So sánh tác động môi trường nuôi dưỡng và nồng độ oxy khác nhau tới tình trạng bất thường nhiễm sắc thể của phôi

Bài viết So sánh tác động môi trường nuôi dưỡng và nồng độ oxy khác nhau tới tình trạng bất thường nhiễm sắc thể của phôi trình bày đánh giá sự bất thường nhiễm sắc thể của phôi khi nuôi cấy ở nồng độ oxy và môi trường nuôi cấy khác nhau (môi trường đơn bước/ đa bước và nồng độ oxy 20%/5%).

SO SÁNH TÁC ĐỘNG MÔI TRƯỜNG NUÔI DƯỠNG VÀ NỒNG ĐỘ OXY

KHÁC NHAU TỚI TÌNH TRẠNG BẤT THƯỜNG

NHIỄM SẮC THỂ CỦA PHÔI

Nguyễn Linh Chi 1,2 , Ngô Thị Tường Châu 2 , Nguyễn Đình Tảo 1 , Nguyễn Ngọc Diệp 3

TÓM TẮT 29

Mục tiêu: Đánh giá sự bất thường nhiễm sắc

thể của phôi khi nuôi cấy ở nồng độ oxy và môi

trường nuôi cấy khác nhau (môi trường đơn

bước/ đa bước và nồng độ oxy 20%/5%)

Phương pháp: Đánh giá phân tích dựa trên

257 chu kỳ IVF/ICSI từ tháng 10/2019 đến tháng

2/2021, sử dụng 2 loại tủ nuôi cấy: tủ nuôi cấy 3

khí K-system G-210 (Úc) (5% O2, 5%CO2,

90%N2) và tủ nuôi cấy 2 khí Thermo Scientific

371 (Đan Mạch) (5%CO2, 75%N2, nồng độ Oxy

theo khí quyển) Noãn trưởng thành (MI và MII)

được nuôi cấy trong môi trường đa bước

G1-PLUS TM (Vitrolife) hoặc môi trường đơn bước

Lifeglobal Lựa chọn bệnh nhân <37 tuổi,

AMH>1,2 ng/ml, AFC≥4 Kết quả sàng lọc

PGT-A phôi ngày 5 cho thấy, tỷ lệ phôi bất

thường cao nhất ở nhóm nuôi cấy phôi bằng

nồng độ oxy cao 20% với môi trường đa bước, ở

mức 46.02±5.31%, thấp nhất ở nhóm oxy thấp

5%, đơn bước ở mức 30.74±3.50%

cùng môi trường đa bước, sự khác biệt về số

1

Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông

2 Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia

Hà Nội

3

Học viện Quân Y

Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Linh Chi

Email: linhchi148@gmail.com

Ngày nhận bài: 25/7/2022

Ngày phản biện khoa học: 10/08/2022

Ngày duyệt bài: 29/08/2022

lượng phôi bất thường/chu kỳ cho kết quả có ý

thể, ở nhóm 5% là 1.60±0.22 phôi/chu kỳ trong khi ở nhóm oxy 20% là 2.08±0.28 phôi/chu kỳ

Kết luận: Nuôi cấy phôi trong môi trường

nồng độ oxy thấp giúp phôi phát triển ít bất thường nhiễm sắc thể hơn so với khi nuôi cấy ở nồng độ khí quyển

Từ khóa: IVF, môi trường nuôi cấy, nồng độ,

bất thường nhiễm sắc thể

SUMMARY COMPARISON THE IMPACTS OF CULTURE MEDIA AND DIFFERENT OXYGEN CONCENTRATION TO CHROMOSOMAL A BNORMALITIES

OF EMBRYOS

Objective: Evaluating the chromosomal

abnormalities of embryos when cultured at different oxygen concentrations and culture medium (single step/multistep medium, oxygen concentration 20%/5%)

Methods: analytical evaluation based on 257

cycles of IVF/ICSI from October 2019 to February 2021, using 2 types of incubator: K-system G-210 3-gas incubator (Australia) (5)

%O2, 5%CO2, 90%N2) and Thermo Scientific

371 (Denmark) 2-gas incubator (5%CO2, 75%N2 and using atmospheric Oxygen concentration) Mature oocytes (MI and MII) were cultured in G1-PLUSTM multistep medium (Vitrolife) or Lifeglobal single step medium Select patients

<37 years old, AMH>1.2 ng/ml, AFC≥4 The

results of embryo PGT-A screening on day 5

showed that the percentage of abnormal embryos

was highest in the group of embryo culture with

high oxygen concentration 20% with multistep

medium, at 46.02±5.31%, the lowest in low

oxygen group 5 %, single step at 30.74±3.50%

) When cultured in the same multistep medium, the difference in

number of abnormal embryos/cycle was

statistically significant with

Specifically, in the 5%

group it was 1.60±0.22 embryos/cycle while in

the 20% oxygen group it was 2.08±0.28

embryos/cycle

Conclusion: Embryo culture in a low-oxygen

environment helped embryos develop fewer

chromosomal abnormalities than when cultured

at atmospheric concentrations

concentration, chromosomal abnormalities

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, kỹ thuật hỗ trợ sinh sản IVF

đang ngày càng được phát triển và hoàn

chỉnh hơn, giúp mang lại thành công lớn cho

các cặp vợ chồng mong con hiếm muộn Bên

cạnh các nghiên cứu kiểm tra hình thái phôi,

các nhà khoa học còn đang tiến hành các xét

nghiệm sinh thiết sàng lọc phôi PGT-A để

đánh giá chất lượng phôi một cách toàn diện

nhất Kết quả sàng lọc phôi PGT-A cho phép

bệnh nhân xác định và lựa chọn được phôi

tốt nhất, có tiềm năng phát triển nhất để

chuyển vào cơ thể mẹ, giúp cải thiện kết quả

thụ tinh ống nghiệm trên mỗi lần chuyển

phôi

Tuy nhiên, để chẩn đoán di truyền trước

làm tổ một cách hiệu quả, cần sinh thiết phôi

ở giai đoạn phôi nang để lấy được mẩu tế

bào đặc trưng nhất, mà không gây ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi sau này Theo đó, môi trường nuôi cấy phôi và nồng độ oxy sẽ

là hai trong những nhân tố ảnh hưởng chính đến sự phát triển của phôi trong các giai đoạn, quyết định sự hình thành và chất lượng phôi nang Thời điểm hiện tại, có hai loại môi trường thương mại đang được sử dụng rộng rãi trong các trung tâm hỗ trợ sinh sản trên thế giới: Môi trường nuôi cấy đơn bước

và môi trường nuôi cấy đa bước Bên cạnh

đó, nồng độ oxy cũng là một vấn đề đang được tranh cãi giữa 5% O2 và 20% O2 trong phòng labo Từ những ngày đầu IVF, các phòng labo luôn sử dụng nồng độ oxy là 20%, tuy nhiên các chuyên gia nghiên cứu thấy rằng nồng độ oxy thực tế trong tử cung

mẹ và động vật có vú chỉ giao động trong khoảng 2-8% [1]

Trước đây người ta cho rằng phôi bất thường là do di truyền của bố mẹ, tuổi mẹ, ti thể nhưng một số nghiên cứu gần đây cho thấy môi trường nuôi cấy và nồng độ oxy có thể ảnh hưởng đến kết quả PGT-A, nhưng chưa đưa ra được khẳng định thống nhất Mặc dù có nhiều nghiên cứu về vấn đề này, nhưng vẫn chưa đủ bằng chứng để đưa một kết luận cụ thể về mối quan hệ giữa môi trường nuôi cấy và kết quả sàng lọc PGT-A [2] [3]

Thực chất, mỗi phòng Labo Hỗ trợ sinh sản đều có một hệ thống nuôi cấy riêng, điều trị nhóm bệnh nhân đặc thù khác nhau, nên

có thể dẫn đến kết quả nghiên cứu khác nhau giữa các trung tâm hỗ trợ sinh sản Để đóng góp thêm vào kết luận, chúng tôi làm nghiên cứu so sánh kết quả sàng lọc phôi PGT-A (phôi ngày 5) khi nuôi cấy trong môi trường đơn bước (Global total)/môi trường đa bước (G1-PlusTM /G2-PlusTM) và trong nồng độ oxy khí quyển/nồng độ oxy thấp

II THỰC NGHIỆM

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng

10/2019 đến tháng 2/2021, dựa trên các chu

kỳ IVF/tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

(ICSI) tại Trung tâm hỗ trợ sinh sản, Bệnh

viện Đa khoa 16A Hà Đông Nghiên cứu sử

dụng tủ nuôi cấy 3 khí K-system G-210 (Úc)

hoặc tủ nuôi cấy 2 khí Thermo Scientific

model 371 (Đan Mạch), môi trường nuôi cấy

sử dụng là môi trường đa bước G-1, G-2 plus

của hãng Vitrolife-Thụy Điển và môi trường

nuôi cấy đơn bước Life Global – Mỹ Các

chu kỳ IVF/ICSI được thực hiện trong cùng

một phòng Lab với cùng quy trình lâm sàng,

quy trình phòng thí nghiệm và vật liệu tiếp

xúc Không có sự thay đổi nhân viên phòng

thí nghiệm phôi học, thay đổi duy nhất là

thay đổi về môi trường nuôi cấy và nồng độ

oxy Đã có sự chấp thuận của Hội đồng quản

trị Trung tâm Hỗ trợ sinh sản, Bệnh viện

16A Hà Đông, dữ liệu được thu thập từ hồ sơ

bệnh án của Trung tâm Nghiên cứu lựa chọn

những bệnh nhân có ít nhất 4 nang thứ cấp

vào ngày 2 chu kỳ kinh, tuổi mẹ <37 tuổi và

chỉ số AMH >1,2 ng/ml Tổng số chu kỳ

IVF/ICSI được đưa vào nghiên cứu là 341

chu kỳ với 3509 phôi

Bệnh nhân sau khi được kích thích buồng

trứng có kiểm soát 9-12 ngày, sau 36 giờ

tiêm rụng, bệnh nhân được hút nang qua

hướng dẫn siêu âm Nang trứng được lấy ra

và chuyển vào phòng thụ tinh ống nghiệm

trong 2 phút, đặt trong tủ ấm 2-4 giờ để

chuẩn bị cho chu kỳ ICSI Sau ICSI, tất cả

noãn được đặt vào môi trường rửa (có chứa

10% chất thay thế huyết thanh tổng hợp

trong 25 vi giọt) và được phân chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm:

Nhóm I: Phôi được nuôi cấy trong tủ 2

khí (20% O2, 6% CO2) với môi trường nuôi cấy đơn bước Lifeglobal

Nhóm II: Phôi được nuôi cấy trong tủ 2

khí (20% O2, 6% CO2) với môi trường nuôi cấy đa bước Vitrolife Nuôi phôi ngày 1 trong môi trường G-1TMPLUS; Sang ngày 3 chuyển sang đĩa 4 giếng có chứa môi trường G-2TMPLUS

Nhóm III: Phôi được nuôi cấy trong tủ 3

khí (5% O2, 6% CO2, 90% N2) với môi trường nuôi cấy đơn bước

Nhóm IV: Phôi được nuôi cấy trong tủ 3

khí (5% O2, 6% CO2, 90% N2) với môi trường nuôi cấy đa bước Vitrolife Nuôi phôi ngày 1 trong môi trường G-1TMPLUS; Sang ngày 3 chuyển sang đĩa 4 giếng có chứa môi trường G-2TMPLUS

Tất cả các phôi đều trải qua phân loại chất lượng tiêu chuẩn của ngày 3 và ngày 5 theo phương pháp của đồng thuận Istanbul (Alpha Scientists in Reproductive Medicine (2011) [4]) Sau đó phôi được sinh thiết và mang mẫu đi sàng lọc chẩn đoán tiền làm tổ, kết quả PGT-A được so sánh giữa 4 nhóm môi trường nuôi cấy So sánh các nhóm phát triển phôi bằng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố để đánh giá ảnh hưởng của tác nhân nghiên cứu lên đối tượng nghiên cứu Kiểm định được sử dụng là kiểm định

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tổng số có 257 chu kỳ thụ tinh ống nghiệm được thực hiện với ít nhất một trứng

được thụ tinh Trong đó, nhóm I có 338 phôi

tương đương với 72 chu kỳ, nhóm II có 228

phôi tương đương với 52 chu kỳ, nhóm III có

268 phôi tương đương với 58 chu kỳ, nhóm

IV có 328 phôi tương đương với 75 chu kỳ

Trong các chu kỳ IVF, ở cả 4 nhóm nghiên cứu, tuổi trung bình của bệnh nhân và thời gian vô sinh tại thời điểm chọc noãn, chỉ như chỉ số nội tiết không có sự khác biệt (bảng 1) (với giá trị )

Bảng 1: Phân loại thông tin cơ bản của bệnh nhân

Thời gian vô

sinh/chu kỳ 4.13±0.55 3.66±0.50 4.12±0.56 4.28±0.49 0.9661 Tuổi trung

bình/chu kỳ 31.27±0.88 31.45±1.01 30.94±1.01 31.20±0.92 0.1811 AMH (ng/mL) 3.63±0.44 3.99±0.73 3.88±0.64 3.52±0.56 0.527

Số nang thứ

cấp AFC 10.87±0.84 11.56±1.10 11.49±1.07 10.32±0.85 1.5194

Số noãn trung bình sau chọc hút và số noãn trưởng thành của mỗi bệnh nhân trong bốn nhóm tương đương nhau Tỷ lệ thụ tinh của các noãn trưởng thành cao, sự khác biệt về tỷ lệ thụ tinh giữa các nhóm không có ý nghĩa thống kê Tương tự, số lượng phôi trung bình của hai nhóm tương đương nhau (bảng 2)

Bảng 2 Đặc điểm KTBT của các bệnh nhân hai nhóm

Số noãn/chu kỳ 11.17±1.02 12.51±1.55 12.20±1.19 11.55±1.10 0.9856

Số phôi ngày

1/chu kỳ 9.80±0.99 11.11±1.50 10.68±1.14 9.80±0.98 1.2716

Tỷ lệ thụ tinh

(%)/chu kỳ 86.26±1.83 85.77±2.29 86.20±2.28 83.76±2.39 1.2228 Kết quả từ bảng 3 cho thấy, sự khác biệt về số lượng phôi ngày 5 trung bình khi sàng lọc đối với mỗi chu kỳ ở cả 4 nhóm nghiên cứu không có ý nghĩa thống kê, số lượng phôi sàng lọc mỗi nhóm giao động khoảng 4 - 5 phôi mỗi chu kỳ Sự khác biệt về số lượng phôi bất thường trung bình đối với mỗi chu kỳ cũng như tỷ lệ phôi bất thường cho kết quả có ý nghĩa thống kê

Bảng 3 Kết quả sàng lọc PGT phôi ngày 5

Số lượng bệnh nhân

Tổng số phôi sàng

Số phôi sàng

lọc/chu kỳ 4.69±0.43 4.38±0.53 4.62±0.48 4.37±0.44 0.3615

Số lượng phôi bất

thường/chu kỳ 1.92±0.23 2.08±0.28 1.55±0.22 1.60±0.22 3.0017

Tỷ lệ phôi bất

thường (%) 39.74±3.43 46.02±5.31 30.74±3.50 34.97±3.82 6.7682

Tỷ lệ phôi bất thường cao nhất ở nhóm nuôi cấy phôi bằng nồng độ oxy cao 20% với môi trường đa bước, ở mức 46.02±5.31%, thấp nhất ở nhóm oxy thấp 5%, đơn bước ở mức 30.74±3.50%

Hình 1 Biểu đồ Histogram về phân bố tỷ lệ phôi bất thường

ở 4 nhóm nghiên cứu (bước dao động 10% trục X)

Từ kết quả hình vẽ, đối với nhóm I và

nhóm II cùng được nuôi cấy trong nồng độ

oxy cao, tỷ lệ phôi bất thường chiếm cao

nhất ở 40-50% Đối với nhóm III và nhóm

IV khi được nuôi cấy trog điều kiện nồng độ

oxy thấp, tỷ lệ phôi bất thường chiếm cao

nhất ở mốc 30-40%

Sử dụng so sánh F-kiểm định để phân tích

và so sánh sự khác biệt kết quả về bất thường phôi giữa các cặp nhóm nghiên cứu nghiên cứu khi nuôi cấy trong cùng điều kiện (hoặc cùng môi trường, hoặc cùng nồng độ oxy):

Bảng 4 So Sánh sự bất phường nhiễm sắc thể giữa các cặp nhóm nghiên cứu

phôi sàng lọc/chu kỳ

Đối với số phôi bất thường/chu

kỳ

Đối với tỷ lệ phôi bất thường/chu

kỳ

Phôi cùng được nuôi trong điều kiện oxy

cao (Nhóm I, nhóm II) 0.5897 0.5462 3.0477

Phôi cùng được nuôi trong điều kiện oxy

thấp (Nhóm III, nhóm IV) 0.4051 0.0682 1.7939

Phôi cùng được nuôi trong môi trường

đơn bước (Nhóm I, nhóm III) 0.0367 3.6064 9.3676

Phôi cùng được nuôi trong môi trường đa

bước (Nhóm II, nhóm IV) 0.0008 5.2066 8.5239

Khi so sánh kết quả sàng lọc phôi bất

thường giữa 2 nhóm được nuôi dưỡng (bảng

4):

- Trong cùng điều kiện về nồng độ oxy

(khác nhau về loại môi trường nuôi cấy), kết

quả cho thấy số lượng trung bình cũng như

tỷ lệ về phôi bất thường mỗi chu kỳ có sự

khác biệt không có ý nghĩa thống kê với

- Trong cùng một loại môi trường nuôi

dưỡng (khác nhau về nồng độ oxy), kết quả

khi so sánh về số lượng phôi bất thường/chu

kỳ cho thấy:

+) Khi nuôi cấy trong cùng môi trường

đơn bước, mặc dù

(bảng 4) nhưng sự khác biệt về số lượng phôi

bất thường/chu kỳ đã bắt đầu có sự khác

nhau (1.92±0.23 so với 1.55±0.22 phôi bất

thường/chu kỳ) (bảng 3)

+) Khi nuôi cấy trong cùng môi trường đa

bước, sự khác biệt về số lượng phôi bất

thường/chu kỳ cho kết quả có ý nghĩa thống

kê với (bảng 4) Cụ

thể, ở nhóm 5% là 1.60±0.22 phôi/chu kỳ

trong khi ở nhóm oxy 20% là 2.08±0.28 phôi/chu kỳ (bảng 3)

- Trong cùng một loại môi trường nuôi dưỡng (khác nhau về nồng độ oxy), kết quả khi so sánh tỷ lệ phôi bất thường ở 2 cặp nhóm, sự khác biệt cho ý nghĩa thống kê với

(bảng 4) Đối chiếu với bảng 3, cho thấy khi nuôi cấy phôi trong điều kiện oxy thấp 5% cho kết quả tốt hơn, thể hiện ở số lượng phôi bất thường cũng như tỷ lệ phôi bất thường thấp hơn hẳn so với nhóm còn lại

Thành phần của 2 loại môi trường nuôi cấy là khác nhau, đặc biệt là nguồn bổ sung protein, tồn tại các hợp chất chung giữa hai loại môi trường nhưng nồng độ khác nhau [5] [6] Bên cạnh đó, mặc dù cả hai loại môi trường đểu được bổ sung albumin huyết thanh của con người nhưng tinh chế theo cách khác nhau, làm ảnh hưởng đến sự tác động của môi trường nuôi cấy đến phôi người Trong khi môi trường đơn bước cung cấp tất cả các dưỡng chất trong 1 công thức duy nhất, môi trường đa bước hướng tới việc bắt chước các điều kiện sinh lý mà giao tử và

phôi được tiếp xúc khi di chuyển từ ống dẫn

trứng vào tử cung mẹ Bên cạnh đó, trên thực

tế trong điều kiện cơ thể, noãn và phôi ở giai

đoạn phân chia sớm được phát triển trong vòi

tử cung ở nồng độ oxy 2 – 5 % Như vậy

việc hạ thấp nồng độ oxy trong điều kiện

nuôi cấy phôi xuống dưới 5% có thể thích

hợp cho sự thụ tinh và sự phát triển của phôi

ở giai đoạn phôi phân chia sớm

Trong nghiên cứu này, số lượng bệnh

nhân, tuổi, chỉ số nội tiết AMH là tương tự

nhau ở cả 2 nhóm; vì vậy, có thể so sánh

khách quan giữa 4 nhóm với điều kiện nuôi

cấy khác nhau (về nồng độ oxy và môi

trường nuôi dưỡng) Phân tích sự phát triển

của phôi nang: Tỷ lệ phôi cao hơn và chất

lượng hình thái phôi tốt hơn đã được quan

sát trên phôi ngày 5 với những phôi được

nuôi cấy trong môi trường đơn bước, kết quả

tương tự với nghiên cứu của Cimandomo

et.al [8] Kết quả sàng lọc phôi PGT-A

không có ý nghĩa thống kê đối với tỷ lệ phôi

bất thường khi so sánh giữa các nhóm phôi

được nuôi cấy ở hai loại môi trường khác

nhau (đơn bước và đa bước), dữ liệu này

tương quan với kết quả nghiên cứu thử

nghiệm SuMMIT [3] – chứng minh rằng tỷ

lệ bất thường của phôi nang không bị ảnh

hưởng bởi loại môi trường nuôi cấy Tuy

nhiên, nồng độ oxy thấp cho kết quả phôi bất

thường nhiễm sắc thể ít hơn nhóm còn lại

Kết quả này có thể được giải thích do nồng

độ oxy cao tạo ra nhiều gốc oxy tự do (trong

điều kiện bình thường có khoảng 1 – 4%

phân tử oxy chuyển thành gốc tự do) Các

gốc tự do này là nhân tố khử phản ứng cực

mạnh và gây độc cho sinh hoá tế bào, bao

gồm cả bộ gen di truyền Các ADN ty thể rất

mẫn cảm với những thay đổi dưới tác động

của những chất oxy hóa này, bởi chúng

không có protein histon bảo vệ và không có

hệ thống sửa chữa sai sót Điều này dễ dẫn đến hậu quả là làm gia tăng tỷ lệ đột biến, gây ảnh hưởng đến quá trình phiên mã của ARN cũng như quá trình sao mã của chính bản thân ADN ty thể ADN đột biến sẽ tổng hợp nên các protein bất thường, bản thân các protein này cũng có thể là đích tấn công của các gốc tự do, gây ra những thay đổi về mặt cấu trúc và mất chức năng [9]

V KẾT LUẬN

Nuôi cấy phôi trong môi trường nồng độ oxy thấp giúp phôi phát triển ít bất thường nhiễm sắc thể hơn so với khi nuôi cấy ở nồng

độ khí quyển

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Fischer B, Bavister BD, "Oxygen tension in

the oviduct and uterus of rhesus monkeys, hamsters and rabbits," J Reprod Fertil , vol

99, No.2, 1993, pp 673–679

2 Desai N, Flyckt R, Austin CM., "Can culture

medium affect morphokinetics, embryo dysmorphisms and euploidy rate?," Fertil Steril vol 108, No.3, 2017, e.160

3 https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2017.07.

482

4 Werner MD, Hong KH, Franasiak JM, Forman EJ, Reda CV, Molinaro TA, et al.,

"Sequential versus Monophasic Media Impact Trial (SuMMIT): a paired randomized controlled trial comparing a sequential media system to a monophasic medium.," Fertil Steril, vol 105, No.5, 2016, pp.1215–21 https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2016.0105

5 ALPHA Scientists in Reproductive Medicin, "The Istanbul consensus workshop

on embryo assessment: proceedings of an expert meeting," Human Reproduction, Vol.26, No.6, 2011, pp.1270-1283, https://doi.org/10.1093/humrep/der037