Đề tài “Nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” potx

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRƯƠNG THỊ MỸ DUYÊN NGHIÊN CỨU KIỂU PLASMID VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA Pangasianodon hy

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

TRƯƠNG THỊ MỸ DUYÊN

NGHIÊN CỨU KIỂU PLASMID VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC

CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

TRƯƠNG THỊ MỸ DUYÊN

NGHIÊN CỨU KIỂU PLASMID VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC

CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths NGUYỄN THỊ THU HẰNG

2009

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành tốt một Luận văn tốt nghiệp thì mỗi một sinh viên đều phải trãi qua những khó khăn và vất vả Tuy nhiên, những khó khăn đó không gây trở ngại cho quá trình làm luận văn của tôi Vì đã được sự giúp đỡ cũng như động viên của gia đình, thầy cô và bạn bè trong suốt thời gian thực hiện đề tài của mình Nhân đây tôi xin được gởi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến:

Gia đình và người thân của tôi đã ủng hộ rất nhiều về mặt tinh thần cũng như vật chất cho quá trình thực tập

Cô Nguyễn Thị Thu Hằng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báo trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Thầy cô và các anh chị trong bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản, khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

Các bạn lớp Bệnh học thủy sản K31 đã động viên cũng như giúp đỡ tôi khi thực hiện đề tài và trong suốt quá trình học tập tại trường

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện trên 8 chủng A hydrophila phân lập trên cá tra bệnh xuất huyết và

tất cả vi khuẩn đã được định danh đến loài Đề tài được thự hiện thông qua 3 nội dung: (i) kiểm tra kháng sinh đồ với các kháng sinh Amoxycillin (AMX, 25µg), Ciprofloxacin (CIP, 5µg), Colistin (CS, 50µg), Doxycycline (DO, 30µg), Florfenicol (FFC, 30µg), Oxolinic acid (OA, 2µg), Streptomycin (S, 10µg), Norfloxacin (NOR, 10µg), (ii) xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng

sinh streptomycin và (iii) ly trích plasmid của vi khuẩn Aeromonas hydrophila

Kết quả kháng sinh đồ cho thấy có 7/8 chủng kháng với amoxicillin, 7/8 mẫn cảm với ciprofloxacin, doxycycline, florfenicol, streptomycin Với kháng sinh colistin

có 2/8 chủng nhạy trung bình và 6/8 mẫn cảm với kháng sinh này Kháng sinh oxolinic acid có 3/8 kháng, 5/8 mẫn cảm Kháng sinh norfloxacin có 1/8 kháng, 1/8 trung bình nhạy, 6/8 mẫn cảm Từ kết quả kiểm tra kháng sinh đồ chọn ra 1 loại kháng sinh (streptomycin) mà vi khuẩn mẫn cảm để xác định nồng độ ức chế

tối thiểu (MIC) của kháng sinh trên vi khuẩn A hydrophila Qua đó cho thấy, đa

phần các chủng cho kết quả mẫm cảm với streptomycin với giá trị MIC dao động

từ 4-16ppm Chỉ duy nhất 1 chủng kháng với streptomycin ở nồng độ 256ppm

Bên cạnh đó, để tìm hiểu với những kết quả kháng thuốc trên của A hydrophila

thì chúng có kiểu plasmid như thế nào Đề tài đã tiến hành ly trích và diện di

plasmid của 8 chủng A hydrophila Kết quả chỉ phát hiện được plasmid của 2

chủng: CA1.2T và CA1.3TT Chúng có kiểu plasmid khác nhau, biểu hiện hai vạch không tương đồng nhau

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH V CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược tình hình dịch bệnh trên cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 3

2.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A hydrophila) 5

2.3 Tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL 6

2.4 Hình thành hệ vi khuẩn kháng thuốc 8

2.5 Thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản 9

2.5.1 Khái niệm thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản 9

2.5.2 Khái niệm kháng sinh 9

2.5.3 Các loại kháng sinh thường dùng trong nuôi trồng thủy sản 9

2.6 Sơ lược về plasmid ở vi khuẩn 12

2.6.1 Các loại plasmid 13

2.6.2 Plasmid tham gia vào cơ chế tái tổ hợp gen nội bào 13

2.6.3 Plasmid có khả năng vận chuyển gen 14

2.6.4 Ý nghĩa sinh học của plasmid 14

2.7 Plasmid và sự kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila 14

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

3.2 Vật liệu nghiên cứu 16

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

3.2.2 Dụng cụ 16

3.2.3 Thiết bị 16

3.2.4 Hóa chất và môi trường 16

3.3 Phương pháp nghiên cứu 17

3.3.1 Phục hồi và tách ròng vi khuẩn 17

3.3.2 Phương pháp kiểm tra kháng sinh đồ 17

3.3.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 19

3.3.4 Phương pháp ly trích plasmid DNA vi khuẩn (Bartie, 2004) 20

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila 22

4.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 26

4.3 Kết quả ly trích plasmid của vi khuẩn Aeromonas hydrophila 28

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề xuất 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC 38

DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH

Bảng 3.1: Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ 18

Bảng 3.2: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho một chủng) 20

Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ 23

Hình 4.1: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên môi trường NA 22

Hình 4.2: Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Aeromonas hydrophila 22

Hình 4.3: Kết quả kháng sinh đồ trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila 23

Hình 4.4: Kết quả MIC của streptomycin với vi khuẩn Aeromonas hydrophila

27

Hình 4.5: Kết quả MIC ở nồng độ 256ppm (mũi tên) 28

Hình 4.6: Kết quả điện di trên 8 chủng Aeromonas hydrophila 29

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Giới thiệu

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong các loài cá da trơn có kích

thước lớn nhất trong họ Pangasiidae phân bố ở hạ lưu sông Mê Kông Vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có truyền thống nuôi cá tra ở quy mô nông hộ từ lâu đời Những thành công trong sản xuất giống nhân tạo vào những năm 1990 đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ nghề nuôi cá tra, trở thành nghề công nghiệp ở nhiều nơi như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long v.v… (Dương Nhựt Long, 2003)

Sản phẩm cá tra nuôi được chế biến đa dạng và xuất khẩu nhiều nước trên thế giới Thị trường tiêu thụ được mở rộng góp phần rất lớn trong việc phát triển công nghiệp nuôi cá tra hiện nay Diện tích nuôi càng mở rộng, năng xuất nuôi và sản lượng cá tra hàng năm tăng lên rất đáng kể Cụ thể năm 2006 sản lượng cá tra

là 825.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu là 736.872.115 USD (Vũ Văn Dũng, 2007) Tuy nhiên, bên cạnh sự phát triển đó thì người nuôi cá tra ở ĐBSCL cũng gặp không ít những khó khăn trở ngại Trở ngại đầu tiên là việc phát triển diện tích nuôi thủy sản với tốc độ nhanh đang phá vỡ quy hoạch vùng nuôi thuỷ sản an toàn, gây ô nhiễm môi trường làm phát sinh dịch bệnh Khó khăn lớn nhất mà người nuôi gặp phải là tình hình dịch bệnh, làm giảm năng xuất và sản lượng nuôi Thêm vào đó việc nuôi cá tự phát, không kiểm soát trong những năm gần đây, người nuôi luôn gia tăng mật độ trong khi trình độ kỹ thuật còn hạn chế Chất thải ao nuôi thải trực tiếp ra môi trường đã tạo điều kiện cho mầm bệnh phát triển, nhất là bệnh vi khuẩn chiến đa số và xuất hiện với tần xuất cao Trong đó,

bệnh xuất huyết do Aeromonas hydrophila gây ra chiếm tỉ lệ khá cao Mặc khác,

do bệnh trên cá nuôi xuất hiện ngày càng nhiều: Xuất huyết, phù đầu, gan thận mủ,…và việc diễn biến phức tạp của bệnh đã khiến người nuôi sử dụng rất nhiều loại kháng sinh, hóa chất với nồng độ không ngừng gia tăng (Nguyễn Quốc Thịnh, 2004−2006) Từ những nguyên nhân đó đã làm cho tình hình dịch bệnh ngày càng diễn biến phức tạp Tạo nên dòng vi khuẩn kháng thuốc làm cho việc điều trị gặp nhiều khó khăn và trở ngại Theo kết quả nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2005), trong 196 dòng vi khuẩn phân lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở ĐBSCL (có cả Aeromonas) hầu hết cho kết quả kháng thuốc và

có 34% kháng nhiều loại kháng sinh Với giá trị MIC có 91 % các dòng vi khuẩn

thử nghiệm có giá trị rất cao (dao động 512 đến ≥1.024ppm) Bên cạnh đó, thì việc kháng thuốc ở vi khuẩn một số còn có liên quan đến việc hình thành plasmid kháng thuốc (R-plasmid) của chúng (Trần Thị Thanh, 2000; Nguyễn Lân Dũng

và ctv, 2007 và Saitanu et al., 1994) Tuy nhiên, những thông tin về việc hình

thành plasmid kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh trên động vật thuỷ sản ở ĐBSCL còn cần nhiều nghiên cứu để góp phần tìm hiểu rõ hơn những plasmid kháng thuốc ở vi khuẩn

Từ những vấn đề trên đề tài “Nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc

của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Nhằm tìm hiểu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila

1.3 Nội dung đề tài

− Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn

Aeromonas hydrophila

− Xác định kiểu plasmid của vi khuẩn Aeromonas hydrophila

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược tình hình dịch bệnh trên cá tra ở Đồng Bằng sông Cửu Long

Cá tra là loài có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ, mật độ nuôi cao và oxy hòa tan thấp (Dương Nhựt Long, 2003) Tuy nhiên, chúng vẫn bị một số bệnh do vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng… Sự hiện diện của những bệnh này đã làm giảm năng xuất và sản lượng cá nuôi rất lớn, gây nhiều thiệt hại cho người nuôi cá tra thâm canh ở ĐBSCL

Những năm 1999-2000, 2002-2003 cá tra bị bệnh, chết nhiều với các biểu hiện: xuất huyết ở miệng và hầu, nổ mắt, thận sưng và có những đốm trắng (Nguyễn Chung, 2008) Đặc biệt vào đầu năm 2006 trên sông Tiền và sông Hậu xảy ra hiện tượng cá tra chết hàng loạt, với đa số có biểu hiện xuất huyết và gan thận có nhiều đốn trắng (Hà Văn và Bình Nguyên, 2006) Trước đây, bệnh do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri (gan thận mủ) gây ra trên cá tra nuôi ở ĐBSCL đã được Ferguson et al., (2001) phát hiện là xuất hiện đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1998

đã gây nhiều thiệt hại cho nghề nuôi cá nơi đây

Hiện nay những bệnh thường gặp và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá tra gồm

ký sinh trùng như: Trichodina, Dactylogyrus, Myxobolus, nấm thủy mi, trùng quả dưa (Ichthyophthyrius), trùng mỏ neo (Lerneae), rận cá (Argulus), trong đó hai loài gây thiệt hại nhiều nhất là Trichodina và Dactylogyrus Bệnh vi khuẩn như: Aeromonas hydrophila, A salmonicida, A sobria, Edwardsiella ictaluri, E tarda, Pseudomonas sp,…Trong đó hai loài gây thiệt hại nhiều nhất là Aeromonas hydrophila tác nhân gây bệnh đốm đỏ, đỏ mỏ, đỏ kỳ, xuất huyết và Edwardsiella ictaluri tác nhân gây bệnh mủ gan (Trần Anh Dũng, 2005)

Bên cạnh những bệnh ký sinh trùng trên thì trong một số nghiên cứu của Nguyễn Quang Hưng (2001), Cao Tuấn Anh (2005) về bệnh ký sinh trùng trên cá tra

giống cũng có các bệnh tương tự là Trichodina, Dactylogyrus, Myxobolus,

Ichthyophthyrius… Ngoài ra, theo kết quả khảo sát của Huỳnh Cẩm Tú (2006), thì có thêm một số giống loài ký sinh trùng như: Epistylis sp, Protoopalina sp, trong đó Trichodina và Dactylogyrus xuất hiện thường xuyên và chiếm tỉ lệ cao

Theo Nguyễn Quốc Thịnh (2004), vào năm 2004 bệnh phù đầu có tần suất xuất hiện nhiều nhất, chiếm (60%) Đây là loại bệnh nguy hiểm, tốn nhiều chi phí cho

việc điều trị và gây thiệt hại lớn cho nông dân Kế đến là bệnh gan thận mủ chiếm

tỷ lệ cao (40,7%) Đây là bệnh gây nhiều thiệt hại làm ảnh hưởng đến năng suất

và lợi nhuận Bệnh có tần suất xuất hiện thấp nhất là tuột nhớt, lở loét, trắng mang (chiếm 1,9%) Đến năm 2006, bệnh ký sinh trùng và vàng da xuất hiện hầu hết các hộ nuôi còn bệnh phù đầu cũng như gan thận mủ xuất hiện với tỉ lệ thấp (21,4% và 3,6%) Ngoài bệnh ký sinh trùng và bệnh vàng da thì xuất huyết đường ruột hay còn gọi là bệnh đốm đỏ cũng có xu hướng tăng mạnh (từ 13% năm 2004 lên đến 93% năm 2006)

Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008) tần suất xuất hiện bệnh trên cá tra vào năm 2007 ở các tỉnh ĐBSCL: Gan thận mủ 52,80%, xuất huyết 42,50%, phù đầu, phù mắt 20,70% và vàng da 21,60% (Trích dẫn bởi Nguyễn Trọng Bình, 2008)

Từ kết quả điều tra của Huỳnh Văn Quang (2008), cũng cho thấy có hai loại bệnh thường xuyên xuất hiện và gây thiệt hại nghiêm trọng trong quá trình nuôi của các hộ nuôi cá tra là bệnh gan thận mủ và xuất huyết Theo thống kê cho thấy, hai loại bệnh này xuất hiện hầu như quanh năm Mức độ thiệt hại của bệnh gan thận

mủ thường cao hơn bệnh xuất huyết, bình quân mức thiệt hại của gan thận mủ là 33,4% tuyến sông Tiền và 43,9% tuyến sông Hậu; trong khi đó, mức thiệt hại bình quân của bệnh xuất huyết là 8% tuyến sông Tiền và 25,1% tuyến sông Hậu (Sở Nông nghiệp Vĩnh Long, 2008)

Bên cạnh đó từ kết quả khảo sát của Trần Kiều Lan Phương (2008), cho thấy dịch bệnh trên cá tra ở Cần Thơ cũng bao gồm: xuất huyết chiếm 35,2%, chiếm tỉ lệ cao nhất là gan thận mủ 94,4%, và các bệnh như trắng gan trắng mang, đốm đỏ, vàng da chiếm tỉ lệ thấp khoảng trên 20% Ngoài ra thì cá tra còn bị ảnh hưởng bởi bệnh ký sinh trùng chiếm 11,3% và bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ và bệnh phù đầu chiếm không quá 7%

Hầu như các tỉnh nuôi cá tra ở ĐBSCL đều phải đương đầu với bệnh xuất huyết, gan thận mủ, vàng da, ký sinh trùng… Nhưng bệnh trên cá tra thường xuất hiện nhiều ở những vùng có diện tích nuôi cá tra lớn như An Giang, huyện Thốt Nốt, Phụng Hiệp của tỉnh Cần Thơ… (Từ Thanh Dung và ctv, 2004) Tổng diện tích nuôi cá tra ở ĐBSCL là rất lớn, thêm vào đó thì con cá tra là loài rất dễ nuôi lại mau lớn Cho nên, những người dân không cần trình độ chuyên môn vẫn có thể nuôi tốt loài cá này Trước đây nuôi cá tra đa phần là nuôi tự phát, không có quy hoạch và phần lớn thì cũng chỉ dựa vào kinh nghiệm Vì vậy việc quản lý tốt môi trường nuôi cũng như khống chế dịch bệnh thì cũng là một chuyện khó khăn Bên

cạnh đó, đa phần người nông dân nuôi cá cũng không có nhận thức tốt về sự ô nhiễm của nước thải từ ao nuôi khi cho thải trực tiếp ra môi trường ngoài, trong khi chúng chưa qua xử lý Từ đó, đi đôi với việc gia tăng diện tích nuôi thì môi trường ngày càng bị ô nhiễm trầm trọng, là một trong những nguyên nhân lớn làm bùng phát dịch bệnh khó kiểm soát (Trần Anh Dũng, 2005)

2.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A hydrophila)

Trước đây, giống Aeromonas thuộc họ Vibrionaceae do chúng có một vài đặc điểm tương tự Vibrio Nhưng đến giữa thập niên 80 Aeromonas được tách ra một

họ riêng là Aeromonadaceae (Horneman và Moris, 2007) bởi có các chỉ tiêu sinh

lý, sinh hóa khác biệt như không mẫn cảm với phản ứng O/129 (150 µg) ngoại trừ

A caviae (Trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008)

Theo Barrow và Feltham (1993), Aeromonas được chia thành 2 nhóm dựa trên

khả năng di động và ngưỡng nhiệt độ phát triển của chúng Nhóm thứ nhất gồm:

A hydrophila, A sobria và A caviae có các đặc điểm là có khả năng di động, hai

đầu hơi tròn, gram âm, hình que ngắn, hiếu khí không bắt buộc, phát triển được ở

37oC… Nhóm thứ hai là A salmonicida (có 3 loài phụ gồm: A salmonicada, A achromogenes và A nova) có đặc điểm tương tự nhưng chúng chỉ phát triển tốt

nhất ở 22oC hoặc thấp hơn và không có tiêm mao cũng như chúng không có khả năng di động (Trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008)

Shotts & Rimler (1973), A hydrophila có những đặc trưng sau: Gram âm, que

thẳng, kích thước khoảng 0,5x1,4-4,0µm, có roi ở hai cực cơ thể, kỵ khí, lên men cacbonat hình thành acid hoặc khí gas, oxydase dương tính, khử nitrat (Trích dẫn bởi Dương Võ Mỹ Hạnh, 2008)

Aeromonas hydrophila khi phát triển trên môi trường đặc trưng SA sẽ cho các

khuẩn lạc có dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và có màu vàng nhạt Cho phản ứng dương tính với Oxidase và Catalase, có khả năng lên men các môi trường đường và sinh khí từ glucose nhưng không có khả năng tạo khí H2S, cho phản ứng dương tính với MR-VP, lysine, arginine, và ornithine Đặc biệt chúng có khả năng phát triển được ở nồng độ muối 6%, nên đã thể hiện được đặc tính phân bố rộng muối (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005)

B Austin và D Austin (1986), cho rằng A hydrophila là nguyên nhân của một

vài tình trạng bệnh khác nhau như thối vây, bệnh đốm đỏ và thường liên kết với

mầm bệnh khác như A salmonisida Bệnh đốm đỏ là biểu hiện sự có mặt của

những vết thương trên da, đặc biệt xuất huyết ở mang và hậu môn, loét, ung mủ,

lồi mắt, phình bụng Bên trong xoang bụng tích tụ dịch loãng, gây thiếu máu và tổn thương các cơ quan như gan, thận

Đặc điểm bệnh do Aeromonas gây ra là làm cho động vật mắc bệnh xuất huyết,

hình thành các vết đỏ trên cơ thể, lở loét ở da và các vết loét này ngày càng lan rộng ra trên bề mặt da, các cơ quan hoặc ăn sâu vào bên trong cấu trúc mô Tùy vào đối tượng nuôi, nhóm vi khuẩn gây bệnh và giai đoạn bệnh mà có những biểu

hiện bệnh lý khác nhau (Inglis et al., 1993)

Nhóm gây bệnh thường gặp là A hydrophila, A sobria và A caviae, được phát

hiện đầu tiên trên cá chình trong báo cáo dịch bùng phát bệnh của Sanarelli (1891) Kế đến trong các nghiên cứu sau này trên cá chép của Schaperclaus

(1930), phân lập được vi khuẩn A hydrophila và cho đây là tác nhân gây bệnh cho cá (Trích dẫn bởi Inglis et al., 1993)

Ngoài ra, A hydrophila còn là tác nhân thứ cấp gây bệnh tuột nhớt trên cá bống

tượng và gây chết cao vào mùa nước đổ ở ĐBSCL (Nguyễn Thị Như Ngọc, 1997) Đến năm 1998, Phạm Hoàng Sanh đã phân lập được 3 giống vi khuẩn trên

cá bệnh xuất huyết là Streptococcus, Aeromonas, Pseudomonas Đây cũng là

bệnh gây thiệt hại nhiều ở cá bè nuôi thịt, bệnh xuất hiện vào mùa khô (tháng 11 đến tháng 4 dương lịch) và rất thường xảy ra đối với cá nuôi bè, chiếm 33% trong 64,84% số bè bị bệnh, làm giảm đáng kể sản lượng cá basa (Nguyễn Minh Nhí,

2007) Bên cạnh đó thì Aeromonas sp còn được phân lập cả trên tôm càng xanh

với những biểu hiện cụt râu và mòn phụ bộ (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005) Ngoài

ra, A hydrophila còn là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết trên cá

trắm cỏ, rô phi, tra, basa, mè vinh (Từ Thanh Dung, 1999 Trích dẫn bởi Lê Trung Tính, 2007)

2.3 Tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL

Trong thời gian qua, do chưa có sự thống nhất cao giữa các Bộ nghành trong việc đưa ra những qui định về việc quản lý sản xuất kinh doanh, sử dụng thuốc, hóa chất còn lỏng lẽo, chưa có biện pháp chế tài hữu hiệu đủ răn đe sai phạm Từ đó việc sản xuất kinh doanh và sử dụng thuốc trong nuôi trồng thủy sản vẫn còn nhiều sai phạm Người nuôi đang chịu áp lực rất lớn từ các nhà sản xuất kinh doanh thuốc và hóa chất, trong khi các sản phẩm mới thường xuyên được tung ra thị trường mà thông tin về chúng thì ít Nhưng các quảng cáo về tính năng, hiệu quả thì nhiều làm cho người nuôi mù mờ, sử dụng tràn lan gây nhiều nguy cơ mất

an toàn vệ sinh thực phẩm, ô nhiễm môi trường, tạo dòng vi khuẩn kháng thuốc… (Nguyễn Thị Phương Nga, 2004)

Cụ thể, trong khảo sát của Nguyễn Thị Phương Nga (2004), tại 3 tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau có 983 sản phẩm thương mại thuốc, hóa chất trên 468 sản phẩm thuốc, hóa chất được Bộ Thủy sản cho phép sử dụng trong nuôi trồng thủy sản được cung cấp bởi 110 nhà sản xuất, kinh doanh, trong đó các nhóm: hóa chất

257 sản phẩm, khoáng thiên nhiên 169 sản phẩm, vitamin-premix-lipid 230 sản phẩm, chế phẩm sinh học 191 sản phẩm, riêng kháng sinh 136 sản phẩm được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, trong đó có 40 loại chỉ chứa 1 kháng sinh thuộc nhóm hạn chế sử dụng, còn lại kết hợp ít nhất 1 kháng sinh hoặc thuốc giảm đau, kháng viêm, trị nấm

Bên cạnh đó, tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra công nghiệp ở Đồng Tháp cũng được ghi nhận có 90 loại thuốc, hóa chất được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản với các mục đích: Diệt tạp, trộn vào thức ăn để phòng bệnh và trị bệnh trực tiếp Riêng kháng sinh trị bệnh cho cá có 58 loại thì hầu hết nằm trong danh mục hạn chế sử dụng, nhiều loại ở dạng nguyên liệu và nguồn gốc không rõ ràng, riêng chất Malachite Green là chất nằm trong danh mục Bộ Thủy sản cấm sử dụng nhưng vẫn được người nuôi sử dụng trong nuôi cá ở đây (Phạm Thanh Tuấn, 2004)

Ngoài ra, từ kết quả khảo sát của Nguyễn Chính (2005) ở An Giang và Cần Thơ, cho thấy có 394 loại thuốc, hóa chất do 75 nhà sản xuất đang được kinh doanh trong khu vực Trong đó có 16% sản phẩm kháng sinh phối trộn từ 3 kháng sinh trở lên, vi phạm qui định về phối trộn kháng sinh: theo quyết định 07/2005 của

Bộ Thủy sản Thuốc, hóa chất nguyên liệu được bán lẻ công khai mà không cần toa nhãn cho người sử dụng Đối với nhóm kháng sinh, các nhà sản xuất đưa ra những khuyến cáo chưa tuân thủ đúng qui định cũng như thời gian ngưng sử dụng trước khi thu hoạch

Qua khảo sát của Châu Hồng Thúy, (2008) có 100% người nuôi xác nhận có sử dụng kháng sinh, hóa chất để phòng trị bệnh cho cá nuôi Trong đó các loại kháng sinh thuộc nhóm Quinolone được sử dụng nhiều nhất, kế đến là các chất thuộc nhóm Aminoside Nhóm Lactam có Amoxicillin và Ampicillin cũng được sử dụng rộng rãi Nhóm Tetracyclin có Oxytetracyclin cũng được sử dụng nhưng không nhiều lắm còn các nhóm kháng sinh còn lại có mặt nhiều trên thị trường nhưng người nuôi cho là không quen nên rất ít sử dụng Và các kháng sinh florfenicol, doxycycline, norfloxacin, enrofloxacin được hầu hết cá hộ nuôi cá

được khảo sát ở Trà Vinh sử dụng Bên cạnh đó, khảo sát của Nguyễn Chính (2005) cũng cho thấy kháng sinh ở hầu hết các nhóm đều được người nuôi cá sử dụng Trong đó, các kháng sinh thuộc nhóm quinolones là được sử dụng với tần suất cao

Riêng nhóm Sulfonamide và Colistin thường được sản xuất như là một dạng kháng sinh kết hợp nên có mặt trong nhiều sản phẩm thuốc điều trị bệnh và đương nhiên cũng được sử dụng với tỷ lệ cao Về liều lượng sử dụng, qua tìm hiểu thì để chắc ăn, thực tế liều lượng sử dụng để điều trị bệnh là cao hơn liều lượng ghi trên nhãn nhiều lần (Nguyễn Chính, 2005)

Theo Nguyễn Thị Phương Nga (2004) cũng như Phạm Thanh Tuấn (2004) đều ghi nhận rằng người nuôi thường tự sử dụng thuốc, hóa chất trong phòng trị bệnh cho cá nuôi hoặc theo chỉ dẫn của người bán hoặc theo nhãn thuốc (64%) và theo kinh nghiệm bản thân (59%) tự pha trộn thuốc trong khi không biết rõ tính kết hợp hay đối kháng của thuốc Rất ít khi theo chỉ dẫn của cán bộ thú y hoặc cán bộ khuyến ngư (3%) Người nuôi biết rất rõ về danh mục các loại thuốc cấm nhưng một số vẫn còn lén lút sử dụng mà chưa hiểu biết rõ về các nguy cơ của việc sử dụng thuốc, hóa chất trong phòng trị bệnh cho cá Thuốc nguyên liệu và thuốc sử dụng cho người vẫn được sử dụng trong nuôi cá tra (Phan Trọng Duy, 2007)

2.4 Hình thành hệ vi khuẩn kháng thuốc

Đây là một bài toán nang giải mà hiện nay các nhà khoa học đang rất quan tâm nghiên cứu, các quốc gia và người nuôi trồng thủy sản phải đối mặt Trong khi kháng sinh được sử dụng rộng rãi cho người và vật nuôi trên cạn thì việc sử dụng chúng trong nuôi trồng thủy sản lại là vấn đề có tầm quan trọng đặc biệt vì nó liên quan tới phương thức phân bố thuốc Không giống như trên cạn môi trường nước rất dễ phát tán, do đó khi cho vào nước thì thuốc nhanh chóng lan truyền cả ao nuôi thậm chí ra cả thủy vực tự nhiên quanh trại, thủy sản được nuôi với mật độ

cao, thuốc có thể trộn vào thức ăn hoặc trực tiếp vào nước (Herwig et al., 1977)

Kết quả là thuốc phát tán rất nhanh và tồn lưu (tuy mức độ có khác nhau) cả trong

ao nuôi và nguồn nước tự nhiên chung quanh Điều này làm cho xuất hiện dòng vi khuẩn kháng thuốc Một khi đã có dòng vi khuẩn kháng thuốc thì phải đưa kháng sinh mới để có thể tiêu diệt chúng và cứ kéo dài chuổi thay đổi thuốc qua nhiều chu kỳ nuôi thì đến một thời điểm việc nghiên cứu ra thuốc mới sẽ không kịp đáp ứng như cầu, hơn nữa có rất nhiều chất có độc tính hoặc mối nguy tìm tàng cao đối với cơ thể con người (Chloramphenicol, nhóm Nitrofurane…) Đã có rất nhiều

công trình nghiên cứu khoa học cho thấy rằng việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản có nguy cơ rất cao tạo ra dòng vi khuẩn kháng thuốc, vi khuẩn có thể tự đột biến và kháng được nhiều thuốc, có thể thừa hưởng về đặc điểm di truyền, cấu trúc hoặc trạng thái sinh lý mà cho chúng sự thuận lợi để đề kháng thuốc… (Claudia Harper, 2002 Trích dẫn bởi Nguyễn Chính, 2005)

Vài nhóm nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy các điều kiện trung bình cho việc phát triển vi khuẩn kháng thuốc ở nuôi trồng thủy sản là nước, bùn đáy và cả cá nuôi (Schmidt, 2000; Sorum, 1998), bùn đáy ở rần một số trại nuôi có sử dụng nhiều kháng sinh thường chứa nhiều vi khuẩn kháng thuốc hơn những trại chung quanh ít hoặc không sử dụng thuốc kháng sinh, mà những vi khuẩn này phần lớn

kháng một hoặc nhiều thuốc (Schmidt et al., 2000; Gonzalez et al., 1999; Herwig

et al., 1997) Tuy nhiên (theo Herwig et al., 1997) nếu điều kiện nuôi trồng thủy

sản tốt, sử dụng kháng sinh một cách hợp lý thì ít khi gặp phải vi khuẩn kháng thuốc (Trích dẫn bởi Nguyễn Chính, 2005)

2.5 Thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản 2.5.1 Khái niệm thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản

Theo Bộ Thủy Sản (2002), thuốc là chế phẩm có nguồn gốc động vật, thực vật, khoáng chất, hóa chất, vắc-xin và các chế phẩm sinh học khác dùng để phòng và trị bệnh; điều chỉnh sinh trưởng, phát triển và sinh sản của thủy sản; xử lý và cải tạo môi trường nuôi Và hóa chất là sản phẩm hóa học dùng để xử lý, cải tạo môi

trường, phòng và trị bệnh cho thuỷ sản nuôi trồng (Lê Thị Kim Liên và ctv, 2007)

2.5.2 Khái niệm kháng sinh

Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh học (do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sản sinh ra) hay do con người tổng hợp nên, có tác động một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu của sự biến dưỡng của các vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), của các nấm (tác nhân kháng nấm), của các siêu vi (tác nhân kháng virus) (Lê Thị Kim Liên, 2007)

2.5.3 Các loại kháng sinh thường dùng trong nuôi trồng thủy sản Nhóm ß-lactamin

Là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn hẹp chủ yếu có tác dụng trên vi khuẩn Gram dương và một số ít vi khuẩn Gram âm, là kháng sinh diệt khuẩn tác dụng ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn Nhưng theo Nguyễn Khang (2005) thì ngoài

tác dụng diệt khuẩn nhóm này còn tác dụng kìm hãm vi khuẩn và nhận thấy kháng sinh ß-lactamin chỉ có tác dụng với vi khuẩn đang phát triển, còn vi khuẩn không phân bào thì không chịu tác dụng của thuốc vì chúng không tổng hợp màng ngoài

Và một số vi khuẩn không có màng ngoài có thể sống sót trong môi trường có

ß−lactamin (Trích dẫn bởi Huỳnh Chí Thanh, 2007)

Đại diện của nhóm này thường được sử dụng trong thủy sản là amoxicillin, ampicillin thường dùng điều trị các bệnh do: Edwardsiellosis, Streptococosis,

Furunculosis, Pasteurellosis Thường điều trị không hiệu quả đối với Vibrio và Aeromonas thường kháng với kháng sinh này (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị

Như Ngọc, 2006) Tuy nhiên, kháng sinh này có thể dùng điều trị bệnh đỏ mỏ, đỏ

kỳ, trắng da, lở loét, chướng hơi, ngửa bụng trên cá Dùng 100g amoxiciline/tấn thức ăn từ 3−5 ngày để trị bệnh xuất huyết trên cá tra−Enthic Septicaenia of

Catfish (ESC), đốm trắng hoại tử nội tạng (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004) và Edwardsiella ictaluri (Từ Thanh Dung, 2005 Trích dẫn bởi Phan Trọng Duy,

2007)

Nhóm Tetracycline

Đây là nhóm kháng sinh có tác dụng kiềm khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở nồng độ cao, có phổ kháng khuẩn rất rộng tác dụng trên vi khuẩn Gram âm, Gram dương, nguyên sinh động vật Tuy nhiên, do mức đề kháng của nhiều loại vi khuẩn

như: Streptococus, Staphylococus, Pseudomonas, E.coli… nên các tetracycline

không còn được sử dụng trong điều trị nhiễm trùng do các vi khuẩn trên (Lê Thị

Kim Liên và ctv, 2007)

Kháng sinh này có tác dụng ức chế giai đoạn sinh tổng hợp Protein (Đỗ Thị Hòa

và ctv, 2004) Hấp thu không đều qua dạ dày, ruột, hấp thu thấp nhất là

chlotetracycline (30%), trung bình là tetracycline, oxytetracycline (60−80%), hấp thu tốt nhất là doxycyclin (90−100%), thức ăn và các chất kháng acid làm giảm hấp thu thuốc (Trần Thị Thu Hằng, 2006 Trích dẫn bởi Huỳnh Chí Thanh, 2007) Đại diện cho nhóm là cá kháng sinh oxytetracyclin và chlotetracyclin thường được dùng phổ biến trong nuôi thủy sản nước lợ, mặn, tetracycline và doxycyclin dùng trong nuôi thủy sản nước ngọt Các kháng sinh này thường dùng để trị bệnh đường ruột, bệnh nhiễm khuẩn máu, xuất huyết của các loài cá nước ngọt: cá tra, basa, trắm cỏ Theo Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc (2006), các kháng sinh này dùng để điều trị đỏ mỏ, đỏ kỳ, trắng da, lở loét, chướng hơi ngửa bụng trên cá, trầy da của ếch, bệnh phồng cổ của baba (Huỳnh Chí Thanh, 2007)

Nhóm Aminosid

Là kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết vi khuẩn Gram âm và một

số vi khuẩn Gram dương hiếu khí, ít tác dụng đối với vi khuẩn kỵ khí vì aminosid thấm qua màng tế bào vi khuẩn một phần nhờ hệ thống vận chuyển hoạt động phụ thuộc vào oxygen nên vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối không chịu tác động Amonisid là kháng sinh diệt khuẩn, chúng ức chế tổng hợp protein, thường được dùng để trị bệnh phát sáng, giảm nhầy, hầu như kháng sinh này không hấp thu qua ruột Do chúng không hấp thu qua ruột nên không nên dùng bằng đường miệng để trị nhiễm khuẩn toàn thân Mặt khác, kháng sinh này gây hại tạp khuẩn ruột vì thế cũng

không nên dùng để trị các bệnh viêm ruột (Lê Thị Kim Liên và ctv, 2007)

Các kháng sinh thuốc nhóm aminosid thường được dùng trong nuôi thủy sản là: streptomycin, kanamycin, gentamycin, neomycin Đối với cá bệnh trướng bụng, đầy hơi do nhiễm ở cá, ếch, baba, tôm có thể dùng chộn vào thức ăn cho ăn (Lê

Thị Kim Liên và ctv, 2007) Ngoài ra, từ kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Như

ngọc (1997) đã sử dụng gentamycin trị bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng cũng mang lại hiệu quả khả quan

dương (Edwardsiella, Aeromonas, Pseudomonas ngoại trừ norfloxacin) Quinolon

ức chế AND-gyrase là men cần thiết cho sự tái bản hay sao chép của phân tử AND, do đó ngăn chặn sự tổng hợp AND và protein ở vi khuẩn (Lê Thị Kim Liên

và ctv, 2007)

Các kháng sinh nhóm quinolon được sử dụng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản: enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh

mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra rất có hiệu quả (Từ Thanh Dung

và ctv, 2005) Kháng sinh norfloxacin, oxolinic acid có hoạt phổ mạnh trên nhóm

vi khuẩn Vibrio sp gây bệnh trên tôm (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004) Nguyễn Thị Như

Ngọc (1997) cũng nhận thấy kháng sinh oxolinic acid điều trị có hiệu quả bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng và theo Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc

(2006) thì các kháng sinh này còn điều trị hiệu quả trên các giống vi khuẩn

Aeromonas sp, Pseudomonas sp, nhưng hiện nay các kháng sinh này đã cấm sử

dụng trong nuôi trồng thủy sản do tồn lưu trong động vật thủy sản và ảnh hưởng đến sức khỏe con người (Huỳnh Chí Thanh, 2007)

Nhóm Phenicol

Có phổ kháng khuẩn rộng, là kháng sinh kìm khuẩn, có hiệu lực diệt khuẩn trên một vài loài và có khả năng phân tán tốt vào các mô cơ thể Cụ thể chloramphenicol rất được ưa chuộng trong trị liệu, nhưng hiện nay kháng sinh này

đã bị cấm do ngoài việc tác dụng trên vi khuẩn chúng còn ảnh hưởng trực tiếp lên

cả con người, gây hiện tượng quái thai và có thể truyền yếu tố kháng thuốc cho vi khuẩn gây bệnh ở người

Tuy nhiên, hiện nay vẫn có thể sử dụng nhóm này trong trị bệnh cho động vật thủy sản thông qua florfenicol Theo Từ Thanh Dung (2008) dùng florfenicol 0,1−0,2g/kg thức ăn cho ăn liên tục trong 5−7 ngày để trị bệnh gan thận mủ trên cá

tra do Edwardsiella ictaluri

2.6 Sơ lược về Plasmid ở vi khuẩn

Ở tế bào Prokaryote, mà cụ thể là ở vi khuẩn qua kính hiển vi điện tử có thể quan sát được chất nhân là phân tử DNA nguyên vẹn có dạng vòng tròn hình chiếc nhẫn Đấy là nhiễm sắc thể của vi khuẩn−nơi chứa nguyên liệu di truyền của tế bào Đồng thời bên cạnh nhiễm sắc thể, người ta còn quan sát thấy những cấu trúc dạng hình nhẫn nhỏ hơn gọi là plasmid Đặc điểm nổi bật của plasmid là có cấu tạo từ DNA, có khả năng tự nhân đôi một cách độc lập, có khả năng tồn tại một cách độc lập với bộ gen của vi khuẩn cũng như có thể gắn vào bộ gen của vi khuẩn Người ta xem plasmid là phần tử di truyền nằm ngoài bộ máy di truyền của

vi khuẩn (Trần Thị Thanh, 2000)

Theo Nguyễn Ngọc Hải (2007) plasmid là phân tử ADN có khả năng mang đoạn

ADN ngoại lai vào trong tế bào chủ (E.Coli hoặc nấm men Saccharomyces cerevsiae) và đảm bảo sự nhân lên của đoạn ADN này trong tế bào chủ Là phân

tử ADN ngoài nhiễm sắc thể có khả năng tự nhân đôi, mang những đoạn gen đặc hiệu (kháng kháng sinh hoặc độc lực) Với những ưu điểm: kích thước nhỏ, dễ sử dụng để tuyển lựa (tính kháng kháng sinh), với cấu trúc gen khởi động có thể sử

dụng để thể hiện chức năng của gen Tuy nhiên, chúng lại có kích thước đoạn

AND mang không lớn hơn 12 kbp

2.6.1 Các loại plasmid

Plasmid được phân loại theo hai nhóm chính gồm (Trần Thị Thanh, 2000 và

Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2007):

Dựa vào khả năng truyền vào vi khuẩn khác:

v Plasmid tiếp hợp (conjugative) chứa các gen giúp thực hiện một quá trình phức tạp gọi là tiếp hợp, chuyển một plasmid sang vi khuẩn khác

v Plasmid không tiếp hợp là những plasmid không có khả năng thực hiện quá trình tiếp hợp, vì thế chúng chỉ có thể được chuyển sang một vi khuẩn khác khi có sự trợ giúp của plasmid tiếp hợp

v Nhóm plasmid trung gian gọi là nhóm plasmid di chuyển được Chúng chỉ mang các gen cần thiết cho việc di chuyển Những plasmid này có thể chuyển với tần suất cao khi có mặt một plasmid tiếp hợp

Dựa vào chức năng chia làm 5 nhóm chính:

v Plasmid giới tính, chúng mang nhân tố giới tính F (Fertility Factor) Sự vận

chuyển DNA từ tế bào vi khuẩn này sang tế bào vi khuẩn khác nhờ vào các sợi nhung mao hình ống trên bề mặt của vỏ tế bào vi khuẩn, do plasmid F hình thành (Trần Thị Thanh, 2000)

v Plasmid mang tính kháng (Resistance-(R) plasmid), mang các gen có khả năng kháng lại các thuốc kháng sinh hay chất độc

v Col-plasmid, chứa các gen mã hóa cho sự tổng hợp colchicine, một protein

có thể giết chết các vi khuẩn khác

v Plasmid phân hủy, giúp phân hủy các chất lạ như toluene hay salicylic acid

v Plasmid mang độc tính, làm cho sinh vật trở thành sinh vật gây bệnh

2.6.2 Plasmid tham gia vào cơ chế tái tổ hợp gen nội bào

Khi plasmid nhân đôi nó sẽ tạo ra những vòng dính liền nhau như một chuỗi nhẫn (cấu trúc này gọi là caten) Các caten sẽ đức đoạn, đưa các plasmid về dạng thẳng

và nếu như bên cạnh có nhiễm sắc thể của vi khuẩn đang sinh sản cũng bị đức ra thì các đoạn thẳng của plasmid và nhiễm sắc thể của vi khuẩn có thể gắn lại với nhau tạo thành một thể thống nhất Như vậy, các plasmid của vi khuẩn có thể lọt vào trong phân tử DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn và ngược lại Những thông tin như vậy sẽ nhân lên và truyền lại cho tế bào con cháu, có thể không giống mẹ nó ở một điểm nào đó Chính nhờ cơ chế tái tổ hợp gen nội bào này mà ta có thể giải

thích tại sao xảy ra sự biến đổi tính chất kỳ lạ của vi khuẩn, sự phản ứng tức thì của chúng đáp ứng lại những thay đổi của môi trường ngoài hay khả năng sống sót mãnh liệt của chúng… (Trần Thị Thanh, 2000)

2.6.3 Plasmid có khả năng vận chuyển gen

Plasmid có thể làm “vật chủ trung gian” − vector, là những cấu trúc có khả năng tự sinh sản, có khả năng gắn kết vào mình những gen lạ và chuyển giao những gen lạ này cho một tế bào khác Cùng với việc chuyển giao thông tin di truyền với các cơ thể khác, các plasmid còn truyền cho các tế bào nhận những đặc điểm quan trọng của mình như: tính đề kháng với các chất kháng sinh, kim loại nặng (Hg, Cd…) và tia cực tím Đặc tính tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp vào quá trình sinh tổng hợp một số chất kháng sinh, trong đó có cả những kháng sinh bị đề kháng bởi chính vi khuẩn đó Đặc điểm sử dụng nguồn cacbon khó đồng hóa như: Campor, octane, cồn octane… làm nguồn dinh dưỡng (Trần Thị Thanh, 2000)

2.6.4 Ý nghĩa sinh học của plasmid

Các tính trạng đọc mã bởi plasmid thường cung cấp cho tế bào chủ ưu thế sinh trưởng và nhờ đó mà các tế bào này thu được ưu thế chọn lọc

Plasmid kháng: Đáng chú ý là các vi khuẩn thể hiện tính đa kháng thuốc được truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua tiếp xúc tế bào đơn giản Ngày nay

ta đã biết các gen của plasmid-R giúp cho vi khuẩn chủ kháng với sunphonamit, streptomixin, chloramphenicol, kanamixin và tetraxiclin Một số plasmid-R cho tính kháng với 8 kháng sinh, số khác kháng với kim loại nặng, độc Các plasmid-R thường là tiếp hợp hoặc có thể huy động Có 2 cơ chế kháng kháng sinh: kháng do plasmid đọc mã và kháng do nhiễm sắc thể đọc mã Chẳng hạn, tính kháng streptomycin do nhiễm sắc thể dựa vào sự thay đổi của hạt riboxom 30S Trái lại, tính kháng streptomycin do plasmid lại dựa vào sự biến đổi chất kháng sinh này nhờ enzim (streptomycin bị adenyl hóa) Một đặc tính khác của vi khuẩn cũng do plasmid đọc mã là vi khuẩn có thể tạo thành các protein có khả năng giết chết hoặc kìm hãm sinh trưởng của các loài thân thuộc, các protein có tác dụng đặc biệt này

được gọi là bacterioxin (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2007)

2.7 Plasmid và sự kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila

Majumdar et al (2007), cho biết việc tồn tại của R-plasmid trong A hydrophila sẽ

ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc bề mặt, sự phát triển và tính độc của chúng khi được cảm nhiễm vào vật chủ Và R-plasmid này quyết định đến sự phát sinh dịch

bệnh do A hydrophila Ngoài ra, sự hiện hiện hay không R-plasmid của A hydrophila còn quyết định tính kháng hay mẫn cảm với một loại kháng sinh mà

nó đã kháng trước đó

Theo Meyer (1964), vi khuẩn Aeromonas hydrophila được khống chế bởi

oxytetracycline Tuy nhiên, đến năm 1988 trong nghiên cứu của Aoki đã phát hiện một loại plasmid của vi khuẩn này với trọng lượng trung bình 20-30 MDa kháng lại oxytetraxycyline, sự kháng thuốc này hầu như phát triển rộng rãi trong các ao nuôi kể cả ao nuôi lươn và nó có tiềm năng có thể phủ nhận lợi ích của

một số chất chống vi khuẩn (Aoki và Egusa, 1971; Toranzo et al., 1983) Aoki

(1988) cảnh báo plasmid-R sẽ được tìm thấy trong một vài chủng loài mầm bệnh

ở cá không liên quan nhau gồm: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida,

và Edwardsiella tarda Bên cạnh đó, Aeromonas hydrophila cũng kháng thụ động

lại nhiều kháng sinh như: ampicillin, chloramphenicol, erythromycin, nitrofurantoin, novobiocin, streptomycin, sulphonamides và tetracycline (Aoki,

1988 và De Paola et al., 1988) Cụ thể, có khoảng trên 38% vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ các ao nuôi cá da trơn bệnh kháng lại oxytetracycilne

(Trích dẫn bởi B Austin và D Austin, 1986)

Bên cạnh đó, theo Mitchell & Plumb (1980); Aoki & Egusa (1971) cũng cho thấy R-plasmid là nguyên nhân của việc đa kháng với hầu hết các kháng sinh chloramphenicol, oxytetracycline (Meyer, 1964) and sulphamerazine (Seaman,

1951) đã sử dụng trị các bệnh nhiễm khuẩn do aeromonad (Ansary et al., 1991; Chang & Bolton, 1987 Trích dẫn bởi Inglis et al., 1993)

Ngoài ra, từ kết quả nghiên cứu của Saitanu et al (1994), việc chuyển đổi plasmid đã được phát hiện từ những chủng A hydrophila kháng thuốc phân lập

R-trên cá ở Thái Lan Hầu hết, những R-plasmid được phát hiện đã đọc mã kháng lại kháng sinh chloramphenicol (CP), sulfamonomethoxine (SA), tetracycline (TC) Đặc biệt, việc chuyển R-plasmid ở vi khuẩn phân lập từ Nhật Bản và Đài Loan thì mã hóa kháng lại TC, SA, CP và Streptomycin (SM) (Aoki et al, 1971; Akashi and Aoki 1986) Thêm nữa, trong nghiên cứu này của ông cũng cho thấy hầu hết vi khuẩn kiểm tra kháng với 19 loại kháng sinh mà ông thử nghiệm Ông còn cho biết kháng sinh TC và SA được sử dụng rất thường trong việc trị bệnh

cho cá Và hầu hết những chủng kháng với TC, SA có chứa R-plasmid (Saitanu et al,1994)

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 05/2009 đến tháng 07/2009 Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản – Khoa Thủy sản – Đại học Cần Thơ

3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Aeromonas hydrophila được phân lập trên cá tra bệnh xuyết huyết, tất

cả vi khuẩn đều đã được định danh tới loài và được trữ ở điều kiện -800C trong glycerol 25% gồm các chủng: TN1.1T, TN2.1G, CA1.3TT, CA1.2T, TN2.4TT, CAF2, SĐ2.1T, CS2.3T

3.2.2 Dụng cụ

− Đĩa petri, chai nấu môi trường 500ml, que trãi thủy tinh, cốc thủy tinh 100ml

− Micropipet 1ml và 5ml, ống nghiệm, hộp đầu col, ống eppendorf, que cấy, đèn cồn, bình xịch cồn, hộp quẹt, lame, lamella, viết lông dầu, găng tay, v.v…

3.2.3 Thiết bị

− Cân điện tử, máy khuấy từ, nồi khử trùng áp suất (autoclave), kính hiển vi

− Tủ sấy khô, tủ cấy vi khuẩn, tủ lạnh, tủ ấm, tủ đông, máy so màu quang phổ

− Máy vortex, bồn điện di, máy li tâm, lò vi sóng…

3.2.4 Hóa chất và môi trường Hóa chất

− Nước cất, cồn đốt, cồn tuyệt đối, NaCl, BaCl2 1%, H2SO4 1%

− Đĩa thuốc kháng sinh thương mại (sản phẩm của Biorad) gồm: Ciprofloxacin (CIP, 5µg), Amoxycillin (AMX, 25µg), Colistin (CS, 50µg), Doxycycline (DO, 30µg), Florfenicol (FFC, 30µg), Oxolinic acid (OA, 2µg), Streptomycin (S, 10µg), Norfloxacin (NOR, 10µg)

− Hóa chất nhuộm gram:

+ Dung dịch 1: crystal violet, ethanol 95%, ammonium oxalate, nước cất

+ Dung dịch 2: potassium iodide, iodine, nước cất

+ Dung dịch 3: 95% ethanol : 5% acetone

+ Dung dịch 4: safranin, ethanol 95%, nước cất

− Tris, EDTA, glucose, sodium hydroxide, SDS, potassium acetate, glacial acetic acid, isopropanol, ethanol, agarose, Ethidium bromide, Loading die

Môi trường

− Môi trường nuôi cấy chung TSA (Triptone Soya Agar), nutrient agar (NA): nuôi cấy vi khuẩn

− Môi trường mueller hinton agar (MHA): lập kháng sinh đồ

− Môi trường lỏng nuôi vi khuẩn NB (Nutrient Broth; Merck)

3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phục hồi và tách ròng vi khuẩn

Theo tài liệu hướng dẫn thực tập chuyên đề bệnh học thủy sản, 2008

Vi khuẩn được lấy từ tủ -800C, rã đông Sau đó được phục hồi trên môi trường

NA và ủ sau 24 giờ ở 28-390C Quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nếu khuẩn lạc đã rời rạc và đồng nhất thì tiến hành nhuộm gram vi khuẩn để kiểm tra tính thuần Kết quả nhuộm gram đã thuần thì tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ cũng như xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC và ly trích plasmids

3.3.2 Phương pháp kiểm tra kháng sinh đồ

Theo tài liệu hướng dẫn thực tập chuyên đề bệnh học thủy sản, 2008

Sử dụng ống McFarland số 3 (0,3 ml BaCl2 1% + 9,7 ml H2SO4 1%), khi đó mật

độ vi khuẩn tương đương 9x108 CFU/ml (Ống McFarland phải giữ trong bóng tối, nhiệt độ 2−80C và không quá 6 tháng)

Dùng que cấy tiệt trùng nhặt một ít khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 5ml nước muối sinh lý tiệt trùng, lắc trộn đều So sánh độ đục giữa ống nghiệm có chứa vi