ỨNG DỤNG DNA BARCODE TRONG TRUY XUẤT NGUỒN GỐC NÔNG SẢN

ỨNG DỤNG DNA BARCODE TRONG TRUY XUẤT NGUỒN GỐC NÔNG SẢN I Giới thiệu DNA barcode 1 1 DNA barcode là gì I Giới thiệu DNA barcode 1 1 DNA barcode là gì Khái niệm mã vạch DNA được Paul Heber, nhà. ỨNG DỤNG DNA BARCODE TRONG TRUY XUẤT NGUỒN GỐC NÔNG SẢN

Trang 1

ỨNG DỤNG DNA BARCODE TRONG TRUY XUẤT NGUỒN GỐC NÔNG SẢN

Trang 2

I Giới thiệu DNA barcode

1.1 DNA barcode là gì

Trang 3

Khái niệm mã vạch DNA được Paul Heber, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph, Ontario đưa ra lần đầu tiên vào năm 2003, nhằm giúp nhận diện các mẫu vật (Hebert, 2003) Mã vạch ADN là trình tự nucleotide của một chuỗi ADN ngắn, có cùng nguồn gốc tổ tiên (orthologous), trong đó có vùng ít bị thay đổi (rất ổn định – bảo thủ) và có vùng dễ thay đổi trong quá trình tiến hóa Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự ADN này để đánh giá sự sai khác di truyền giữ các sinh vật

Trang 4

Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong geneome của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau, nó tương tự như máy quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngoài chúng rất giống nhau nhưng thực sự là khác nhau

Trang 5

Như vậy mã vạch DNA là một phương pháp định danh mà nó sử dụng một đoạn DNA chuẩn ngắn nằm trong bộ genome của sinh vật đang nghiên cứu nhằm xác định sinh vật đó thuộc về loài nào

Trang 6

Sau khoảng 10 năm nghiên cứu và phát triển DNA barcode, đến nay các nhà khoa học đã công bố trên 5 nghìn công trình khoa học trên các tạp chí khoa học chuyên ngành, với 3.483.696 trình tự mã vạch ADN ở 215.513 loài sinh vật, trong đó động vật có 144.402 loài, thực vật có 54.478 loài, nấm và các dạng sinh vật khác có 16.633 loài (theo tổ chức Hệ thống dữ liệu mã vạch sự sống - BOLD thống kê đến 1/11/2014

Trang 7

Từ cơ sở dữ liệu trên cho thấy, hướng nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch ADN đang được nhiều quốc gia, nhiều nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm phát triển, đặc biệt trong những năm gần đây và sẽ là một xu thế nghiên cứu trong thời gian tới (Valentini,

2009, 2010; Maurizio, 2010)

Trang 8

Mã vạch ADN được xem là một công cụ mới, hỗ trợ có hiệu quả trong nghiên cứu về phân loại, phát hiện loài mới, giám định loài và các mẫu có nguồn gốc từ sinh vật sống hoặc đã chết thậm chí đã qua chế biến, vì vậy mã vạch ADN có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cữu cũng như thực tiễn (Nimis, 2010; Bruni, 2010; Bell, 2011; Hebert, 2003; Lahaye, 2008; Liu, 2010)

Trang 9

Có nhiều đoạn ADN đặc trưng được sử dụng làm ADN mã vạch, các đoạn ADN mã vạch có thể là những đoạn ADN nằm ở trong:

-Nhân (nuclear DNA - nDNA),

như: 18S, 5,6S, 26S, 5S spacer và vùng ITS;

-Nằm ở ty thể (Mitochondrial DNA - mtDNA),

như: Cytb và vùng kiểm soát (control region);

-Lục lạp (Chloroplast DNA - cpDNA),

như: matK, rcbL, atpβ, ndnF, 16S

Trang 10

1.2 Các ứng dụng DNA barcode hiện nay

Những ứng dụng của mã vạch DNA không chỉ nhận diện nhanh các mẫu mà còn mở rộng nghiên cứu sắp xếp theo nhóm những

bí ẩn, còn mơ hồ hoặc những loài phức tạp Trong hệ sinh thái, mã vạch DNA rất hữu ích trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu mặc dù chúng hầu như không giống nhau về hình thái Phân tích sinh thái học ở thực vật đang diễn ra mạnh mẽ để hiểu được chế độ dinh dưỡng hoặc hướng di cư của động vật.

Trang 11

Mã vạch DNA cũng được ứng dụng tại hải quan nhằm hỗ trợ việc xác định nguồn gốc của sinh vật sống hoặc hàng nhập khẩu,

để ngăn cản sự vận chuyển trái phép các loài thực vật và động vật quý hiếm qua biên giới.

Trang 12

1.2.1 Kiểm soát tác nhân gây hại trong nông nghiệp

Sử dụng mã vạch DNA sẽ giúp định danh nhanh chống các loài gây bệnh ở giai đoạn tiềm ẩn (giai đoạn ấu trùng), hỗ trợ chương trình kiểm soát sâu bệnh bảo vệ cây trồng Cho đến này, về cơ bản đã hoàn thành mã vạch DNA để nhận diện sâu bệnh ở cây ăn trái trên thế giới và chuyển giao thiết bị, công nghệ cho các nhân viên hải quan của nhiều quốc gia để họ có thể xác định và ngăn cản sự lan truyền của trái cây nhiễm sâu bệnh.

Trang 13

1.2.2 Xác định vật chủ trung gian gây bệnh

Mã vạch DNA cũng được sử dụng để nhận diện những vật chủ trung gian gây bệnh Quá trình nhận diện các loài mang bệnh lây truyền giữa người và động vật Giúp hiểu biết thêm những bệnh truyền nhiễm cũng như phương pháp điều trị đạt được hiệu quả nhanh chóng Mã vạch DNA cho những vật chủ gây bệnh đang được xây dựng và phổ biến Điều này cung cấp cho các tổ chức và các cơ quan

y tế cộng đồng các công cụ và phương pháp hiệu quả để ngăn cản và hạn chế sự phát triển của ruồi và diệt côn trùng (CBOL ABS Brochure, 2012)

Trang 14

1.2.3 Bảo vệ loài nguy cấp

Mã vạch DNA có thể giúp những cơ quan có thẩm quyền chỉ ra thịt có nguồn gốc từ những loài nguy cấp, ngăn chặn săn bắn bất hợp pháp và giúp bảo tồn sự đa dạng sinh học Một dự án chiến lược trên toàn thế giới của mã vạch DNA đã được công bố gần đây nhằm xây dựng một thư viện mã vạch của các loài đang bị đe dọa (CBOL ABS Brochure, 2012)

Trang 15

1.2.4 Duy trì nguồn tài nguyên thiên nhiên

Mã vạch DNA ngoài việc giúp ngăn ngừa bệnh, kiểm soát hành vi săn bắn trái phép những loài nguy cấp mà nó còn được ứng dụng trong nông nghiệp và khai thác lâm nghiệp Có ít nhất hai dự án về mã vạch cho cá (Fish-BOL) và cây thân gỗ (Tree-BOL) nhằm thúc đẩy công tác quản lý và bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên (CBOL ABS Brochure, 2012)

Trang 16

1.2.5 Kiểm tra chất lượng nước

Nguồn nước bị ô nhiễm cần được xác định để phòng ngừa và biện pháp xử lý Ô nhiễm càng cao thì càng khó khăn hơn trong việc xác định các chỉ số ô nhiễm Vì thế, các nhà khoa học đang cô gắng xây dựng thư viện mã vạch DNA cho những “chỉ số mập mờ” Điều này giúp cho cán bộ quản lý môi trường tiêu chuẩn hóa lại các chỉ số trong việc đánh giá nước và thiết lập quy trình đáng giá tiêu chuẩn nước tốt hơn ở mỗi quốc gia

Trang 17

II Ứng dụng DNA barcode trong truy xuất nguồn gốc nông sản

2.1 Nguyên lý DNA barcode

- Bước 1: Phân lập DNA từ mẫu

- Bước 2: Khuếch đại vùng mã vạch DNA mục tiêu bằng PCR

- Bước 3: Trình tự các sản phẩm PCR

- Bước 4: So sánh các trình tự kết quả với cơ sở dữ liệu tham chiếu để tìm ra loài phù hợp

Trang 18

2.1.1 Lựa chọn các vùng DNA barcode

- Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật

- Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao

- Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài

Trang 19

2.1.1 Lựa chọn các vùng DNA barcode

ITS matK trnK-rps16 trnH-psbA atpB-rbcL ycf6-psbM trnV-atpE trnC-ycf6 psbM-trnD trnL-F rbcL

ITS 18S TEF1α TEF3 nLSU LNS2 ITS COI

16S Specific genes

WGS

Pre-barcode

18S

28S ITS 18S COI rbcL

…

Trang 21

2.1.3 Kỹ thuật PCR

• Tóm tắt quy trình thực hiện một phản ứng PCR

-Thiết kế mồi

- Chuẩn bị mẫu DNA

- Pha mix với các thành phần theo thứ tự sau:

- Cho vào máy lập chương trình chạy phù hợp

- Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose với sự có mặt của thang chuẩn

Trang 22

2.1.4 Phương pháp điện di trên gel agarose

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, 120V, 65mA trong 20 phút, đệm TAE 0,5X Sản phẩm PCR của các mẫu sẽ được tải vào giếng cùng với một giếng chứa DNA ladder

Sau điện di, các băng sáng xuất hiện dưới tác dụng của tia UV và DNA ladder sẽ được dùng làm thang đo kích thước cho các sản phẩm PCR

Trang 23

2.2.5 Giải trình tự PCR

- Phương pháp hóa học của Maxam-Gilbert

- Phương pháp enzyme sử dụng các dideoxynucleotide (Trình tự Sanger)

- Next generation sequencing – Giải trình tự thế hệ mới

Trang 24

2.2.6 Hiệu chỉnh trình tự

* Hiệu chỉnh trình tự bằng phần mềm FinchTV

- Kết quả giải trình tự 2 chiều được trả về dưới các dạng file: file AB1 (.ab1) và file text Sử dụng phần mềm FinchTV mở file AB1 đối với trình tự được giải với mồi xuôi (forward) và mồi ngược (reverse)

Trong các cửa sổ hiện ra có các sóng sắc phổ:

• Màu xanh lục: nucleotide loại A (Adenine)

• Màu xanh dương: nucleotide loại C (Cystein)

• Màu đen: nucleotide loại G (Guanine)

• Màu đỏ: nucleotide loại T (Thyamine)

Trang 25

* Hiệu chỉnh trình tự bằng phần mềm SeaView

Bước 1: trong cửa sổ chương trình FinchTV chọn menu ‘Edit’, chọn ‘copy in FASTA Format’ (hoặc sử dụng tổ hợp phím nhanh Ctrl+C)

Bước 2: mở phần mềm SeaView 4.2.12, vào menu ‘Edit’ chọn “load sequence” Khi cửa sổ hiện ra, nhấn tổ hợp phím Ctrl+V để dán trình tự đã copy dưới

định dạng FASTA vào Tiến hành cắt phần tên của trình tự (định dạng FASTA, ví dụ D26 – F) và chuyển vào ổ ‘Sep name’ trong cửa sổ, chọn “Add to alignment”.

Bước 4: chọn 2 trình tự xuôi và ngược của cùng một mẫu trong cửa sổ SeaView, vào menu “Align” chọn “Align selected sequences” để sắp thẳng hàng

Trang 26

* Hiệu chỉnh trình tự bằng phần mềm SeaView

Bước 5: kiểm tra các điểm sai khác giữa các trình tự Mỗi điểm sai khác giữa hai trình tự xuôi và ngược sẽ được chỉnh sửa dựa theo trình tự nào có sóng

sắc phổ rõ ràng hơn, đáng tin cậy hơn

Đối với các đoạn chỉ có ở trình tự xuôi hoặc ngược thì tiến hành kiểm tra, hiệu chỉnh trình tự dựa trên việc quan sát các sóng sắc phổ Nếu những điểm trong đoạn này không rõ ràng thì cần giải lại hoặc loại bỏ

Bước 6: tạo trình tự thống nhất (trình tự liên ứng - Consensussequence), trong cửa sổ SeaView chọn 2 trình tự vào menu ‘Edid’ chọn ‘Consensus

sequence’ Kết quả tạo thành một trình tự kết hợp, thỏa hiệp, có thể đổi tên bằng cách chọn trình tự Consensus và vào ‘Edid’, chọn ‘Rename sequence’, đặt tên lại trình tự thỏa hiệp cho phù hợp.

Trang 27

2.2.6.3 So sánh với cơ sở dữ liệu Genbank để kiểm tra độ chính xác của trình tự

Các bước thực hiện BLAST:

• Bước 1: vào trang wed http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

• Bước 2: chọn BLAST  nucleotide blast

• Bước 3: copy và dán trình tự cần phân tích vào cửa sổ ‘Enter Query Sequence’ Trong tùy chọn ‘Database’ chọn ‘nucleotide

collection’ Các tùy chọn khác đặt như mặc định

• Bước 4: chọn BLAST để phân tích và nhận kết quả

Trang 28

2.2.7 Xây dựng cây phát sinh chủng loài

2.2.7.1 Sắp cột thẳng hàng, chọn vùng phân tích và phân tích

Quá trình sắp cột thẳng hàng được thực hiện bằng phần mềm SeaView với tùy chọn MUSCLE và các thông số mặc định.

2.2.7.2 Xác lập mô hình tiến hóa

The Molecular Evolution Genetics Analysis (MEGA) – Phân tích tiến hóa về mặt di truyền phân tử - là phần mềm được xây dựng để phân tích so sánh về DNA và protein, nhằm mục đích suy luận về các mô hình tiến hóa phân tử của gen, bộ gen của các loài theo quá trình tiến hóa.

Việc xây dựng cây phát sinh dựa trên phần mềm MEGA 6.06 theo mô hình Kimura 2 - thông số, thuật toán Neighbor-Joining, chỉ số bootstrap là 1.000, để tiến hành tính toán khoảng cách di truyền và xây dựng cây phát sinh loài.

Trang 29

2.2 Một số ứng dụng DNA barcode trong truy

xuất nguồn gốc nông sản đã thực hiện

Phần dành cho đơn vị

Trang 30

2.2.1 Ứng dụng DNA barcode trong truy xuất nguồn gốc các loại ngủ cốc và gia vị

Trang 31

Nghiên cứu của Zang et al (2021)

Vật liệu: 53 mẫu hạt giống thuộc 25 loài của chi Oryza và Leersia từ nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới Phương pháp: Sử dụng 4 mã vạch DNA thực vật thông thường ( matK , rbcL , psbA-trnHvà ITS), sáu mã vạch DNA lục lạp dành riêng cho lúa ( psaJ - rpl33 , trnC-rpoB , rps16 - trnQ , rpl22-rps19 , trnK - matK và ndhC-trnV ), hai mã vạch DNA nhân cụ thể cho lúa (NP78 và R22 ), và một mã vạch siêu DNA bộ gen lục lạp

Kết quả: Đã đánh giá được hiệu suất của các mã vạch, xác định được danh tính các loài trong chi lúa Phát hiện 17% trong số

53 hạt giống từ ngân hàng hạt giống lúa hoặc bộ sưu tập đồng ruộng bị dán nhãn sai

Trang 32

Nghiên cứu của De Mattia et al (2011)

Vật liệu: 64 mẫu gia vị thuộc 6 chi khác nhau (bạc hà, húng quế, oregano, xô thơm, cỏ xạ hương và hương thảo)

Phương pháp: Sử dụng 4 mã vạch DNA (rpoB, rbcL, matK và trnH- psbA)

Kết quả: trnH-psbA đứng đầu về giá trị phân hóa giữa các loài, tiếp theo là matK với các giá trị khoảng cách di truyền giữa các loài trong khoảng từ 0% đến 7% và 0% đến 5% và thấp hơn là trình tự rbcL và rpoB Nhìn chung nếu có sự kết hợp giữa trnH-psbA và matK sẽ cho hiệu quả tốt hơn trong phân định loài.

Trang 33

2.2.2 Ứng dụng DNA barcode trong truy xuất nguồn gốc các loại thịt và sữa

các loại thịt và sữa

Trang 34

Một số nghiên cứu đã được tiến hành để truy xuất nguồn gốc các loại thịt của một số động vật có vú bằng cách sử dụng kỹ

thấy mã vạch DNA là một phương pháp đáng tin cậy để truy xuất nguồn gốc của thịt động vật có vú

Trang 35

Nghiên cứu của Hellberg et al, 2017

- Tổng số 60 sản phẩm thương mại khác nhau đại diện cho nhiều loại thịt động vật đã được nghiên cứu, bao gồm thịt nguội, thịt xay, sấy khô loại thịt,

và thịt đóng hộp.

- Sử dụng mã vạch độ dài đầy đủ (658 bp) và mã vạch nhỏ (127 bp) của cytochrome c gen tiểu đơn vị oxydase I (COI)

- Kết quả nghiên cứu cho thấy mã vạch đầy đủ có tỷ lệ giải trình tự thành công cao hơn (68,3%) so với mã vạch mini (38,3%) và mã vạch đầy đủ được phát hiện là phương pháp mạnh mẽ để phát hiện các loài trong thịt và các sản phẩm gia cầm, ngoại trừ sản phẩm đóng hộp

Trang 36

Truy xuất nguồn gốc sữa

Một công trình nghiên cứu nổi bật của Grass và các cộng sự, 2014 tại Viện Công nghệ Liên bang Thụy Sĩ ở Zurich

Đóng gói đoạn DNA trong các hạt silica vào nguyên liệu sữa trước khi sau chế biến thành sữa chua và phô mát -> truy xuất lại đoạn DNA đã bổ sung trong sản phẩm -> xác định nguồn gốc

Trang 37

Nghiên cứu của Syromyatnikov et al (2018), sử dụng mã vạch DNA để xác định thành phần các vi sinh vật trong sữa -> kiểm soát chất lượng sữa

Nghiên cứu của Uncu et al (2020), sử dụng phương pháp phân tích mã vạch DNA để xác định sự pha trộn của dầu thực vật trong sữa và các sản phẩm từ sữa, … -> Xác dịnh sự pha trộn tạp chất trong sữa

Trang 38

2.2.3 Ứng dụng DNA barcode như một công cụ truy xuất nguồn gốc trong quá trình chế biến công nghiệp thực phẩm

công nghiệp thực phẩm

Trang 39

Các nghiên cứu đã được thực hiện

trong sữa chua (Knight et al., 2007) và dư lượng trái cây (ví dụ chuối) trong nước trái cây , nguyên chất, sôcôla, bánh quy, v.v (Sakai et al., 2010)

2.2.3 Ứng dụng DNA barcode như một công cụ truy xuất nguồn gốc trong quá trình chế biến công nghiệp thực phẩm

Trang 40

2.2.3 Ứng dụng DNA barcode như một công cụ truy xuất nguồn gốc trong quá trình chế biến công nghiệp thực phẩm

Nghiên cứu của Shehata et al (2019)

- Thử nghiệm trên 100 sản phẩm xúc xích "đơn loài" được thu thập từ

các thị trường bán lẻ của Canada

- Sử dụng mã vạch DNA và PCR kỹ thuật số

Kết quả nghiên cứu của Shehata et al (2019)

Trang 41

2.2.4 Ứng dụng DNA barcode trong an toàn thực phẩm và gian lận thương mại

- Năm 2007, đã xảy ra một trường hợp gian lận thực phẩm trong đó gluten lúa mì được sử dụng trong thức ăn cho vật nuôi bị pha trộn với melamine, dẫn đến bệnh tật và cái chết của hàng ngàn vật nuôi ở Mỹ

- Vụ bê bối sữa Trung Quốc năm 2008 là một sự cố lớn về an toàn thực phẩm Sữa và sữa bột trẻ em bị nhiễm melamine Nó ảnh hưởng đến khoảng 300.000 người, bao gồm cả trẻ sơ sinh…

- Vụ bê bối thịt ngựa vào năm 2013 (DNA của ngựa được phát hiện trong thịt bò burger đông lạnh bày bán tại một số siêu thị Ireland và Anh)

Tiêu đề	Ứng dụng DNA Barcode trong Truy xuất Nguồn Gốc Nông Sản
Trường học	Đại học Guelph
Chuyên ngành	Sinh học
Thể loại	Báo cáo nghiên cứu
Năm xuất bản	2023
Thành phố	Guelph

Định dạng
Số trang	50
Dung lượng	1,94 MB