Bài viết Khảo sát một số đột biến gen liên quan đến điều trị đích trong ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS) trình bày khảo sát đồng thời các đột biến KRAS, NRAS và BRAF bằng kỹ thuật NGS và mối liên quan giữa các đột biến và một số đặc điểm lâm sàng.
Trang 1KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN LIÊN QUAN ĐẾN ĐIỀU TRỊ ĐÍCH
TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT
GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS)
Nguyễn Thị Huệ 1 , Nguyễn Xuân Hậu 1,2 , Triệu Tiến Sang 3 , Lương Thị Lan Anh 1,2 , Nguyễn Thị Minh Ngọc 1,2 , Lê Thị Minh Phương 4 ,
Lê Dương Minh Anh 1 , Bùi Thị Lành 5 , Phạm Quang Anh 6 ,
Đỗ Thị Huyền Trang 1 , Phạm Hùng Sơn 1 , Đào Thị Trang 1 ,
Vũ Thị Hà 1 , Vũ Thị Huyền 1 , Nguyễn Phú Cường 7 , Nguyễn Thị Trang 1,2
TÓM TẮT 31
Đặt vấn đề: Đột biến KRAS, NRAS và
BRAF là nguyên nhân gây đề kháng với thuốc
điều trị nhắm đích kháng EGFR trong ung thư
đại trực tràng (UTĐTT) Mục tiêu: Khảo sát
đồng thời các đột biến KRAS, NRAS và BRAF
bằng kỹ thuật NGS và mối liên quan giữa các đột
biến và một số đặc điểm lâm sàng Đối tượng và
phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang hồi
cứu và tiến cứu trên 58 bệnh nhân UTĐTT được
xét nghiệm đột biến KRAS, NRAS và BRAF
bằng kỹ thuật NGS Kết quả: Tỉ lệ đột biến
KRAS, NRAS và BRAF là 39,7%, 1,7% và
8,6% Không bệnh nhân nào mang đột biến đồng
thời trên hai hoặc ba gen Có mối liên quan có ý
nghĩa thống kê giữa đột biến gen và vị trí ung
thư Không có mối liên quan giữa đột biến gen
với giới, tuổi, kích thước khối u, hoặc mức độ
1 Đại học Y Hà Nội
2
Bệnh viện Đại học Y Hà Nội
3
Học viện Quân Y
4 Đại học Quốc gia Hà Nội
5
Bệnh viện Bưu điện
6
Đại học Y Thái Bình
7
Bệnh viện Phụ sản Trung ương
Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Trang
Email: trangnguyen@hmu.edu.vn
Ngày nhận bài: 10/8/2022
Ngày phản biện khoa học: 25/08/2022
Ngày duyệt bài: 10/09/2022
biệt hóa của ung thư Kết luận: Công nghệ NGS
giải trình tự đồng thời nhiều gen, mở ra tiền đề cho sự phát triển của y học cá thể hóa trong chẩn đoán và điều trị UTĐTT
Từ khóa: Ung thư đại trực tràng, KRAS,
NRAS, BRAF, điều trị đích, NGS
SUMMARY INVESTIGATION OF GENE MUTATIONS RELATED TO ANTI-EGFR TARGETED THERAPY IN COLORECTAL CANCER BY USING NEXT GENERATION SEQUENCING
(NGS) TECHNIQUE
Introduction: KRAS, NRAS, and BRAF
mutations cause resistance to anti-EGFR targeted
therapy in colorectal cancer (CRC) Objectives:
Investigating the mutations of three genes KRAS, NRAS, and BRAF simultaneously in CRC by using NGS technology and correlation between these mutations and some clinical
features Subjects and methods: A retrospective
and prospective cross-sectional descriptive study
on 58 CRC patients tested for KRAS, NRAS, and BRAF mutations by using the NGS
technique Results: The mutation rate of KRAS,
NRAS, and BRAF was 39.7%, 1.7%, and 8.6% respectively No patient had two or three gene mutations simultaneously There was a statistically significant correlation between gene mutations and tumor location There was no
Trang 2statistically significant correlation between gene
mutations and sex, age, or tumor size, or cancer
differentiation grade Conclusions: The
application of NGS technology helps to sequence
multiple genes simultaneously, opening a
premise for the development of personalized
medicine in the diagnosis and treatment of
colorectal cancer
Keywords: Colorectal cancer, KRAS, NRAS,
BRAF, targeted therapy, NGS
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một
trong những bệnh ung thư phổ biến nhất ở cả
hai giới và là nguyên nhân gây tử vong do
ung thư đứng hàng thứ hai trên thế giới.1 Ở
Việt Nam, tỷ lệ mắc chuẩn hóa theo tuổi của
bệnh UTĐTT là 14,1 trên 100.000 dân.2
Năm 2020, Việt Nam có khoảng 16.400 ca
mắc mới và 8.200 ca tử vong do CRC.2
Do các triệu chứng lâm sàng của UTĐTT
giai đoạn đầu không rõ ràng nên thực tế hầu
hết bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn
muộn Đối với UTĐTT giai đoạn muộn, liệu
pháp điều trị nhắm trúng đích với nhiều ưu
điểm như liều thấp và ít độc hại đã giúp cải
thiện đáng kể hiệu quả điều trị Hiện nay,
thuốc điều trị ung thư nhắm trúng đích phổ
biến nhất là kháng thể đơn dòng kháng
EGFR Tuy nhiên, có một tỉ lệ lớn bệnh nhân
không đáp ứng với liệu pháp kháng EGFR
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến gen
KRAS, NRAS và BRAF gây ra sự hoạt hóa
quá mức con đường tín hiệu EGFR là một
trong những cơ chế chính của việc đề kháng
với các thuốc đích kháng EGFR.3,4 Do chi
phí điều trị đích cao nên cần làm xét nghiệm
các đột biến KRAS, NRAS, BRAF trước khi
lựa chọn phương pháp điều trị để tránh lãng
phí tiền bạc và thời gian của bệnh nhân
Ở Việt Nam, một số tác giả đã nghiên cứu
về đột biến gen trong UTĐTT nhưng chỉ đề
cập đến một hoặc hai trong ba gen trên Các nghiên cứu trước đây hầu hết sử dụng các kỹ thuật PCR với độ nhạy thấp và khả năng hạn chế chỉ phát hiện một số dạng đột biến nhất định.5,6 Ngày nay, sự phát triển của công nghệ Giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing – NGS) đã mang lại một cái nhìn toàn diện trong xét nghiệm di truyền với các ưu điểm về độ nhạy, độ chính xác, thông lượng và tốc độ cao
Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu: “Khảo sát đồng thời các đột biến của ba gen KRAS, NRAS và BRAF trong UTĐTT bằng công nghệ NGS và mối tương quan giữa các đột biến này với một số đặc điểm lâm sàng”
II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
58 bệnh nhân được chẩn đoán UTĐTT dựa trên các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng và mô bệnh học tại Bệnh viện Đại học
Y Hà Nội và có kết quả xét nghiệm đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF trước khi điều trị đích từ 1/2020 đến 6/2022
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang hồi cứu và tiến cứu, phương pháp lấy mẫu thuận tiện Thời gian nghiên cứu: 8/2021 - 6/2022 Phân tích đột biến gen được thực hiện tại Trung tâm Di truyền lâm sàng và Hệ gen (Bệnh viện Đại học Y Hà Nội) và Đại học Quân Y bằng công nghệ NGS thế hệ hai
Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ thứ hai
Tách chiết DNA: Tách gDNA từ mô FFPE bằng hóa chất QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Inc., Germany) hoặc ctDNA từ huyết tương bằng hóa chất MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit (Applied Biosystems, USA) Kiểm tra nồng độ DNA
Trang 3sau tách chiết bằng máy Qubit 4 Fluorometer
(Invitrogen, USA), yêu cầu nồng độ ≥ 2 ng /
µL
Chuẩn bị thư viện: Các mẫu DNA đạt
nồng độ yêu cầu được tiến hành chuẩn bị thư
viện DNA bằng bộ kit Ion Plus Fragment
Library (Ion Torrent, Hoa Kỳ), và sau đó làm
giàu thư viện trên hệ thống Ion OneTouch 2
(Ion Torrent, Hoa Kỳ)
Giải trình tự: Thư viện DNA đã làm giàu
được tải vào Ion PI Chip v3 (Ion Torrent,
Hoa Kỳ) và sau đó được giải trình tự tự động
trên máy giải trình tự Ion Proton (Ion
Torrent, Hoa Kỳ) Dữ liệu trình tự được
chuyển sang và phân tích trên Ion Torrent
Server (Ion Torrent, Hoa Kỳ)
2.3 Xử lý số liệu
Số liệu sau khi thu thập được nhập vào
máy tính, làm sạch số liệu, quản lý và phân
tích số liệu bằng phần mềm thống kê tin học
SPSS 20
2.4 Đạo đức nghiên cứu
- Nghiên cứu tuân theo các quy định của
Hội đồng Đạo đức trong Nghiên cứu Y sinh
Trường Đại học Y Hà Nội
- Chúng tôi cam kết nghiên cứu trên tinh
thần trung thực
- Tất cả thông tin về bệnh nhân được giữ
kín, chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu
III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Đặc điểm chung của nhóm đối
tượng nghiên cứu
58 bệnh nhân UTĐTT được nghiên cứu,
gồm 35 nam (60,34%) và 23 nữ (39,66%)
Tuổi tại thời điểm chẩn đoán dao động từ 26
đến 83 tuổi, tuổi trung bình là 58,09 ±
14,419 Có 72,4% bệnh nhân từ 50 tuổi trở
lên
Bảng 1 Vị trí ung thư của nhóm bệnh
nhân trong nghiên cứu
Vị trí ung thư Số lượng Tỉ lệ
Đại tràng phải 14 24,1% Đại tràng trái 19 32,8% Trực tràng 25 43,1%
Nhận xét: Ung thư trực tràng chiếm tỷ lệ
cao nhất, 43,1%, tiếp theo là đại tràng trái (32,8%) và đại tràng phải (24,1%)
3.2 Kết quả khảo sát đồng thời các đột biến gen KRAS, NRAS và BRAF trong UTĐTT bằng kỹ thuật NGS
Bảng 2 Tỉ lệ đột biến của KRAS, NRAS
và BRAF trong UTĐTT
Đột biến gen Số lượng Tỉ lệ
Đột biến trên hai
Nhận xét: 50% bệnh nhân mang đột biến
một trong ba gen Tỷ lệ đột biến KRAS cao nhất, chiếm 39,7% Không có bệnh nhân nào
có đồng thời hai hoặc ba đột biến gen
Bảng 3 Các dạng đột biến của KRAS, NRAS và BRAF
Gen Dạng đột
biến
Số lượng Tỉ lệ
KRAS
Trang 4Nhận xét: KRAS có 8 loại đột biến ở các codon 12, 13, 61 và 146 Loại đột biến gen
KRAS thường gặp nhất là G12D Gen NRAS có 1 loại đột biến Q61R và gen BRAF có 1 loại đột biến V600E
3.3 Mối liên quan giữa đột biến gen KRAS, NRAS và BRAF và một số đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân UTĐTT
Bảng 4 Mối liên quan giữa đột biến gen và một số đặc điểm lâm sàng
Đột biến Không đột
Test kiểm định
Tuổi Tuổi trung bình 60,76 55,41 0,16 T-test
Vị trí ung thư
Đại tràng phải 3 11
0,049 χ2 test Đại tràng trái 11 8
Kích thước
khối u (so với
chu vi đại trực
tràng)
0,452 Fisher's Exact
Test
Mức độ biệt
hóa ung thư
1,000 Fisher's Exact
Test Biệt hóa vừa 25 24
Nhận xét: p <0,05 => Có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa đột biến gen và vị trí
khối u p> 0,05 => Không có mối liên quan giữa đột biến gen với giới tính, tuổi, kích thước khối u, hoặc mức độ biệt hóa của ung thư
IV BÀN LUẬN
4.1 Đặc điểm chung của nhóm đối
tượng nghiên cứu
Giới tính và tuổi là hai trong những yếu tố
nguy cơ của ung thư nói chung và ung thư
đại trực tràng nói riêng Nhiều nghiên cứu đã
chỉ ra rằng tỷ lệ mắc bệnh UTĐTT ở nam
giới cao hơn ở nữ giới Theo Cơ quan
Nghiên cứu Ung thư Quốc tế IARC, năm
2020, số ca mắc mới UTĐTT ở nam giới là
1.065.960 ca, ở nữ giới là 965.630 ca trên
toàn thế giới.1 Nghiên cứu của chúng tôi
cũng có sự phân bổ tương tự với số lượng
bệnh nhân nam cao hơn khoảng 1,5 lần so với số lượng bệnh nhân nữ
Nguy cơ ung thư đại trực tràng tăng lên khi tuổi cao Nghiên cứu của Bùi Ánh Tuyết tại Bệnh viện K năm 2018 cho thấy, tuổi trung bình khi chẩn đoán là 54,5 tuổi, nhóm tuổi từ 50 đến 69 là phổ biến nhất, chiếm 70,8% Độ tuổi ít gặp nhất là dưới 30 tuổi, chiếm 4,6%.5 Nghiên cứu của chúng tôi cũng
có kết quả tương tự Tuổi trung bình khi chẩn đoán là 58,09 ± 14,419 tuổi, nhóm bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên chiếm 72,4%
Trong nghiên cứu này, ung thư trực tràng chiếm tỷ lệ cao nhất, sau đó là ung thư đại
Trang 5tràng trái và thấp nhất là đại tràng phải Có
sự khác biệt về tỉ lệ vị trí khối u giữa các
nghiên cứu trước đó Điều này có thể là do
các phương pháp lấy mẫu khác nhau của các
nghiên cứu Tuy nhiên, vị trí khối u chỉ ảnh
hưởng đến các phương pháp phẫu thuật chứ
không ảnh hưởng đến chỉ định điều trị trúng
đích
4.2 Các đột biến gen KRAS, NRAS và
BRAF ở bệnh nhân UTĐTT
Trong ung thư đại trực tràng, KRAS là
gen được nghiên cứu nhiều nhất Tỷ lệ đột
biến KRAS cũng cao nhất, chiếm 40-60%
Các đột biến ở gen BRAF và NRAS ít gặp
hơn.5–7 Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho
kết quả tương tự Tỷ lệ đột biến KRAS là cao
nhất, 39,7%, tiếp theo là BRAF (8,6%) và tỷ
lệ đột biến NRAS là thấp nhất với 1,7% Đối
với bệnh nhân mang đột biến một trong ba
gen thì không được chỉ định liệu pháp nhắm
trúng đích kháng EGFR, cần thay thế bằng
các liệu pháp khác phù hợp
Các đột biến của các gen KRAS, NRAS
và BRAF có tính loại trừ lẫn nhau Trong
nghiên cứu của chúng tôi, không có bệnh
nhân nào mang đột biến ở đồng thời hai hoặc
ba gen kể trên Vì vậy, theo khuyến cáo của
Bộ Y tế, việc xét nghiệm đột biến gen NRAS
và BRAF được tiến hành sau khi có kết quả
xét nghiệm đột biến gen KRAS.8 Tuy nhiên,
việc này có thể mất nhiều thời gian và gây
lãng phí tiền cho bệnh nhân Trong khi đó,
với sự phát triển tiên tiến của công nghệ
NGS, chúng ta có thể dễ dàng khảo sát đồng
thời nhiều gen đối với một số lượng lớn mẫu
Do tỷ lệ đột biến cao nhất nên gen KRAS
cũng có nhiều dạng đột biến nhất, 8 dạng đột
biến chủ yếu ở codon 12 và 13 Đột biến
KRAS G12D xuất hiện nhiều nhất, với tỷ lệ
13,8% Mỗi gen NRAS và BRAF chỉ có một
loại đột biến là NRAS Q61R và BRAF
V600E, đây cũng là những dạng đột biến thường gặp trong các nghiên cứu khác Theo hiểu biết của chúng tôi, cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào báo cáo mối liên quan giữa
sự tiến triển của UTĐTT và các dạng đột biến KRAS, NRAS và BRAF
4.3 Mối liên quan giữa các đột biến gen KRAS, NRAS và BRAF với một số đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân UTĐTT
Sau khi kiểm định bằng các test thống kê kiểm định, chúng tôi tìm thấy thấy có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa đột biến KRAS, NRAS, BRAF và vị trí khối u (p
<0,05) Không có mối liên quan giữa đột biến gen với giới tính, tuổi, kích thước khối
u, hoặc mức độ biệt hóa ung thư (p> 0,05)
Tỷ lệ đột biến gen ở ung thư trực tràng và trực tràng trái cao hơn so với đại tràng phải Điều này vẫn còn nhiều mâu thuẫn giữa các nghiên cứu Lê Thái Khương và cộng sự đã báo cáo mối liên quan giữa đột biến ở các gen KRAS, NRAS, BRAF và PIK3CA với vị trí khối u và giai đoạn bệnh, nhưng đột biến gen thường gặp nhất ở ung thư đại tràng phải.7 Nghiên cứu của Bùi Ánh Tuyết cho thấy nguy cơ đột biến KRAS trong ung thư trực tràng cao gấp 10 lần ung thư đại tràng.5
V KẾT LUẬN
Các gen KRAS, NRAS và BRAF có tỉ lệ đột biến cao ở bệnh nhân UTĐTT Xét nghiệm đột biến gen là bắt buộc trước khi có chỉ định điều trị trúng đích Việc ứng dụng công nghệ NGS giúp giải trình tự đồng thời nhiều gen, mở ra tiền đề cho sự phát triển của y học cá thể hóa trong chẩn đoán và điều trị UTĐTT Tuy nhiên, do cỡ mẫu nghiên cứu còn hạn chế nên một số kết luận không
có ý nghĩa thống kê Chúng tôi đề xuất tiến hành các nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn và thời gian nghiên cứu dài hơn để đánh giá
Trang 6hiệu quả của liệu pháp điều trị trúng đích ở
bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 IARC Globocan 2020, Colorectal Cancer
https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancer
s/10_8_9-Colorectum-fact-sheet.pdf
2 IARC Globocan 2020, Viet Nam
https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/popula
tions/704-viet-nam-fact-sheets.pdf
3 Berg M, Soreide K EGFR and downstream
genetic alterations in KRAS/BRAF and
PI3K/AKT pathways in colorectal cancer:
implications for targeted therapy Discov
Med 2012;14(76):207-214
4 Van Cutsem E, Köhne CH, Láng I, et al
Cetuximab plus irinotecan, fluorouracil, and
leucovorin as first-line treatment for
metastatic colorectal cancer: updated analysis
of overall survival according to tumor KRAS
and BRAF mutation status J Clin Oncol
2011;29(15):2011-2019
doi:10.1200/JCO.2010.33.5091
5 Bùi Ánh Tuyết Nghiên cứu một số đặc điểm
lâm sàng, cận lâm sàng và tình trạng đột biến gen KRAS trong ung thư đại trực tràng tại Bệnh viện K Luận án tiến sĩ Trường Đại học
Y Hà Nội 2018
6 Nguyễn Kiến Dụ Nghiên cứu đặc điểm lâm
sàng, cận lâm sàng và đột biến gen KRAS, BRAF ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Luận án tiến sĩ Trường Đại học Y Hà Nội
2017
7 Lê Thái Khương, Nguyễn Đại Dương, Đỗ Đức Minh, Hoàng Anh Vũ Khảo sát đột
biến các gen KRAS, NRAS, BRAF và PIK3CA trong ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh 2021;25(6):191-197
8 Bộ Y tế Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị ung
thư đại - trực tràng Quyết định số 2549/QĐ-BYT 19/04/2018
BIẾN ĐỔI NỒNG ĐỘ DNA PHÔI THAI TỰ DO Ở CÁC THAI PHỤ TUỔI THAI TỪ 6 ĐẾN 15 TUẦN
Vũ Thảo Hằng 2 , Đặng Tiến Trường 2 , Nguyễn Duy Bắc 2 , Nguyễn Xuân Kiên 2 TÓM TẮT 32
Mục tiêu: Khảo sát tỷ lệ DNA phôi thai tự do
ở giai đoạn trước 10 tuần là cơ sở cho việc triển
khai xét nghiệm sàng lọc trước sinh không xâm
1
Bệnh viện Quân y 103
2
Học viện Quân y
Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Xuân Kiên
Email: xuankiễn@yahoo.com
Ngày nhận bài: 29/7/2022
Ngày phản biện khoa học: 16/08/2022
Ngày duyệt bài: 05/09/2022
lấn (NIPT) ở tuổi thai sớm Đối tượng và
phương pháp nghiên cứu: DNA tự do được
tách từ huyết tương thai phụ mang thai nam có tuổi thai từ 6 đến 15 tuần của thai kỳ Định lượng DNA tự do bằng kỹ thuật Realtime PCR Xác định tỷ lệ nồng độ DNA phôi thai tự do ở thai
phụ tuổi thai 6 đến 15 tuần Kết luận: Nồng độ
và tỷ lệ phần trăm DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ từ 6 đến 15 tuần có xu hướng tăng dần theo tuổi thai
Từ khóa: cfDNA, NIPT và tuổi thai