( TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HCM SỐ 6 (1) 2011 )KHOA HOC — KŸ THUÂT XÂY DQG QUY TRÌNH REAL TIME PCR TRÊN 16S rRNA GEN CÚA VI KHUAN LAO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 112 ( 17 )TS Lí• Huy in Ái[.]
Trang 1TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ 6 (1) 2011KHOA HOC — KŸ THUÂT 17 XÂY DQG QUY TRÌNH REAL TIME-PCR
TRÊN 16S rRNA GEN CÚA VI KHUAN LAO
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
112
TS Lí• Huy in Ái ł'liúy • The Trvony Kim Phi«my,•*
Ho Thy Thanh Thiiy•*•
TÓM TÁT
Him nay Into ‹an là möt trong nhGng henh nhiËm khuan thvčng găJ› nhat, nguy ën nhün chú yeu là do nhiÏm vi khuan Mycobucterium iubercufnsis PCR là Ü thuat sinh hoc pliân tæ dævc st dyng làm phirong phóp phćit hien cčic tác nhân nhieiri täc hiét là nhiËm viru.s hay cń‹ › i
khuân khó nuói cay nhv trong hyp cua Mycohacterium tuhercułosis bait J›ht o'ng pháp nài ch‹›
kit quá nhanh, chính xác i à có dó nhay cao Vghić'n cúu nài' âvyc lhi c him nham m șc dích -xây
‹In-rig quy trinh Realtime• PCR en Jyng trình ty gen dírh 16S rRN.4, möt trinh tv duvc únz
‹lung nhicu trong chic li‘nh vyc' phăn loai hoc- i tin tint hoc và chain doán v hr›e L"húnz tôi üã
m phát hien vi khuün law hŸing thuat Realtime PCR dã xác d(nh các thöng st i-/ tính dnc him cua he moi/mau dô lrên Iÿ ihuyêt và thyc nghiem, d nhay cua moi/mÜu Jô trong guy trinh
Realtime PCR phút hi ÿn DNA vi khuân lao âit sÖ læong hùn min toi thić'ii là 10-’ ban suo/ml vù ú‘i the nghieni ąuy trinh Realtime PER phát him vi khuân lao trên 30 min henh phiim ghi rihân
Tù khóa: 7 ó,S rRNA pen, Mycoharterium tuberculosis, Realtime PCR
ABSTRACT
C.urrentlv, tuberculosi,s i.s slill one ‹›ftlie mo,st common infe‹-tiou.s Ji.seasrs, mainly c‹iiiseJ
hv Mycabacterium tubercula,si.s bae'lerium infection PCR IS II łtiolEC Nlar òiri/ogr IEChnią ue
used lo ‹leiect infectious agent.f,e,s cia//J viruse.s or bacteria with slowly culture ‹i› in the ease ofMycobacterium tuberculosis because of its/ustne.s.s, accur‹iiene,s,s anJ high sensiti it
U"e carried out this s tu‹iy in order to ‹develop ‹i p'roto‹ ol hased on Realtime PCR usinç• I 6.$ rRNA gene as a t‹irget sequence which i.s cxtc•n.lively u.ord in taxonomy, molecular c› olul ion and medical diagnostics Web hiiv‹• suc'ceeded in Jesițming ltte primers/pi-ohes on the 165 rRNA gene
to detect Mycobacterium tuberculosis hy Realtime PER, have iJcntifirJ the parameter-s oJ thr
.speci rein' i›ț the primers/prohe, theoretieall i' and cxpcrimentullv the Bens iti ity of the ț›rimers/ț›rohe in the Realtime PCR ț›rotoc’ol reacheJ to 10’ copies/ml, the protocol wa,s also tc.sted on 3 I) samples given good results.
Kev words 7 dS rIŁ4A gen, Mycohacíeriuøt tuberculosis, Realtime Pi R
MÒ DÀU
Bênh lao và vi khuân gây benh lao dã
duoc biet rõ tù mot the ky nay‘ N híîng lieu
pháp chüa tf! băng k háng sinh tò ra hieu quà tü
nhiîng năm 1960 Tuy nhićn, trong nhúng thâp
nićn 90 den nay, dã xuat hien nhieu chùng vi
khuan lao kháng thuoc, rat khó chüã tF! Ua dang
có nguy co lây lan rat nhanh, de doa hàng
triêu nguòi trên the giói [1, 2] Viet Nam
dímg thú
Trang 21 2 trong 22 naóc có so bénh nhân lao cao trên toàn
câu Năm 2007, Viet Nam uóc tính có 1 50 ca nhiem lao
mói/nghìn dân và ty le mac bcnh là 1 92 ca/nghìn
dân Ty lè lao da kháng thuoc trong tòng sô ca nhiêm lao mćri là 2.7%›, và trong tông so ca
dã qua dieu ti 1 là I 9% [2]
Trang 318113 TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ 6 (1) 2011TAP CHÎ KHOA HOC SO 1 (19) - 2011
Hien nay, lao van là mot trong nhùTig benh
nhiêm khuân thuòng gap nhât, ánh hiróng chù
yêu dên phôi vä cíing có thê ành hiròrig dên
he than kinh trung irong, he bąch huyet, he
tuan hoàn, he nieu duc, xtrong và khóp
Nguyên nhàn chù yeu là do nhiem vi
khuan Mycobacierium tuberculosis V“e benh
ly, khoãng 90%• các trirÕng hip nhiem khuan
lao là tiêm an khòng trieu chug Chan doán
benh nhân lao dã dtrqc th¡rc hien bang nhieu
phaong phźp khác nhan nhtr ch;Jp X quang
phoi, làm phàn log tuberculin, xét nghiem dàm
tic tiep tìm tic khuan lao và PCR Trong dó,
PCR là ky thuat sinh hpc phân tù dtrqc s’v dog
làm phirong pháp phát hien các tác nhân gây
nhiêiu d{ac biet là nhiêm virus hay các vi khuan
khó nuôi cay nhtr truòng hqp cúa
.Yfycrihac-ter ium tuher‹ulosis bòi phirøng pháp này
cho ket quà nhanh, chính xác và có do nhąy
cao
Ter nhiiTlg năm 1960, thông tin ve vùng
gen I 6S rRNA Jopc các nhà khoa hoc tim hieu
và còng bo Hien nay, vùng ten 165 rRNA này
là mot trong nhimg vù rig thông tin di truyen
diryc sù dung pho bien nham de dinh danh,
phân loąi và xây ding cây phát sinh loài Các
hiróng nghiên cćru st dqng vùng gen l 6S
rRNA này không chi giói hąn trong các linh
vyc phân loąi hpc, tien hóa hpc mà còn huóng
den các ïìng dung rong rãi trong linh v irc chan
doán y hpc, thùy sàn môi triròng [3, 4, 5 6]
Vùng gen l 6S rRNA có kích thtróc khoàng
1540 bp, mã húa cho phân t(r I 6S rRNA, mot
thành phan quan trong cau thành neø tieu dam
vj nhò cùa ribtisome Bên cąnh các dac diêm
ke trén, gen lćis rRNA vói dac trwg là có
nhieu vùng bào ton ó cap do cho cà nhóm vi
kh uan thtrc (Eubacteria) và xen kë giiia các
vùng bào ton dó là các vùng bien dong nhung
lai mang tính bào ton ò câp dô loài [3 5] Có
the ke ra mot so các công trình htróng drug dung
US rRNA gen trong chan doán y hoc
Radstrom ct al, 1994, l99fi, 2003, 2008;
Xu ei n/, 2003; Le Huyen Ai Thuy ef n/, 2005;
Marcello el o/, 2008; Tzanakaki et al, 2005;
Rothman et a/, 2010; Chiba ei n/, 2009; vvv.
Viec sù dqng vùng gen l fiS rRNA trong phân
loąi và phà he hpc chi Mycobucteria cùng chù
yen @p trung tréø hai vùng trình ty siêu bieø dong A và B, tirøng Whig hai vùns ›! tFí HU-cleotide I 30-210 và 430-500 (các vi trí này duoc tính theo bio gen E cc›//) [7 ß)
Trony thęs te, viec chan doán và dinh &nh
vi kh lao ‹r nuóc ta trong thòi Sian qua chù yen dna vào các vùng /S6II0 Dây là mot trinh chèn
có kích thtróc khoáng duói 2,5 kb có măt trong hau het bô gen các loài vi khuan lao Vi c sir dung
1S6 IU vói so bán sao hien dren trong mot @ gen
là nhieu copy làm trình tv dích làm tãng do nhay cùa klthuat phat hien lên it nhieu Tuy nhiên, meat hąn che là so 1trktig trính tp này dôi khi thap hø fi trinh tu, khó di chuyen"’, và dc mat ó mot so chùng vi khuân lao [9] Do dó, viec xây dçmg mot quy trinh dia trên mot vÎing tririh ty khác nham
sung cho các tnròng hip vùng 156110 bj mat di là
dòi hò1 Up thiet trong chan doán phân ter bênh lao.
trên the giói, có rat nhieu còng trình nghićn cúu st dung các kÿ thu eat sinh hoc phâJi tií nhir Nested-PCR; Realtime-PCR, Multiplex realtime — PCR PCR-Reverse dot blot vvv, nham phat hien nhanh và dinh danh phú’c hop
MJ'c’o6ocfcJ io gây bènh lao ò nguòi dia trén
trìøh to US rRNA gen làm trình ter dích [ń 7,
10, 11 , 12, 13, 14, I S Nhóm nghiên chin
chùng tôi uu tien (pa chon kÿ’ thuat Realtime PCR nhanh khai thác các uu diem cùa ky thuat nàş', cy the là hąi che ngoąi nhiem (do không phài phân tích ket quà bang dies di), do nhą
& do dăc hieu cúa Realtime PCR cúng dê
dàng kiem soát
NGLYÊN LIĘU VÀ PHU'ØNG PHÁP
Ch úng vi hhuan lao Mzcohncierium
tuberc ulosis MTB)
!Wáu binh phÉm
Màu benh pham dàm, dich phet co hçng nghi nhiem vi khuan lao do cong ty throng mąi, d'lCh vu và sán xuat Vlet Á cung cap Chon 19c 30
man benh pham dã dupe xác d!•h nhiem khuan
lao MTB dtroc sù dung cho thù nghiem quy trinh vòa dtipc xây drug trong nghièn cúu này
Trang 419 TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ 6 (1) 2011KHOA H@C — KY THUA? J 14
DNA tit mau dam benh nhân san khi
d ipc xñ IQ bang phosphate bufTer vat irucolytic
sol ution ket hop vñi N -Acety 1-I.-Cystcin sc
duJv ly trich bang pliirr›iig phap sr dung
phc-hot/ci lorofcrm, pho‹1y theo phuonü phép cria
Chomczj nsti & Sacchi (1 3S7): 100 ¡i l hHyÉt
tharih dirqc them vào 900 il frizol plus UNA
sau do dirqc tùa bang Isoprt paiiol vti chat trq
tùa Glyco B tue UNI dirwc giri trong dung dich
TI° l X (Tris-ED’l A) và bào quàn -20"C cho
dcn khi stf dun3
Thiàt he m ‹ri & mm Jii
Càc trình tu’ ci’ia gen 16S rRN A diroc thu
thâp tù ngân hàng gcn N C D l (http: w wu
ncbi iilm.nih.gov) Viec thict ke mli, nhân do
doi hoi tuan thù càc nguyén tac ce ban de dam
bào tinh dac hicu i à toi mn cho r hàn iïn Real
time PCk Các plian mem só di.ing Sao gom
C lustal X L 81 (F.M Bl Châu Âu), Annhyb
4.522, nãiu 2004 (Oli 'ier Frlard, Hoa kev) Phan
mém trtrc tuj du BLA Üd (NC i3I, leoa K/›’)
h t Up:// w w u' ii c h i ul m ii i h go i /IJ L A
ST/’, Phàn mêm Oli o Analyzer 3.Fl ID I, Ho.a
k/v) http: /sc itoo1s idtdna.com/scitools’Apr
lica- t ione ’Oligt Anais xer'' Moi i-à mau d‹\ sir
dung trong nghiéli com này dir‹ic tom tat trong
bang 1 trong dó S 77 là moi xtiôi, TBr là irá i
ngirpc và
Bang !.Cáchem6i; maudó
‹ú dung tru‹tg nghiên ctru
/I'ffr//imePCA
tronL mOi phan (ml rién biCt
Kf?T QUA & THAt3 LL.JN
Hin h 1 : Vj trí bat cap cúa môi và mau dvi trén trin h tu’ gen 165 rRh A cúa x'i khuan lao
Mycobacterium tuberculosis
“
Trang 520 TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ 6 (1) 2011
lt1l S'
115 T7jP CHI KHOA Ht C SÖ 1 (I9J - 20î J
Dõn ğ thcTi chtmg tć›i dã thøc hiên kháo
sát cåc cÎac tính khác cüa moi I'd" mau"dò nhu
cût‹ trt‹c kț r tóc, nhict do núny cha*’ thänh
phá n ’? CiC , v v) kćt qua (dñ lieu không
trình hày) Aeu cho th‹a› hü moi'mau dî› v ùa
thict źe dam hao t‹›t cá thôny so x‘ù› nću
Hình 2: Ket quă khäo sdt do d}ac hieu
cúa hue moi/man dõ
bet quå trên cho this' cúc màu DNA F!
PV, I ìBV x’à 2 coli chat ket q ›á do‹ ng tính vći
tùny cap moi chuyćn hiet dùna de phat hicn
chúng (tin hieu htiynh quang vacrt trćn tin hieu
nen) Vói căp moi phát hiȘn MTB str dung
trčn cúc nyuon USA hán mau khác deu ch‹› kËt
qtia âm tính ttín hieu hrtynh quany thap h‹Tn tin
hieu nen), chi do‹Tng tính khi hc m‹›i/mau dč›
phút hien M’Łß sù dyny trên DNA cùa M"ŁR
Ket quá nàș k1zănÿ dtmh hc mûi/mau Jô cćia I ófi
rRNA been Izì źhuech dai d{ac hieu ch‹› yî"JA
11’l*R
”Fhù n hićm dñ may’ cúa 1zč moí/mau d‹›
Ï 6ù rRî'ł.4 yen cuü › i khuan )a‹ disc thiCt kc bank cfc phan úny Realtime PIER dia trên
dô tu 10' 10' bàn sao'm1
Hìiih 3: Ket quä khäo sät do nh¿ay
10 ban sao/tel khong có tin hieu; ó n/5iig I( DNA 41TI3 10' bàn sao/ml, piá tri C“t la 37.94; tircrnd úng lan I t các giü t*! *› * • ác nong dO
DN A M"FE 10', 10’, l0' và 10' f›ili sao,' ml là ›3.60; 29.95; 26.48 và 22.96 Do do, chù••s tôi
ct ihc kct luJan do nhąy cüa he moi/man dù là
rat t‹it i à guy trình Realtime PC R trćn hc
mJi/mau do này có thć phńt hicn DC A MT’B ‹ï north do 1 0' bin sao 'm1
Thy n Eh m qttt frÌøźi trên min benh yhóm
C’hiJng tô i lien hünh thu’ nglii¢m guy trình trćn DNA diryc tách chiet tù 3t) matt hć,nh pham nhicm lao nhan tù cont ty Vİct Á Set
q tià cho thay › ńi 30 man thù deu cho ket quá
‹turn ¿ tính khi thirc hien phån unp• Realtime
PC R rong dù man bcnh pham so IO cho kćt
qiià dir‹mg tính vri viec rhút hićn lirçng DN A MTB thap nl›ït là l.08F.+03 10.8 x10' bàn sao ml IBànp 2) Ket q uå may cûng hoàn toàri phù harp vńi ket qua tliù do nhąy c ùa quy trình Realtimc PCR ń' trcn
Trang 6TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ 6 (1) 2011KHOA HOC — KY THUÂT
Realtime PCR trên 30 man benh phâm
116
“ i '
› ' e t ' m a n
Kit quã Realti me PCR
K í h i e u m 3 u
Ket qua Real time
PCR
k í h i e u m a n
Ket qua Realti me PCR
1 1.30E +06=
ł,3 xl0‘
1
1 3.54E+03=
3.g4 xl0’
2
12.ó8E*03
— 2.óR xl0'
2 1.30E +08=
1.3 xl0'
1
2 E*083.50
= 3.5 xl0‘
2
29.7SE*03 = 9.75 xl0’
3 1.79E+
09 — 1.79 x10'
1
3 1.56E+09=
1.5ó xl0’
2
3 *046.23E I›.23 xl0’
4 7.t5ELOS -7.15 xł0‘
1
4 1.5lE*09=
1.51 x10’
2
4 *06-3.29E 3.29
x lß"
5 2.69E*
05 2.ó9 x10'
I
S E*089.95
=9.9 5 xl0‘
2
53.29E+04 -3.29 tilt‘
6 I.63E*
07=
1.63 x10’
1
6 2.34E*09=
2.34
xlf)"
2
6 +07 =1.7ßF 1.75 x10"
7 ń.34E
*08=
ó.34 xl0‘
1
7 5.53 E-09=
5.53 xl0’
2
7 +07 =1.52E 1.*2 xt0"
8 2.34E +ß4=
2.34 xl0•
I
R 1.14E*II9
-1 14 x10"
2
89.7łłE 0õ'-9.7 xÌ0‘
9 2.34E
*09 = 2.34 xl0’
1
9 *t)4=I.l3E 1.13 xÌ0’
2
9 4.00E
*0S '4 xl0' 1
0 1.0SE*03 — 1.05 xlf)'
2
0 +03 =4.77E 4.77 xìłł'
3
0 4.łłlJE* 08'
4 xI0
^
Trang 7B\zóc dau, mot so ket quå Realtime PCR drręc tiep tuc thù nghiem trćn so lcrcmg mau này dã dugc kiem chtmg ląi bang
giåi trình ter benh pham Iún hen và so sánh vói các quy san
pham PCR và ket quà cúa cà hai ph‹foj1g trinh khäc dâ chuan
hóa dć ćłúnh ciá tuàn dien pháp cho thay hoàn toàn trùng khóp
và áp dung quy trình vàc th rc te
Benh lao da và dang tiep tyc gây ành 1.WHO/HTM/TB/2008.394 (2008), Pnfi-fuòtr- htróng nghiém trpng
den sùc khóe con ngir’oi, ‹ ulosis ‹frug re.si›lun‹'‹• in fee
'orl‹l, 4“' là mot benh mang tính xã hÿi chù yeu ò các refiorl.
ltte WHØ/Ič!ATLD Glohul Pro¡c‹t on niróc nghèo và dang phát
triên Viec chàn doán Anti-tuherculosis Drug Re s i.st‹ince
.Yurvcil-và phát hien sćrm benh lao cú y
nghîa crrc ky quan tron g trong
v iec phòng chong, dieu tri căn
bênh lây truy en này Vói st
ho try kinh ph í phía nhà triròng
và cùa Công ty Vițt Á nhóm
nghièn cùu ch úng tôi trong
dieu kien cho phép dã thirc
hien nghiên cúu này và thu
lance, Geneva, World Health
Orgaii ization
2.WHO/H’FM/TB/2009.411 (2009
I Glohal
Financing, WHO report
2009, Geneva, World Health Organization.
dcręc nhîing ket quà nh‹ï sau: (I) Oã thiet ke 3 Le Huyen Ai
Thuy, Duony Jïuong Giany, J'hai
thanh côrrg he moi/mâu dù trên 165 rRNA gen Kc Quan, Ho
Huynh Thuy Duong (200*), nham phát hien vi khuan lao bang
ky thuat Re- Ribos‹›mal RNA yencs an‹J o/›/y/i‹’ufr‹7r/ in aJtime
PCR (2) Oã xác dinh các thông so vê ruf›id diagnr›.sis ‹›Ț
has ferial in/ccfl‹7n'.y tính dăc hiéu cùa he moi/mau dò trûn ly
th\iyet ‹Ii'.sea.‹es, Proceeding of g" A-IMBN (Asia- và th c
nghiem, dô nhą}‘ cùa moi/mau dò Pacific International molecular
biol network)
trong quy trình Rea ltime PCR
phát hien DNA vi khuân lao
dat so lirong bàn mau toi thlêu
là 10' bdn sao/m1; (3) Dã th ù
nghiem quy trình Realtime
PCR phàt hien vi khijân lao
trên 30
4.Gregory M.C, Michael R,
Susanne G, e/ al (2009)
Phy.Biology r›J' Wy 'r›hu‹-tcri,
Advances in microbial physiology, SS: 52 -1 82
mau benh phâm và ghi nhan ket quá tot, mau 5 Jill E Clarridge III
(2Œt4}/ymfO{/ćiS’rfi\-'d Get' bgnh phâm vói lirong DNA bàn mau
thap nhat JmrxeM is /drJ/ir’rzfíon ofBuckmin on phát
hien diiqc có nong do DNA là 10.8x10' C'łini«2 wi‹mbiokify'
‹ml Infec ti‹ns Diseases, bàn sao/ml Quy trình via hình thành nên
Clinical Microbiolo Reviews 17(4):ß4(ł—562
Trang 822117 TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ 6 (1) 2011TAP CHÏ KHOA H@C SÖ ] (J9) - 201 I
6 Soumitesh C, Danica H, Michele B, ct n/ 12.Richardson E.T, Samson D i3anaei N
(20G7), A detailed analysis of 165 ribosomal (2009), RapidIdeHtyication o[ cobacferiym
RNA gene segments for the diagnosi,s of lvherculosi.s and Nontuhurcuhwi .tfycr›f›«/‹•-pathogenic bacteria, I Microbiol Methods, ria by Multiplex, Real-Time PCR, Journal
69(2): 330—339 of Clinical M icrobiology, 47(5): 1497—1502
7.Bo”ttger E C (1996), Approaches for iden- 13.Patel, I, B, Leonard D G, Pan X ct al.
ti]i‹ation of fmicroorganisms Despite longer 2000), Sequent e-ba 'eJ ideofiJicofion of’
experience with fatty acid profile DNA- MycohaCferium sj›ecies fisifig the HicroSeq hased analysis offers several advantages, 50U 165 rDNA hacterial ideritiJi“cation,system,
ASM News, 62: 247—250 J Clin Microbiol, 38: 24f›—251
8.Enrico Tortoli (2003), Impu‹’t of Gene ie 14.Richard C l4, Luiz C O, Ray B R' rr ‹i/.
Studies on Mycobucterial Tax‹›nomy the (2o03), PCR-BaseJ tlethuJ To Di i•i‘entiate New fy!cohacteria oJ’ the I990s, C.i inical il!z sub.›pecies oJtH• ycobacterium tubercul‹›sis
Microbiology Reviews, 319—354 Complex on the Basis of Genomic Deletions.
9.Barun M, Natalia E K, Pablo J B, Barry N Journal of Clinical Microbiology, 41(4):
K (2006), Molecular EpidemiolO of l 637-1650
Tubercvlo.i i,s: Current In.rights, Cl inical
Microbiology Reviews, 19(4): 658—685 15.Soo, P C, Horng Y, T, Hsueh P R, et al
10.Blanca I R, Diana 1 Ct, Gregory L S, t•i p (2006) Direct and siinultaneou.
identification (2006), Selective enrichment and detection • f !
i›J‘ mycobactericil DNA in paucibacillary (kITBC) and Mycobacterium tuhei culo› is specimen,i, 1 Microbiol Methods, 67(2): ( B) hy rayid mtiltiplrx nested PCR-ICT 220—
11.Cloud, J L., Neal H, Rosenberry R, ef al.
(2002), IJentiJicutiori ol“ Mycobacterium
spp by using u commercial 165 rih‹›somal
D.V"A sequencing kit and additional
sequenc-ing libraries, I.Clin Microbiol, 4G:400—406.