Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát một số hoạt tính sinh học của loài lycopodiella cernua (l ) pic serm và kadsura coccinea (lem ) a c sm ở việt nam

Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ loài Thông đất .... Ho ạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được từ loài Thông đất L.. Hoạt tính sinh học của các hợp

TỔ NG QUAN

T ổ ng quan chung v ề chi Lycopodiella Holub

Chi Thông đất nhỏ (Lycopodiella Holub.) là một chi thuộc họ Thạch tùng (Lycopodiaceae) Trên thế giới, chi này có khoảng 25–30 loài và phân bố chủ yếu ở các khu vực châu Mỹ, châu Đại Dương và New Guinea.

Trong danh mục các loài thực vật Việt Nam [3], duy nhất 1 loài là Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm thuộc chi này xuất hiện tại nước ta

Các công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi

Lycopodiella Holub chủ yếu là các công bố về loài Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.

T ổ ng quan v ề loài Thông đấ t (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.)

- Tên Việt Nam: Thông đất, còn có tên gọi khác là Thạch Tùng nghiên

- Tên khoa học: Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm

- Tên gọi khác: Lycopodium cernuum L., Palhinhaea cernua (L.) Franco & Vasc

- Chi: Thông đất nhỏ - Lycopodiella Holub

- Loài: Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm

Hình 1.1 Hình ảnh cây Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.) Hình ảnh được lấy từ trang web https://www.alamy.com/stock-photo/lycopodium-cernuum.html

Cây mọc trên đất và vươn lên, có thân cao 30-50 cm và phân nhánh nhiều Lá mọc sít nhau, hình dải nhọn Bông rất nhiều, tương đối nhỏ, treo thòng ở đầu các cành nhỏ bên, màu nâu nhạt Túi bào tử gần hình cầu, hai mảnh vỏ không đều nhau.

Cây Thông đất thường gặp ở độ cao lên tới 1200 m, hiếm khi vượt quá giới hạn này Nó ưa sáng và có thể chịu được hạn và ẩm Cây thường mọc thành đám trong các trảng cây bụi thưa hoặc trảng cỏ thứ sinh ở ven rừng, trên vách đá và đất trống bỏ hoang.

1.2.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến

Phân bố của nó rất rộng, hiện diện hầu như khắp các vùng đồi núi thấp trên toàn quốc Ngoài ra, nó còn có mặt ở khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới.

- Bộ phận dùng: Toàn cây

1.2.1.4 Tính vị, tác dụng, công dụng

Cây Thông đất có vị đắng, cay, tính ấm, có tác dụng khư phong khử thấp, thư cân hoạt huyết, trấn khái, thu liễm chỉ huyết và lợi tiểu; ở Vân Nam (Trung Quốc), cây được xem có vị ngọt, hơi đắng, tính bình, có tác dụng thanh can minh mục, khư phong chỉ khái, giải độc, chỉ huyết an thai, thư cân hoạt huyết và lợi niệu.

Người ta thường dùng cây này để chữa viêm gan cấp tính, mắt đỏ sưng đau, phong thấp đau nhức xương và ho mãn tính, với liều 20–24 g sắc uống hoặc phối hợp với các vị thuốc khác Ở Vân Nam (Trung Quốc), cây được dùng trị đau khớp xương, mồ hôi trộm, quáng gà, tiểu tiện bất lợi, có triệu chứng đẻ non, bỏng lửa và trẻ em bị tê liệt sau di chứng Ở Malaysia, nước sắc của cây được dùng làm thuốc rửa trị phù thũng và cũng chữa ho Tro cây ngâm trong giấm được dùng chườm chữa phát ban da [1].

1.2 2 Thành phần hóa học c ủa lo ài Thông đất

Thành phần hoạt chất chính trong loài Thông đất chủ yếu là alkaloid, flavonoid và đặc biệt là các terpenoid

1.2.2.1 Các nghiên cứu ngoài nước a Các alkaloid

Họ Thông đất được biết đến là nguồn nguyên liệu tiềm năng để phân lập các alkaloid, đặc biệt là các Lycopodium alkaloid; hầu như trong mọi loài thuộc họ này đều chứa alkaloid, nổi bật là huperzine A và huperzine B, các hợp chất có hoạt tính ức chế AChE rất mạnh.

Lycopodium alkaloid là một nhóm alkaloid liên quan về cấu trúc và được phân lập từ các loài thực vật thuộc chi Lycopodium L Đến năm 2004, đã có 201 alkaloid Lycopodium được công bố từ 54 loài của chi Lycopodium L Những alkaloid này thường chứa khung carbon cơ bản gồm 16 nguyên tử carbon, đôi khi lên tới 32 nguyên tử carbon (xuất hiện ở dạng dime) hoặc ít hơn 16 nguyên tử carbon do sự phân cắt liên kết Chúng thuộc các dạng quinolizine, pyridine và α-pyridone.

A W Ayer đã chia Lycopodium alkaloid thành 4 nhóm cấu trúc: lycopodine, lycodine fawcettimine và hỗn hợp Bộ khung của các nhóm chất này như sau [4]:

Theo công bố của Zhao và cộng sự vào năm 2010 và 2012, các Lycopodium alkaloid phân lập từ loài này gồm có: palhinine A (1), acetyllycoposerramine M (2),

5 palcernine A (3), lycoflexine N-oxide (4), lycodine (5), lycoflexine (6), α-obscurine

Năm 2016, sáu hợp chất Lycopodium alkaloid mới được phân lập và xác định cấu trúc là palhicerine A–F (12–17) từ các phân đoạn alkaloid bởi nhóm nghiên cứu của Tang và cộng sự Cũng trong nghiên cứu này, các nhà khoa học đã phân lập được các Lycopodium alkaloid đã biết là lycopoclavamine A (18) và lycoposerramine.

M (19), clavolonine (20), diacetyllycofoline (21), anhydrolycodoline (22), gnidioidine (23), huperzine E (24), 12-deoxyhuperzine O (25), fawcettimine (26), phlegmariurine B (27), lycodine (28), des-N-methyl-α-obscurine (29) [7]

Vào năm 2012, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được lycopalhine A (30) – một alkaloid Lycopodium với bộ khung chưa từng được ghi nhận trước đó Đến năm 2013, nhóm này công bố sự xuất hiện của isopalhinine A (31) – một alkaloid Lycopodium mới có vòng năm (pentacyclic) theo hệ số 5/6/6/7, cùng với palhinine B (32) và palhinine C (33) [8, 9] Bên cạnh các Lycopodium alkaloid, cây Thông đất còn chứa các alkaloid cernuane như cernuine (34), lycocernuine (35) và 2-hydroxycernuine (36) [6].

Bảng 1.1 Một số alkaloid phân lập từ loài Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm

Tên chất Ký hiệu TLTK

Năm 2006, nhóm nghiên cứu Ren.X.Tan đã phân lập được ba flavonoid là dẫn xuất của apigenin Trong số này có một hợp chất mới là apigenin-4′-O-(2′′-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside (39), và hai hợp chất đã biết là các dẫn suất của apigenin.

O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside (40), apigenin-4′-O-(2′′,6′′-di-O-p- coumaroyl)-β-D-glucopyranoside (41) [12].

Trong công bố năm 2020, Gui-Shan Tan và nhóm nghiên cứu của mình đã phân lập được tám hợp chất flavonoid mới và một hợp chất đã biết, gồm palhinoside A-H (47–54) và apigenin-7-O-(6″-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside (55) [13].

Bảng 1.2 Một số flavonoid phân lập từ loài Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm

Tên chất Ký hiệu TLTK

Apigenin-4′-O-(2′′-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside 39 [12, 14] Apigenin-4′-O-(6′′-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside 40

Thông đất là loài thực vật chứa lượng lớn các terpenoid Theo các công bố trên thế giới và Việt Nam, các terpenoid phân lập từ loài này chủ yếu là các serratane triterpenoid

Serratane triterpenoid là các triterpene gồm 5 vòng ngưng tụ, trong đó có 1 vòng

7 cạnh (vòng C) và có chứa 2 nhóm methoxy ở vị trí C-3 và C-21 Hợp chất này có một liên kết đôi nằm ở vị trí C-14/C-15, đôi khi nó có thể bị oxy hóa thành nhóm hydroxyl hoặc cầu oxy [15]

Năm 2002 Zhang và các cộng sự đã phân lập được 6 serratane-triterpenoid mới là lycernuic acid C-E (56-58), lycernuic ketone A-C (59-61) [16]

Theo một công bố của Tan và nhóm nghiên cứu vào năm 2012, có 4 hợp chất serratene triterpenoid mới cùng 2 hợp chất đã biết được phân lập từ phân đoạn ethyl acetate Đó là các hợp chất 3β,21β,24-trihydroxyserrat-14-en-24-(4′-hydroxybenzoate) (62), 3β,21α,24-trihydroxyserrat-14-en-3-(4′- hydroxybenzoate) (63), 3β,14α,15α,21α-tetrahydroxyserrat-14-en-3-(3′-methoxy-4′- hydroxybenzoate) (64), 3β,14α,15α,21α-tetrahydroxyserrat-14-en-21-acetyl-3-(4′- hydroxybenzoate) (65), 3β,21β,24-trihydroxyserrat-14-en (66) và 3α,21β,24,29- tetrahydroxy-16-oxoserrat-14-en (67) [11].

Trong một nghiên cứu nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học ở loài Thông đất, nhóm nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được một nhóm serratane triterpenoid, bao gồm lycernuic ketone D (68), lycernuic ketone E (69), 3α,21β,24-trihydroxyserrat-14-en-16-one (70) và lycernuic A (71) [17].

T ổ ng quan v ề chi Kadsura Juss

1.3.1 T ổ ng quan chung về thành phần hóa học chi Kadsura Juss

Chi Na rừng, còn gọi là Nắm cơm (Kadsura Juss.), thuộc họ Ngũ vị (Schisandraceae Blume.), có khoảng 16 loài phân bố chủ yếu ở khu vực châu Á Tại Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ, chi này có 4 loài; theo Nguyễn Tiến Bân có 5 loài và 1 thứ là: Nắm cơm lá hẹp (K angustifolia A.C Smith), Na rừng (K coccinea (Lem.) A C Smith.), Xửn xe tạp (K heteroclita (Roxb.) Craib.), Ngũ vị

15 nam (K longipedunculata Fin & Gagnep.), Nắm cơm lá thuôn (K oblongifolia Merr.), Xưn xe trung bộ (K coccinea var annamensis (Gagnep.) Ban) [3]

Thành phần hóa học chính của các thực vật thuộc chi này là các terpenoid, flavonoid và lignan

1.3.2 Các terpenoid Ở chi này, các terpenoid đặc trưng nhất là các triterpenoid và tập trung vào 4 bộ khung chính là: lanostane (3,4-seco-lanostane; 14(13→12)-abeolanostane; 18

(13→12)-abeolanostane, norlanostane và các nhóm lanostane triterpenoid khác); kadlongilactone; cycloartane (cycloartane; 3,4-secocycloartane; 14(13→12)-abeo- cycloartane; 3,4:9,10-disecocycloartane); schinortriterpenoid và các triterpenoid khác [23]

Hình 1.2 Cấu trúc khung terpenoid từ chi Kadsura Juss

Có rất ít công bố về flavonoid từ các loài thuộc chi Kadsura Juss Các flavonoid phần lớn thuộc dẫn xuất của catechin [24] và anthocyanin [25]

1.3.4 Lignan Đây là nhóm chất chính được phân lập từ các loài thuộc chi Kadsura Juss Trong thời gian từ 2014-2021 đã có 81 lignan được công bố [26] và tập trung vào 5 bộ khung chính là: dibenzocyclooctadiene, spirobenzofuranoid, alryltetralin, diarylbutane và tetrahydrofuran

Hình 1.3 Cấu trúc khung lignan từ chi Kadsura Juss.

T ổ ng quan v ề loài Na r ừ ng (Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.)

1.4.1 Đặ c điể m th ự c v ậ t cây Na rừng

- Tên Việt Nam: Na rừng, tên khác: Nắm cơm, (dây) Xưn xe, Ngũ vị nam…

- Tên khoa học: Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm

- Phân lớp: Ngọc lan - Magnoliidae

- Loài: Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm

Hình 1.4 Hình ảnh cây Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.)

Đây là một dây leo lớn có nhánh mọc trườn, thân mỏng phủ lớp lông tuyết màu sẫm và sau đó có lỗ bì hình dải Lá bầu dục hay thuôn, có gốc góc, thon hẹp, tù, dài 6–10 cm, rộng 3–4 cm, mặt dưới nhạt màu và rất nhẵn Hoa đơn tính mọc ở nách lá, dài khoảng 15 mm và rộng 10 mm, màu tím Quả giống như quả na to Cây na rừng phân bố rải rác trong rừng ở độ cao 400–800 m Cây ra hoa vào tháng 5–6, có quả tháng 8–9 Hình ảnh được lấy từ PlantsofTheWorldOnline và ScienceDirect.

1.4.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến

Phân bố tại các tỉnh thành Việt Nam bao gồm Lào Cai, Yên Bái, Thái Nguyên (Đại Từ, Linh Thông); Lạng Sơn (Văn Quan); Vĩnh Phúc (Tam Đảo); Hà Nội (Ba Vì); Quảng Trị (Đông Trị); Kon Tum và Lâm Đồng (Di Linh, Braian, Bảo Lộc) Ngoài ra, còn có ở Trung Quốc, Lào, Thái Lan và Myanmar.

1.4.1.4 Tính vị, tác dụng, công dụng

Rễ có vị cay ấm, hơi đắng và có hương thơm, có tác dụng hành khí chỉ thống, hoạt huyết tán ứ và khứ phong tiêu thũng Quả cũng có tác dụng hành khí chỉ thống, hoạt huyết và tán ứ Thân và lá có vị chua ngọt, tính hơi ấm; có tác dụng hoạt vị, tán ứ, tiêu thũng, giải độc, hành khí và chỉ thống.

Quả Na rừng ăn được, và quả Na rừng rang lên được dùng làm thuốc an thần và gây ngủ Rễ cây có tác dụng viêm ruột mạn tính, viêm dạ dày - ruột cấp tính, viêm loét dạ dày và hành tá tràng, đồng thời được dùng trong điều trị các triệu chứng phong thấp đau xương, đau do chấn thương (đòn ngã ứ đau), đau bụng trước khi hành kinh, đau sau sinh và sưng vú.

Trong dân gian thường dùng vỏ thân, vỏ rễ làm thuốc bổ, kích thích thích tiêu hóa, giảm đau [1].

1.4.2 Th à nh ph ầ n h ó a h ọ c cây Na r ừ ng

Các công trình nghiên cứu trên thế giới và trong nước đã phân tích và xác định thành phần hóa học của Na rừng Kết quả cho thấy các hợp chất chính gồm terpenoid, flavonoid, lignan và steroid Những thành phần này đóng vai trò quan trọng trong đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng trong dược liệu và sản phẩm chăm sóc sức khỏe Nghiên cứu tiếp tục đi sâu vào cấu trúc, cơ chế tác dụng và khả năng khai thác thương mại của từng nhóm hợp chất.

1.4.2.1 Các nghiên cứu ngoài nước a Các terpenoid

Theo một báo cáo vào năm 2020, các terpenoid được phân lập từ Na rừng chủ yếu là sesquiterpenoid và triterpenoid [27]

Trong các triterpenoid, phần lớn tập trung vào khung lanostane, seco-lanostane, kadlongilactone, cycloartane và seco-cycloartane, cùng với nortriterpenoid Trong khung lanostane, điển hình có coccinilactone A-B (93-94) [28] và kadcoccinone D-F (95-97) [29]; khung seco-lanostane gồm seco-coccinic acid A-B (98-99) [30]; khung kadlongilactone có kadcoccilactone K-M (100-102) [31]; các triterpenoid cycloartane có kadcoccilactone Q (103) [31]; khung seco-cycloartane có coccinetane A-B (104-105) [32]; và nortriterpenoid như kadcoccilactone A-E (106-110) [33].

Năm 2008, Gao và cộng sự đã phân lập được từ dịch chiết acetone của thân cây

Na rừng các triterpenoid là kadcoccilactone A-J (106-115); 2 triterpenoid đã biết là kadsuphilactone A và micrandilactone B [33]

Trong công bố của Wang và cộng sự năm 2008, 7 hợp chất triterpenoid khung lanostane được phân lập từ rễ của loài này, gồm seco-coccinic acid A-B (98-99), seco-coccinic acid C-F (116-119) và coccinilactone A (93) [28] Đến năm 2009, nhóm này tiếp tục phân lập thêm 5 triterpenoid khung lanostane mới từ dịch chiết ethanol của rễ cây Na rừng, bao gồm Coccinone A-D (120-123) và coccinilactone B (94) [34].

Theo Li và cộng sự vào năm 2012, các triterpenoid từ cây Na rừng có thể kể đến neokadsuranic acid B (124), kadsuracoccin acid A (125) và anwuweizonic acid

Vào năm 2010, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được một triterpenoid mới thuộc khung lanost-9(11)-3-one từ rễ cây Na rừng Hợp chất này được xác định là 3-hydroxy-12-acetoxycoccinic acid và được ghi nhận là hợp chất số 127 trong nghiên cứu [36].

Huang và cộng sự đã phân lập được thêm 2 triterpenoid mới từ thân cây trong một công bố năm 2019 Đó là kadsuricoccin A-B (128-129) [37]

Ngoài các triterpenoid đặc trưng, các nhà khoa học còn phân lập được các sesquiterpenoid Năm 2016, Hu và cộng sự đã công bố sự xuất hiện của kadcoccinin

A (131) và kadcoccinin B (132) – các sesquiterpenoid được phân lập từ thân cây Na rừng [38].

Bảng 1.5 Một số terpenoid phân lập từ loài Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm

Tên chất Ký hiệu TLTK

20(R),24(E)-3-Oxo-9β-lanosta-7,24-dien-26-oic acid 130 [39]

Một lượng flavonoid nhỏ được phân lập từ cây Na rừng Theo nghiên cứu của Gao và cộng sự năm 2012, bên cạnh các lignan, một flavonoid được phân lập từ cây Na rừng là ascovertin, được ghi nhận trong tài liệu [40].

Năm 2020, Mi Hee Woo và cộng sựđã công bố một số flavonoid phân lập từ rễ của loài thực vật này là: (-)epi-catechin (133), (+)gallocatechin (134), catechin

Theo một tổng hợp của Yang và cộng sự vào năm 2020, các lignan có ở Na rừng tập trung vào 4 bộ khung chính [27]:

Các lignan dibenzocyclooctadiene đã được công bố với 58 hợp chất khác nhau, cho thấy sự đa dạng về cấu trúc do liên kết với các nhóm thế khác nhau trên khung lõi dibenzocyclooctadiene Nhóm methoxy là nhóm thế phổ biến nhất, bên cạnh các nhóm thế như acetyl, angeloyl, tigloyl, propanoyl, benzoyl, cinnamoyl và butyryl Một số hợp chất điển hình gồm schisantherin P-Q (136-137) [41], kadsuralignan I (138) [42], kadsuralignan J (139), kadsuralignan F (140) [43], neokadsuranin (141) [44], kadsuralignan G (142) [45], và isovaleroylbinankadsurin A.

Fang và cộng sự đã phân lập được 5 spirobenzofuranoid dibenzocyclooctadiene lignan từ cặn ethyl acetate của rễ cây K.coccinea, gồm schiarisanrin B (144), heteroclitin D (145) kadsulignan H-I (146-147), và schiarisanrin A (148) [46]

Li và cộng sự cũng công bố sự xuất hiện của kadsulignan E (149) và F (150) trong một nghiên cứu từ rễ của cây Na rừng [47]

Li và cộng sự đã phân lập được kadsuralignan C (151) từ dịch chiết chloroform của thân cây Na rừng; đây là hợp chất đầu tiên trong nhóm này được báo cáo [48].

Yeon và cộng sự thu được (7′S,8′S,8R)-(8β,8′α)-dimethyl-4,4′-dihydroxy-5,3′- dimethoxy-5′-cyclolignan glucoside (152) [49]

Năm 2007, nhóm nghiên cứu của Li đã phân lập được kadsuralignan H (153) từ cặn chiết ethyl acetate của rễ cây Na rừng [42]

Các hợp chất Kadsurindutin E (154), coccilignan A (155) và meso-dihydroguaiaretic acid (156) đã được nhóm nghiên cứu của Fang và cộng sự phân lập và xác định cấu trúc từ cặn ethyl acetate chiết từ rễ cây Na rừng [46] Ngoài ra, hợp chất kadcoccilignan (157) cũng được Gao và cộng sự công bố vào năm 2012 [40].

Bảng 1.6 Các lignan phân lập từ loài Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm

Tên chất Ký hiệu TLTK Tên chất Ký hiệu

Kadsulignan H 146 Kadcoccilignan 157 [40] d Các hợp chất khác

Ngoài thành phần chính là terpeneoid, lignan, flavonoid, trong cây Na rừng còn chứa một số hợp chất khác như β-sitosterol (158) và β-sitosteryl-3-O-β-D- glucopyranoside (159) [39]

1.4.2.2 Các nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, năm 2009, nhóm nghiên cứu của Ninh Khắc Bản và cộng sự đã phân lập được một hợp chất 3,4-seco-lanostane triterpenoid là seco-coccinic acid F

(119) và 1 hợp chất đã biết là 20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta-7,24-dien-26-oic acid (130) từ cặn chiết methanol từ rễ cây Na rừng [39]

Trong một báo cáo tại Hội nghị khoa học ở Việt Nam vào năm 2009, từ rễ cây

Ở rừng Tràng Định (Lạng Sơn), các nhà khoa học đã tiến hành chiết tách tinh dầu từ rễ cây Na rừng và xác định thành phần hóa học của chúng Kết quả cho thấy tinh dầu rễ Na rừng chứa 36 hợp chất được xác định, trong đó có α-pinene, camphene, α-terpeniol, β-caryophyllene, 1,2,3-trimethyl và β-himachalene, mở ra triển vọng ứng dụng và nghiên cứu sâu về thành phần hóa học của loài cây này [50].

Các hợp chất và dịch chiết được phân lập từ cây Na rừng thể hiện nhiều hoạt tính sinh học nổi bật, bao gồm gây độc tế bào, kháng HIV, chống viêm gan, chống oxy hóa và tác dụng bảo vệ thần kinh Những đặc tính này làm nổi bật tiềm năng của cây Na rừng trong nghiên cứu dược liệu và phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe dựa trên các hợp chất tự nhiên.

1.4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào

Kasuracin A thể hiện tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư đáng kể với IC50 dao động từ 1,05 đến 11,31 µg/mL trên bốn dòng tế bào người là HCT116, A549, HL-60 và HepG2 Các kết quả cho thấy mức độ nhạy khác nhau giữa các dòng tế bào, phản ánh đặc tính sinh học và cơ chế đáp ứng riêng biệt của kasuracin A Nghiên cứu gợi ý tiềm năng của kasuracin A như một chất chống ung thư, đồng thời cần thêm đánh giá sâu hơn về cơ chế tác dụng và tối ưu hóa điều kiện thử nghiệm để làm rõ hiệu quả trên các loại ung thư khác nhau.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Đối tượ ng nghiên c ứ u

2.1.1 Loài Thông đất ( Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.)

Toàn bộ thân cây Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.) được thu hái tại Sapa, Lào Cai, Việt Nam vào tháng 3 năm 2017 Mẫu thực vật được định danh bởi TS Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST) Mẫu tiêu bản (NCCBG.01.20) được lưu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, VAST.

2.1.2 Loài Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.)

Lá cây Na rừng Kasura coccinea (Lem.) A C Smith được thu hái vào tháng 5 năm 2017, trong khi thân cây được thu hái vào tháng 5 năm 2018 tại Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Mẫu thực vật được định danh bởi PGS.TS Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST) Mẫu tiêu bản KC201705 và KC201805 được lưu tại Viện Kỹ thuật Hóa học, Đại học Bách Khoa Hà Nội.

*Nguồn ảnh từ đề tài Nafosted mã 104.01-2018.07

*Ngu ồ n ả nh t ừ đề tài Nafosted mã 104.01-2019.318

Hình 2.1 Mẫu các loài thực vật

Phương pháp nghiên cứ u

2.2.1 Phương pháp phân lập chất

Sắc ký cột (CC) được thực hiện trên silica gel (Kieselgel 60, 70–230 mesh và

230–400 mesh, Merck), silica gel pha đảo YMC (ODS-A, 12 nm, S-150 mm, YMC Co., Ltd., Nhật Bản), gel polyme xốp (Diaion® HP-20, 20–60 mesh, Mitsubishi

Chemical, Tokyo, Japan), nhựa Sephadex ™ LH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences

Trong quy trình TLC, hai loại nền được dùng từ AB, Uppsala, Thụy Điển và YMC RP-18 (30–50 μm, Fuji Silysia Chemical) Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên các tấm silica gel 60 F254 (1.05554.0001, Merck) và RP-18 F254S (1.15685.0001, Merck) đã được tráng trước Để phát hiện các chất, mẫu được phun bằng dung dịch H2SO4 10% và nung nóng 1,5–2 phút để hiện thị các vệt trên tấm TLC.

2 2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các chất

Cấu trúc các hợp chất phân lập được xác định dựa vào các thông số vật lý kết hợp với các phương pháp phổ hiện đại

2.2.2.1 Góc quay cực riêng của một hợp chất quang hoạt chứa các trung tâm bất đối, được đo trên máy JASCO P-2000 Polarimeter (Tokyo, Nhật Bản) tại Viện Hóa sinh biển, VAST

Phổ HR-ESI-MS là công nghệ cho phép xác định chính xác khối lượng của các ion mảnh (fragment ion) hoặc phân tử nhờ độ phân giải cao Phổ được đo trên máy Agilent 6530 Accurate-Mass mass spectrometer (CA, Mỹ) tại Viện Hóa học, VAST, nhằm xác định thành phần mẫu với độ chính xác cao.

2.2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ NMR được đo trên các hệ máy Bruker AVANCE III HD 500 (Bruker, Đức) và Bruker AVANCE III HD 500 (MA, Mỹ) ở chế độ FT-NMR, thuộc Viện Hóa học, VAST; đồng thời máy JEOL JNM-AL 400 MHz cũng được sử dụng để đo phổ NMR Chất nội chuẩn được dùng là TMS (Tetramethyl silane).

- Các kỹ thuật phổ NMR được sử dụng bao gồm:

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1 H-NMR, 13 C-NMR

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMQC, HMBC, 1 H- 1 H COSY, NOESY

Các dung môi được sử dụng gồm DMSO-d6, methanol-d4, chloroform-d1 và pyridine-d5 Việc lựa chọn dung môi phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu; nguyên tắc cơ bản là dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu để đảm bảo kết quả phân tích chính xác Việc tối ưu dung môi giúp nâng cao hiệu quả hòa tan, giảm nhiễu tín hiệu và tăng độ lặp lại của phép đo Khi chọn dung môi cần xem xét tính tương thích với quy trình phân tích và tính ổn định của mẫu, nhằm đảm bảo quá trình phân tích diễn ra ổn định và đáng tin cậy.

2.2.2.4 Phổ lưỡng sắc tròn (CD)

Phổ CD dùng để xác định cấu trúc tuyệt đối của các hợp chất phân lập từ tự nhiên có các trung tâm carbon bất đối, được đo trên máy Chirascan spectrometer (Applied Photophysics, Vương quốc Anh) tại Viện Hóa sinh biển, VAST.

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bàovà ức chế sinh trưởng tế bào ung thư

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các mẫu dịch chiết và các chất tinh sạch được đánh giá trên ba dòng tế bào ung thư: HepG2 (ung thư gan), SK-Mel-2 (ung thư da melanoma) và MCF7 (ung thư vú), tại Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Khả năng ức chế sinh trưởng tế bào ung thư của các dòng tế bào HCT-15 (ung thư đại tràng), NUG-3 (ung thư dạ dày), NCI-H23 (ung thư phổi), ACHN (ung thư thận), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt) và MDA-MB-231 (ung thư vú) được đánh giá tại Phòng thí nghiệm Hóa học các sản phẩm tự nhiên biển, Viện Khoa học và Công nghệ Đại dương Hàn Quốc, Busan, Hàn Quốc Nghiên cứu tập trung vào tiềm năng sinh học của các sản phẩm tự nhiên từ biển đối với điều trị ung thư thông qua thử nghiệm trên các dòng tế bào nói trên Các kết quả cho thấy khả năng ức chế tăng sinh tế bào ở một số dòng ung thư, cho thấy triển vọng ứng dụng dược liệu biển trong phát triển liệu pháp ung thư Đây là đóng góp cho lĩnh vực dược học biển và nghiên cứu kháng ung thư từ nguồn tự nhiên, hỗ trợ định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo.

- FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma)

- Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pipette, eppendorf, máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-Rad), đầu đọc vi tấm VersaMax (LLC, Sunnyvale, CA, USA)

- Chất tham khảo: Ellipticine (Sigma, USA), adriamycin (Sigma, USA).

- Các hóa chất thông thường khác

These cancer cell lines were provided by Prof Dr J M Pezzuto of the University of Hawaii and Prof Dr Jeanette Maier of the University of Milan, Italy, in collaboration with the American Type Culture Collection (ATCC) in Manassas, VA, USA.

❖ Nguyên lý của phép thử [56]:

Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử chuẩn nhằm sàng lọc và phát hiện các chất có khả năng kiềm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt tế bào ung thư trong điều kiện nuôi cấy in vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks.

Phép thử xác định hàm lượng protein tế bào tổng dựa trên mật độ quang học (OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với các phân tử protein, vì vậy số lượng tế bào và lượng protein càng lớn sẽ cho OD càng cao Phép thử được thực hiện ở các điều kiện đã được chuẩn hóa cho quá trình nhuộm SRB và đo OD, cho phép ước lượng nhanh chóng và hiệu quả hàm lượng protein tế bào.

Các mẫu thử nghiệm được hòa tan trong DMSO và chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau (0,5; 2; 10; 20 và 40 μM) bằng phương pháp pha loãng tương ứng với môi trường tăng trưởng, nhằm đảm bảo sự đồng nhất của mẫu và phù hợp với yêu cầu thí nghiệm.

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm

- Chất thử (10 L) đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm

190 L tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử trong giếng là 100 g/mL, 20 g/mL; 4 g/mL; 0,8 g/mL

Ủ trong tủ ấm 48 giờ Những giếng không có chất thử nhưng có TBUT (190 μL) sẽ được dùng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 chứa tế bào sẽ được cố định bằng trichloroacetic acid 50% (50 μg/mL) – TCA.

- Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB 0.4% trong 30 phút ở 37 o C, rửa 3 lần bằng acetic acid 1% rồi để khô ở nhiệt độ phòng

- Thuốc nhuộm liên kết với protein được chiết với base Tris 10 mM ở pH 10,5 để xác định mật độ quang học

- Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy đọc ELISA (Bio-Rad) và đầu đọc vi tấm VersaMax

- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽđược xác định thông qua công thức sau:

[OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100 % ức chế = 100% -

OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0)

- Phép thửđược lặp lại 3 lần đểđảm bảo tính chính xác

Ellipticine ở các nồng độ 10 μg/mL, 2 μg/mL, 0,4 μg/mL và 0,08 μg/mL được sử dụng làm chất đối chứng dương trong các thử nghiệm gây độc tế bào; Adriamycin được sử dụng làm chất đối chứng dương trong các thử nghiệm ức chế tăng trưởng tế bào ung thư.

Trong thí nghiệm này, DMSO 10% được dùng làm đối chứng âm để so sánh với các điều kiện thử nghiệm Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định bằng phần mềm TableCurve 2Dv4.

TH Ự C NGHI Ệ M

Phân l ậ p các h ợ p ch ấ t t ừ loài Thông đấ t (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.)

3.1.1 Quy trình phân lập các chất

Toàn cây Thông đất sau khi thu hái được rửa sạch, phơi khô và nghiền nhỏ, cho thu được 5,2 kg bột dược liệu khô Lượng bột này được ngâm chiết bằng methanol ở nhiệt độ phòng, 3 lần với tổng thể tích 30 L trong 24 giờ Dịch chiết methanol được đem cô quay và thu được cặn chiết tổng 360 g Cặn chiết tổng được hòa vào 2 L nước và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexane và ethyl acetate, rồi cô quay ở áp suất giảm để thu được các cặn chiết n-hexane (H), cặn chiết ethyl acetate (E) và dịch chiết nước (W) Sơ đồ quy trình ngâm chiết được thể hiện trên hình 3.1.

Hình 3.1 Sơ đồ ngâm chiết thân cây Thông đất

Dịch nước được phân tách trên cột Diaion HP-20 và rửa giải với hệ dung môi

MeOH/nước với tỷ lệ lần lượt là 100/1; 50/50 và 100/0) thu được 3 phân đoạn W1-

3 Phân đoạn W2 (3,2 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP18 sử dụng hệ dung môi rửa giải là MeOH/nước (1/2 đến 2/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ (W2A-W2D) Hợp chất LC1 (1,0 mg) thu được từ phân đoạn W2A tinh chế trên cột pha đảo RP18 hệ MeOH/acetone/H2O (8/1/1) và chạy qua cột Sephadex™ LH-20

Phân đoạn W2C được chạy sắc ký cột pha thường với hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6/5/0,04/0,1) thu được 3 phân đoạn nhỏ W2C1-W2C3

LC18 được thu với khối lượng 3,0 mg bằng hai bước tinh chế: phân đoạn W2C1 trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải EtOAc/MeOH/H2O (7/1/0,1), và sau đó tinh sạch trên cột Sephadex LH-20 bằng hệ dung môi MeOH/H2O (1/1) Quá trình kết hợp giữa sắc ký cột silica gel và gel lọc Sephadex LH-20 cho phép tách và cô lập LC18 ở dạng tinh khiết.

Phân đoạn W2C3 (150 mg) được thực hiện trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi EtOAc/MeOH/H2O (7/1/0,1) và sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ dung môi MeOH/H2O ở tỷ lệ 1/3 và 1/2, cho thu được LC19 (4,0 mg), LC20 (13,0 mg) và LC2 (4,0 mg) Phân đoạn W2D (640,0 mg) được tiến hành bằng sắc ký cột pha thường với hệ dung môi chưa được nêu rõ.

CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6,5/1/0,04/0,1) và cột Sephadex™ LH-20 rửa giải bằng hệ dung môi MeOH/acetone/H2O (8/1/1) thu được hợp chất LC3 (3,0 mg) và LC4 (24,0 mg)

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập dịch nước của cây Thông đất

Cặn chiết Ethyl acetate (60 g) được tách thành 4 phân đoạn nhỏ E1-E4 bằng sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexane/EtOAc (10/1 đến 0/1) Phân đoạn E3 (30 g) được tiếp tục sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexane/EtOAc (20/1 đến 1/1) và thu được 4 phân đoạn nhỏ E3A-E3D.

Tinh chế phân đoạn E3B (7,0 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môi acetone/H2O (4/3) thu được hợp chất LC6 (2,5 mg) và LC12 (9,0 mg)

Phân đoạn E3C (14,0 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo hệ dung môi MeOH/H2O (1/1) và tinh chế thêm trên cột sắc ký pha thường hệ dung môi

CH2Cl2/acetone (6/1) thu được các hợp chất LC5 (10,0 mg); LC7 (2,0 mg); LC8

Tinh chế phân đoạn E3D (2,8 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môi acetone/H2O (1/3) và tinh chế thêm trên cột silica gel pha thường hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH (20/1) thu được hợp chất LC16 (10,0 mg) và LC17 (5,0 mg)

Tiến hành sắc ký cột pha thường phân đoạn E4 (15g) hệ dung môi n- hexane/EtOAc (6/1 đến 1/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ E4A-E4D

Quá trình tinh chế phân đoạn E4A (1,4 g) được thực hiện lần lượt trên sắc ký cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH/H2O (8/1) và trên cột Sephadex™ LH-20 bằng hệ MeOH/H2O (1/1); từ đó thu được các hợp chất LC10 (10,0 mg), LC11 (50,0 mg), LC13 (15,5 mg và LC14 (5,0 mg).

Phân đoạn E4D (1,0 g) được tinh chế trên sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ dung môi acetone/H2O, rồi tiếp tục sắc ký cột pha thường và rửa giải bằng hệ dung môi phù hợp để tối ưu hóa độ tinh khiết và hiệu quả tách riêng các thành phần.

CH2Cl2/MeOH (15/1) thu được hợp chất LC15 (6,0 mg)

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập cặn EtOAc của cây Thông đất 3.1.2 Thôn g số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ loài Thông đất

3.1.2.1 Hợp chất LC1: Lycocernuaside E (hợp chất mới)

KLPT chính xác (tính toán) [C25H32O12Cl] - : 559,1588

Công thức phân tử: C25H32O12, Mw = 524 g/mol

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.1

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.2

3.1.2.3 Hợp chất LC3: Bombasin 4-O-β-D-glucopyranoside

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.3

3.1.2.4 Hợp chất LC4: Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D- glucopyranoside

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.4

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.5

3.1.2.6 Hợp chất LC6: Lycernuic B (hợp chất mới)

Góc quay cực riêng: − 54.3 (c 0,04, MeOH)

KLPT chính xác (tính toán) [C37H55O6] - : 595,4004

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.6

3.1.2.7 Hợp chất LC7: Lycocernuic ketone F (hợp chất mới)

Góc quay cực riêng: − 31,6 (c 0,1; MeOH)

KLPT chính xác (tính toán) [C30H49O4] + : 473,3625

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.7

3.1.2.8 Hợp chất LC8: Lycernuic ketone C

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng 4.1.8

3.1.2.9 Hợp chất LC9: Lycernuic ketone B

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.9

1H-NMR(500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng 4.1.10

3.1.2.11 Hợp chất LC11: 3-epi-lycoclavanol

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng 4.1.11

3.1.2.12 Hợp chất LC12: Methyl lycernuate B

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng 4.1.12

3.1.2.13 Hợp chất LC13: Lycernuic acid B

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng 4.1.13

3.1.2.14 Hợp chất LC14: 3β,21β,24-trihydroxyserrat-14-en-16-one

1H-NMR(500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13 C-NMR(125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng 4.1.14

3.1.2.15 Hợp chất LC15: Apigenin-4′-O-(2′′-O-p-coumaroyl)-β-D-

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.15

3.1.2.16 Hợp chất LC16: Apigenin-4′-O-(6′′-O-p-coumaroyl)-β-D- glucopyranoside

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ): xem Bảng 4.1.16

3.1.2.17 Hợp chất LC17: Apigenin-4′-O-(2′′,6′′-di-O-trans-p-coumaroyl)-β-D- glucopyranoside

Chất bột màu vàng nhạt

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) xem Bảng 4.1.17

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.18

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR(125 MHz, CD3OD):xem Bảng 4.1.19

3.1.2.20 Hợp chất LC11: Cermizine C N-Oxide

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.20

Phân l ậ p các ch ấ t t ừ loài Na r ừ ng (Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.)

Thân Na rừng sau khi thu hái được rửa sạch, phơi khô, chặt và nghiền nhỏ, cho thu 5,5 kg bột khô; bột này được chiết bằng methanol 80% với dung tích 6 L cho mỗi lần, thực hiện 3 lần liên tiếp ở nhiệt độ phòng và mỗi lần kéo dài 48 giờ; dịch chiết methanol thu được sau các lần chiết được ghép lại và cô quay ở áp suất giảm nhằm thu được dung dịch cô đặc chứa tinh chất.

320 g cặn chiết được hòa tan vào 2 L nước Cặn chiết này sau đó được phân bố chiết bằng cách lần lượt dùng n-hexane (1 L x 3 lần) và ethyl acetate (1 L x 3 lần), phần còn lại là nước Các dịch chiết được cô quay ở áp suất giảm để thu được các cặn chiết tương ứng, được ký hiệu là cặn H.

Phân đoạn ethyl acetate được thực hiện bằng sắc ký cột pha rắn với chất hấp phụ silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH từ 0% đến 100%, cho ra 12 phân đoạn nhỏ (KCE1–KCE12), được xác định và phân chia dựa trên dữ liệu sắc ký lớp mỏng (TLC) của từng phân đoạn.

Phân đoạn KCE3 (7,5 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP18, rửa giải bằng hệ acétone/metanol/nước (1/1/1,5), thu được 6 phân đoạn nhỏ (KCE3A-KCE3F) Phân đoạn KCE3B (320 mg) được tinh chế trên cột Sephadex LH-20, rửa giải bằng metanol, thu được hợp chất KC13 (5,6 mg).

Phân đoạn KCE3D (550 mg) được sắc ký cột pha thường rửa giải hệ

CH2Cl2/EtOAc (5/1) thu được hợp chất KC15 (6,1 mg)

Phân đoạn KCE3F (625 mg) được tinh chế trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexane/acetone (4/1) thu được hợp chất KC14 (7,1 mg)

Phân đoạn KCE5 (200 mg) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP18, rửa giải bằng acetone/H2O (1,2/1) để thu được hợp chất KC1 (5,8 mg)

Quá trình sắc ký cột pha đảo RP18 phân đoạn KCE6 (8,3 g) rửa giải bằng hệ dung môi MeOH/H2O (1,5/1) cho 5 phân đoạn nhỏ (KCE6A–KCE6E) Phân đoạn KCE6B (350 mg) được tinh chế thêm bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi EtOAc/acetone (3/1,2) thu được KC2 (8,5 mg) và KC3 (5,5 mg) Hợp chất KC4

(6,2 mg) thu được từ phân đoạn KCE6E (320 mg) bằng sắc ký cột RP18 và rửa giải bằng hệ dung môi acetone/H2O (1,3/1)

Như vậy, từ thân cây Na rừng đã phân lập được 7 hợp chất, từ KC1-KC4 và

Hình 3.4 Sơ đồ phân lập chất từ thân cây Na rừng 3.3.1.2 Từ lá cây

Lá cây Na rừng sau khi thu hoạch được rửa sạch, phơi khô và nghiền thành bột để thu được bột khô; bột này được chiết bằng methanol 95% ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ để thu dịch chiết methanol Dịch chiết MeOH sau đó được cô đặc dưới áp suất để thu được cặn chiết, cặn chiết này được hòa vào nước và tiến hành phân bố bằng các dung môi hữu cơ n-hexane và CH2Cl2 (dichloromethane), cùng với lớp nước để tách các pha và chuẩn bị cho các bước xử lý tiếp theo.

Phân đoạn CH2Cl2 (11 g) được tách trên sắc ký cột silica gel và rửa giải bằng hệ dung môi MeOH/CH2Cl2 từ 0–100%, thu được 8 phân đoạn nhỏ (KCB1–KCB7) Phân đoạn KCB5 (0,2 g) được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 bằng dung môi MeOH/H2O (1/1), thu được KC5 (4,5 mg).

Phân đoạn KCB6 (1,2 g) được tiến hành bằng sắc ký cột pha thường và rửa giải bằng hệ n-hexane/CH2Cl2/MeOH/H2O (1/3/1) Tiếp tục tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ acetone/H2O (1/1,8), thu được KC6 (4,3 mg).

Lớp H2O được phân tách trên cột Diaion HP-20 bằng hệ dung môi MeOH trong nước (từ 0% đến 100%) thu được bảy phân đoạn (KCC1 ‒ KCC7)

Hợp chất KC7 (2,7 mg) và KC8 (6,3 mg) thu được từ sắc ký cột pha đảo RP18 phân đoạn KCC2 (0,35 g) hệ dung môi acetone/H2O (1/2,5)

Phân đoạn KCC3 (0,16 g) được tiến hành sắc ký cột pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc/MeOH/H2O (5/1/0,02) để thu được hợp chất KC11 (5,2 mg) Phân đoạn KCC4 (0,86 g) được phân tách trên cột silica gel pha thường hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (7/1), tinh chế thêm trên Sephadex LH-20 và rửa giải bằng hệ dung môi MeOH/H2O (1/1) để thu được hợp chất KC10 (5,9 mg).

Hợp chất KC9 (4,5 mg) thu được từ phân đoạn KCC5 (0,72 g) trên sắc ký cột pha đảo RP18 rửa giải bằng hệ dung môi acetone/H2O (1/1,6)

Phân đoạn KCC6 (1,08 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ dung môi acetone/H2O (1/1,2) để thu được hợp chất KC12 (6,3 mg)

Như vậy, từ lá cây Na rừng đã phân lập được 8 hợp chất, từ KC5-KC12

Hình 3.5 Sơ đồ phân lập chất từ lá cây Na rừng

3.2 2 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ loài Na rừng 3.2.2.1 Hợp chất KC1: Kadnanolactone H

1H-NMR(400 MHz, pyridine-d 5 ) và 13 C-NMR(100 MHz, pyridine-d 5 ): xem Bảng 4.2.1

1H-NMR(400 MHz, pyridine-d 5 ) và 13 C-NMR(100 MHz, pyridine-d 5 ): xem Bảng 4.2.2

3.2.2.3 Hợp chất KC3: Kadcoccilactone V (hợp chất mới)

KLPT chính xác (tính toán) [C29H41O9] + : 533,2751

1H-NMR(400 MHz, pyridine-d 5 ) và 13 C-NMR(100 MHz, pyridine-d 5 ): xem Bảng 4.2.3

1H-NMR(400 MHz, pyridine-d 5 ) và 13 C-NMR (100 MHz, pyridine-d 5 ): xem Bảng 4.2.4

3.2.2.5 Hợp chất KC5: Kadsuracin A (hợp chất mới)

KLPT chính xác (tính toán) [C30H34O10NH4] + : 572,2496

1H-NMR(400 MHz, chloroform-d 1 ) và 13 C-NMR(100 MHz, chloroform-d 1 ): xem Bảng 4.2.5

1H-NMR(400 MHz, chloroform-d 1 ) và 13 C-NMR(100 MHz, chloroform-d 1 ): xem Bảng 4.2.6

3.2.2.7 Hợp chất KC7: (S)-1-phenylethyl-6-α-L-arabinopyranosyl-β-D- glucopyranoside (hợp chất mới)

Chất dạng dầu không màu

Góc quay cực riêng: − 60,2 (trong MeOH; c 0,05)

KLPT chính xác (tính toán) [C19H28O10Na] + : 439,1580

1H-NMR(400 MHz, methanol-d 4 ) và 13 C-NMR (100 MHz, methanol-d 4 ): xem Bảng 4.2.7

3.2.2.8 Hợp chất KC8: 3,4-dihydroxyphenylethanol-5-O-β-D-glucose

1H-NMR(400 MHz, methanol-d 4 ) và 13 C-NMR (100 MHz, methanol-d 4 ): xem Bảng 4.2.8

Chất dạng dầu không màu

1H-NMR(400 MHz, methanol-d 4 ) và 13 C-NMR (100 MHz, methanol-d 4 ): xem Bảng 4.2.9

1H-NMR(400 MHz, methanol-d 4 ) và 13 C-NMR (100 MHz, methanol-d 4 ): xem Bảng 4.2.10

1H-NMR(400 MHz, methanol-d 4 ) và 13 C-NMR (100 MHz, methanol-d 4 ): xem Bảng 4.2.11

Chất bột màu vàng đỏ

1H-NMR(400 MHz, methanol-d 4 ) và 13 C-NMR (100 MHz, methanol-d 4 ): xem Bảng 4.2.12

3.2.2.13 Hợp chất KC13: Seco-coccinic acid A

1H-NMR (400 MHz, pyridine-d 5 ) và 13 C-NMR (100 MHz, pyridine-d 5 ): xem Bảng 4.2.13

3.2.2.14 Hợp chất KC14: Seco-coccinic acid F

1H-NMR (400 MHz, pyridine-d 5 ) và 13 C-NMR (100 MHz, pyridine-d 5 ): xem Bảng 4.2.14

1H-NMR(400 MHz, chloroform-d 1 ) và 13 C-NMR(100 MHz, chloroform-d 1 ): xem Bảng 4.2.15

KẾ T QU Ả VÀ TH Ả O LU Ậ N

Các h ợ p ch ấ t phân l ậ p t ừ loài Thông đấ t (L.cernua)

Từ toàn bộ thân của loài Thông đất, các nhà nghiên cứu đã phân lập được 20 hợp chất, trong đó có 3 hợp chất mới Cấu trúc của các hợp chất được xác định chi tiết và trình bày dựa trên phân tích hóa học, cho thấy sự đa dạng hóa hóa học của loài này Những kết quả này làm sáng tỏ tiềm năng ứng dụng của các hợp chất trong dược liệu và dược phẩm, đồng thời mở ra triển vọng nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của loài Thông đất.

4.1.1 Hợp chất LC1: Lycocernuaside E ( hợp chất mới)

Hình 4.1.1.a Cấu trúc của hợp chất lycocernuaside D và LC1

Hợp chất LC1 thu được ở dạng bột màu trắng

Công thức phân tử của LC1 được xác định là C25H32O12, dựa trên phổ HR-ESI-

MS, cho pic ion giả phân tử [M+Cl] - tại m/z 559,1587 (tính toán cho C25H32O12Cl - ; 559,1588)

Hình 4.1.1.b Phổ HR-ESI-MS của hợp chất LC1

Phổ 1 H-NMR của LC1 cho thấy nó thuộc bộ khung neolignan, cụ thể gồm sáu tín hiệu proton của hai vòng thơm thế ba ở các vị trí 1,3,4 với δ H 7,14 (1H; d; J = 1,5

Hz, H-2); 7,13 (1H; d; J = 8,5 Hz; H-5) và 6,99 (1H; dd; J = 2,0; 8,5 Hz; H-6), cũng như δ H 7,56 (1H; d; J = 2,0 Hz, H-2′); 7,10 (1H; d; J = 8,5 Hz; H-5′); 7,60 (1H; dd;

Trong phổ 1H NMR của hợp chất này, các tín hiệu cho J = 2,0; 8,5 Hz được gắn cho H-6′; hai nhóm oxymethine xuất hiện ở δH 4,97 (1H; d; J = 4,5 Hz, H-7) và 4,61 (1H; d; J = 5,5 Hz, H-8); một nhóm oxymethylene ở δH 3,60 (1H; dd; J = 6,0; 12,0 Hz; H-9a) và 3,87 (1H; m; H-9b); hai nhóm methoxy ở δH 3,92 (3H; s; 3′-OCH3) và 3,85 (3H; s; 3-OCH3); một proton anome ở δH 4,88 (1H; tín hiệu chồng chập; H-1′′); và một nhóm methyl acetyl hóa ở δH 2,57 (3H; s).

Cấu hình β-D-glucoside được khẳng định khi so sánh giá trị δ C của LC1 với tài liệu tham khảo [61]

Hình 4.1.1.c Phổ 1 H-NMR giãn rộngcủa hợp chất LC1 đo trong methanol-d 4

Phổ 13 C-NMR của LC1 cho thấy sự xuất hiện của 25 nguyên tử carbon, bao gồm sáu nguyên tử carbon thuộc một đơn vị β-glucopyranosyl ở δ C 102,9 (CH; C-1′′), 74,9 (CH; C-2′′); 78,2 (CH; C-3′′); 71,4 (CH; C-4′′); 77,8 (CH; C-5′′) và 62,5 (CH2; C-6′′), điều này được làm sáng tỏ qua các tương quan trên phổ HSQC và HMBC Ngoài ra là tín hiệu của 3 nhóm methyl, 1 nhóm methylene, 8 nhóm methine và 7 carbon không chứa proton

Hình 4.1.1.d Phổ 13 C-NMR của hợp chất LC1 đo trong methanol-d 4

Các dữ liệu phổ NMR gợi ý rằng LC1 là một neolignan glycoside [17]

Phân tích HMBC cho H-1'' (δH 4,90) xác nhận rằng đơn vị glucose được liên kết tại C-4, được xác thực bởi tương quan HMBC giữa H-1'' và C-4 (δC 147,5) Vị trí của hai nhóm methoxy tại C-3 và C-3' được xác định qua các pic HMBC giao từ 3-OCH3 (δH 3,85) đến C-3 (δC 150,6) và từ 3'-OCH3 (δH 3,92) đến C-3' (δC 151,1).

Hình 4.1.1.e Phổ HSQC của hợp chất LC1 đo trong methanol-d 4

Hình 4.1.1.f Phổ HMBC của hợp chất LC1 đo trong methanol-d 4

Cấu hình tương đối của gốc aglycone trong LC1 được khẳng định là erythro, dựa vào hằng số tương tác nhỏ giữa H-7 và H-8 (3J7,8 = 4,5 Hz) và so sánh dữ liệu 1H và 13C NMR với các chuẩn tham chiếu, cho thấy sự phù hợp với cấu trúc erythro và củng cố giả thiết về gốc aglycone của LC1.

13C-NMR với các dữ liệu của neolignan lycocernuaside D được báo cáo trước đây

[17, 62], điểm khác biệt là sự xuất hiện của một nhóm glucoside tại vị trí C-4 trong

LC1 có cấu trúc được xác định như trong hình 4.1.1.g; đây là một hợp chất mới và được đặt tên là lycocernuaside E Chi tiết phổ của hợp chất này được trình bày ở phụ lục 1.

Hình 4.1.1.g Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của LC1 Bảng 4.1.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất LC1 và hợp chất tham khảo

Vị trí # δ C δ C a,b DEPT δ H a,c độ bội, (J= Hz) HMBC

1′′ 102,9 CH 4,88 (tín hiệu chồng chập) 4

# δ C của lycocernuaside D [17] đo trong DMSO-d 6 , a methanol-d 4, b 125 MHz, c 500 MHz

Hình 4.1.2: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của LC2

Hợp chất LC2 thu được dạng bột màu trắng

Phổ 1 H-NMR cho thấy các tín hiệu của một vòng thơm thế 3 ở các vị trí 1,3,4 tại [δ H 7,05 (br s; H-2); 7,17 (d; J = 8,0 Hz; H-5) và 6,96 (br d; J = 8,0 Hz; H-6)] và một vòng thơm thế 4 ở các vị trí 1,3,4,5 tại δ H 6,78 (s; H-2′); 6,76 (s; H-6′) Ngoài ra là các tín hiệu proton của propanoic acid tại δ H 2,86 (t; J = 7,5 Hz; H-7′); 2,58 (t; J 7,5 Hz; H-8′) và một proton oxymethine tại δ H 5,57 (d; J = 6,0 Hz; H-7) Các nhóm methoxy được quan sát thấy tại δ H 3,85 và 3,88

Bên cạnh đó, các tín hiệu đặc trưng của một đơn vị glucose cũng được quan sát thấy tại δ H 4,90 (d; J = 7 Hz, H-1′′) và các tín hiệu ở vùng 3,50-3,87 ppm

Phổ 13 C-NMR cho thấy sự có mặt của 26 tín hiệu carbon bao gồm 12 carbon thơm, bên cạnh đó là các tín hiệu của nhóm oxymethine tại δ C 88,5 (C-7); nhóm methine tại δ C 55,6 (C-8), các nhóm methylene tại δ C 32,0; 37,5(C-7′, C-8′), và nhóm methoxy tại δ C 56,7; 56,8 (3′-OCH3; 3-OCH3)

Các dữ liệu trên cho thấy LC2 có cấu trúc là một neolignan glycoside dihydrobenzofuran [14].

Bảng 4.1.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất LC2 và hợp chất tham khảo

Vị trí # δ C δ C a,b DEPT δ H a,c độ bội, (J= Hz) HMBC

# δ C của lycocernuaside A [14] đo trong methanol-d 4 , a methanol-d 4, b 125 MHz, c 500 MHz

Phân tích phổ HMBC cho thấy các tương tác giữa H-6/H-2 tới C-7 xác định nhóm oxymethine gắn tại vị trí C-1, và các tương tác giữa H-7′/H-8′ tới C-1′/C-9′ khẳng định phần propionic acid gắn ở C-1′ Vị trí của các nhóm methoxy được xác định dựa trên tương quan HMBC giữa proton nhóm methoxy và các carbon liên quan, từ đó định vị chính xác các nhóm methoxy trên cấu trúc phân tử.

Trong phân tích HMBC, tương quan giữa H-1″ (δH 4,90) và C-4 (δC 147,6) cho thấy đơn vị glucopyranosyl được liên kết thông qua oxy ở C-4; giá trị J của proton anomeric (H-1′′, J = 7,0 Hz) khẳng định cấu hình β-glucoside Cấu hình tại C-7 và C-8 được xác định là trans dựa trên giá trị hằng số tương tác đặc trưng J7,8 = 6,0 Hz.

Việc so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất LC2 với dữ liệu phổ của lycocernuaside A được công bố [14] cho thấy sự phù hợp giữa các thông số phổ (bảng 4.1.2) Sự khớp này cho phép xác định LC2 là lycocernuaside A, và chi tiết phổ được trình bày trong phụ lục.

4.1.3 Hợp chất LC3: Bombasin 4-O- β -D-glucopyranoside

Hình 4.1.3: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của LC3

Hợp chất LC3 thu được dạng bột màu trắng

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất LC3 tương đồng với LC2 và cho thấy LC3 là một neolignan glycoside dihydrobenzofuran Sự khác biệt giữa LC3 và LC2 tập trung ở vị trí C-7' và C-8', đồng thời LC3 không còn tín hiệu của nhóm carboxyl tại δC 178,1 (C-9') như LC2.

Giá trị δ C 199,3 gợi ý sự có mặt của nhóm carbonyl tại vị trí C-7' và nhóm CH3 tại δ C 26,5 (C-8') Điều này được xác nhận thêm khi phân tích các tương quan trên HSQC và HMBC.

Bảng 4.1.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất LC3 và hợp chất tham khảo

Vị trí # δ C δ C a,b DEPT δ H a,c độ bội, (J= Hz) HMBC

# δ C của bombasin 4- O- β - D - glucopyranoside [63] đo trong DMSO-d 6 , a methanol-d 4, b 125 MHz, c 500 MHz

So sánh dữ kiện phổ của LC3 với hợp chất bombasin 4-O-β-D-glucopyranoside

Lyocernuside C được công bố trong tài liệu [65], cho thấy sự phù hợp của các tín hiệu phổ (bảng 4.1.3) và cho phép xác định hợp chất LC3 là bombasin 4-O-β-D-glucopyranoside Chi tiết phổ được trình bày ở phụ lục 3.

4.1.4 Hợp chất LC4: Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O- β -D- glucopyranoside

Hình 4.1.4: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của LC4

Hợp chất LC4 thu được dạng chất bột màu trắng

Các dữ kiện phổ NMR của hợp chất LC4 cho thấy nó tương tự như hợp chất

LC2 cho thấy điểm khác biệt duy nhất tại vị trí C-9' Trong LC2, vị trí C-9' là một nhóm carboxyl có giá trị độ dịch chuyển hoá học đặc trưng δC 178,1 Tuy nhiên trong các điều kiện thí nghiệm khác hoặc ở các mẫu liên quan, sự xuất hiện và độ lệch của tín hiệu tại C-9' có thể bị ảnh hưởng bởi môi trường liên kết và trạng thái cấu trúc, dẫn tới biến thiên nhỏ của δC hoặc sự xuất hiện của tín hiệu phụ.

Các h ợ p ch ấ t phân l ậ p t ừ loài Na r ừ ng (K.coccinea)

Qua phân lập từ thân và lá của loài Na rừng, 15 hợp chất tinh khiết đã được cô lập, trong đó có 3 hợp chất mới lần đầu được phát hiện Cấu trúc của các hợp chất này được xác định chi tiết bằng các phương pháp phân tích hiện đại, làm nổi bật đặc điểm hóa học và tiềm năng ứng dụng của từng hợp chất trong lĩnh vực dược liệu và sinh học.

Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của KC1

Hợp chất KC1 thu được ở dạng bột màu trắng Dữ liệu 1 H-NMR của KC1 cho thấy tín hiệu của ba nhóm methyl bậc ba tại δ H 1,13 (s; H-18); 1,43 (s; H-30) và

Trong phổ 1H-NMR, tín hiệu ở δH 1,88 (s; H-27) và một nhóm metyl tại δH 1,34 (d; J = 8,0 Hz) được ghi nhận Hai proton olefinic xuất hiện ở δH 7,50 (s; H-24) và 5,75 (d; J = 4,0 Hz; H-12) Hệ spin ABX gồm các tín hiệu ở δH 4,41 (1H; d; J = 4,0 Hz), 2,70 (1H; d; J = 16,0 Hz) và 2,95 (1H; dd; J = 4,0; 16,0 Hz) được quan sát và gán tương ứng với H-1, H-2α và H-2β dựa trên các tương tác trên phổ HMQC.

Dữ liệu 13C-NMR của KC1 cho thấy tín hiệu của 29 carbon, gồm hai nhóm carbonyl este tại δC 176,2 (C-3) và 175,0 (C-26); bốn nguyên tử carbon không bão hòa tại δC 149,4; 148,0; 130,7 và 121,1 được gán lần lượt cho H-24; H-13; H-25 và H-12; bốn carbon không liên kết với proton gồm tín hiệu tại δC 52,9 (C-14) và ba carbon liên kết với oxy tại δC 99,9 (C-10); 89,0 (C-4) và 70,9 (C-9); bốn nhóm oxymethine tại δC 83,0 (C-1, C-23); 77,2 (C-15) và 75,5 (C-22); bốn nhóm methine tại δC 58,8 (C-8); 55,0 (C-5); 44,8 (C-20) và 42,9 (C-11); bảy nhóm methylene và bốn nhóm methyl.

Các dữ kiện phổ trên cho thấy KC1 có cấu trúc của một nortriterpenoid dilactone

Vị trí của các nhóm methyl được xác định dựa vào các tương tác trên phổ HMBC Các pic giao giữa H-30 (δH 1,43) và H-29 (δH 3,85) với C-4 (δC 89,0) cho thấy nhóm 30-CH3 và nhóm hydroxymethylene (C-29) gắn vào C-4 Các kết quả HMBC này cung cấp bằng chứng định vị các nhóm methyl trên khung cấu trúc và hỗ trợ xác nhận vị trí của chúng dựa trên các tín hiệu H-30 và H-29.

CH3 gắn vào C-25 Tương tự là các tương tác của H-18 với C-8/C-14/C-15 và H-21 với C-17/C-20/C-22

So sánh dữ kiện phổ của KC1 với hợp chất kadnanolactone H đã được công bố

Những tín hiệu phổ ở các vị trí tương ứng phù hợp với bảng 4.2.1 cho thấy sự nhất quán của dữ liệu phổ Kết hợp dữ liệu phổ HMQC và HMBC cho phép khẳng định hợp chất KC1 là kadnanolactone H; chi tiết phổ được tham khảo trong phụ lục 21.

Bảng 4.2.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất KC1 và hợp chất tham khảo

Vị trí C # δ C δ C a,b DEPT δ H a,c độ bội, (J = Hz) HMBC

# δ C của kadnanolactone H [71] đo trong pyridine-d 5 , a pyridine-d 5, b 100 MHz, c 400 MHz 4.2.2 Hợp chất KC2: Micrandiactone H

Hình 4.2.2: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của KC2

Hợp chất KC2 thu được ở dạng bột màu trắng

Dữ liệu 1 H-NMR của KC2 tương tự hợp chất KC1, sự khác biệt ở các vị trí C-

Trong hợp chất KC1, tín hiệu C-12 và C-13 được xác định là từ các carbon olefinic với các giá trị δC đặc trưng lần lượt là 121,1 (C-12) và 148,0 (C-13); tín hiệu C-14 ở δC 52,9 cho thấy một carbon không liên kết với proton và gắn với nhóm methyl Trong hợp chất KC2, tín hiệu C-12 ở δC 39,6 thuộc nhóm methylene, còn tín hiệu C-13 được ghi ở δC chưa được nêu.

46,4 của carbon không liên kết với proton và gắn với nhóm methyl (C-18) Điều này được khẳng định dựa vào tương tác HMBC của H-18 (δ H 1,34) với C-11 (δ C

38,9)/C-12 (δ C 39,6)/C-13 (δ C 46,4)/C-17 (δ C 54,7) Ngoài ra, tín hiệu C-14 tại δ C

87,2 cho thấy nó liên kết với nhóm hydroxyl

Qua so sánh dữ liệu phổ của hợp chất KC2 với hợp chất micrandiactone H được công bố [49], ta nhận thấy tín hiệu phổ ở các vị trí tương ứng phù hợp với nhau (bảng 4.2.2) Việc đối chiếu với các dữ kiện phổ từ HMQC và HMBC cho phép khẳng định KC2 là micrandiactone H, kèm theo chi tiết phổ được trình bày ở phụ lục 22.

Bảng 4.2.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất KC2 và hợp chất tham khảo

Vị trí C # δ C δ C a,b DEPT δ H a,c độ bội, (J = Hz) HMBC

# δ C của micrandiactone H [49] đo trong methanol-d 4 , a pyridine-d 5, b 100 MHz, c 400 MHz 4.2.3 Hợp chất KC3: Kadcoccilactone V ( hợp chất mới)

Hình 4.2.3.a: Cấu trúc của hợp chất KC3 và hợp chất micrandiactone H

Hợp chất KC3 được thu được ở dạng bột màu trắng Phân tích bằng phổ khối lượng ion hóa phun điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS) cho thấy có một pic ion giả phân tử ở m/z liên quan đến hợp chất KC3, xác nhận khối lượng phân tử và tính chất cấu trúc của hợp chất KC3 dựa trên dữ liệu HR-ESI-MS.

533,2745 [M+H] + (tính toán cho C29H40O9H; 533,2751), gợi ý công thức phân tử của KC3 là C29H40O9

Hình 4.2.3.b Phổ HR-ESI-MS của hợp chất KC3 c

Hình 4.2.3.c Phổ 1 H-NMR của hợp chất KC3 đo trong pyridine-d 5

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất KC3 tương tự như KC2, cho thấy sự tương đồng về phổ ở cả proton và carbon, nhưng điểm khác biệt duy nhất là KC3 có một liên kết đôi thay cho nhóm oxymethine trong KC2.

Hình 4.3.3.d Phổ 13 C-NMR của hợp chất KC3 đo trong pyridine-d 5

Hình 4.2.3.e Phổ HMQC của hợp chất KC3 đo trong pyridine-d 5

Dữ liệu 1 H-NMR của KC3 cho thấy tín hiệu của ba nhóm methyl bậc ba tại δ H

1,38 (s; H-30); 1,43 (s; H-18) và 1,84 (s; H-27) và một nhóm methyl bậc 2 tại δ H

1,20 (d; J = 6,5 Hz; H-21) Hai proton olefinic tại δ H 7,01 (br s; H-24) và 5,51 (d; J

Trong phân tích phổ, hệ spin ABX được quan sát với các hằng số ghép đôi đặc trưng, cho phép gắn các tín hiệu vào H-1, H-2a và H-2b dựa trên các tương tác trên phổ HMQC Cụ thể, tín hiệu δH 4,41 (1H; d; J = 4,0 Hz), δH 2,74 (1H; d; J = 17,4 Hz) và δH 2,98 (1H; dd; J = 4,0; 17,4 Hz) được nhận diện lần lượt là H-1, H-2a và H-2b.

Dữ liệu 13 C-NMR của KC3 thể hiện sự có mặt của 29 nguyên tử carbon bao gồm: 4 nhóm methyl, 8 nhóm methylene, 8 nhóm methine, 9 nguyên tử carbon không liên kết với H

Các dữ kiện trên cho thấy KC3 có cấu trúc là một nortriterpenoid khung schiartane tương tự hợp chất KC2 [70, 72]

Hình 4.2.3.f Phổ HMBC của hợp chất KC3 đo trong pyridine-d 5

Thật vậy, phổ HMBC cho thấy các mối tương quan của một proton olefinic ở δ H

5,51 (H-22) với C-17 (δ C 55,7); C-21 (δ C 22,4); C-23 (δ C 147,8); C-24 (δ C 139,4) và của H-21 (δ H 1,20) đến C-17 (δ C 55,7); C-20 (δ C 33,8); C-22 (δ C 120,6), gợi ý một liên kết đôi thế ba Δ 22 trong vòng E

Trong bộ khung schiartane, H-1 được định hướng β, và C-9 và C-10 lần lượt được đề xuất là cấu hình S- và -R [70, 72] Phổ 1 H- 1 H NOESY hiển thị tương quan của H3-30 (δ H 1,38) với H-1 (δ H 4,44), cho biết định hướng β của CH3-30 Đặc biệt, các giá trị chuyển dịch hóa học của các trung tâm bất đối tại δ C 87,1 (C-14) và 77,2 (C-15) trong KC3 tương tự như của 14S,15S tại δ C 87,6 (C-14) và 77,2 (C-15) [78] và hoàn toàn khác với 14R,15S tại δ C 85,1 (C-14) và 73,9 (C-15) [76], nên cấu hình của KC3 được khẳng định là 14S và 15S

Các tương tác trên phổ 1 H- 1 H NOESY của H-21 (δ H 1,20) đến H-17 (δ H 2,33) và từ H-18 (δ H 1,43) đến H-8 (δ H 2,04)/H-15 (δ H 4,43), đã khẳng định về cấu hình này và các định hướng H-8β và H-17α

Dựa vào các dữ kiện trên có thể khẳng định cấu trúc của KC3 như hình 4.2.3.a Đây là hợp chất mới và được đặt tên là kadcoccilactone V (chi tiết phổ xem phụ lục 23)

Hình 4.2.3.g Phổ NOESY của hợp chất KC3 đo trong pyridine-d 5

Bảng 4.2.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất KC3 và hợp chất tham khảo

Vị trí C # δ C δ C a,b # δ H độbội, (J = Hz) δ H a,c độ bội, (J= Hz) HMBC

# δ C, # δ H của KC2 đo trong pyridine-d 5 , a pyridine-d 5, b 100 MHz, c 400 MHz

Hình 4.2.4: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của KC4

Hợp chất KC4 thu được dưới dạng bột màu trắng

Hợp chất KC4 có cấu trúc tương tự KC2 và khác biệt duy nhất ở cấu hình tại vị trí C-23 Ở KC2, C-23 được xác định có cấu hình α Tuy nhiên, phân tích NOESY giữa H-17 (δH 3,34) và H-24 (δH 7,27) cho thấy C-23 của KC4 có cấu hình β.

Do đó, hợp chất KC4 được suy ra là C-23 epimer của KC2

Qua so sánh dữ liệu phổ của KC4 với hợp chất kadnanolactone I đã công bố [71], nhận thấy sự phù hợp của tín hiệu phổ tại các vị trí tương ứng (bảng 4.2.4) Bên cạnh các tương tác trên phổ HMQC và HMBC, kết quả này cho phép khẳng định KC4 là kadnanolactone I; chi tiết phổ được trình bày trong phụ lục 24.

Bảng 4.2.4 Số liệu phổ NMR của hợp chất KC4 và hợp chất tham khảo

Vị trí # δ C δ C a,b DEPT δ H a,c độ bội, (J = Hz) HMBC

# δ C của kadnanolactone I [71] đo trong pyridine-d 5 , a pyridine-d 5, b 100 MHz, c 400 MHz 4.2.5 Hợp chất KC5: Kadsuracin A ( hợp chất mới)

Hình 4.2.5.a: Cấu trúc hóa học của KC5 và hợp chất kadsurarin

Hợp chất KC5 thu được dưới dạng chất rắn màu trắng Phổ HR-ESI-MS của nó cho thấy một pic ion giả phân tử tại m/z 572,2488 [M + NH4] + (tính cho

C30H34O10NH4, 572,2496) ứng với công thức phân tử C30H34O10

Hình 4.2.5.b Phổ HR-ESI-MS của hợp chất KC5

Hình 4.2.5.c Phổ 1 H-NMR của hợp chất KC5 đo trong CDCl 3

Phổ 1 H-NMR của KC5 cho thấy một proton olefinic ở δ H 5,98 (m, H-3′′), một tín hiệu doublet của nhóm methyl ở δ H 1,87 (d, J = 7,3 Hz, H-4′′) và một tín hiệu singlet của nhóm methyl ở δ H 1,42 (H-5′′), hai tín hiệu singlet của proton vòng thơm ở δ H 6,50 (H-11) và 6,74 (H-4), hai proton methylenedioxy ở vùng trường thấp ở δ H 5,92 (br s; H-19a) và 5,93 (br s, H-19b), hai proton olefinic sp 2 thế ở δ H

4,86 (br s, H-17a) và 5,30 (br s, H-17b), bốn tín hiệu singlet của nhóm methoxy ở δ H 3,57 (OCH3-14); 3,75 (OCH3-2); 3,85 (OCH3-1); 3,91 (OCH3-3), hai nhóm oxymethine ở δ H 6,40 (s; H-6) và 5,70 (m; H-9), một tín hiệu của nhóm methine ở

89 δ H 2,82 (m; H-8), một nhóm methyl bậc 2 ở δ H 1,24 (d; J = 7,1 Hz), liên kết với nhóm angeloyl [δ H 5,98 (H-3′′); 1,87 (d; J = 7,1 Hz; H-4′′); 1,42 (s, H-5′′′)], và một tín hiệu singlet của nhóm methyl ở δ H 1,54 (H-2′)

Hình 4.2.5.d Phổ 13 C-NMR của hợp chất KC5 đo trong CDCl 3

Phổ 13 C-NMR của KC5 cho thấy tín hiệu của 2 carbon nhóm carbonyl ở δ C

Đánh gi á ho ạ t tính sinh h ọ c c ủ a các h ợ p ch ấ t phân l ập đượ c

4.3 1 Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được từ loài Thông đất (L cernua)

4.3.1.1 Kết quả đánh giáhoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)

Các hợp chất thu được từloài Thông đất được đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh

Trong mô hình tế bào BV2 được kích thích bởi LPS, NO được sản sinh tăng lên Đầu tiên, các chất được sàng lọc nhằm xác định hoạt tính gây độc tế bào đối với BV2 kích thích bởi LPS thông qua phương pháp MTT; kết quả cho thấy tất cả các hợp chất được kiểm tra đều không gây độc tế bào BV2.

111 bào ở nồng độ 80 μM Sử dụng nồng độ này, các hợp chất tiếp tục được thử nghiệm hoạt tính ức chế NO bằng phương pháp Griess Kết quả thu được như sau:

Bảng 4.3.1.1 Khả năng ức chế sản sinh NO của các hợp chất LC1-LC20 trên tế bào BV2 kích thích bởi LPS

STT Hợp chất Giỏ trị IC 50 (àM)

Từ bảng kết quả trên cho thấy các hợp chất LC3, LC5 có khả năng ức chế sản sinh

NO với giỏ trị IC50 lõ̀n lượt là 21,2 ± 1,1; 28,5 ± 1,4 àM

4.3.1.2 Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư

20 hợp chất được phân lập từ loài Thông đất đã được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào Đánh giá được thực hiện trên ba dòng tế bào ung thư người gồm MCF7 (ung thư vú), HepG2 (ung thư gan) và SK-Mel-2 (khối u ác tính) bằng phương pháp SRB.

Bảng 4.3.1.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc tếbào của các hợp chất LC1-LC20

Hợp chất Dũng tế bào IC 50 (àM)

Kết quả cho thấy hợp chất LC7 cho hoạt tính ức chế ở mức trung bình trên cả ba dòng tế bào ung thư được thử nghiệm, với giá trị IC50 lần lượt là 44,85 ± 2,16 µM trên MCF7, 47,97 ± 2,53 µM trên HepG2 và 69,64 ± 2,97 µM trên SK-Mel-2 Hợp chất LC16 cho hoạt tính ức chế yếu trên ba dòng tế bào này với IC50 lần lượt là 54,55 ± 3,15 µM trên MCF7, 84,77 ± 4,86 µM trên HepG2 và 92,25 ± 4,58 µM trên SK-Mel-2. -**Support Pollinations.AI:**🌸 **Quảng cáo** 🌸 Tối ưu hóa nội dung SEO khoa học hiệu quả cùng Pollinations.AI miễn phí—[ủng hộ sứ mệnh](https://pollinations.ai/redirect/kofi) giúp AI đến gần hơn với cộng đồng!

4.3.2 Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được từ loài Na rừng (K coccinea)

4.3.2.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)

Các hợp chất được thu từ lá Na rừng (KC5-KC12) được đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW264.7 được kích thích bằng LPS Đầu tiên, các hợp chất được sàng lọc độc tính tế bào bằng phương pháp MTT, kết quả cho thấy tất cả các hợp chất đều không gây độc tế bào ở nồng độ 50 μM Với nồng độ này, các hợp chất tiếp tục được thử nghiệm hoạt tính ức chế NO bằng phương pháp Griess Kết quả thu được cho thấy các hợp chất không gây độc ở 50 μM và có mức độ ức chế NO khác nhau giữa các hợp chất, cho thấy tiềm năng của KC5-KC12 trong việc giảm sản sinh NO ở hệ mô hình RAW264.7 được kích thích bởi LPS.

Bảng 4.3.2.1 Khả năng ức chế sản sinh NO của các hợp chất KC5-KC12 trên tế bào RAW264.7 kích thích bởi LPS

STT Hợp chất Giỏ trị IC 50 (àM)

Từ bảng kết quả trên cho thấy các hợp chất KC5, KC6 có khả năng ức chế sản sinh

NO với giỏ trị IC50 lõ̀n lượt là 10,2 ± 0,66 và 21,7 ± 1,22 àM

4.3.2.2 Kết quả đánh giáhoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào ung thư

Các hợp chất phân lập từ thân cây Na rừng (KC1-KC4, KC13-KC15) được đánh giá có hoạt tính ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư người trên 6 dòng tế bào, bao gồm dòng HCT-116, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển liệu pháp chống ung thư.

Trong nghiên cứu này, hoạt tính kháng ung thư được đánh giá bằng phương pháp SRB với adriamycin làm chất đối chứng trên các dòng tế bào: dòng 15 (ung thư đại tràng), NUG-3 (ung thư dạ dày), NCI-H23 (ung thư phổi), ACHN (ung thư thận), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt) và MDA-MB-231 (ung thư vú) Kết quả được thể hiện trong bảng sau.

Bảng 4.3.2.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bàocủa các hợp chất

KC1-KC4 và KC13-KC15

HCT-15 NUGC-3 NCI-H23 ACHN PC-3 MDA-MB-

Kết quả cho thấy hợp chất KC15 có khả năng ức chế mạnh sự tăng trưởng của tế bào ung thư phổi NCI-H23, với IC50 là 1,28 ± 0,01 µM, và thể hiện hiệu quả ức chế đáng kể trên 5 dòng tế bào ung thư khác với các giá trị IC50 lần lượt là 2,67 ± 0,02 µM (HCT-15), 1,80 ± 0,02 µM (NUGC-3), 2,63 ± 0,01 µM (ACHN), 2,33 ± 0,01 µM (PC-3) và 2,38 ± 0,02 µM (MDA-MB-231).

Các hợp chất LC3, LC5, KC5 và KC6 thể hiện hoạt tính ức chế sản sinh NO trong các hệ sinh học Về mặt cấu trúc, đây là các hợp chất lignan – nhóm hợp chất được công nhận có khả năng ức chế sản sinh NO mạnh so với các nhóm hợp chất hữu cơ khác.

Trong các chất có cùng khung LC2, LC3, LC4, LC5, sự khác biệt nổi bật của LC3 so với các hợp chất còn lại là sự có mặt của nhóm -COCH3 tại vị trí C-1′; thêm vào đó, LC5 mang gốc β-D-glucoside tại vị trí C-4 trong khi các hợp chất khác không có Kết quả cho thấy sự hiện diện của nhóm -COCH3 ở C-1′ và gốc β-D-glucoside ở C-4 ảnh hưởng đến hoạt tính ức chế NO của các lignan thuộc khung này.

LC7 là một serratane triterpenoid có hoạt tính gây độc tế bào So với các hợp chất cùng bô khung LC8, LC9 và LC14, điểm khác biệt ở vị trí C-21 là LC7 mang nhóm β-OH, còn các hợp chất còn lại mang nhóm α-OH Kết quả cho thấy nhóm β-OH tại C-21 liên quan đến hoạt tính gây độc tế bào trong các serratane triterpenoid có cùng bô khung.

KC15 thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào ung thư tốt nhất trong số các hợp chất được nghiên cứu thuộc bộ khung này Đây là hợp chất duy nhất thuộc bộ khung này được phân lập từ Na, cho thấy KC15 có tiềm năng to lớn cho các ứng dụng trong ung thư và xứng đáng được theo dõi trong các nghiên cứu về cơ chế tác dụng và tối ưu hóa hiệu quả.

Hiện tại, dữ liệu có sẵn chưa đủ cơ sở để gợi ý mối liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính của KC15 Tuy nhiên, dựa trên tài liệu tham khảo về một số hợp chất có cấu trúc tương tự [87, 88], vòng lactone 7 cạnh của KC15 được cho là đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính của hợp chất này.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Trong quá trình thực hiện luận án này, chúng tôi đã thu được những kết quả nghiên cứu về loài Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.), Na rừng

Kadsura coccinea (Lem.) A C Sm.), cụ thể như sau:

1 Về thành phần hóa học: Đã phân lập và xác định được 35 hợp chất sạch từ các loài thực vật này, trong đó:

Từ loài Thông đất, đã thu được tổng cộng 20 hợp chất được đánh số LC1–LC20, trong đó 3 hợp chất mới là lycocernuside E (LC1), lycernuic B (LC6) và lycernuic ketone F (LC7); 17 hợp chất còn lại đã biết thuộc các nhóm chất gồm lignan (LC2–LC5), serratane triterpenoid (LC8–LC14), flavonoid (LC15–LC17) và cernuane triterpenoid (LC18–LC20).

From the wild Na plant, fifteen compounds (KC1–KC15) were identified, including three new compounds: kadcoccilactone V (KC3), kadsuracin A (KC5), and (S)-1-phenylethyl-6-α-L-arabinopyranosyl-β-D-glucopyranoside (KC7); twelve known compounds belong to three chemical classes—nortriterpenoids (KC1–KC4), lignan (KC6), and phenolic glycosides (KC8–KC15).

KC12), seco-lanostane triterpenoid (KC13-KC14), 3,4-secocycloartane triterpenoid

(KC15) Trong đó hợp chất thalictoside (KC10) lần đầu tiên được phân lập từ loài thực vật này

2 Về hoạt tính sinh học

Các hợp chất sạch được thử hoạt tính sinh học ức chế sản sinh NO và gây độc tế bào ung thư Kết quả cho thấy:

* Hoạt tính ức chế sản sinh NO