Tóm tắt luận án: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam.

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam.

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI

SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) VÀ

SÂM VIỆT NAM (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.)

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội

2 Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

1 Nguyen Thi Hoang Anh, Nguyen Huu Tung, Pham Trung

Hieu, Pham Quang Dương, Le Dang Quang, Vu Dinh Hoang (2020) Bioactive saponins from Panax bipinnatifidus Seem growing in Viet Nam Vietnam Journal

of Science and Technology, 58 (6A), 228-235

2 Phan Van Kiem, Vu Dinh Hoang, Nguyen Thi Hoang Anh,

Dinh Thi Phuong Anh, Dinh Thi Phuong Anh, Do Thi Trang,

Bui Huu Tai (2021) Panabipinoside A and Panabipinoside

B, two new oleananeane triterpenoid saponins from the roots of Panax bipinnatifidus with nitric oxide inhibitory activity Journal of Chemical Research (ISI: Q4), 45, 850-

855

1

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

Từ xa xưa, ông cha ta đã sử dụng các loại thảo mộc để làm thuốc chữa bệnh cứu người Công dụng của các loài thảo dược đó được lưu truyền qua nhiều thế hệ và đến tận ngày nay, người dân vẫn có thói quen

sử dụng cây cỏ phổ biến để điều trị một số bệnh thông thường Do có nguồn gốc từ thực vật tự nhiên, nên các sản phẩm dược liệu có độc tính thấp, phù hợp với quy luật sinh lý của cơ thể

Ở trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các loài thuộc chi Panax được

sử dụng rất phổ biến làm thuốc bổ và là thành phần trong một số bài thuốc truyền thống của dân tộc Sâm vũ diệp có tác dụng giảm stress, tăng cường tính đề kháng, chống ung thư, chống thổ huyết [5,6,7] Sâm Việt Nam dùng làm thuốc để tăng cường sức khỏe, chống ung thư, bảo vệ gan [3,8,9] Tuy nhiên, các đề tài nghiên cứu về với các đối tượng này tại Việt Nam vẫn còn hạn chế

Do đó, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm vũ diệp (Panax

bipinnatifidus Seem.) và Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) ở Việt Nam”

Mục tiêu của luận án:

1 Nghiên cứu thành phần hóa học của củ Sâm vũ diệp (Panax

bipinnatifidus Seem.) và lá Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) thu hái tại Việt Nam

2 Đánh giá một số hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được

để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra sản phẩm chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng và góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh từ các loài này

Nội dung luận án bao gồm:

1 Nghiên cứu phân lập các hợp chất từ củ Sâm vũ diệp (Panax

bipinnatifidus Seem.) và lá Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) ở Việt Nam bằng các phương pháp sắc ký kết hợp

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

2

3 Đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được

Những đóng góp mới của luận án:

Đây là nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

hai loài thực vật là Panax bipinnatifidus Seem và Panax vietnamensis Ha

et Grushv ở Việt Nam Nghiên cứu này đã thu được các kết quả mới như

sau:

 Từ Sâm vũ diệp (P bipinnatifidus): đã phân lập và xác định cấu

trúc của 10 hợp chất saponin (SVD-1 đến SVD-10) bao gồm 08 saponin thuộc khung oleanane (SVD-1 đến SVD-8) và 02 saponin thuộc khung dammarane (SVD-9 và SVD-10) Trong đó:

 02 hợp chất mới: được đặt tên là panabipinoside A (SVD-1) và panabipinoside B (SVD-2)

 04 hợp chất lần đầu được phân lập từ Sâm Vũ Diệp (P

bipinnatifidus): kalopanax-saponins E (SVD-4), spinasaponin A glucoside (SVD-5), 20(S)-ginsenoside Rg3 (SVD-9), chikusetsusaponin VI (SVD-10)

28-O- 04 hợp chất đã biết: ginsenoside Ro (SVD-3), stipuleanoside R1

(SVD-6), stipuleanoside R2 (SVD-7), araloside A (SVD-8)

 Từ Sâm việt nam (P vietnamensis): đã phân lập và xác định cấu

trúc của 05 hợp chất saponin (SVN-1 đến SVN-5), cả 05 hợp chất này đều

là saponin thuộc khung dammarane

 01 hợp chất lần đầu được phân lập từ Sâm Việt Nam (P

vietnamensis) : notoginsenoside E (SVN-1)

 04 hợp chất đã biết: ginsenoside Rd (SVN-2),

pseudoginsenoside-RS1 (SVN-3), ginsenoside Rg1 (SVN-4) và ginsenoside Rb1 (SVN-5)

Về hoạt tính sinh học:

Trong số các hợp chất phân lập được, có một số hợp chất thể hiện

hoạt tính gây độc tế bào, ức chế sản sinh NO và ức chế enzym

α-glucosidase

Bố cục của luận án:

Luận án gồm 147 trang với 43 bảng biểu, 35 hình vẽ, 160 tài liệu

3

tham khảo cập nhật đến năm 2021 Bố cục luận án gồm: mở đầu (02 trang), chương 1 - tổng quan (35 trang), chương 2 - đối tượng và phương pháp nghiên cứu (09 trang), chương 3 - thực nghiệm (07 trang), chương 4 - kết quả và thảo luận (71 trang), kết luận và kiến nghị (02 trang), danh mục các công trình đã công bố của luận án (01 trang), tài liệu tham khảo (20 trang)

NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN

LỜI MỞ ĐẦU

Trình bày ý nghĩa thực tiễn, mục tiêu và nội dung nghiên cứu của luận án

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trình bày về các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt

tính sinh học của 2 loài thực vật Panax bipinnatifidus Seem và Panax vietnamensis Ha et Grushv

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Củ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được thu hái ở Sa Pa,

Lào Cai vào tháng 5/2019 và được giám định tên khoa học bởi nhà khoa học uy tín

Lá Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) được thu hái ở

Kon Tum vào tháng 10/2020 và được giám định tên khoa học bởi khoa học

uy tín

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập chất

Sử dụng các phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký cột (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các chất

Cấu trúc các hợp chất phân lập được xác định dựa vào các thông số vật lý như đo góc quay cực riêng kết hợp với các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt

4

nhân 1D, 2D

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu sinh học

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được thực hiện theo phương pháp

MTT, hoạt tính ức chế sản sinh NO và hoạt tính ức chế enzyme

Hình 3.1 1: Sơ đồ chiết và phân lập các hợp chất sạch từ

Sâm vũ diệp (P bipinnatifidus)

5

3.1.2 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ loài Sâm vũ diệp

Phần này trình bày thông số vật lý và dữ liệu phổ của 10 hợp chất

(1 đến 10) phân lập được, trong đó có 2 hợp chất mới là

SVD-1 và SVD-2

3.2 Phân lập các chất từ loài Sâm việt nam

3.2.1 Quy trình phân lập chất

Các chất được phân lập từ lá Sâm việt nam theo hình 3.1.2

Hình 3.1.2 Sơ đồ chiết và phân lập các hợp chất sạch từ

Sâm việt nam (P vietnamensis)

6

3.3.2 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ Sâm việt nam

Phần này trình bày thông số vật lý và dữ liệu phổ của 05 hợp chất

(SVN-1 đến SVN-5) phân lập được trong đó có 1 hợp chất mới lần đầu

phân lập được từ Sâm việt nam

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Các hợp chất phân lập từ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus)

Từ củ Sâm vũ diệp đã phân lập được 10 hợp chất Trong đó có 2 hợp

chất mới là panabipinoside A (SVD-1) và panabipinoside B (SVD-2) Các hợp chất có cấu trúc như sau:

4.1.1 Hợp chất SVD-1: Panabipinoside A (hợp chất mới)

Hình 4.1.1.1 Cấu trúc của hợp chất SVD-1

Hợp chất SVD-1 thu được dưới dạng bột màu trắng Góc quay cực

riêng là [α]D25 = +12,2 (c = 0,1; MeOH) Phổ khối lượng HR-ESI-MS xuất

7

hiện pic ion giả phân tử tại m/z 941,51031 [M – H]–, tính toán cho công thức C48H77O18là 941,51099 Như vậy hợp chất SVD-1 có công thức phân

tử là C48H78O18 Phổ IR cho thấy sự có mặt của các nhóm hydroxyl (3401

cm− 1), C=O carboxylic (1732 cm− 1) và C-O-C (1028 cm− 1)

942 # 87 RT: 0.39 AV: 1 NL: 3.92E5

T: FTMS - p ESI Full ms [400.0000-1500.0000]

m/z 0

987.78992

968.22235 818.92035

793.16797 712.50507

902.13434 840.90094

Hình 4.1.1.1: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất SVD-1

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C-NMR của SVD-1 mang các

đặc điểm của một saponin có phần aglycone là một triterpene khung oleanane đặc trưng của các saponin chính đã được công bố từ Sâm vũ diệp

(P bipinnatifidus)

Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của 7 nhóm methyl singlet bậc 3,

cộng hưởng trong vùng trường mạnh ở δH 0,88; 0,91; 0,92; 1,00; 1,03; 1,09 và 1,21 ppm, một nhóm oxymethylene ở 3,50 (2H , s, H-28) Proton

olefin tại δ 5,21 (1H, br s, H-12) gợi ý sự có mặt của 1 liên kết đôi trong khung oleanane Tín hiệu proton anomeric ở δ 4,17 (1H, d, J = 8,0 Hz); 4,42 (1H, d, J = 7,5 Hz) và 4,64 (1H, d, J = 8,0 Hz) khẳng định sự có mặt

của ba đơn vị đường Các tín hiệu còn lại của ba đơn vị đường cũng xuất

hiện trong khoảng δH 3,23–3,71

1160.14cm-1

1431.96cm-1 1388.90cm-1 1731.72cm-1

1262.90cm-1

590.68cm-1 640.88cm-1

1459.46

1367.57

1302.70 1235.14 1200.00 891.89

754.05

Hình 4.1.1.2: Phổ IR của hợp chất SVD-1

Phân tích phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC, HMBC cũng như

phổ ESI-MS của SVD-1 gợi ý cho thấy hợp chất này có 48 nguyên tử

carbon, trong đó có 30 nguyên tử carbon thuộc khung oleanane và 18 nguyên tử carbon thuộc ba đơn vị đường Sự có mặt của nối đôi đặc trưng

C-12/C-13 của khung oleanane thể hiện qua tín hiệu tại δ 123,6 (CH) và

145,8 (C) ppm Các nhóm oxymethylene, oxymethine xuất hiện tại tín hiệu

δC 77,8 và 91,1 ppm Ba anomeric carbon được xác định ở δC 105,3; 105,0

và 106,3

Phổ HSQC cho phép xác định các proton tương tác trực tiếp với

carbon như proton H-1′ (δH 4,17), H-2′ (δH 3,20), H-3′ (δH 3,35), H-4′ (δH

3,32), H-5′ (δH 3,32), và H-6′ (δH 3,68/3,78) có tương tác với các nguyên

tử carbon ở δC 105,3; 75,1; 77,8; 71,5; 78,2 và 62,8 tương ứng Ngoài ra, trong phổ COSY cũng quan sát được sự tương tác giữa H-1′, H-2′, H-3′, H-4′, H-5′, H-6′

Tương tác HMBC từ H-1′ (δH 4,17) đến C-28 (δC 77,8) và từ H-28

(δH 3,50) đến C-1′ (δC 105,3) cho phép xác định có liên kết C-O tại C-28

Bên cạnh đó, tương tác HMBC từ H-28 (δH 3,50) đến C-16 (δC 22,7)/C-17

(δC 37,8)/ C-18 (δC 44,2)/C-22 (δC 33,0) khẳng định lại chính xác vị trí của nhóm 28-CH2O

Đơn vị đường glucuronopyranosyl của SVD-1 được gắn vào C-3, vị

trí này được khẳng định dựa trên độ chuyển dịch hóa học của C-3 và tương

tác HMBC từ proton anomeric δH 4,42 (d, J = 7,5 Hz) đến C-3 (δC 91,1)

chuyển hóa học của C-3′′(δC 87,0), độ dịch hóa học của C-3′′ được chuyển dịch sang vùng trường yếu hơn so với trường hợp không có gắn nhóm đường vào cùng vị trí C-3′′ [69]

Khi đo phổ NMR trong CD3OD thì tín hiệu carbon C-6′′ (carbon carboxylic trong glucuronic acid) không xuất hiện, tuy nhiên, sự có mặt của nhóm carboxylic này được khẳng định trên phổ IR (νC = O: 1732 cm-1)

Nhóm methyl bậc 3:

0,88-1,21

10

và điều này được xác nhận một lần nữa bởi dữ liệu phổ HR-ESI-MS và bằng cách so sánh NMR của C-1″, C-2″, C-3″, C-4″, C-5″ giữa hợp chất

SVD-1 và hợp chất SVD-4 và SVD-5 Đường glucuronopyranosyl là một

đường phổ biến được xác định trong saponin triterpene từ thực vật thuộc

họ Araliaceae [17,70,71,72] Căn cứ vào hằng số tương tác của proton anomeric ở δH 4,17; 4,42 và 4,64 (J = 7,5–8,0 Hz) ta có thể khẳng định tất

cả các đơn vị đường trong hợp chất SVD-1 đều ở dạng β

Hình 4.1.1.4: Phổ 13 C-NMR giãn rộng của hợp chất SVD-1

Cấu hình của các đơn vị đường trong hợp chất SVD-1 tương tự với

cấu hình của các đơn vị đường trong các saponin đã được phân lập từ chi

Panax [17,70,71,72,73,74] Và điều này được khẳng định thêm bởi quá

trình thủy phân bằng acid hợp chất SV1 Sự có mặt của glucose và

D-glucuronic acid trong các sản phẩm thủy phân bằng acid của hợp chất

11

So sánh với hợp chất erythrodiol [75] đã được phân lập từ loài

Cylicodiscus gabunensis cho thấy SVD-1 có phần aglycone giống

14

4.1.2 Hợp chất SVD-2: Panabipinoside B (hợp chất mới)

Hình 4.1.2.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC, COSY chính của

hợp chất SVD-2

Hợp chất SVD-2 thu được dưới dạng bột màu trắng Phổ khối lượng

HR-ESI-MS xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 1073,54980 [M – H]–, tính toán cho công thức C53H85O22là 1073,55325 Như vậy hợp chất SVD-

15

của hợp chất 1, gợi ý hợp chất 2 là dẫn xuất của hợp chất

SVD-1 Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của 7 nhóm methyl singlet bậc 3 cộng

hưởng trong vùng trường mạnh tại các giá trị δH 0,87; 0,91; 0,92; 0,99;

1,02; 1,08 và 1,20 (3H, s) Proton olefin tại δ 5,20 (1H, br s, H-12) gợi ý sự

có mặt của 1 liên kết đôi trong khung oleanane

Nhóm 28-CH2-O- oxymethylene và là liên kết đôi C-12/C-13 được

xác định ở δH 3,50 (2H, s)/ δC 77,9; δH 5,20 (br s)/δC 123,6 và δC 145,8 tương ứng

Bốn đơn vị đường được xác định thông qua bốn tín hiệu anomeric tại

Độ dịch chuyển hóa học của C-4′′ (δC 77,8) ở SVD-2 được chuyển

dịch sang vùng trường yếu hơn so với trường hợp gốc đường arabinofuranosyl không gắn vào vị trí C-4′′ của đường glucuronopyranosyl, điều này khẳng định thêm rằng đường

arabinofuranosyl trong SVD-2 được gắn tại vị trí C-4′′ của đường

glucuronopyranosyl [69]

Hằng số tương tác lớn (J = 8,0 Hz) của các proton anomeric H-1′ (δH

4,16), H-1′′ (δH 4,39) và H-1′′′(4,88), chứng tỏ hằng số tương tác diaxial

17

đường điển hình hay xuất hiện trong saponin từ rễ của chi Panax và được

khẳng định một lần nữa bằng cách thủy phân SVD-2 trong môi trường acid

[17,29,42,70,71,72,73,74]

Sự có mặt của D-glucose, D-glucuronic acid và L-arabinose trong

sản phẩm thủy phân acid của hợp chất SVD-2 được xác nhận bằng phân

tích sắc ký lớp mỏng (TLC) và bằng cách so sánh góc quay cực riêng của chúng với góc quay cực riêng của D-glucose, D-glucuronic acid và L-arabinose [66]

Do đó, cấu trúc hóa học của hợp chất SVD-2 được xác định là 3β,

1,70 (m) 1,87 (m)

3 91,1 3,21 (dd, 12,0,

3,21 (dd, 12,0, 4,5)

1,42 (m) 1,90 (m)

1,16 (m) 1,33 (m)

1,51 (m) 1,60 (m)

3,20 (dd, 9,0, 7,5)

1′′ 106,3 4,42 (d, 7,5) 106,4 4,39 (d, 8,0) 2′′ 74,8 3,47 (dd, 9,0,

3,56 (dd, 9,0, 8,0)

4.2 Các hợp chất phân lập từ loài Sâm việt nam (P vietnamensis)

Từ lá Sâm việt nam đã phân lập được 05 hợp chất sạch : notoginsenoside E (SVN-1), ginsenoside Rd (SVN-2), pseudoginsenoside-RS 1 (SVN-3), ginsenoside Rg 1 (SVN-4) và

ginsenoside Rb 1 (SVN-5) Các hợp chất có cấu trúc như sau: