ý nghĩa các xét nghiệm huyết thanh và sinh học phân tử trong chẩn đoán

Chính vì vậy mà các xét nghiệm phát hiện HBeAg cũng như phát hiện antiHBc IgM được sử dụng để đánh giá tình trạng hoạt động của HBV trong cơ thể bệnh nhân nhiễm HBV, ngoài ra xét nghiệm

Vai trò và ý nghĩa các xét nghiệm huyết thanh và sinh học phân tử trong chẩn đoán, giúp chỉ định điều trị và theo dõi hiệu quả điều trị bệnh viêm gan siêu vi mạn tính Phạm Hùng Vân Tóm tắt Xét nghiệm phát hiện HBsAg và anti-HCV

là các xét nghiệm hết sức cần thiết để phát hiện và sàng lọc người bị nhiễm HBV hay HCV Tuy nhiên các xét nghiệm này không thể được sử dụng cho chẩn đoán bệnh viêm gan mạn tính trên bệnh nhân Chính vì vậy mà các xét nghiệm phát hiện HBeAg cũng như phát hiện antiHBc (IgM) được sử dụng để đánh giá tình trạng hoạt động của HBV trong cơ thể bệnh nhân nhiễm HBV, ngoài ra xét nghiệm phát hiện anti HBe cũng được các nhà lâm sàng sử dụng

để đánh giá sự chuyển đổi huyết thanh cho biết đáp ứng điều trị trên bệnh viêm gan mạn tính do HBV Ngày nay, các xét nghiệm sinh học phân tử ngày càng được sử dụng nhiều để giúp các bác sĩ cho chỉ định điều trị cũng như theo dõi hiệu quả điều trị đặc hiệu bệnh viêm gan siêu vi mạn tính do HBV hay HCV mà trong bài báo cáo sẽ trình bày một cách chi tiết, kể cả các xét nghiệm phát hiện đột biến kháng thuốc trên HBV hay xét nghiệm xác định kiểu gene IL28B để tiên đoán hiệu quả điều trị interferon Một sự trở lại ngoạn mục của một xét nghiệm huyết thanh cổ điển là xét nghiệm định lượng

HBsAg cũng được đề cập đến nhờ ý nghĩa của xét nghiệm trong sự đánh giá hiệu quả điều trị interferon trên bệnh nhân viêm gan siêu vi mạn tính do HBV.

Xét nghiệm sinh học phân tử trong viêm gan B Xét

nghiệm phát hiện và định lượng HBV-DNA

Đa số người bị nhiễm virus viêm gan B thì sẽ có được đáp ứng miễn dịch bảo

vệ, tức là sẽ tạo được kháng thể chống HBsAg (gọi là anhti-HBsAg) và tiêu diệt được virus viêm gan B Người đó khi thử máu sẽ dương tính anti-HBsAg Tuy nhiên có một số người hệ miễn dịch lại không thể tạo ra được kháng thể bảo vệ này nên thử máu lúc nào cũng dương tính với HBsAg Trong cơ thể của người đó có một sự đấu tranh qua lại giữa hệ miễn dịch và virus Nếu hệ miễn dịch cân bằng được hay ưu thế hơn thì sẽ kiềm hãm không cho virus nhân bản được thành các virus hoàn chỉnh do vậy mà sẽ không có hay sẽ có rất ít

virus hoàn chỉnh vào trong máu Những trường hợp này được gọi là người lành mang virus, nếu thử máu sẽ thấy HBsAg dương tính nhưng dấu hiệu cho thấy có virus

hoàn chỉnh là HBV-DNA, tức là acid nhân của virus, thường âm tính hay dương tính với

số lượng (số copies) rất thấp (<105/ml) Nhưng nếu hệ miễn dịch không kiềm hãm được mà để virus thắng thế thì chúng sẽ nhân bản được nhiều trong tế bào gan tạo ra được nhiều virus hoàn chỉnh vào máu của bệnh nhân và lúc này thử máu sẽ thấy HBsAg dương tính đồng thời có virus hoàn chỉnh hiện diện trong máu với số lượng cao phát hiện thông qua xét nghiệm HBV-DNA cho kết quả dương tính và số lượng vượt trên 105 copies/ml Trong trường hợp này cần

phải xác định gan người bệnh có bị tổn hại không, tức là người đó có bị viêm gan mạn tính không? Nếu xác định là bị viêm gan mạn tính thì phải được

điều trị đặc hiệu Do vậy, nếu một người bị HBsAg dương tính, chúng

ta cần phải cần phải thử máu xem HBV-DNA có bị dương tính không và số

lượng bao nhiêu? Đây chính là xét nghiệm phát hiện và định lượng HBV-DNA Nếu HBV-DNA dương tính với số lượng quá 105/ml thì phải tiếp tục xem men gan (là thử nghiệm ALT hay SGPT) của họ có cao không? Nếu cao vượt

ngưỡng 2 lần bình thường (ALT bình thường là 19 IU ở nữ và 33 IU ở nam) thì được coi là viêm gan mạn tính và phải điều trị Nếu men gan bình thường thì cần phải chắc chắn là tế bào gan có bị thương tổn không thông qua xét

nghiệm về hình thái tế bào gan như sinh thiết gan hay fibroscan Nếu kết quả cho thấy có thương tổn thì họ cũng phải được xem là đang bị viêm gan mạn tính và phải cần điều trị đặc hiệu cho bệnh nhân dù men gan bình thường Xét nghiệm phát hiện và định lượng HBV-DNA là một loại xét nghiệm sinh học phân tử, thông thường được thực hiện bằng kỹ thuật PCR định lượng, được gọi

là qPCR hay real-time PCR Về mặt nguyên tắc qPCR cũng giống như PCR nhưng có thêm một tính năng nữa là có thể đếm được có bao nhiêu bản gốc DNA trước khi được nhân bản nhờ một hệ thống quang học có khả năng phát hiện được phản ứng xãy ra trong ống nghiệm trong khi nhân bản xãy ra Do

áp dụng được đặc điểm PCR là một kỹ thuật mở hoàn toàn, người làm xét nghiệm có thể tự pha thuốc thử để làm xét nghiệm mà không phải bị lệ thuộc

và các kit xét nghiệm mua từ các hãng nước ngoài rất đắt tiền, nên hiện có nhiều phòng xét nghiệm tại Việt Nam thực hiện được xét nghiệm sinh học phân tử này Tuy nhiên nếu dựa trên hệ thống mở thì muốn kết quả xét

nghiệm được chính xác, người làm xét nghiệm phải thực hiện đủ các chứng

để kiểm soát không cho các sơ sót xãy ra trong quá trình làm xét nghiệm và các chứng này phải hiển thị trên kết quả xét nghiệm Đối với xét nghiệm qPCR phát hiện và định lượng HBV-DNA thì trong kết quả phải hiển thị được đường biểu diển chuẩn để chứng minh thao tác định lượng đạt chuẩn thông qua hệ số tương quan (R) của các mẫu chuẩn phải đạt trên 0.990 và hiệu quả phản ứng (E) phải đạt 90-105% và đồng thời chứng minh kết quả định lượng

là được tính toán từ kết quả của các mẫu chuẩn được chạy song hành cùng với mẫu thử chứ không phải là được tính toán từ một công thức có sẵn Ngoài

ra, nếu muốn kết luận một kết quả âm tính thì trong kết quả định lượng phải hiển thị được mẫu đó dương tính được với chứng nội tại để đảm bảo âm tính này là âm tính thật sự chứ không phải âm tính giả vì phản ứng khuếch đại bị

ức chế Xét nghiệm qPCR phát hiện và định lượng HBV-DNA còn phải được

dùng để theo dõi hiệu quả điều trị của các thuốc kháng virus mà bác sĩ chỉ định trên bệnh nhân Nếu sau khi chỉ định điều trị khoảng 1 – 3 tháng mà kết quả xét nghiệm cho thấy lượng virus (được gọi là HBV-DNA copy hay IU) giảm được 100 lần (gọi là giảm 2 log) thì bác sĩ điều trị có thể đánh giá là thuốc kháng virus có hiệu quả Hiện nay có khá nhiều thuốc kháng virus dành cho viêm gan B mạn tính rất hiệu quả, HBV bị ngăn chận không cho nhân bản rất nhanh, chính vì vậy HBV-DNA biến mất khỏi máu sớm hơn là HbeAg, sẽ biến mất khỏi máu chậm hơn Chính vì vậy HBV-DNA là một dấu ấn rất tốt để theo dõi được đáp ứng khá sớm của điều trị và hiện nay các nhà y học thống nhất

sử dụng HBV-DNA làm chỉ số theo dõi đáp ứng điều trị hơn là HbeAg Ngoài ra xét nghiệm này cũng phải được chỉ định cứ mỗi 3 tháng trong quá trình điều trị để đánh giá hiệu quả điều trị và nguy cơ kháng thuốc của virus trên bệnh nhân Bất cứ khi nào kết quả phát hiện và định lượng HBV-DNA cho thấy có sự xuất hiện trở lại HBV-DNA trên ngưỡng phát hiện thì bác sĩ điều trị phải lưu ý

vì đây chính là dấu hiệu cho thấy virus đang kháng thuốc điều trị hay bệnh nhân không tuân thủ liệu pháp điều trị mà bác sĩ đang chỉ định

Xét nghiệm phát hiện đột biến kháng thuốc Một người đã bị xác định là

bị viêm gan virus B mạn tính nếu không được điều trị đặc hiệu thì virus sẽ không bị khống chế mà sẽ liên tục nhân bản trong tế bào gan và sẽ tàn phá

tế bào gan với hậu quả sẽ dẫn đến xơ gan và từ thương tổn xơ gan, bệnh nhân có thể bị đi dần đến tình trạng xơ gan mất bù rồi chết, hay từ xơ gan có thể bị dẫn đến ung thư gan Cũng có trường hợp bệnh nhân bị ung thư gan

mà không cần thiết phải bị qua giai đoạn xơ gan, đây chính là những trường hợp bệnh nhân tình cờ qua khám sức khoẻ thấy bị khối u trong gan (qua siêu

âm chẩn đoán) rồi sau đó bị xác định là ung thư gan, xét nghiệm máu cho thấy HBV-DNA dương tính với số copies cao (>105) Chính vì vậy mà nếu đã bị chẩn đoán là bị viêm gan B mạn tính (tiêu chuẩn chẩn đoán là HBV-DNA trên

105 copies/ml, ALT cao gấp 2 lần bình thường hay xét nghiệm sinh thiết hoặc fibroscan thấy tổ chức gan bị tổn thương) thì nhất thiết phải được điều trị đặc hiệu để kiềm chế không cho virus nhân bản để gây tổn thương gan Nhiều nghiên cứu đã cho thấy nếu không được điều trị để khống chế số lượng virus hoàn chỉnh trong máu bệnh nhân luôn dưới ngưỡng phát hiện thì nguy cơ xơ gan hay ung thư gan ở những người này sẽ rất cao Thời gian điều trị bằng thuốc kháng virus có thể sẽ kéo dài trong nhiều năm vì cho đến nay các nhà y học chỉ đạt đến thành công là khống chế được virus không cho nhân bản chứ rất hiếm khi loại trừ được virus vì chúng tồn tại trong tế bào gan ở dạng cccDNA (covalently closed circular DNA) không bị tác động bởi thuốc kháng virus Do phải điều trị thuốc kháng virus một thời gian dài nên virus có cơ hội tiếp xúc với thuốc kháng virus và như vậy là chúng có cơ hội bị đột biến để kháng thuốc Do vậy nếu trong thời gian điều trị, xét nghiệm theo dõi virus là HBV-DNA bổng nhiên bị trở lại dương tính và lượng HBV-DNA bị tăng lên dần thì đây chính là dấu hiệu cho biết virus có khả năng kháng lại thuốc đang điều trị Lúc này cần phải xét nghiệm để phát hiện xem thuốc có bị virus đề kháng không? Hiện nay công ty Nam Khoa đã phát triển được phương pháp giải trình tự một đoạn gen 700bases trên vùng gene rt của virus để có thể phát hiện được rất tất cả điểm đột biến giúp virus kháng được lamivudine, adefovir, entecavir và tenofovir Có thể ví kỹ thuật này như là kỹ thuật làm kháng sinh đồ dành cho HBV, vượt trội hơn nhiều kỹ thuật khác chỉ có thể phát hiện từng đột biến một cho từng thuốc kháng virus một, do vậy mà sẽ cung cấp cho bác sĩ nhiều thông tin hơn để cho quyết định chính xác hơn là

liệu có nên thay đổi thuốc không Xét nghiệm phát hiện đột biến precore

và core promoter

Trong bộ gen (DNA) của virus viêm gan B có một gene được gọi là gene tiền lõi, mã hóa thông tin di truyền giúp virus sinh ra được kháng nguyên e

(HBeAg) và kháng nguyên này được virus tiết ra ngoài khi nó nhân bản Do vậy nếu trong máu bệnh nhân có sự xuất hiện HBeAg thì có nghĩa là có sự nhân bản của virus trong cơ thể Nếu bệnh nhân được điều trị bằng thuốc kháng virus thì virus sẽ bị chặn lại và không nhân bản được đồng thời hệ thống miễn dịch nhận diện HBeAg của bệnh nhân có cơ hội phát triển do vậy

mà trong máu bệnh nhân xuất hiện được kháng thể chống HBeAg (gọi là anti-HBeAg) Trường hợp này y học gọi là có chuyển đổi huyết thanh chứng minh được hệ miễn dịch thắng thế với các kết quả xét nghiệm cho thấy HBeAg trở nên âm tính, anti-HBeAg dương tính, và HBV-DNA không phát hiện được hay phát hiện được như số lượng rất thấp Tuy nhiên trong bệnh nhân bị

viêm gan B mạn tính, quá trình đấu tranh giữa virus với hệ miễn dịch của cơ thể cũng đã thúc đẩy virus viêm gan B có nguy cơ tạo ra một đột biến tại vùng precore (codon 1896) tạo nên một mã kết thúc trên gene này hay đột biến tại vùng core promoter (codon 1762 hay 1764) do vậy mà virus không thể tổng hợp được kháng nguyên HBeAg, lúc này virus được gọi là bị đột biến precore và/hay core promoter Đột biến precore, và đặc biệt đột biến core promoter có liên hệ rất cao với nguy cơ ung thư gan trên bệnh nhân viêm gan

B mạn tính, do vậy trên một bệnh nhân viêm gan B mạn đang được điều trị với thuốc kháng virus, nếu kết quả xét nghiệm cho thấy HBeAg âm tính, AntiHBeAg dương tính, nhưng HBV-DNA lại xuất hiện dương tính, đồng thời men gan trồi sụt thất thường, thì đây chính là dấu hiệu báo động nguy cơ virus đột biến precore và/hay core promoter Trong trường này, cho chỉ định xét nghiệm phát hiện đột biến precore/core promoter là rất cần thiết Xét nghiệm phát hiện đột biến precore/core promoter hiện nay đã được công ty Nam Khoa thực hiện bằng giải trình tự với nguyên tắc là dùng PCR khuếch đại một đoạn dài 250 bases trên vùng gene preC chứa các vị trí (1762, 1764 và 1896) rồi giải trình tự trực tiếp để phát hiện xem có đột biến tại vị trí này hay không Một kết quả phát hiện có đột biến precore và/hay core promoter trên bệnh nhân bắt buộc bệnh nhân phải được điều trị suốt đời hay điều trị cho

đến khi HBsAg biến mất Xét nghiệm định lượng HBsAg Thuốc kháng virus

không thể là giải pháp giúp điều trị khỏi hẵn bệnh trên các bệnh nhân viêm gan B mạn tính Do vậy hiện nay các nhà điều trị đang trông chờ liệu pháp interferon vì đã có nhiều chứng cứ y học cho thấy interferon phối hợp với thuốc kháng virus có thể giúp loại trừ HBV vĩnh viễn ra khỏi bệnh nhân chứng minh được qua sự biến mất HBsAg trong máu, tức là xét nghiệm HBsAg trở nên âm tính trong quá trình điều trị Tuy nhiên không phải bệnh nhân nào được điều trị bằng liệu pháp trên đều có được kết quả khỏi bệnh Chính vì vậy phải có xét nghiệm giúp theo dõi để tiên đoán được hiệu quả điều trị bằng interferon Xét nghiệm phát hiện và định lượng HBV-DNA không thể làm được điều này vì ngay sau khi điều trị một thời gian ngắn thì HBV-DNA trong máu của bệnh nhân đã trở nên âm tính Các nhà nghiên cứu đã cho thấy có một sự liên hệ rất rõ ràng giữa sự thay đổi về lượng của kháng nguyên HBsAg trong máu của bệnh nhân với hiệu quả điều trị interferon Nếu trong quá trình điều trị, lượng HBsAg trong máu giảm một cách có ý nghĩa sẽ chứng minh được

liệu pháp interferon là có hiệu quả trên bệnh nhân Chính nhờ phát hiện này

mà một xét nghiệm miễn dịch cổ điển là xét nghiệm HBsAg đã quay trở lại thành một xét nghiệm không thể thiếu được nếu bác sĩ muốn chỉ định điều trị interferon kết hợp thuốc kháng virus trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính của mình Dù là xét nghiệm cổ điển nhưng do phải có kết quả định lượng theo IU (đơn vị quốc tế) nên chỉ có một vài hệ thống kín đã được chấp nhận mới có thể thực hiện được và đây cũng chính là lý do tại sao xét nghiệm định lượng HBsAg hiện nay còn khá đắt so với các xét nghiệm miễn dịch thông thường

khác như định tính HBsAg, anti-HBsAg, HBeAg, anti-HBeAg, anti-HBcAg… Xét nghiệm xác định kiểu gene HBV

Trước đây các nhà nghiên cứu phải dựa trên các dấu ấn của kháng nguyên bề mặt (HBsAg) của HBV để phân biệt các nhóm HBV Ngày nay nhờ sự hiểu biết cặn kẽ về trình tự của bộ gene HBV, các nhà nghiên cứu đã phân ra 9

genotype (A-I) Sự phân bố genotype là rất tùy thuộc vào địa dư, ví dụ tại Mỹ genotype chủ yếu là A, C

và sau đó là B, còn tại Việt Nam thì chủ yếu là C rồi đến B Genotype của HBV liên quan khá nhiều đến tiến triển bệnh, đột biến và kháng thuốc Nhiều nghiên cứu đã cho thấy genotype C có dự hậu kém, đáp ứng kém với thuốc kháng virus, nguy cơ đột biến core promoter cao và nguy cơ ung thư gan cao hơn genotype B Do ý nghĩa như vậy nên nhiều nhà lâm sàng cho chỉ định xét nghiệm xác định genotype HBV TS Kenji Abe của Viện Nghiên Cứu Bệnh Nhiễm Tokyo đã phát triển một kỹ thuật nested multiplex PCR để xác định genotype HBV có thể áp dụng tại các phòng thí nghiệm có phương tiện PCR Đối với các phòng thí nghiệm có phương tiện giải trình tự như phòng thí nghiệm của công ty Nam Khoa thì ngoài phương pháp của Kenji Abe, chúng tôi cũng đã xây dựng xét nghiệm vừa phát hiện đột biến precore/core

promoter vừa xác định genotype, hay xét nghiệm vừa phát hiện đột biến kháng thuốc vừa xác định genotype dựa trên cơ sở giải trình tự phát hiện các đột biến muốn tìm rồi sau đó so chuỗi trên gene bank với chương trình blast search để xác định genotype của trình tự giải được Với giải pháp này thì bác

sĩ không cần cho chỉ định tìm genotype nhưng vẫn có được thông tin về genotype đi kèm với kết quả phát hiện các đột biến precore/core promoter

hay đột biến kháng thuốc Xét nghiệm phát hiện đột biến mất đoạn trên gene PreS2 TS Kenji Abe đã phát hiện được là trên các mẫu ung thư gan lấy

từ bệnh nhi bị ung thư gan tại Việt Nam là có tỷ lệ cao phát hiện được HBV-DNA và trong đó có đến 36% là có đột biến mất đoạn trên gene PreS2 Kết hợp với các nhà nghiên cứu tại Đài Loan, nhóm nghiên cứu đã chứng minh được vai trò cuả đột biến mất đoạn này trong gây ung thư gan thực nghiệm trên chuột Với chứng cứ này, các nhà y học cũng phải quan tâm đến xét nghiệm truy tầm đột biến mất đoạn PreS2 trên các bệnh nhân viêm gan B mạn tính để có thể phát hiện được sớm nguy cơ ung thư gan Công ty Nam Khoa với sự hợp tác của TS Kenji Abe đã xây dựng được thành công kỹ thuật PCR rồi giải trình tự để phát hiện đột biến gây ung thư quan trọng này và sẵn sàng hợp tác cùng các nhà nghiên cứu và điều trị để có được các nghiên cứu rộng hơn về căn nguyên ung thư gan, hiện được thống kê là ung thư hàng

đầu tại Việt nam Xét nghiệm phát hiện đột biến trốn thoát vaccine của HBV Một người đã chích ngừa viêm gan B và có kháng thể bảo vệ

(anti-HBsAg) vẫn có nguy cơ nhiễm HBV và dẫn đến viêm gan mạn tính cao nếu sau khi chủng ngừa họ bị nhiễm bởi chủng virus mang đột biến trốn thoát

vaccine Đột biến trốn thoát vaccine được TS Kenji Abe phát hiện trên một bệnh nhi tại Nhật sau khi chủng ngừa HBV đã có anti-HBsAg và bổng dưng xuất hiện HBsAg rồi anti-HBsAg dần dần biến mất Từ bệnh nhi này, TS Kenji Abe đã phát hiện được chủng HBV có đột biến tại codon 145 (Gly145Arg/Lys)

và chính do sự đột biến này mà virus đã thay đổi được tính kháng nguyên của epitope “a” để trốn thoát được khả năng bảo vệ của kháng thể chống HBsAg

và nhờ đó mà nhiễm được trên bệnh nhân và gây bệnh Với vị trí đột biến đã xác định và với cơ chế gây bệnh rõ ràng như vậy, chúng tôi cho là các nhà điều trị cũng như nghiên cứu phải quan tâm đến vấn đề phát hiện đột biến trốn thoát vaccine trên các bệnh nhân tồn tại song song trong huyết thanh vừa anti-HBsAg vừa HBsAg, hay trên các bệnh nhân sau khi chủng ngừa mà

tự nhiên lại xuất hiện HBsAg và biến mất anti-HBsAg TS Kenji Abe và phòng thí nghiệm của công ty Nam Khoa rất sẵn sàng để hổ trợ các nghiên cứu như vậy