XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN KHÁNG THỂ đơn DÒNG dựa TRÊN NUÔI cấy tế bào ĐỘNG vật

KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Đề tài XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG DỰA TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT NỘI DUNG 01 Giới thiệu chung 02 Quy trình thu nhận KT dựa trên NCMTBĐV 03 T.

Đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN

KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG DỰA TRÊN

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

NỘI DUNG

01 Giới thiệu chung

02 Quy trình thu nhận KT dựa trên NCMTBĐV

03 Thu nhận KT đơn

dòng

04 So sánh phương pháp

05 Ứng dụng

GIỚI THIỆU

 Tương tác KN-KT chuyên biệt

 Đòi hỏi kỹ thuật cao

 Không giới hạn về số lượng

 Tương tác KN-KT không chuyên

biệt

 Dễ sản xuất

 Giới hạn về số lượng

Giới thiệu

Kháng thể đơn dòng (mAb) là thuốc thử quan trọng được sử dụng trong nghiên cứu y sinh, chẩn đoán bệnh và điều trị các bệnh như nhiễm trùng và ung thư

Các kháng thể này được tạo ra bởi các dòng tế bào hoặc dòng vô tính thu được từ động vật đã được miễn dịch với chất là đối tượng nghiên cứu

Giới thiệu

Dòng tế bào:

 Các dòng tế bào được tạo ra bằng cách kết hợp các tế bào B miễn dịch và các tế bào u tủy (myeloma cells)

 Để tạo ra mAb mong muốn, các tế bào phải được nuôi cấy

theo một trong hai cách:

 Bằng cách tiêm vào khoang phúc mạc của một con chuột đã được chuẩn bị thích hợp (phương pháp in vivo, hoặc cổ

trướng của chuột)

 Bằng cách nuôi cấy mô trong ống nghiệm

Giới thiệu

Nguyên tắc của Chính phủ Hoa Kỳ về sử dụng và chăm sóc Động vật có Xương sống được dùng làm thí nghiệm:

 Động vật được chọn cho quy trình phải có loài và chất lượng thích hợp

và số lượng tối thiểu cần thiết để có được kết quả hợp lệ

 Nên xem xét các phương pháp như mô hình toán học, mô phỏng máy

tính và hệ thống sinh học trong ống nghiệm

 Việc sử dụng động vật một cách hợp lý, bao gồm cả việc tránh hoặc

giảm thiểu sự khó chịu, đau khổ và đau đớn khi phù hợp với các thực hành khoa học đúng đắn là điều bắt buộc

QUY TRÌNH

Quy trình

Sự hình thành tế bào lai Hydridoma:

 Hybrid = lai tế bào lympho B x tế bào ung thư dòng tủy myeloma ; -oma =

tumor (khối u)

 Kháng thể đơn dòng là chuỗi tế bào Hybridoma sản sinh ra kháng thể đơn        

dòng là "bất tử" và có thể sản sinh ra các kháng thể giống nhau hoàn toàn

 Quá trình này bắt đầu bằng cách tiêm cho chuột một kháng nguyên gây ra

phản ứng miễn dịch Một loại tế bào bạch cầu, tế bào B, tạo ra các kháng thể liên kết với kháng nguyên được tiêm

tế bào u đặc hiệu mà có thể phát triển

dễ dàng trong nuôi cấy và sản sinh

kháng thể

   4 - Tách các tế bào dung hợp sản

sinh kháng thể đặc hiệu với các

kháng nguyên mong muốn

Quy trình

Sản xuất kháng thế đơn dòng bằng phương pháp in vitro:

Quy trình Phương pháp nuôi cấy khối mô:

Là phương pháp đơn giản

Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vitro là gia tăng nuôi cấy tế bào lai hybridoma thành những khối và làm sạch kháng thể đơn dòng từ môi trường nuôi cấy

Huyết thanh của bò cái đang mang thai chứa khoảng 50 µg/ml globulin miễn dịch của bò đươc sử dụng trong hầu hết môi trường nuôi cấy mô

Tế bào lai hybridoma phát triển trong 10% huyết thanh thai bê (FCS), thích nghi trong khooảng thời gian ( 8-12 ngày) để phát triển trong ít hơn 1% FCS hoặc trong môi trường không có FCS

Sự thích nghi này có thể kéo dài hơn và trong 3-5% trường hợp tế bào lai hybrydoma sẽ không bao giờ thích nghi với môi trường FCS thấp

Quy trình Phương pháp nuôi cấy khối mô:

Sau khi thích nghi, việc nuôi cấy tế bào cho phép nuôi theo thông thường, sử dụng bình thót cổ nuôi cấy mô dưới điều kiện phát triển chuẩn khoảng 10 ngày

Kháng thể đơn dòng sau đó sẽ được thu hoạch từ môi trường

Phương pháp nuôi cấy khối mô là một công nghệ tương đối đơn giản

để thực hiện, có giá thành đầu tư thực hiện tương đối thấp, có thời gian

từ lúc bắt đầu đến khi kết thúc khoảng 3 tuần, điều này gần giống với phương pháp dịch tràn ổ bụng, và làm cho nó có thể sản xuất số lượng kháng thể đơn dòng có thể so sánh được với việc sản xuất bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột

Quy trình

 Điều bất lợi trong những phương pháp này là một thể tích lớn môi

trường nuôi cấy mô phải xử lý, nồng độ kháng thể đơn dòng thu được sẽ thấp ( khoảng vài microgam trong mỗi mililit) và một vài kháng thể đơn

dòng bị biến đổi trong suốt quá trình cô đặc và tinh sạch

Trên thực tế, sự chọn lọc một kháng thể đơn dòng cho thấy độ hoạt

động bị giảm sút 42% bằng một hoặc một nồng độ chuẩn

Phương pháp nuôi cấy khối mô:

Quy trình

Sản xuất KT đơn dòng bằng phương pháp in vivo (phương pháp tràn dịch ổ bụng chuột):

Quy trình Một số hình ảnh về phương pháp chọc dò:

THU NHẬN

Thu nhận

 Thu nhận kháng thể đơn dòng được thực hiện theo nhiều kỹ thuật khác

nhau tùy thuộc vào mục đích sử dụng và bản chất của kháng thể.

 Một số kỹ thuật cơ bản thường được sử dụng trong thu nhận kháng thể đơn

dòng:

Sắc ký lỏng cao

áp HPLC

Ngưng tụ bằng ammonium sulfate, nồng độ

50%

Sắc ký trao đổi

ion Sắc ký lọc gel

Thu nhận

Sắc ký lỏng cao áp HPLC Sắc ký lọc gel

Thu nhận

Kháng thể đơn dòng có thể được thu nhận không cần tinh khiết bằng các phương pháp ly tâm phân đoạn Trong trường hợp cần kháng thể tinh khiết hơn có thể sử dụng các

phương pháp sắc ký cột ái lực với protein A, protein G

 Các protein có trọng lượng phân tử cao hơn sẽ kết tủa ở

nồng độ ammonium sulfate thấp hơn (50%)  không thu được

protein tinh khiết cao nhưng hỗ trợ loại bỏ một số protein không mong muốn

SO SÁNH

So sánh

Ưu điểm:

Phương pháp in vivo Phương pháp in vitro

Thường sản xuất mAb ở một nồng

độ rất cao Nồng độ cao của mAb

trong dịch tràn ổ bụng ở chuột

có thể hạn chế việc nhiễm trong

dịch nuôi cấy in vitro khi số lượng

tương đương của mAb được sử

So sánh

Ưu điểm:

Phương pháp in vivo Phương pháp in vitro

 Tránh phải thuần hóa kháng

thể sản xuất bởi phương

pháp nuôi cấy mô

 Đơn giản, dễ triển khai rộng

rãi

 Sử dụng hệ thống màng nền

bán thấm sản xuất mAb có nồng độ thường cao như

trong phương pháp dịch tràn

ổ bụng

 Tránh được sự tạp nhiễm từ

cơ thể chuột

So sánh

Nhược điểm:

Phương pháp in vivo Phương pháp in vitro

 Là nguyên nhân gây đau đớn

và nguy hại đến chuột

 mAb sản xuất bằng phương

pháp in vivo có thể chứa nhiều

protein chuột và những chất gây

ô nhiễm khác mà yêu cầu phải

được làm sạch

 Giảm ái lực miễn dịch, thay

đổi chức năng sinh học của kháng thể

So sánh

Nhược điểm:

Phương pháp in vivo Phương pháp in vitro

 Phương pháp dịch tràn ổ bụng ở

chuột kéo theo việc tiếp tục sử dụng

chuột và yêu cầu phải theo dõi hằng

ngày

 Một số tế bào lai hybridoma

không phát triển tốt hoặc chết đi trong quá trình nuôi cấy

 Yêu cầu việc sử dụng FBS

(huyết thanh thai bê)

ỨNG DỤNG

Ứng dụng

Nghiên cứu y sinh

Chẩn đoán bệnh và điều trị các bệnh như nhiễm trùng và

ung thư