việc chuyển gen cho phép bổ sung những tính trạng cần thiết mà vẫn giữ được đặc tính của giống (C James, 2003) Nhưng để tạo được cây chuyển gen
thì quy trình tái sinh in vitro là yêu cầu đầu tiên và có ý nghĩa quyết định đến sự thành công của
phương pháp vì thường chỉ có thể chuyển gen vào các tế bào, mô (lá, thân, callus), phôi… sau đó nuôi cấy chúng để tái sinh thành cây hoàn chỉnh có mang các đặc tính đã được chuyển nạp ở nước
ta, sự tái sinh in vitro của một số giống khoai lang đã được công bố (Phạm Bích Ngọc và CS, 2002),
nhưng cũng còn những hạn chế như: hệ thống tái sinh phức tạp, thời gian nuôi cấy dài nên các vấn
đề này rất cần được tiếp tục nghiên cứu cải tiến
2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu dùng trong các thí nghiệm là cây in vitro sạch virus của các giống khoai lang Chiêm
dâu (CD), Nông nghiệp 31 (NN31) và Lim đã được tạo ra trong các nghiên cứu trước đây (Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch, 2003)
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Tiêu chuẩn cây khoai lang để tách mẫu cấy: cây nuôi cấy mô có 8 lá, cao 7cm Mẫu cấy là
đoạn thân không có chồi nách dài 0,5 - 0,7cm và mô lá kích thước 0,5 x 1cm Các mẫu cấy này
được nuôi cấy trên môi trường MS (Murashige - Skoog, 1962) có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng thực vật tuỳ thuộc từng thí nghiệm Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện: nhiệt độ: 27±2oC, cường độ chiếu sáng: 3000 lux, quang chu kỳ: 16 giờ chiếu sáng/ 8 giờ tối
Trang 2Tiêu chuẩn cây khoai lang cấy mô khi đưa ra vườn ươm: cây có 5 lá, cao 4cm, có 3-4 rễ Cây con
được trồng trong điều kiện tự nhiên ở nhà lưới cách ly, tưới ẩm thường xuyên, cung cấp dinh dưỡng Growmore (20:20:20) 1 lần/ tuần
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại có 50 mẫu Các chỉ tiêu thí nghiệm được quan sát và đo đếm định kỳ, 5 –15 ngày 1 lần (tuỳ theo yêu cầu của thí nghiệm)
3 Kết quả nghiên cứu
3.1 Khả năng tái sinh của mô thân cây khoai lang
ảnh hưởng của Benzyladenin (BA) và các hợp chất auxin đến sự tái sinh của mô thân
Trong thí nghiệm này, mô thân khoai lang chỉ tái sinh (tạo rễ, tạo callus và tạo chồi) khi được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung chất điều khiển sinh trưởng (bảng 1) Hình thức tái sinh callus
là phổ biến nhất và đều cho tỷ lệ tái sinh đạt 100% trên tất cả các công thức, tiếp đến là hình thức tái sinh rễ (công thức tốt nhất đạt 100%) và thấp nhất là tái sinh chồi (công thức tốt nhất đạt 43,3%) Trong các công thức thí nghiệm trên, môi trường cho tỉ lệ tái sinh chồi đạt cao nhất ở giống Chiêm dâu là môi trường MS có bổ sung 1ppmBA + 0,5ppmIAA/lít (đạt 43,3%) và giống NN31 là môi trường MS có bổ sung 1ppmBA + 0,1ppm IAA/lít (đạt 16,6%) Chồi được hình thành là chồi
đơn và tái sinh từ mô sẹo Đường hướng tái sinh này không thông qua quá trình tạo phôi soma như một số công bố trước đây (Liu Q C., et al., 1998, Lucckmini K W et al., 1994)
Bảng 1 ảnh hưởng của BA và các hợp chất auxin đến sự tái sinh mô thân cây khoai lang giống CD
và NN31 (sau 8 tuần)
Các đường hướng tái sinh Công thức thí nghiệm(ppm)
Tỉ lệ tạo cal (%) Tỉ lệ tạo rễ (%) Tỉ lệ tạo chồi (%) Sốchồi/mẫu cấy Giống Chiêm dâu
Giống NN31
ảnh hưởng của kinetin và các hợp chất thuộc nhóm auxin đến sự tái sinh của mô thân
Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 2 chứng tỏ tác động của tổ hợp kinetin và các hợp chất auxin đến khả năng tái sinh của mô thân cũng theo quy luật tương tự như tác động của tổ hợp
BA và các auxin Nhưng trong thí nghiệm này tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đã được cải thiện hơn Môi trường MS + 1ppm kinetin + 0,5 ppm IAA là môi trường cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất đối với cả giống CD (53,3%) và NN31 (20,0%)
Như vậy, so với BA, kinetin tỏ ra có hiệu quả hơn trong kích thích sự tái sinh chồi từ mô thân
và trong sự tổ hợp với các auxin thì tổ hợp giữa kinetin và IAA cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất.Từ nhận định này, thí nghiệm đã được mở rộng với những tổ hợp có nồng độ cao của kinetin để nâng cao hơn nữa sự tái sinh chồi của mẫu cấy vì đây là đường hướng tái sinh quan trọng nhất
Trang 3Bảng 2 ảnh hưởng của kinetin và các hợp chất auxin đến sự tạo chồi của mô thân cây khoai lang
giống CD và NN31 (sau 8 tuần)
Đường hướng tái sinh Công thức thí nghiệm
Tỉ lệ tạo cal (%) Tỉ lệ tạo rễ (%) Tỉ lệ tạo chồi (%) Sốchồi/ mẫu cấy Giống Chiêm dâu
Giống NN31
Kết quả thực nghiệm ở bảng 3 chỉ rõ: mô thân cây khoai lang có khả năng tái sinh callus và rễ
khi được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung kinetin (từ 1- 2 ppm) kết hợp với IAA (nồng độ
0,1ppm và 0,5 ppm) với tỷ lệ 100% Nhưng nồng độ cao của kinetin đã làm giảm tỷ lệ tái sinh chồi
của mô thân giống CD Công thức CT3 (1,2ppm kinetin phối hợp với 0,5 ppm IAA) cho tỉ lệ tái sinh
chồi cao nhất, đạt 73,3% Đối với giống NN31 quy luật tái sinh chồi có sự khác biệt so với giống
CD, công thức CT7 (có 2 ppm kinetin và 0,1IAA) là công thức cho tỉ lệ tái sinh chồi cao nhất, đạt
33,3% Đối với cả 2 giống, đã có một tỷ lệ nhỏ mẫu cấy tái sinh theo hướng hình thành cụm chồi
Tuy nhiên, số lượng chồi/cụm chồi còn ít (thông thường là 2 chồi)
Bảng 3 ảnh hưởng của kinetin và IAA đến sự tái sinh của mô thân cây khoai lang giống CD và
NN31 (sau 8 tuần) Công thức thí nghiệm Đường hướng tái sinh
Tỉ lệ tạo callus (%) Tỉ lệ tạo rễ (%) Tỉ lệ tạo chồi (%) Sốchồi/ mẫu cấy Giống Chiêm dâu
Giống NN31
Trang 4Để xác định khả năng tái sinh của giống khoai lang Lim, mô thân của giống này đã được nuôi cấy trên một số môi trường tái sinh chồi có hiệu quả của giống CD và NN31 Kết quả nghiên cứu được thể hiện trên bảng 4
Bảng 4 ảnh hưởng của kinetin và IAA đến sự tái sinh của mô thân cây khoai lang Lim (sau 8 tuần)
Công thức thí nghiệm Tỉ lệ tạo cal (%) Tỉ lệ tạo rễ (%) chồi (%) Tỉ lệ tạo Số chồi/ mẫu cấy
CT2:1,2ppm Ki + 0,5 ppm IAA 100 100 56,6 1
Tương tự như giống CD và NN31, mô thân của giống khoai lang Lim chỉ tái sinh (tạo callus, tạo rễ, tạo chồi) trên môi trường có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng (kinetin và IAA) ở cả công thức CT1 và CT2 mẫu cấy có khả năng tái sinh cao, tỉ lệ tạo chồi là 40% và 56,6% Phương thức hình thành chồi của giống Lim cũng là chồi tái sinh từ callus và ở dạng chồi đơn
3.2 Khả năng tái sinh của mô lá cây khoai lang
Bảng 5 ảnh hưởng của kinetin và IAA đến sự tái sinh chồi của mô lá cây khoai lang
(sau 8 tuần) Giống NN31 Giống Chiêm dâu Giống Lim Công thức thí nghiệm
Tỉ lệ tạo cal (%)
Tỉ lệ tạo
rễ (%)
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Tỉ lệ tạo cal (%)
Tỉ lệ tạo
rễ (%)
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Tỉ lệ tạo cal (%)
Tỉ lệ tạo
rễ (%)
Tỉ lệ tạo chồi (%)
MS+1,0ppmKi+0,5ppmIAA 100 3,3 0 100 6,6 0 100 10 3,3 MS+1,2ppmKi+0,5ppmIAA 100 3,3 3,3 100 6,6 0 100 10 3,3
Mô lá của các giống khoai lang nghiên cứu đã được nuôi cấy trên một số công thức thí nghiệm
đã cho tỷ lệ tái sinh chồi cao khi nuôi cấy mô thân Kết qjuả nghiên cứu (bảng 5) cho thấy mô lá của các giống khoai lang có khả năng tái sinh callus rất mạnh (100% trên hai công thức CT1 và CT2) Nhưng khác với mô thân, tỷ lệ mô lá tạo rễ chỉ đạt 3,3 - 10,0 % Đặc biệt, khả năng tái sinh chồi từ mô lá ở các giống rất thấp: giống CD không có cảm ứng tạo chồi ở cả hai công thức CT1 và CT2, giống NN31
có sự hình thành chồi ở công thức CT2, riêng giống Lim có sự tạo chồi ở cả hai công thức CT1 và CT2 nhưng tỷ lệ hình thành chồi ở tất cả các công thức đều chỉ đạt là 3,3% Do đó, rất cần phải tiếp tục nghiên cứu để nâng cao được tỷ lệ tái sinh chồi của mô lá
3.3 Đánh giá sự sai khác về sinh trưởng giữa cây tái sinh và cây nhân giống vô tính in vitro
trong giai đoạn vườn ươm
Các cây tái sinh từ mô thân của giống Chiêm dâu được trồng trong điều kiện tự nhiên của vườn
ươm So với các cây nhân nhanh in vitro (nuôi cấy các đoạn thân mang 1 nách lá) của giống này, các cây tái sinh không có sự sai khác về tỷ lệ sống và hình thái Nhưng sự sinh trưởng của các cây nhân
in vitro tỏ ra ưu thế hơn đôi chút
Bảng 6 Khả năng sống và sinh trưởng của cây tái sinh và cây nhân giống
vô tính in vitro tại vườn ươm (sau 4 tuần) Loại cây Tỉ lệ cây
sống (%)
Chiều cao TB (cm)
Số lá TB (lá) Đặc điểm hình thái
Cây tái sinh 100 22,74 ± 2,1 6,63 ± 0,7 Cây mập, khoẻ, lá xanh
Cây nhân in vitro 100 24,70 ± 2,5 7,48 ± 0,8 Cây mập, khoẻ, lá xanh
Như vậy có thể kết luận rằng cây tái sinh từ mô thân cây khoai lang có thể sinh trưởng bình thường ở điều kiện ngoài vườn ươm giống như cây nhân giống vô tính in vitro Tuy nhiên cần phải tiếp tục đánh giá sự phát triển và hình thành sản phẩm kinh tế (củ) của cây tái sinh trong thời gian tiếp theo
Trang 54 Kết luận
Đã xây dựng được quy trình tái sinh in vitro của các giống khoai lang Chiêm dâu, Nông nghiệp
31 và Lim làm cơ sở cho kỹ thuật chuyển gen qua việc xác định được:
4.1 Loại mô thích hợp dùng để tái sinh cây khoai lang qua mô sẹo là mô thân
4.2 Phương thức hình thành chồi chủ yếu là chồi đơn tái sinh từ mô sẹo
4.3 Môi trường tái sinh chồi tốt nhất đối với mô thân các giống khoai lang khác nhau là khác nhau:
Đối với giống Chiêm Dâu và giống Lim: MS + 1,2 ppmkinetin và 0,5 ppm IAA/lít Trên môi trường này tỷ lệ tái sinh chồi của giống Chiêm dâu đạt 73,3% và giống Lim đạt 56,6%
Đối với giống NN31: MS + 2,0 ppm kinetin và 0,1 IAA/lít Trên môi trường này tỷ lệ tái sinh chồi đạt 33,3%
4.4 Cây tái sinh có khả năng sống và sinh trưởng bình thường giống như cây nhân giống vô tính in
vitro ở ngoài điều kiện môi trường tự nhiên
Tài liệu tham khảo
Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch, 2003 “Nghiên cứu làm sạch virus bằng nuôi cấy meristem trên một số giống khoai lang ở Bắc Việt nam” Báo cáo khoa học hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2003 Nxb Khoa học kỹ thuật, trang: 735-739
Phạm Bích Ngọc, Đinh thị Phòng, Egnin M., Prakash C S., Lê Trần Bình, 2002 “Hoàn thiện phương pháp chuyển gen vào một số giống khoai lang Việt Nam thông qua Agrobacterium
tumefaciens” Tạp chí khoa học và công nghệ Tập 40-số ĐB/2002, trang:142-149
Niên giám thống kê, 2003 Nxb Thống kê, Hà nội-2003 Trang: 45
Clive James, 2003 “ Global Status of Commercialized Transgenc Crops: 2003” ISAAA Briefts p: 1-25
Liu Q C., et al., 1998 “An efficient system of embryogenic suspension culture and plant regeneration in sweetpotato, Impact on a changing world" International potato center program report, 1997-1998, p 265 – 267
Lucckmini K W et al., 1994 “Plant regeneration of sweetpotato(Ipomoea batatas Poir.)” Plant Cell Reports 3, p: 112-115
Murashige T., Skoog F A., 1962 “A revised medium for rapid growth and biossays with tobaco
tissue culture” Physiol plant 15, p: 473-479
Faostat - FAO Statistics Database (Online) Accessed June 1999 http://apps.fao.org
