Báo cáo thực hành KT di truyền PCR KHUẨN LẠC XÁC ĐỊNH DÒNG TẾ BÀO VI KHUẨN ,CHUYỂN GENE VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN

Báo cáo thực hành KĨ THUẬT DI TRUYỀN BÀI 1 TẠO TẾ BÀO KHẢ NẠP VÀ TÁCH CHIẾT DNA PLASMID TỪ TẾ BÀO VI KHUẨN I Nguyên tắc Các tế bào sẽ tiếp nhận các đoạn DNA một cách ngẫu nhiên Không phải tất cả các l.

Báo cáo thực hành

KĨ THUẬT DI TRUYỀN

BÀI 1 TẠO TẾ BÀO KHẢ NẠP VÀ TÁCH CHIẾT DNA PLASMID TỪ

TẾ BÀO VI KHUẨN

I Nguyên tắc

- Các tế bào sẽ tiếp nhận các đoạn DNA một cách ngẫu nhiên Không phải tất cả các loài vikhuẩn đều có khả năng tiếp nhận DNA Ngay cả những loài có khả năng này cũng chỉ có thểtiếp nhận được DNA ở những pha sinh trưởng nhất định và trong những môi trường nuôi cấy

cụ thể Các loài Streptococcus pneumoniae và Bacillus subtilis tương đối dễ khả biến hơn, trong khi E coli phải mất đi hai loại enzyme exonuclease và phải được nuôi cấy trong môi

trường có nồng độ cao của calcium chlodride để làm cho màng tế bào của nó có thể thấmđược DNA Như vậy, những quá trình xử lý đặc biệt cũng được thực hiện nhằm gia tănghiệu quả chuyển gene ở vi khuẩn và làm chúng nhạy cảm hơn dưới tác động của cá chất hóahọc hay dòng điện trong kỹ thuật chuyển gene Những tế bào vi khuẩn này được gọi là tếbào khả nạp (competent cells)

- Quá trình chuyển gen đưa plasmid vào tế bào vi khuẩn là một bước quan trọng trong quytrình tạo dòng giúp chọn lọc và nhân bản plasmid Với những dòng vi khuẩn đã được sànglọc, tuyển chọn, việc nuôi cấy và tách chiết plasmid sẽ cho phép thu nhận một lượng lớnplasmid để dùng cho các bước tiếp theo trong quy trình tạo dòng Thông thường, sinh khối

vi khuẩn sẽ được ly giải kiềm giúp giải phóng plasmid khỏi tế bào Một bước xử lý acid hóanhanh bằng dung dịch kali acetate đậm đặc sẽ cho phép kết tủa protein và DNA nhiễm sắcthể DNA plasmid ở trạng thái siêu cuộn xoắn, vẫn ở trong dung dịch và có thể được giữ lạitrên cột silica spin DNA plasmid được rửa bằng dung dịch ethanol và sau đó được rửa giảitrong nước hoặc đệm TE

Hình 1 Quy trình tách chiết DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn dùng cột silica spin

- Bộ kit tách DNA plasmid

- Gel agarose 1.5% / 1 tấm

III Quy trình thí nghiệm

Cấy vi khuẩn vào

ống nghiệm chứa môi trường LB không có kháng sinh

Nuôi cấy lắc với tốc độ 150 rmp ở 370C trong thời gian 16-20h

Ly tâm ở tốc độ 8000rpm trong 2

phút

Lặp lại các bước để thu nhận toàn

bộ sinh khối từ dịch vi khuẩn

Hút lần lượt 1ml dịch vi khuẩn

sang eppendorf

Loại bỏ dịch nổi để thu sinh khối vi khuẩn

Bổ sung 1ml dung dịch CaCl2 lạnh Vortex để huyền phù sinh khối, ủ eppendorf trong đá 30 phút

2 Quy trình thu nhận sinh khối vi khuẩn tách chiết DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn bằng bộ kit

Loại bỏ dịch nổi để thu sinh khối vi khuẩn

Ly tâm dịch vi khuẩn ở 8000 rpm

trong 2 phút

Bổ sung 500µl hỗn hợp dung dịch CaCl2 và glycerol lạnh, vortex để

huyền phù sinh khối

Bảo quản các ống vi khuẩn ở nhiệt độ

-80oC

10 mL dung dịch vi khuẩn chứa

Hút chuyển lần lượt 100µl dung dịch

vi khuẩn vào các eppendporf lạnh

vô trùng

10 mL dung dịch vi

khuẩn chứa plasmid mục tiêu

(pha lag)

Ly tâm ở 11000 rpm trong 5

phút Hút 1 mL dịch nuôi cấy

Cho 250 mL PL1 buffer + 10 µl RNase A vào

tube chứa 1.5 mL cặn tế bào

Vortex

Thêm 250 µl PL2 buffer

Loại bỏ dịch nổi Thu cặn tế bào

Thêm 500 µl WB1 buffer

Loại bỏ chất lỏng bên dưới Giữ lại cột

Loại bỏ chất lỏng bên dưới

Ly tâm ở 11000 rpm

trong 2 phút

Đặt cột vào tube cũ

Giữ lại cột

Chuyển cột sang tube mới

IV Kết quả thí nghiệm:

V Thảo luận kết quả:

- Sau khi tiến hành tách chiết DNA plasmid, để xác định nồng độ của DNA trong dung dịch,nhóm thực hiện phân tích plasmid bằng phương pháp đo mật độ quang bằng máy quang phổnanodrop Kết quả thu được DNA plasmid với nồng độ rất thấp lần lượt là 46 và 55 µg/mL

- Nồng độ DNA plasmid thấp như trên có thể do lượng DNA và buffer trong thí nghiệmchưa thật sự chính xác (do đầu típ không khớp với micropipette)…

Hình 2 Kết quả phân tích plasmid bằng phương pháp đo

mật độ quang

để cắt DNA giúp chèn có định hướng hoặc không định hướng vào plasmid tương thích DNA bộ gene (genome), từ bất kỳ nguồn nào, cũng thường được cắt với RE tại vị trí nhậnbiết đặc trưng gồm 6-8 base liên tiếp, là dạng vị trí nhận biết với tần suất trong genome íthơn so với vị trí nhận biết 4 base, dẫn đến tạo các phân đoạn DNA có kích thước lớn Kíchthước của các đoạn chèn mong muốn của thư viện dòng nhân bản sẽ quyết định loại enzyme

và điều kiện của phản ứng cắt Thông thường, một chuỗi các độ pha loãng của enzyme đượclựa chọn thường được sử dụng để phân cắt nguồn vật liệu khởi đầu, sau đó kích thước cácđoạn chèn các đoạn chèn mong muốn được phân tách bằng điện di trên gel agarose Phươngpháp chuẩn bị này tạo các phần đoạn DNA có kích thước mong muốn với các đầu tươngthích với các vector đã lựa chọn

Thông thường, quy trình subcloning yêu cầu sử dụng 1-2 RE cắt ngay bên ngoài đoạn chèn

mà không cắt trong chính đoạn chèn Các RE, có một vị trí nhận biết trong vùng đa điểm tạodòng (multi cloning sites-MCS), thường được chọn sử dụng khi chúng không cắt vị trí kháctrong DNA vector và thường tạo ra hai phân đoạn dễ tách biệt Gene mục tiêu được tạo dòngvào một vector với mục tiêu nâng cao hiệu quả biểu hiện thành protein hoặc giúp sàng lọcgene Trong những trường hợp này, gene mục tiêu cần phải được gắn chèn vào đúng hướng

và năm trong khung đọc với promoter phiên mã

Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ enzyme polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR)thường được sử dụng để khuếch đại gene hay phân đoạn DNA của gene mục tiêu, từ bất kỳnguồn DNA nào, để tạo dòng Để tạo các đầu tương thích, thường trình tự nhận biết của RE

sẽ được thêm vào đầu 5' của cả hai mồi PCR Hơn nữa, để tạo hiệu quả gắn kết và cắt của

RE, một số gốc base cũng sẽ được thêm vào phía trước và phía sau điểm nhận biết ở đầu 5'.Khi chọn vị trí cắt giới hạn để thêm vào trình tự mồi, điều quan trọng là xác định vị trí cắtphải tương hợp với vector, chiều của các đoạn chèn và vị tri cắt không xảy ra trong genehoặc trong phân đoạn DNA

Chuẩn bị eppendorf

2µl Buffer 1µl Enzyme BamHI 15µl DNA

Trộn nhẹ bằng micropipette

Ủ ở 370C trong

60 phút

Chuẩn bị eppendorf

Trộn nhẹ bằng micropipette

II Vật liệu và phương pháp

- Thực hiện phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme BamHI

- Thực hiện phản ứng cắt plasmid DNA với 2 enzyme là EcoRI và BamHI

III Quy trình thí nghiệm

1 Thực hiện phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme BamHI

Chuẩn bị eppendorf

2µl Buffer

1µl Enzyme BamHI và 1µl Enzyme EcoRI

v va

16µl DNA

Trộn nhẹ bằng micropipette

và 4µl loading dye

Nạp mẫu phản ứng cắt

Điện di ở 100 voltage

trong 60 phút

Quan sát và so sánh

2 Thực hiện phản ứng cắt plasmid DNA với 2 enzyme là EcoRI và BamHI

3 Điện di kiểm tra kết quả cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn

IV Kết quả thí nghiệm:

Sau khi điện di bản gel agarose 1.5% ở 100 voltage trong 60 phút , ta thu được kết quả như hình bên dưới

Hình 3 Kết quả phân tích plasmid bằng phương pháp điện di trên gel agarose

(L: Ladder 1kb; 1-2: DNA plasmid không cắt; 3-4: DNA plasmid được cắt bởi BamHI; 5-6: DNA plasmid được cắt bởi 2 enzyme EcoRI + BamHI và EcoRI + PstI; 7-8: DNA plasmid

không cắt của nhóm sáng)

V Thảo luận kết quả

- Sau khi có được kết quả điện di, nhận thấy các vạch điện di xuất hiện không rõ ràng, khôngphân đoạn tách biệt Ở DNA marker dùng làm mẫu nên xuất hiện rõ ràng hơn sản phẩm cắtplasmid của mẫu thí nghiệm, điều này khó xác định được sự phân cắt của hai phản ứng cắtenzyme cắt giới hạn Vì thế không so sánh được khả năng cắt plasmid bằng RE so vớiplasmid chưa được cắt

- Sau khi điện di, các vạch điện di xuất hiện không rõ ràng có thể là do tỉ lệ đổ bản gelagarose không phù hợp ảnh hưởng đến sự di chuyển của các đoạn DNA trong môi trườngdiện di, hay cũng có thể do dung dịch điện di không đạt chuẩn ảnh hưởng đến kết quả

VI Trả lời câu hỏi

Vì sao phản ứng cắt plasmid DNA với một enzyme giới hạn lại sử dụng enzyme BamHI mà không sử dụng enzyme EcoRI?

Trả lời: Bởi vì vị trí nhận biết để phân cắt của enzyme BamHI có vị trí là 319bp nằm gần hơn nhiều so với vị trí nhận biết của enzyme EcoRI (5675bp) vì thế hiệu quả cắt của enzyme

BamHI trên plasmid sẽ dễ dàng hơn.

BÀI 3

CHUYỂN GENE VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SHOCK NHIỆT VÀ TÁCH CHIẾT LẠI DNA PLASMID

I. Nguyên tắc:

Chuyển gen là quá trình đưa DNA ngoại lai vào tế bào sinh vật Quá trình chuyển plasmid vào tế bào vi khuẩn (quá trình biến nạp) không chỉ quan trọng trong nghiên cứu mà còn trong nhân bản và lưu trữ plasmid Bởi vì điều này, hầu như tất cả các plasmid, thậm chí các plasmid được thiết kế cho ứng dụng ở thực vật và động vật, cũng đều mang vùng khởi đầu sao chép (ori) và vùng gene kháng kháng sinh dùng như một marker để chọn lọc dòng vi khuẩn Có nhiều biến đổi di truyền được thực hiện để tạo các chủng vi khuẩn có thể chuyển gene vào dễ dàng hơn cũng như giúp duy trì plasmid mà không làm thay đổi plasmid.

Hình 4 Plasmid pET11a

II Vật liệu:

Plasmid pET11a: 2µl

Vi khuẩn khả nạp E coli DH5-alpha và BL21: 100µl

Môi trường LB agar: 50ml

Đĩa petri chứa môi trường LB ager bổ sung kháng sinh (ampicilin)

III Quy trình thí nghiệm

nhiệt

Hút bổ sung 5µl của plasmid vào vi khuẩn khả nạp đã giải đông Trộn nhẹ hỗn hợp bằng micropipette

Đặt ống eppendorf chứa hỗn hợp biến nạp trong chậu nước đá trong 5 phút

Chuyển eppendorf vào bể ổn nhiệt ở

42oC trong 42 giây

Đặt eppendorf lại vào chậu nước đá

trong 5 phút

Bổ sung 1ml môi trường LB

Ủ trên máy lắc 37oC trong 45 phút

Cấy trải toàn bộ dung dịch vi khuẩn vào đĩa petri chứa môi trường LB agar

có bổ sung kháng sinh

Giải đông ống vi khuẩn khả nạp vào hộp đá trong 5-10 phút

IV Kết quả thí nghiệm

Hình 5 Kết quả sàng lọc thể biến nạp dựa trên khả năng kháng kháng sinh

1-Vi khuẩn BL21 đã chuyển gen; 2- Vi khuẩn DH5-alpha không chuyển gen (đối chứng)

Nuôi ủ đĩa petri ở 37oC qua đêm

Chọn 10 khuẩn lạc mọc rời trên đĩa

petri

Thu được chủng

vi khuẩn kháng kháng sinh

Hình 6 Kết quả phân tích plasmid bằng phương pháp đo mật độ quang (lần 2)

- Thực hiện cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn với nồng độ DNA plasmid cao hơn (68

µg/ml)

Hình 7 Kết quả phân tích plasmid bằng phương pháp điện di trên gel agarose (lần 2) (L: Ladder 1kb; Uncut: DNA plasmid không cắt với nồng độ 68 µg/ml; Cut1: DNA plasmid

được cắt bởi BamHI; Cut2: DNA plasmid được cắt bởi 2 enzyme EcoRI + BamHI)

- Thảo luận kết quả:

+ Sau khi thực hiện cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn với nồng độ DNA plasmid cao hơn

hơn (68 µg/ml), tuy nhiên kết quả đạt được không như mong muốn, trên bản gel không xuấthiện bất cứ band nào ngoài các band trên thang chuẩn

+ Nguyên nhân có thể do nồng độ DNA plasmid này quá thấp nên khi cắt DNA không thu được kết quả

L Uncu t Cut1 Cut2

V Thảo luận kết quả

1 Kết quả sàng lọc thể biến nạp dựa trên khả năng kháng kháng sinh

Xét về khả năng sinh trưởng của vi sinh vật, chủng DH5-alpha sinh trưởng phát triển mạnh hơn nhiều so với chủng BL21, cho nên với lượng 100 µl ampicilin 50mM, ta thấy:

- Đĩa cấy vi khuẩn BL21 đã chuyển gen kháng kháng sinh không xuất hiện khuẩn lạc (khôngphát triển)

- Mặc khác, chủng DH5-alpha phát triển mạnh mẽ trên đĩa môi trường LB bổ sung kháng sinh ampicilin

Do vậy, không thể đánh giá kết quả sàng lọc thể biến nạp

2 Kết quả phân tích DNA plasmid

+ Sau khi thực hiện cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn với nồng độ DNA plasmid cao hơn

hơn (68 µg/ml), tuy nhiên kết quả đạt được không như mong muốn, trên bản gel không xuất hiện bất cứ band nào ngoài các band trên thang chuẩn

+ Nguyên nhân có thể do nồng độ DNA plasmid này quá thấp nên khi cắt DNA không thu được kết quả

BÀI 4

PHƯƠNG PHÁP PCR KHUẨN LẠC XÁC ĐỊNH DÒNG TẾ BÀO VI

KHUẨN MANG GENE MỤC TIÊU

I Nguyên tắc:

Phương pháp PCR khuẩn lạc (colony PCR) là phương pháp rất thuận lợi và hiệu quả trongviệc sàng lọc số lượng lớn các dòng vi khuẩn để xác định sự hiện diện hay vắng mặt củaplasmid mang gene mục tiêu trong quá trình tạo dòng Các dong vi khuẩn chuyển gene cóthể được ly giải trong nước hoặc dung dịch đệm trong một bước xử lý nhiệt trước khi bổsung vào hỗn hợp phản ứng PCR hoặc cũng có thể bổ sung trực tiếp vào phản ứng và được

ly giải trong giai đoạn khởi đầu của chu kỳ nhiệt Bước xử lý nhiệt trong giai đoạn khởi đầucho phêp giải phóng plasmid DNA từ tế bào vi khuẩn làm nguyên liệu (mạch khuôn) chophản ứng PCR

Trong phản ứng PCR, với một cặp mồi đặc hiệu cho gene mục tiêu cho phép xác định sựhiện diện của gene mục tiêu trong cấu trúc của plasmid Ngoài ra, với các mồi chuyên biệtđược thiết kế cho các vùng gene trên khung vector, bên cạnh gene mục tiêu, cho phép xácđịnh chiều và kích thước của gene mục tiêu Trong tất cả các trường hợp, sản phẩm của phảnứng PCR được xác định bằng điện di trên gel agarose

Hình 8 Quy trình PCR khuẩn lạc

II Vật liệu và phương pháp:

- Phân tích kết quả bằng điện di gel agarose

III QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM:

Hoà tan khuẩn lạc vào dung dịch phản ứng bằng đầu típ vô trùng

Vortex và spindown nhanh các ống phản ứng

Chuẩn bị bản gel agarose 1,5%

Trộn 25l sản phẩm PCR vào 6,25l gel loading buffer (GLB)

IV Kết quả thí nghiệm

Sau khi tiến hành thí nghiệm ta có được kết quả như sau:

Hình 9 Kết quả phân tích sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose

(L: Ladder 100bp – 1013bp, 1-10: Sản phẩm PCR khuẩn lạc vi khuẩn chứa gen mục tiêu,

11-12: Đối chứng âm - dương)

Nạp mẫu vào gel

Điện di sản phẩm cắt ở 100 voltage trong 30 phút

Quan sát xác định band sản phẩm PCR

So sánh với marker để xác định kích thước

V Thảo luận

*Sau khi điện di sử dụng thuốc nhuộm gel safeview:

- Trong thời gian chờ gel đông thì safeview đã bị mất màu

- Qua nhiều lần sử dụng safeview thì không hiển thị được các band sản phẩm PCR.Nên có thể thuốc nhuộm safeview đã bị hỏng hoặc hết hạn sử dụng Và các thao tác chưađúng nên ảnh hưởng đến kết quả

*Nhóm thực hành đã quyết định chọn thuốc nhuộm Ethidium bromide (EtBr) để thay thếcho safeview:

- Cách thực hiện:

- Sau khi thay đổi thuốc nhuộm vẫn không thể thấy được các band của sản phẩm PCR

Có thể do thao tác thực hiện còn nhiều sai sót, hoá chất không đảm bảo chất lượng, mồi quá dài (không đặc hiệu) nên kết quả không thể xác định được các band sản phẩm PCR

và xác định được kết qủa chính xác

 Bổ sung kết quả thực hiện lần 2

Do PCR khuẩn lạc không đạt được kết quả mong muốn, tiếp tục tiến hành thực hiện lại thí nghiệm lần 2 với một số thay đổi:

+ Giữ nguyên thể tích của các thành phần: MyTaq mix và nước, thay đổi thể tích của mồi xuôi và mồi ngược:

+ Giữ nguyên quy trình nhiệt, thay đổi nhiệt độ bắt cặp:

Điện di trên gel agarose 1.5%

Dùng sản phẩm điện di ngâm vào EtBr 15 phút

Quan sát xác định band sản phẩm PCR trong hộp đèn soi UV

So sánh với marker để xác định kích thước

Kết quả điện di PCR khuẩn lạc lần 2

Hình 10 Kết quả phân tích sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose

(L: Ladder có kích thước từ 100 bp – 1013bp; 1-10: Sản phẩm PCR khuẩn lạc vi khuẩnchứa gen mục tiêu; 11-12 : Đối chứng dương : Sinh khối sau khi ly tâm dịch vi khuẩn được

cấy trong môi trường LB lỏng chứa Amp)

Thảo luận kết quả

- Sau khi thay đổi một số điều kiện của phản ứng PCR colony, nhìn vào bản gel sau khi điện

di ta thấy ở giếng số 4 và số 10 xuất hiện các band, điều chứng tỏ gen mục tiêu đã được chènthành công vào plasmid ở các khuẩn lạc này Ước tính kích thước plasmid chứa đoạn gen ở giếng số 10 khoảng 1000bp

- Ở các giếng còn lại (ngoại trừ ladder) không xuất hiện band nào, kết luận các plasmid không được chèn thành công gen mục tiêu ở các khuẩn lạc này