ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CHỈNH sửa GEN CRISPR cas TRONG CHỌN tạo GIỐNG cây TRỒNG

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA GEN CRISPR Cas TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG 1 GIỚI THIỆU Sự phát sinh đột biến ngẫu nhiên có thể làm tăng sự biến đổi di truyền  Hiệu ứng không mong muốn ngoà. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA GEN CRISPRCas TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA GEN CRISPR-Cas TRONG CHỌN TẠO GIỐNG

CÂY TRỒNG

Endonuclease được sử dụng

để gây ra đứt gãy sợi kép trong

các gen mục tiêu quan tâm

Thông qua việc nối kết đầu cuối

không tương đồng (NHEJ) hoặc

sửa chữa theo hướng tương

đồng (HDR)

 Chèn, xóa, thay thế và tái tổ

1 GIỚI THIỆU

CHƯƠNG 2:

ỨNG DỤNG CRISPR-Cas TRONG TẠO GIỐNG

CÂY TRỒNG

2.1 Hệ thống CRISPR-Cas 2.1.1 Tổng quan về hệ thống CRISPR-Cas

• CRISPR-Cas: các cụm xen kẽ đều với các đoạn palindromic ngắn lặp lại – các protein liên kết với CRISPR

• Một locus CRISPR đặc trưng bởi:

− Các đoạn lặp và các đệm: CRISPR là một mảng liên

tiếp các trình tự dài 23-50 bp

− Trình tự thủ lĩnh: locus CRISPR nằm một phía của

trình tự thủ lĩnh giàu AT dài 100-350 bp

2.1.1 Tổng quan về hệ thống CRISPR-Cas

• Vi khuẩn thiết lập cơ chế bảo vệ tế bào nhận ra và phân biệt DNA ngoại lai với DNA tự thân

• Protein cas, các locus CRISPR và CRISPR RNA (crRNA): thích nghi và di truyền chống lại DNA ngoại lai

• Yếu tố di truyền phụ và gen ngoại lai: duy trì khả năng miễn dịch CRISPR

• Miễn dịch qua trung gian CRISPR chống lại plasmid, biến đổi DNA mang gen có lợi

2.1.1 Tổng quan về hệ thống CRISPR-Cas

• CRISPR đại diện các đoạn lặp lại của DNA tìm thấy trong

bộ gen của vi khuẩn cổ

• CRISPR thường nằm trên nhiễm sắc thể

2.1.1 Tổng quan về hệ thống CRISPR-Cas

2.1.2 Phân loại hệ thống CRISPR-Cas

• Hệ thống CRISPR-Cas phân thành 2 lớp và 6 loại:

Lớp 1

• Loại I: chứa gen cas3 mã hóa một protein lớn với các hoạt động helicase và DNase riêng biệt

• Loại III: chứa các module polymerase và RAMP

• Loại IV: gồm các locus CRISPR-Cas thô sơ

• Loại VI: nhận diện hai domain HEPN Rnase; cas13 phân cắt sợi đơn RNA thay vì DNA.

2.1.2 Phân loại hệ thống CRISPR-Cas

2.1.3 Cơ chế hoạt động của hệ thống

CRISPR-Cas

• Hệ thống CRISPR-Cas gồm ba giai đoạn: thích nghi, biểu hiện và can thiệp

• Thích nghi:

− Sự thích nghi đòi hỏi sự tích hợp của các đoạn

nucleic acid từ các phân tử xâm nhập

− Đoạn nucleic acid ngoại lai chọn để tích hợp gọi là

proto-spacer xếp cạnh các trình tự được bảo tồn gọi là motif liền kề proto-spacer (PAM)

2.1.3 Cơ chế hoạt động của hệ thống

CRISPR-Cas

• Phá vỡ sợi đôi DNA mục tiêu, tạo cấu trúc vòng R thông qua lai với trình tự đệm trong crRNA (bắt đầu từ PAM).

• Vòng R là cơ chất để các cas endonuclease phân cắt.

• Một số hệ thống CRISPR-Cas nhắm vào mục tiêu là RNA thay vì DNA.

2.1.3 Cơ chế hoạt động của hệ thống

CRISPR-Cas

Hình 2.2: Tổng quan về

cơ chế hoạt động của hệ

thống CRISPR-Cas

2.2 Tiềm năng của CRISPR-Cas trong chỉnh sửa gen ở cây trồng

• Chỉnh sửa gen (GE) là cơ sở của kỹ thuật nhân giống mới bao gồm gây đột biến hướng oligo (ODM), SSN, ZFN, TALEN,…

• CRISPR/Cas thay thế các đột biến ngẫu nhiên, làm giảm đáng kể nền của các đột biến mục tiêu không mong muốn.

• CRISPR/Cas có thể thay thế TALEN nhắm mục tiêu cụ thể đến một vị trí bộ gen xác định.

• Hệ thống CRISPR-Cas của vi khuẩn dễ lập trình, rẻ và tương thích đa kênh.

• Bao gồm hai thành phần:

+ Protein Cas

+ RNA dẫn đường đơn (sgRNA), hướng protein Cas đến

vị trí đích mong muốn trên bộ gen

• Tin sinh học: thiết kế các sgRNA cho các thí nghiệm

2.2 Tiềm năng của CRISPR-Cas trong chỉnh sửa gen ở cây trồng

2.2 Tiềm năng của CRISPR-Cas trong chỉnh sửa gen ở cây trồng

• Ưu điểm: hệ thống sẽ không ngừng hoạt động

cho đến khi tất cả các vị trí đích được xử lý.

• Bằng cách sử dụng Cas9 chết (dCas9), nCas9 kết

hợp với cytidine deaminase hoặc adenine deaminase.

 Thành công chỉnh sửa gen trên: lúa, cà chua và bông.

nCas9 kết hợp với cytidine deaminase hoặc adenine deaminase, như TadA được thiết kế được gọi là trình chỉnh sửa cơ sở:

• Cytosine (CBE) chuyển đổi C–G thành T–A

• Trình chỉnh sửa cơ sở adenine (ABE) thay đổi cặp cơ sở A–

T thành cặp G-C, tương ứng

• Ở thực vật, các đột biến điểm gây ra như vậy đã dẫn đến

việc tạo ra giống lúa kháng thuốc trừ cỏ

2.2 Tiềm năng của CRISPR-Cas trong chỉnh sửa gen ở cây trồng

2.3 Ứng dụng liên quan đến Cas9 và các loại

Cas protein mới

• Protein SpCas9 được thiết kế mở rộng khả năng

tương thích nâng cao, nhận dạng NG-PAM.

• Cas9-NG phù hợp để chỉnh sửa bộ gen tại vị trí NG

PAM ở thực vật

• xCas9 sẽ tốt nếu sử dụng như một SpCas9 đặc hiệu

cao trong tế bào thực vật.

• SpCas9-NG, SpCas9-VQR đã được áp dụng thành

công trong chỉnh sửa ở thực vật

2.3 Ứng dụng liên quan đến Cas9 và các loại

Cas protein mới

• Các biến thể Cas9 với các ưu tiên PAM khác nhau đã

được phát hiện ở các vi khuẩn khác nhau

• Các biến thể Cas9 được sử dụng cho ứng dụng

chỉnh sửa bộ gen

• Các gen mã hóa hầu hết các protein này đều nhỏ

hơn SpCas9, đây là một lợi thế cho việc phân phối gen bằng các vector virus.

Các loại protein Cas mới có khả năng được áp dụng để chỉnh sửa bộ gen thực vật

- Protein Cas13

- CRISPR-Cas Loại V

- Hệ thống CRISPR-Cas phân lập từ các vi sinh vật chưa được nuôi cấy

- Hệ thống CRISPR-Cas14 CasX và CasY

- Cas3 một nuclease từ Thermobifida fusca và E coli

2.3 Ứng dụng liên quan đến Cas9 và các loại

Cas protein mới

•Đối với ngũ cốc: điều

khiển cân bằng cytokinin nội

môi là một cách thiết thực để

tăng năng suất

• Đối với cây ăn quả: tăng

năng suất bằng cách chỉnh sửa

2.4.2 Nâng cao chất lượng

•Trong sản xuất nông nghiệp ngoài năng suất thì các đặc tính của cây trồng cũng rất quan trọng Hạt có hàm lượng amylose thấp có chất lượng khi ăn và nấu tốt hơn.

•CRISPR–Cas cũng giúp tạo các loại cây trồng chất lượng cao

•Giàu carotenoid, acid oleic và aminobutyric acid

γ-•Giảm acid phytic.

•Việc phá vỡ các yếu tố nhạy cảm của vật chủ bằng cách sử dụng CRISPR–Cas là một cách bảo vệ thực vật chống lại stress sinh học

•Bằng cách gây đột biến vùng khởi động của O

sativa SWEET11, SWEET13 và SWEET14 sử dụng

CRISPR-Cas

Tạo ra các dòng lúa có phổ rộng kháng X oryzae pv

oryzae.

2.4.3 Kháng bệnh

•CRISPR-Cas9 có thể được lập trình để phân cắt

bộ gen của virus DNA thực vật và tạo ra khả năng kháng virus nhờ khả năng tạo ra DSB.

• Loại bỏ các gen nhạy cảm của cây trồng cũng

là một cách hiệu quả để tạo ra tính kháng virus phổ rộng.

2.4.4 Kháng thuốc diệt cỏ

•Việc chỉnh sửa các gen nhắm mục tiêu thuốc diệt cỏ để tạo ra tính kháng nội sinh bằng cách sử dụng CRISPR-Cas là hấp dẫn do tốc độ, tính linh hoạt và không có gen chuyển

• Acetolactate synthase (ALS) là một enzyme quan trọng trong sinh tổng hợp acid amin chuỗi nhánh và là mục tiêu của thuốc diệt cỏ như sulfonylurea và imidazolinone

•Acetyl coenzymee A carboxylase (ACCase) là một enzyme quan trọng trong sinh tổng hợp lipid và là một mục tiêu diệt cỏ có giá trị khác

2.5 Ứng dụng trong tạo giống cây trồng

•Tạo dòng bất dục đực: thiết lập bất dục đực theo dòng mẹ là cách tiếp cận thiết thực và hiệu quả nhất để loại bỏ các hạt đồng hợp tử.

•Chỉnh sửa gen bằng CRISPR–Cas được thực hiện bằng cách nhắm mục tiêu vào bất dục đực 1 (Ms1) và Ms45, mã hóa protein chuyển lipid liên kết glycosylphophatidylinositol và một enzyme tương tự như enzyme tổng hợp cleosidine.

2.5 Ứng dụng trong tạo giống cây trồng

2.6 Ứng dụng trong tạo giống cây trồng

•Thao tác sự không tương thích tự thân: Thông qua

sửa đổi S-RNase bởi CRISPR–Cas, một gen đồng trội chịu trách nhiệm cho sự tự tương hợp giao tử ở họ Solanaceae, các dòng khoai tây tự tương hợp đã được tạo

ra

•Thông qua đột biến các gen như farnesyl pyrophosphat synthase 2, CRISPR–Cas cũng có thể có vai trò trong việc khôi phục khả năng tự tương hợp và có thể được sử dụng để phát triển các hệ thống nhân giống lai

2.5 Ứng dụng trong tạo giống cây trồng

•Các công nghệ tạo giống khác:

•Phép lai giữa các dòng xa thường dẫn đến hiện tượng bất dục lai nghiêm trọng, nguyên nhân là do tương tác di truyền có hại giữa các allele lặn và cản trở việc khai thác ưu thế lai

•Sự tái tổ hợp đồng loại trong quá trình meiosis hiếm khi xảy ra ở các vị trí mong muốn, nhưng việc nhắm mục tiêu cụ thể vào một allele của cha mẹ bằng

2.6 Ứng dụng trong thuần hóa giống hoang dại

pimpinellifolium)

• Có khả năng chống chịu bệnh

đốm vi khuẩn và bệnh muối rất

cao

• Cần thay đổi một số đặc điểm

như: kiểu phát triển tràn lan, trái

nhỏ, giá trị dinh dưỡng kém và

độ dài ngày

• Lúa mì dại (Thinopyrum

• Khoai tây dại (Solanum spp.) có

khả năng chống chịu bệnh mốc

sương cao và có chỉ số đường

huyết tốt hơn

• Nhưng hàm lượng glycoalkaloid

cao và kích thước củ nhỏ khiến

chúng không thích hợp để trồng

trên diện tích lớn

2.6 Ứng dụng trong thuần hóa giống hoang dại

Cây lupin (Lupinus spp.) Cỏ linh lăng (Medicago sativa)

2.6 Ứng dụng trong thuần hóa giống hoang dại

• Mối quan tâm chính là

nguy cơ tạo ra những thay

đổi di truyền không mong

vị trí không mong muốn

2.7 Những nguy cơ của cây trồng chỉnh sửa gen

• Các mối quan tâm khác về công

nghệ CRISPR-Cas9:

• Liên quan đến protein Cas9 vì nó

gây ra phản ứng miễn dịch khi

được phân phối bởi virus liên

quan đến adeno đã được thí

nghiệm ở chuột

• Lo ngại về tính đặc thù của Cas9

• Số lượng hạn chế các trang web

2.7 Những nguy cơ của cây trồng chỉnh sửa gen

• Sự thiếu thông tin trong đại chúng về sự phân biệt giữa cây biến đổi

gen, cây chuyển gen và cây được chỉnh sửa bộ gen.

2.7 Những nguy cơ của cây trồng chỉnh sửa gen

3 KẾT LUẬN

 Với khả năng chỉnh sửa gen có một không hai, CRISPR–Cas đã giúp tạo ra hàng trăm giống cây trồng với hiệu suất nông học được cải thiện và cách mạng hóa công nghệ nhân giống

 Bên cạnh đó, việc biến đổi trực tiếp một số protein ngoại sinh vào thực vật có thể là một vấn đề, sẽ rất hữu ích nếu tinh chỉnh các nền tảng tiến hóa có định

TÀI LIỆU THAM KHẢO

• Makarova, K.S., Y.I Wolf and E.V Koonin, 2018 Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems:

Where from Here? The CRISPR Journal, 1(5): 325-336.

• Schenke, D and D Cai, 2020 Applications of CRISPR/Cas

to Improve Crop Disease Resistance: Beyond Inactivation

of Susceptibility Factors iScience, 23(9): 101478.

• Zhu, H., C Li and C Gao, 2020 Applications of CRISPR-Cas

in agriculture and plant biotechnology Nature Reviews

Molecular Cell Biology, 21(11): 661-677.

THANK FOR YOUR ATTENTION!