Dịch chiết nang trứng chín thúc đẩy quá trình chín sinh lý và phát triển phôi heo trinh sản

Bài viết Dịch chiết nang trứng chín thúc đẩy quá trình chín sinh lý và phát triển phôi heo trinh sản nghiên cứu sự ảnh hưởng của dịch chiết nang trứng lên khả năng chín sinh lý và phát triển của phôi heo trinh sản. Mời các bạn cùng tham khảo!

DỊCH CHIẾT NANG TRỨNG CHÍN THÚC ĐẨY QUÁ TRÌNH CHÍN

SINH LÝ VÀ PHÁT TRIỂN PHÔI HEO TRINH SẢN

Nguyễn Bá Tư 1

1 Viện Phát triển Ứng dụng Email: tunb@tdmu.edu.vn

TÓM TẮT

Dịch chiết nang trứng chín có ảnh hưởng quan trọng đến sự phát triển của trứng heo in vitro, khả năng kích hoạt trứng và phát triển phôi heo trinh sản Các kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 42 giờ nuôi cấy tỷ lệ trứng heo chín có sự khác biệt ý nghĩa trong tỷ lệ trứng chín giữa môi trường bổ sung dịch chiết nang trứng heo chín và dịch chiết nang trứng heo có kích thước 4-6 mm (lần lượt là 87% và 62%) Ngoài ra, dịch chiết nang trứng chín đã giúp nâng cao tỷ lệ trứng chín rất tốt từ 30% (nang kích thước 4-6 mm) lên 53% (nang trứng chín), đồng thời kết quả đã giảm đáng kể tỷ lệ trứng xấu từ 24% (nang kích thước 4-6 mm) xuống 10% (nang trứng chín) Tỷ lệ trứng kích hoạt thành công cũng như phát triển phôi heo trinh sản đến giai đoạn phôi nang (blastocyst) đã làm rõ vai trò của dịch chiết nang trứng chín đến chất lượng của phôi heo trinh sản Trong đó, dịch chiết nang trứng chín đã giúp nâng cao tỷ lệ phôi nang từ 37% (nang kích thước 4-6 mm) lên 71% (nang trứng chín) Kết quả này góp phần hoàn thiện quy trình nuôi chín trứng heo in vitro

Từ khóa: Dịch chiết nang trứng heo; môi trường in vitro; nang trứng chín; phôi heo trinh sản

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Dịch chiết nang trứng đã được chứng minh có các thành phần dinh dưỡng đặc biệt bao gồm đầy đủ các yếu tố sinh trưởng, phát triển, vi khoáng, vitamin, hormone , vv, cung cấp cho trứng phát triển theo từng giai đoạn từ GV đến giai đoạn chín sinh lý (Park và nnk., 2021) Hiện

nay, trong quy trình nuôi trứng heo in vitro, việc bổ sung dịch chiết nang trứng heo đã trở nên

thường quy và hầu hết các quy trình đều thống nhất lấy dịch chiết nang trứng có kích thước 4-6mm để bổ sung với hàm lượng 10% vào môi trường TCM199 đã giúp cải thiện chất lượng

trứng chín in vitro và phát triển phôi (Pawlak và nnk., 2018) Tuy nhiên, khi nang trứng đạt

kích thước 4-6mm thì trứng bên trong mới gần đạt kích thước tối đa, và thường sẽ phát triển rất chậm ở giai đoạn này về kích thước mà chủ yếu phát triển về sinh lý giúp đến giai đoạn chuyển

từ giảm phân 1 sang giảm phân 2 Việc ức chế tạm thời quá trình phân chia nhân được đảm nhiệm bởi hàm lượng cAMP vốn được tiết ra từ lớp tế bào Granulosa cells Chính vì vậy, trong

nuôi cấy in vitro, nếu dùng dịch chiết nang trứng giai đoạn này sẽ có một phần hiện hữu hàm

lượng cAMP sẽ cản trở quá trình chín sinh lý của trứng hoặc ít nhất sẽ kéo dài thời gian chín của trứng hơn 38 giờ thậm chí hơn 42 giờ nuôi cấy (Pawlak và nnk., 2018) Thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì chất lượng trứng càng bị ảnh hưởng, quá trình già hóa càng nhanh, chất lượng trứng chín càng kém (Pawlak và nnk., 2018) Thực tế cho thấy tỷ lệ trứng chín in vitro so với chín in vivo chỉ đạt 60-70%, đặc biệt là tỷ lệ phát triển phôi thường chỉ đạt 35-40% đến giai

đoạn phôi nang (blastocyst), điều này được giải thích bắt nguồn chủ yếu từ quá trình nuôi trứng

heo in vitro còn rất xa so với quá trình chín sinh lý bên trong nang trứng heo Chính vì vậy, việc

thiết lập quy trình nuôi trứng heo in vitro sao cho có thành phần môi trường gần giống nhất với môi trường in vivo sẽ đóng vai trò quyết định đến chín sinh lý của trứng heo, ảnh hưởng trực tiếp đến phát triển phôi heo sau khi kích hoạt Dựa trên sự khác biệt cơ bản về hàm lượng cAMP giữa dịch chiết nang trứng có kích thước 4-6 mm và nang trứng chín, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của dịch chiết nang trứng lên khả năng chín sinh lý và phát triển của phôi heo trinh sản

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

Hóa chất, môi trường sử dụng trong nghiên cứu này được cung cấp từ hãng Sigma-Aldrich (St Louis, MO)

Buồng trứng heo được lấy từ lò mổ Tân Bình, Phường Tân Bình, Thị xã Dĩ An, tỉnh Bình Dương

2.2 Phương pháp

Nuôi trứng chín

Buồng trứng heo được thu từ lò mổ tại địa phương, được bảo quản trong dung dịch PBS-PVA trong quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm tái biệt hoá tế bào, Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Phức hợp tế bào hạt và trứng được thu nhận bằng phương pháp cắt các nang trứng có kích thước 4-6 mm Trứng được lựa chọn có đủ lớp tế bào hạt (cumulus) và kích thước như nhau trong tất cả các lô thí nghiệm và đối chứng

Sử dụng môi trường TCM 199 (Sigma Chemical Co., USA) bổ sung 10% dịch chiết nang trứng, 10 IU/ml hCG (Human chorionic gonadotropin) để nuôi trứng Chuyển 20-30 trứng (tuỳ thí nghiệm) vào nuôi trong vi giọt lớn (floating drop) 500 µl/ giọt trong đĩa 60 mm phủ dầu ở điều kiện 5% CO2 tại 38,5oC Sau 38- 42 giờ nuôi cấy, trứng chín được loại bỏ tế bào hạt bởi enzyme hyaluronidase qua mouth pipete, và ủ trở lại trong vòng 1 giờ để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo (Lai và nnk., 2002)

Dịch chiết nang trứng được thu từ hai loại nang: 1/ Nang có kích thước 4-6 mm; 2/ nang trứng đã chín

Trứng nuôi trong môi trường TCM-199 và đánh giá sự ảnh hưởng của dịch chiết nang trứng đến sự chín của trứng heo bao gồm: (1) thời gian, độ dãn nở của các lớp tế bào hạt (cumulus cell layers), và (2) sự xuất hiện thể cực thứ nhất

Kích hoạt trứng trinh sản

Trứng sau khi ủ 2 giờ được kích hoạt bằng hệ thống điện trong môi trường mannitol (0,3

mM mannitol, 0,1 mM MgSO4, 0,05 mM CaCl2 and 0,01% (w/v) PVA (Zimmermann & Vienken, 1982) Khoảng 20 trứng được đặt trong đĩa kích hoạt với chương trình đã thiết lập (100 V/cm (N = 2), 100 µs nhờ hệ thống dung hợp tế bào LF201 (Cell fusion – Nuclear transplantation generator LF201), trứng sau khi kích hoạt được chuyển vào môi trường nuôi phôi (IVD, NCSU-23), theo dõi quá trình phân cắt phôi trong 7 ngày đầu tiên

3 KẾT QUẢ

3.1 .Dịch chiết nang trứng có ảnh hưởng trực tiếp, quan trọng đến sự chín của trứng heo in vitro

Bảng 1: Ảnh hưởng của dịch chiết nang trứng sự chín hình thái của trứng heo in vitro

a,b, Sự khác biệt với mức ý nghĩa: p <0.05

Hình 1 Trứng heo sau 42 giờ nuôi cấy (A bổ sung dịch chiết nang trứng 4-6mm; B bổ sung

dịch chiết nang trứng heo chín)

Bảng 2: Ảnh hưởng của các loại dịch chiết nang trứng đến chất lượng trứng heo chín in vitro

Phương pháp Số trứng nuôi

Dịch nang

trứng 4-6

(± 5.20) a

22.34 (± 6.62)

22.53 (± 0.95) c

24.91 (±8.32) Dịch nang

trứng chín

(± 7.89) b

26.86 (± 6.68)

10.07 (± 1.01) d

10.07 (± 1.01)

a,b,c, Sự khác biệt với mức ý nghĩa,: p <0.05, c,d: p < 0.001

Hình 2 Hình thái trứng heo chín in vitro

(A trứng rất tốt; B trứng tốt; C Trứng trung bình; D trứng kém)

Kết quả nuôi cấy trứng heo in vitro trong bảng 1 và hình 1 cho thấy có sự khác biệt đáng

kể giữa việc bổ sung hai loại dịch chiết nang trứng có kích thước khác nhau vào môi trường nuôi cấy trứng (TCM-199) Trong đó, dịch chiết nang trứng chín giúp trứng heo đạt đến độ trưởng thành về hình thái (bao gồm độ dãn nở của các lớp tế bào hạt- cumulus cell layers) và

sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (1st pB) là cao hơn (87%) so với trứng heo chín hình thái trong môi trường TCM-199 bổ sung dịch chiết nang trứng kích thước 4-6mm (62%) Tiếp tục so sánh sâu hơn về chất lượng trứng heo chín, các kết quả từ bảng 2 và hình 2 chỉ ra sự khác biệt đáng

kể giữa 2 nghiêm thức, đặc biệt, dịch chiết nang trứng chín giúp thu được tỷ lệ trứng heo chín rất tốt (53%) và trứng tốt (26%) cao hơn đáng kể so với trứng nuôi trong dịch chiết 4-6mm (lần lượt là 30% và 22 %, p<0.05) Đặc biệt, dịch chiết nang trứng chín giúp giảm đáng kể tỷ lệ trứng chất lượng trung bình và trứng kém (10% và 10%) so với đối trứng (22% và 24%)

3.2 Dịch chiết nang trứng heo chín giúp gia tăng khả năng tự kích hoạt trứng heo trinh sản

Bảng 3 Ảnh hưởng của dịch chiết nang trứng heo đến sự kích hoạt trinh sản

a,b Sự khác biệt với mức ý nghĩa: p <0.05

Kích hoạt thành công là điều kiện tiên quyết cho sự phát

triển phôi và hậu phôi, các trứng rất tốt được đem kích hoạt và

theo dõi sự hình thành tiền nhân cái (female pro-nuclear, FPN)

Các kết quả ở bảng 3 và hình 3 cho thấy sự khác biết ở mức

thống kê, trong đó, dịch chiết nang trứng chín giúp nâng cao

hiệu quả kích hoạt trứng heo trinh sản (91%) so với dịch chiết

nang trứng 4-6 mm (71%), điều này như một bằng chứng rất rõ

ràng là dịch chiết nang trứng heo chín đã góp phần quan trọng

nâng cao chất lượng trứng heo chín in vitro

Hình 3 Sự hình thành tiền nhân

cái (female pro-nuclear-FPN)

3.3 Dịch chiết nang trứng heo chín ảnh hưởng đến sự phát triển và hình thành phôi nang in vitro

Bảng 4 Ảnh hưởng của dịch chiết nang trứng đên sự phát triển của phôi heo trinh sản in vitro

(%) Phôi phát triển Phương pháp

Số trứng nuôi cấy

(%) phôi 2

TB

(%) phôi 4

(%) Phôi dâu (morula)

(%) hôi nang (blastocyst)

Dịch nang

trứng 4-6

(± 9.84)

74.96 (±11.73)

50.23 (± 19.06) a

41.33

37.63 (±7.26) e

Dịch nang

trứng chín

(± 4.50)

87.06 (± 8.86)

73.99 (±5.49) b

73.99 (± 5.49) d

71.76 (± 2.21) f

a,b,c,d,e,f Sự khác biệt với mức ý nghĩa:: a,b,c,d,e,f: p <0.05

Trứng heo sau khi được kích hoạt được tiếp

tục chuyển qua môi trường nuôi phôi NCSU-23,

sự phân cắt phôi được theo dõi sau 24hrs, 48hrs,

72hrs, 96hrs, 120hrs, và 142hrs nuôi cấy, các số

liệu được ghi nhận trong bảng 4 cho thấy sự khác

biệt đáng kể về tỷ lệ và tốc độ phân cắt phôi giữa

2 nghiệm thức Trong đó, sự khác biệt lớn nhất bắt

đầu xảy ra ở giai đoạn phôi 8 tế bào (73% đối với

nghiệm thức dịch nang trứng chín, và 50% đối với

dịch chiết nang trứng 4-6 mm), tiếp tục quan sát

sau 120 giờ và 142 giờ nuôi cấy chúng tôi ghi nhận

sự khác biệt rất đáng kể trong sự hình thành phôi

dâu (73% và 41%) và phôi nang (71% và 37%)

Hình 4 Các giai đoạn phát triển của phôi

heo trinh sản in vitro

Trứng heo sau khi được kích hoạt được tiếp tục chuyển qua môi trường nuôi phôi

NCSU-23, sự phân cắt phôi được theo dõi sau 24hrs, 48hrs, 72hrs, 96hrs, 120hrs, và 142hrs nuôi cấy, các số liệu được ghi nhận trong bảng 4 cho thấy sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ và tốc độ phân cắt phôi giữa 2 nghiệm thức Trong đó, sự khác biệt lớn nhất bắt đầu xảy ra ở giai đoạn phôi 8

tế bào (73% đối với nghiệm thức dịch nang trứng chín, và 50% đối với dịch chiết nang trứng 4-6 mm), tiếp tục quan sát sau 120 giờ và 142 giờ nuôi cấy chúng tôi ghi nhận sự khác biệt rất đáng kể trong sự hình thành phôi dâu (73% và 41%) và phôi nang (71% và 37%)

4 THẢO LUẬN

Dịch chiết nang trứng heo được bổ sung vào môi trường nuôi trứng heo in vitro hiện nay đã

trở thành quy trình phổ biến tại hầu hết các phòng thí nghiệm cả Việt nam và trên thế giới Nhiều công trình đã chứng minh dịch chiết nang trứng heo có ảnh hưởng rõ nét đến chất lượng trứng chín

in vitro (Kim và nnk., 1996; Da Broi và nnk., 2018) Điều này đã được giải thích khi phân tích các

yếu tố tự nhiên bên trong dịch chiết nang trứng mà môi trường nhân tạo chưa thể thiết lập được như quy trình tự nhiên, bao gồm các yếu tố phát triển như hormones; growth factors of the Transforming Growth Factor-beta (TGF-beta); interleukins; Reactive Oxygen Species (ROS); Glutathion (GSH); yếu tố chống lại sự chết theo chương trình (anti-apoptotic factors); các proteins, peptides và amino-acids; đường; prostanoids(Revelli và nnk., 2009) Điều này đã giúp giải thích lý do việc bổ sung

dịch chiết nang trứng là đặc biệt cần thiết trong quá trình thiết lập quy trình nuôi trứng heo in vitro

Tuy nhiên, một đặc điểm rất quan trọng là các giai đoạn phát triển của nang trứng khác nhau lại có các thành phần hóa học rất khác nhau và nó ảnh hưởng trực tiếp đến phát triển phôi

và thai đã được chứng minh ở Lạc đà (El-Shahat và nnk., 2018); Heo (Ducolomb và nnk., 2013) Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 2 loại dịch chiết thu từ nang trứng heo có kích thước khác nhau, bao gồm dịch chiết nang trứng kích thước 4-6 mm và dịch chiết nang trứng chín sinh

lý Các kết quả từ các bảng 1 và 2 cho thấy dịch chiết nang trứng chín có ảnh hưởng rất rõ nét đên sự phát triển của trứng (độ dãn nở của lớp tế bào cumulus cell, sự hình thành thể cực thứ nhất, chất lượng trứng chín) Thực tế hiện nay, rất ít các phòng thí nghiệm chú ý đến kích thước của nang trứng có ảnh hưởng hay không đến chất lượng trứng chín, mà hấu hết đều chỉ thu dịch chiết nang trứng 4-6 mm và mặc định sẽ bổ sung 10% vào môi trường TCM-199 (Azari-Dolatabad và

nnk., 2021) Tuy nhiên, vấn đề ở chỗ, đối với trứng heo ở giai đoạn khi nang trứng có kích thước 4-6 mm thường là ở giai đoạn GV-3,4 và ở giai đoạn này trong dịch chiết nang trứng sẽ có một lượng chất cAMP đóng vai trò ức chế sự phân chia nhân giúp trứng bên trong nang trứng sẽ có

đủ thời gian phát triển chất lượng cho tế bào chất góp phần quan trọng trong sự chín sinh lý của trứng (Suzuki và nnk.,1986) Chính vì vậy, một giả thuyết đặt ra là nếu lượng cAMP vẫn tồn tại bên trong dịch chiết nang trứng thì khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy liên tục 42 hrs thì sẽ ảnh hưởng không tốt đến sự chuyển tiếp giai đoạn từ giảm phân I sang giảm phân II Chỉ khi cAMP

bị ức chế thì trứng mới có thể chuyển tiếp từ giai đoạn giảm phân I sang giảm phân II và chín tại

kỳ giữa giảm phân II Điều này tạo ra mối liên hệ giữa dịch chiết nang trứng chín với hàm lượng cAMP, chúng tôi muốn chứng minh điều này, và, các kết quả nghiên cứu đã giúp làm sáng tỏ ý tưởng trên Rõ ràng, dịch chiết nang trứng chín giúp thúc đẩy bao gồm cả quá trình chín trứng heo in vitro, khả năng tự kích hoạt, sự phát triển phôi heo đến giai đoạn phôi nang Các kết quả

từ nghiên cứu này đã góp phần quan trọng cho việc thiết lập quy trình nuôi cấy trứng heo in vitro

Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ bởi Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo đề tài

mã số ĐL.CN-49/16, và Đại học Quốc gia TP HCM (VNU-HCM) theo đề tài mã số B2016-28-01

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Azari-Dolatabad, N., et al (2021) Follicular fluid during individual oocyte maturation enhances cumulus expansion and improves embryo development and quality in a dose-specific manner

Theriogenology, 166, 38-45 https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2021.02.016

2 Da Broi, M., et al (2018) Influence of follicular fluid and cumulus cells on oocyte quality: clinical implications Journal of assisted reproduction and genetics 35(5): 735-751 https://doi.org/10.1007/s10815-018-1143-3

3 Ducolomb, Y., et al (2013) Effect of porcine follicular fluid proteins and peptides on oocyte

maturation and their subsequent effect on in vitro fertilization Theriogenology 79(6): 896-904

https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2013.01.024

4 El-Shahat, K., et al (2018) Follicular fluid composition in relation to follicular size in pregnant and

non-pregnant dromedary camels (Camelus dromedaries) Animal Reproduction (AR) 10(1): 16-23

https://pesquisa.bvsalud.org/portal/resource/pt/vti-8203

5 Kim, K., et al (1996) The effects of follicular fluid on in vitro maturation, oocyte fertilization and

the development of bovine embryos Theriogenology 45(4): 787-799

https://doi.org/10.1016/0093-691x(96)00008-8

6 Lai, L., et al (2002) Production of α-1, 3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer

cloning Science 295(5557): 1089-1092 https://doi.org/10.1126/science.1068228

7 Park, J.-E., et al (2021) Porcine follicular fluid derived from> 8 mm sized follicles improves oocyte

maturation and embryo development during in vitro maturation of pigs Zygote 29(1): 27-32

https://doi.org/10.1017/S0967199420000398

8 Pawlak, P., et al (2018) The consequences of porcine IVM medium supplementation with follicular

fluid become reflected in embryo quality, yield and gene expression patterns Scientific reports 8(1):

1-12 https://doi.org/10.1038/s41598-018-33550-4

9 Revelli, A., et al (2009) Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to

metabolomics Reproductive biology and endocrinology 7(1): 1-13 https://doi.org/10.1186/1477-7827-7-40

10 Suzuki, S., et al (1986) Cooperative inhibitory effect of follicular fluid and cAMP on hamster

oocyte maturation Experientia 42(7): 795-798 https://doi.org/10.1007/BF01941527