BÀI PHÚC TRÌNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN

- Kỹ thuật ly trích DNA phải đảm bảo các thao tác thu nhận DNA tổng số có độ tinh sạch cao, hàm lượng đủ lớn, ít bị đứt gãy,cũng như khảo sát về số lượng và chất lượng của mẫu DNA ly trí

1

ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

- -

BÀI PHÚC TRÌNH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN

Mã HP: CS320

Cán bộ hướng dẫn

2 Cao Nguyễn Tuyết Hoa B2005912

3 Lê Thị Tố Quyên B2015044

4 Lê Hoàng Thi B2015047

5 Vũ Ngọc B2010572

Cần Thơ, 11/2022

2

BÀI PHÚC TRÌNH

PHÂN TÍCH VÙNG GEN 16S DNA CỦA VI KHUẨN

BẰNG ENZYME CẮT GIỚI HẠN

I LY TRÍCH DNA CỦA VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỐC NHIỆT

1 Mục đích

- Khảo sát sự đa dạng giữa các dòng vi khuẩn cũng như đặc tính riêng của từng dòng vi khuẩn bằng cách phân lập vùng 16S rDNA của vi khuẩn

- Kỹ thuật ly trích DNA phải đảm bảo các thao tác thu nhận DNA tổng số có

độ tinh sạch cao, hàm lượng đủ lớn, ít bị đứt gãy,cũng như khảo sát về số lượng

và chất lượng của mẫu DNA ly trích nhằm tuyển chọn các mẫu DNA đủ yêu cầu để thực hiện các phân tích về bộ gene bằng phương pháp sinh học phân tử như PCR, SSR, RAPD, PCR-RFLP,… Cung cấp cho sinh viên những kiếm thức thực tế về gene cũng như sự đa dạng của nó Giúp sinh viên có kinh nghiệm về thao tác kỹ thuật khi việc phân lập vùng gene của vi khuẩn

2 Vật liệu và hóa chất

Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm:

- Máy ly tâm

- Máy ủ nhiệt

- Bộ micropipette

- Đầu cole

- Ống tuýp eppendoft 2,2 mL và 1.5Ml

Hóa chất:

- Dung dịch TE 1X

- 3 dòng vi khuẩn , 1 hỗn hợp và 1 đối chứng

3 Quy trình

1) Hút 2mL dung dịch vi khuẩn cho vào ống tuýp eppendoft 2,2 mL

- Ống 1: L4

- Ống 2: L7

- Ống 3: L7 + L8

- Ống 4: L8

- Ống 5: Đối chứng

2) Ly tâm 13000 vòng/phút, 5 phút

3) Thu cặn tế bào + 200 µL TE votex

3

4) Ly tâm 13000 vòng/phút, 3 phút

5) Thu cặn tế bào + 200 µL TE votex

6) Ly tâm 13000 vòng/phút, 3 phút

7) Thu cặn + 50 µL TE votex, trộn đều

8) Ủ ở 95oC trong 10 phút

9) Ly tâm 13000 vòng/phút, 5 phút

10) Hút phần dung dịch 30 µL cho vào tube 1,5mL

II KHUẾCH ĐẠI VÙNG 16S rRNA BẰNG MỒI TỔNG

1) Vật liệu và hóa chất

Vật liệu thí nghiệm:

- Máy PCR

- Máy chụp gel và đọc hình BioRad UV 2000

- Bộ điện di một chiều

- Ống tuýp eppendoft 0.5ml và 1.5ml

- Micropipette

- Giấy parafin

Hóa chất:

- BiH2O

- Buffer 5X

- Mồi xuôi 27F

- Mồi ngược 1492R

- Taq polymerase

- Mẫu DNA ly trích từ (phần I)

- Loading buffer

- Gel agarose 1,5%

Trình tự đoạn mồi:

Primer Trình tự primer

4

2) Nguyên lí:

- Kỹ thuật PCR – RFLP:

PCR – RFLP kỹ thuật này là sự kết hợp giữa phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) truyền thống và sự đa dạng của hệ thống RE ( enzyme cắt giới hạn) Trong phương pháp này vùng DNA quan tâm sẽ được khuếch đại bằng mồi chuyên biệt nhờ phản ứng PCR Vùng DNA sau khi khuếch đại sẽ được cắt bởi enzyme cắt giới hạn Phương pháp này khắc phục được tính phức tạp của RFLP, cũng như ít tốn kém và an toàn hơn do thời gian thực hiện nhanh, không sử dụng phóng xạ Tuy nhiên, do sử dụng PCR nên có thể sai lệch kết quả nếu nguồn DNA bị nhiễm

- Kỹ thuật điện di:

Điện di (electrophoresis) là kỹ thuật quan trọng trong lĩnh vực hóa học, hóa sinh và sinh học phân tử Điện di thường được dùng trong việc tinh sạch và phân tích các phân tử sinh học như nucleic acid, protein và một số ít phức hợp của carbohydrat, lipid

Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường Sự dịch chuyển này do thành phần lực điện trong lực Lorentz trong điện trường do tích điện âm của phân tử DNA sẽ di chuyển từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) Các phân tử DNA sẽ di chuyển trong điện trường với các tốc độ khác nhau do chúng khác nhau về kích

thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng)

Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một

kĩ thuật để phân tích các phân tử DNA, RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point) Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay

polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel) Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau) kích thước của phân tử

so với kích thước lỗ của gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử

5

Trong trường điện di các phân tử có kích thước càng nhỏ sẽ di chuyển càng nhanh, những phân tử cùng kích thước sẽ di chuyển cùng tốc độ Khi quá trình điện di kết thúc các phân tử DNA sẽ được quan sát thấy nhờ sử dụng chất nhuộm phát huỳnh quang Hiện nay,thuốc nhuộm được sử dụng phố biến là safe view, chất này được khuyến cáo là không độc, không gây hại cho môi trường và sinh vật, hiệu quả tương đương thuốc nhuộm ethidium

bromide (rất độc) được dùng trước kia Mỗi vệt sáng (băng-band) xuất hiện trên bản gel là sự thể hiện của một tập hợp các phân tử DNA có cùng kích thước Để ước lượng kích thước các phân tử DNA, phân tích thang chuẩn thường được sử dụng Thang chuẩn hay còn gọi là “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (MoclecµLar weigth maker-MWM), đây là tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước được biết trước, dựa vào kích thước biết trước này người nghiên cứu có thể biết được kích thước đoạn DNA cần nghiên cứu

- Kỹ thuật PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction),là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào

đó Có sự hiện diện của Taq polymerase, mồi, dNTPs, DNA khuôn ( được trích từ sinh vật có đoạn DNA cần khuếch đại)

Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, bao gồm các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ trong phản ứng biến tính ADN và tái bản ADN Đoạn mồi (là đoạn ADN ngắn) mang các trình tự bổ sung với trình tự ADN đích và ADN

polymerase là những thành phần quan trọng cho phép khuếch đại một cách chọn lọc và lặp lại Khi quá trình PCR diễn ra, ADN mới được tạo ra từ ADN khuôn ban đầu sẽ tiếp tục được sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử ADN tiếp theo, tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền trong đó các mẫu DNA được khuếch đại theo cấp số nhân

 Một phản ứng PCR bao gồm các giai đoạn:

Giai đoạn khởi đầu: (Chỉ cần đối với những enzyme ADN polymerase bắt

buộc phải kích hoạt bằng nhiệt độ) Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 94-96°C (hay 98°C nếu sử dụng polymerases cực kỳ bền nhiệt) và được tiến hành trong 1-9 phút

Giai đoạn biến tính: đây là bước đầu tiên của chu kỳ và là quá trình tăng

nhiệt độ lên 94-98°C trong 20-30 giây ADN được biến tính bằng cách phá

vỡ liên kết hydro giữa các bazo, tạo thành phân tử ADN sợi đơn

Giai đoạn gắn mồi: hạ nhiệt độ xuống khoảng từ 45-600C để gắn kết các chuỗi mồi, cho phép các chuỗi mồi đặc hiệu gắn lại trên đoạn DNA cơ bản ở

vị trí có mã tương đồng

6

Giai đoạn kéo dài: do tác dụng của enzyme taq polymerase thực hiện ở 720C (nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của taq) Tiến hành sinh tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có đoạn mồi theo chiều5’-3’

Giai đoạn bảo quản: Giai đoạn này thực hiện ở nhiệt độ 4-15°C trong một

thời gian để bảo quản ngắn hạn sản phẩm của phản ứng

3) Quy trình + Pha mix

a) Pha mix PCR thực hiện nhân vùng 16S DNA với các thành phần cho 1 phản ứng như bảng bên dưới

Thành phần Thể tích (µL)

Mồi xuôi 27F

Mồi ngược 1492R

Taq polymerase 0,1X

∑ = 25 µL

Pha mix cho nhóm 5 sinh viên:

- Hút 78,75 µL BiH20 vào tuýp 1.5ml

- Tiếp tục hút 25 µL buffer 5X

- Hút 5 µL mồi 27F

- Hút 5 µL mồi 1492R

- Hút 1.25µL Taq polymerase

- Trộn đều hỗn hợp mix sau đó hút 23µL vào 5 ống tuýp 0.2ml

- Hút 2µL DNA mẫu vào từng tuýp 0.2mL

7

- Tiến hành PCR với máy PCR với chu kì nhiệt như sau:

b) Điện di sản phẩm PCR 16S DNA

Bước 1 Dùng micropipette (2-20µL) hút 10 μL phần dung dịch trong tuýp PCR cần điện di trộn đều với 2µL loading buffer trên giấy parafim

Bước 2 Tiếp tục dùng micropipette hút hết phần dung dịch vừa trộn, bơm

vào các giếng trên bảng gel agarose (1,5%) và bơm thang chuẩn

Bước 3 Đặt vào khay điện di Chạy điện di với hiệu điện thế 100 V Theo

dõi gel trong khi điện di, không để phần mẫu chạy khỏi bảng gel

Bước 4 Sau khi hoàn tất quá trình điện di, chụp hình gel và phân tích kết

 Kết quả và hình gel

Hình 1 Chu kỳ nhiệt PCR

Hình 2 Kết quả điện di

8

 Nhận xét

- Mẫu của nhóm có tổng cộng 10 giếng, qua kết quả ta thấy giếng

3,4,7,8,10 có xuất hiện band tuy nhiên độ rõ rệt các band không đồng đều chứng tỏ độ tinh sạch DNA ở các nhóm có sự khác biệt, các band ở giếng

số 4,10 rất mờ do có độ tinh sạch thấp hơn so với các band ở giếng số 3,4,7,8,10 Ở các giếng còn lại không xuất hiện band chứng tỏ mẫu không còn DNA hoặc là lượng DNA quá ít, nguyên nhân có thể là do thao tác ly trích DNA chưa đúng và DNA không giải phóng, hoặc quá trình hút dịch DNA sau ly tâm không chính xác

- Quan sát giếng 7 ta thấy mẫu DNA đã tinh sạch không còn lẫn tạp chất hoặc rất ít

III KHẢO SÁT VÙNG 16S - rDNA BẰNG ENZYME CẮT GIỚI HẠN

1 Mục đích và nguyên lí

 Mục đích:Khảo sát sự đa dạng và tiến hóa của các mẫu vi khuẩn bằng việc sử dụng các enzyme cắt giới hạn chuyên biệt

 Nguyên lí:RFLP hay còn gọi là kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn, là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA hệ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng tạo ra hàng loạt đoạn DNA có độ dài xác định,

số lượng các đoạn phụ thuộc vào số điểm nhận biết trong hệ gen Sử dụng

kỹ thuật RFLP có thể xác định một tính trạng ở trạng thái đồng hợp hoặc

dị hợp trong một các thể Vì vậy, RFLP là một chỉ thị tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là tốn kém và mất thời gian, sử dụng phóng xạ, đòi hỏi phải có một lượng DNA lớn (50 – 200 ng từ mỗi cá thể) Enzyme cắt giới hạn (RE) là nhân tố chính trong kỹ thuật RFLP RE là một enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu RE hiện diện trong tế bào vi khuẩn như một

hệ thống bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại sự xâm nhập của virus Hiện tại

RE được chia thành 3 nhóm tùy theo tính chất cắt sợi DNA của chúng Trong đó nhóm I và nhóm III không cắt ngay vị trí nhận biết Nhóm II là nhóm RE cắt ngay vị trí nhận biết, thường vị trí nhận biết của nhóm này là

từ 4 – 12 cặp nucleotide Đây là nhóm RE được ứng dụng trong các kỹ thuật sinh học phân tử Hiện tại có khoảng hon 3400 RE được phân lập trong đó có hơn 540 RE đã được thương mại hóa

9

2 Vật liệu và hóa chất

Dụng cụ và thiết bị

- Bộ điện di một chiều

- Máy chụp gel và đọc hình BioRad UV 2000

- Máy ủ nhiệt

- Gel agarose 1.5%

- Micropipette

- Hộp nước đá

- Tuýp eppendoft

Hóa chất

- BiH2O

- Buffer vàng 10X

- Enzyme cắt giới hạn SmaI

- Sản phẩm PCR

- Loading buffer

3 Quy trình

1) Chuẩn bị 3 tuýp 1,5 mL

2) Pha mix phản ứng cắt enzyme cắt giới hạn theo bảng dưới đây:

Thành phần Thể tích (µL) Tổng (µL)

∑ = 15 µL

Enzyme RE Nguồn gốc ly trích Vị trí cắt và trình tự cắt

SmaI Serratia marcescens Sb CCC | GGG

GGG | CCC

10

3) Chia đều hỗn hợp mix cho 3 tuýp (mỗi tuýp 7 µL)

4) Hút 8 µL sản phẩm PCR vào từng tube

5) Ủ 37oC trong 1 giờ

6) Trộn mẫu với dung dịch thuốc nhuộm 2 µL Loading buffer

7) Load mẫu vào gel và tiến hành điện di

8) Chụp hình gel và ghi nhận kết quả

Hình 3 Kết quả điện di

1 2 3 4 5 6 M

11

Với: M : Mẫu đối chứng

Nhóm 1: 1,2,3

Nhóm 2: 4,5,6

Nhận xét:

- Nhóm 1 chỉ có mẫu 1 và mẫu 3 có band, còn các band còn lại bị lỗi nguyên nhân do buffer pha lỗi, cho quá nhiều thuốc nhuộm màu 2 lúc chạy gel, bơm DNA trôi ra ngoài

- Hình 3, band 1,3 có 2 band có cùng kích thước  Các enzyme cắt giới hạn cắt cùng một vị trí đặt hiệu Hai mẫu có chứa đoạn gene 16S rDNA của vi khuẩn

- Các band 4,5,6 do quá trình thao tác bị sai nên không có DNA trong mẫu, khiến enzyme không thể cắt, dẫn đến không xuất hiện band

12