TÀI LIỆU HƯỚNG dẫn THÍ NGHIỆM hóa SINH 2 (phòng thí nghiệm CNSH) bài 1 QUY tắc AN TOÀN và các KHÁI NIỆM cơ bản

- Khi làm việc với các chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần ngọn lửa - Khi làm việc với các acid và bazơ mạnh, cần lưu ý: ❖ Bao giờ cũng đổ acid hay baz vào nước khi pha loãng không đượ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA- BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-*** -

TÀI LIỆU HƯỚNG DẪN

THÍ NGHIỆM HÓA SINH 2

(Phòng thí nghiệm CNSH)

Giáo viên hướng dẫn: Ths PHẠM THỊ KIM THẢO Sinh viên thực hiện:

Lớp sinh hoạt:

Nhóm học phần:

Nhóm thí nghiệm:

LƯU HÀNH NỘI BỘ

Đà Nẵng, 2019-2020

1

BÀI 1: QUY TẮC AN TOÀN VÀ CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

I QUY TẮC SỬ DỤNG HÓA CHẤT

- Hóa chất được sắp xếp trong kho hay trong tủ theo từng loại (hữu cơ, vô cơ, acid, bazo, muối, kim loại…) hay theo một thứ tự a, b, c để khi cần dễ tìm

- Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi và trước khi dùng phải đọc kỹ nhãn hiệu, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu

- Các loại hóa chất bị thay đổi ngoài ánh sáng cần giữ gìn trong chai lọ màu vàng

- Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay, không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất

- Khi làm việc với các chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần ngọn lửa

- Khi làm việc với các acid và bazơ mạnh, cần lưu ý:

❖ Bao giờ cũng đổ acid hay baz vào nước khi pha loãng (không được đổ nước vào acid hay bazo)

❖ Không hút acid hay bazơ mà phải dùng các dụng cụ riêng như bầu cao su

❖ Trường hợp bị bỏng acid hay bazơ, cần rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên chỗ bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hay CH3COOH 1% (nếu bỏng bazơ) Nếu bị bắn vào mắt, dội mạnh với nhiều nước lạnh hoặc NaCl 1%

❖ Trường hợp bị uống vào miệng hay dạ dày:

Nếu là acid, súc miệng và uống nước lạnh có MgO

Nếu là baz, súc miệng và uống nước thật lạnh có CH3COOH 1%

- Không hút bằng ống hút khi còn ít hóa chất trong lọ

II NỒNG ĐỘ CỦA DUNG DỊCH

Khi hòa tan muối vào nước ta được nước muối

a Muối: chất hòa tan hay dung chất

b Nước: Dung môi

c Nước muối: dung dịch

2

Nồng độ của dung dịch có thể thay được diễn tả nhiều cách khác nhau:

1) Nồng độ % khối lượng theo khối lượng (%P/P): số g chất hòa tan có trong 100 g dung dịch

Ví dụ: dung dịch NH4Cl 5% theo khối lượng là 100 g dung dịch ấy sẽ có 5 g NH4Cl tinh khiết

2) Nồng độ % khối lượng theo thể thể tích (% P/V): số g chất hòa tan có trong 100 ml dung dịch

Ví dụ: dung dịch CuSO 4 10% theo thể tích là 100 ml dung dịch ấy sẽ có 10 g CuSO 4 tinh khiết

3) Nồng độ % thể tích theo thể tích (% v/v): số ml dung chất có trong 100ml glycerin 4) Nồng độ phân tử – Nồng độ mol (Mol/l hay M): là số phân tử gram trong 1ít dung dịch hay số mol trong 1 lít dung dịch

5) Nồng độ g/l: số gram chất tan có trong 1 lit dung dịch

6) Nồng độ dung dịch bão hòa: khối lượng tối đa chất hòa tan trong dung dịch

7) Dung dịch nguyên chuẩn (N): một dung dịch được gọi là nguyên chuẩn khi một lít dung dịch ấy chứa một khối lượng chất hòa tan được gọi là đương lượng gram

III CÁCH PHA VÀ ĐỊNH CHUẨN MỘT SỐ DUNG DỊCH THƯỜNG DÙNG

Với điều kiện của phòng thực tập sinh hóa hiện nay, chúng ta có thể pha 2 dung dịch chuẩn gốc sau đây:

Dung dịch acid oxalic (COOH) 2 N( γ =2): cân thật chính xác M/2 lượng (COOH)2 để hòa tan với nước cất thành một lít, ta được một dung dịch chuẩn acid oxalic 1 N Bảo quản

trong chai thủy tinh nút mài và để tránh ánh sáng

Dung dịch KIO 3 N/10 ( γ =6): cân thật chính xác (M/6 x 10) lượng iodat kali hòa tan

với nước cất thành 1 lít, ta được dung dịch chuẩn KIO3 N/10

Hai dung dịch trên dùng để chuẩn độ lại các dung dịch chúng ta pha sau

Dung dịch NaOH N

Cân 40 g NaOH hòa tan thành 1 lít dung dịch với nước cất

3

Định lại chuẩn độ NaOH này với dung dịch (COOH)2 N đã pha trên: lấy 10 ml dung dịch NaOH mới pha chuẩn độ với dung dịch (COOH)2 N trên với sự hiện diện của thuốc thử màu phenolphtalein Nếu dung dịch NaOH này có nồng độ > N hay <N ta phải tính thêm lượng nước hay NaOH thêm vào để được một nồng độ đúng N dùng để định chuẩn các acid sau

Axit nguyên chuẩn N

Muốn pha các dung dịch nguyên chuẩn từ acid đậm đặc, nếu chưa biết độ hòa tan tối đa và

tỷ trọng các acid đậm đặc ta xác định độ nguyên chuẩn của nó bằng cách lấy 1 ml chuẩn độ với NaOH N đã biết

Ví dụ: acid lấy là 30 N, ta phải pha loãng 30 lần ít hơn để được acid N Sau đó hiệu chỉnh lại cho đúng nồng độ N với NaOH N hay Na2CO3 N

Dung dịch HCl N (HCl đậm đặc 12 M = 12 N, γ =1) Hòa 85 ml HCl đậm đặc

trong nước cất vừa đủ 1 lít Xác định chuẩn độ đúng với NaOH N trên (dùng thuốc thử màu phenol phtalein)

Từ dung dịch mẹ HCl N, ta áp dụng hệ thức C1V1= C2V2 để pha thành các dung dịch HCl các nồng độ nhỏ hơn:

Dung dịch permanganat kali (KmnO 4 ) ( γ =5)

Cân (M/5x1/10) g KMnO 4 hòa tan trong nước cất cho đủ 1 lít Hiệu chuẩn nồng độ theo cách sau: hút 10ml dung dịch (COOH)2(N/10) + 10 ml dung dịch H 2 SO 4 1/5

Đun nóng khoảng 40 - 50C Nhỏ KMnO4 vừa pha đến màu hồng nhạt

Dung dịch Na 2 S 2 O 3 N/10 ( γ =1)

Cân M/1x1/10 g Na2S2O3 hòa tan thành 1 lít với nước cất Định lại nồng độ với dung dịch KIO3 N/10 pha ở trên theo cách sau: hút 10 ml dung dịch KIO3 N/10 thêm vào một ít tinh thể KI + 2 ml HCl đậm đặc Định chuẩn với dung dịch Na2S2O3 vừa pha đến khi mất màu nâu của iod sinh ra (thử với hồ tin bột)

Dung dịch Iod ( γ =1) N/10

4

Cân (M/1 x 1/10) g + 25,5 g KI pha thành 1 lít với nước cất, định phân lại nồng độ với dung dịch Na2S2O3 N/10 vừa hiệu chỉnh trên

IV PHA HÓA CHẤT THÍ NGHIỆM

2.1 Chuẩn bị dung dịch iod 0,1N

- Dung dịch iot 0,1 N: hòa tan 12,7 g iốt vào 350 ml dung dịch nước của 40 g Kali iodua Thêm nước cất đến 1 lít

- Tính hệ số hiệu chỉnh: Dùng pipet lấy 25 ml dung dịch iốt vào bình nón cỡ 250 ml, thêm

20 – 30 ml nước cất và chuẩn độ bằng dung dịch Natri thiosunfat 0,1; đến màu vàng nhạt, thêm 2 – 3 ml dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn đến hết màu xanh

T = VOTO/V Trong đó: VO: thể tích dung dịch Natri thiosunfat tiêu tốn (ml);

TO: Nồng độ đương lượng của dung dịch Natri thiosunfat (%);

V: thể tích dung dịch iốt 0,1N đã dùng (ml)

2.2 Chuẩn bị dung dịch hồ tinh bột

Hồ tinh bột 0,7%: hòa 0,7g tinh bột hòa với 1 ít nước cất sau đó bổ sung thêm nước cất đang sôi đủ 100ml đun nhẹ ít phút Để nguội Dung dịch phải để chỗ mát và hạn dùng 10 ngày kể từ khi pha chế

2.3 Chuẩn bị thuốc thử Fehling

- Dung dịch Fehling A: hòa tan 0,4g CuSO4.5H2O trong 10 ml nước cất (nếu dung dịch đục thì cần lọc)

- Dung dịch Fehling B: hòa tan 0,2g C4H4O6NaK.4H2O và 1,5g NaOH trong 10 ml nước cất Thuốc thử Fehling (chỉ pha ngay trước khi sử dụng để hạn chế sự tạo thành kết tủa Cu(OH)2: trộn 1 thể tích Fehling A và 1 thể tích Fehling B, lắc đều, thu được dung dịch trong, xanh biếc

5

BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG IOD

1 Nguyên tắc

Vitamin C có thể khử dung dịch iod, dựa vào lượng iod bị khử bởi vitamin C có

trong mẫu, suy ra hàm lượng vitamin C

2 Hóa chất

- Dung dịch HCl 5%

- Dung dịch iot 0,01N

- Dung dịch tinh bột 1%

3 Tiến hành

Cân 10 g rau chân vịt tươi, nghiền nhỏ trong cối sứ với 10 ml HCl 5%, nghiền kỹ

cho đến khi thành dạng đồng thể, cho toàn bộ vào ống đong (hoặc bình định mức), dẫn đến

vạch 100ml bằng nước cất, khuấy đều, lọc Lấy 20ml dịch lọc cho vào bình nón dung tích

100ml, chuẩn độ bằng dung dịch I2 có tinh bột làm chỉ thị màu (cho 5 - 10 giọt tịnh bột 1%

vào bình chứa vitamim C), chuẩn độ đến khi xuất hiện màu xanh thì dừng lại

4 Tính kết quả

Hàm lượng vitamin C trong mẫu (theo phần trăm) được tính theo công thức sau:

Trong đó: V: số ml dung dịch iot 0,01N dùng chuẩn độ

V1: thể tích mẫu thí nghiệm (100ml) V2: Thể tích dịch mẫu lấy để xác định (20ml) W: khối lượng mẫu (10g)

0,00088 số gam vitamin C tương ứng với 1 ml dung dịch iot 0,01N

6

BÀI 3: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CATALASE

1 Nguyên tắc

Catalase: H2O2 oxydoreductase phổ biến rộng rãi trong tế bào động vật, thực vật và

có trong tế bào vi sinh vật, vật hiếu khí Catalase xúc tác phản ứng phân giải H2O2 thành nước và oxy phân tứ, ngoài ra nó còn oxy hóa các rượu và một số hợp chất khác làm thay đổi thành phần axit và một số chất khác Vì vậy nếu hàm lượng catalase cao trong một số chế phẩm hay nguyên liệu thì nó xúc tiến quá trình oxy hóa mạnh hơn Để biết

và xác định nó, tìm ra một số nguyên nhân hư hỏng thực phẩm hay so sánh hoạt lực catalase có thể dựa vào lượng oxy phân tử được tạo thành (phương pháp áp kế) hoặc lượng H2O2 bị phân hủy (phương pháp chuẩn độ bằng KMnO4)

Catalase là enzym xúc tác cho phản ứng:

2H2O2 O2 + 2H2O (1)

Ta định lượng catalase bằng phương pháp sử dụng KMnO4 để xác định lượng H2O2

trước và sau khi enzym tác dụng theo phương trình phản ứng:

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8 H2O (2)

2 Vật liệu

+ Khoai tây, cát, bột CaCO3, KMnO4 0.1N, H2SO4 10%, H2O2 0,1% trong đệm phosphate pH = 7

+ Ống nghiệm, pipet, cối, chày, buret 50 ml, bình định mức 100 ml, bình nón 250

ml, nồi cách thủy 100ºC

3 Tiến hành

+ Chuẩn bị dung dịch catalase:

Cân 2g khoai tây cho vào cối, nghiền cùng cát, thêm từ từ 2-3ml nước và một ít CaCO3 để trung hòa dung dịch chiết (đến khi ngừng tạo bọt CO2), chuyển toàn bộ mẫu đã nghiền vào bình định mức, thêm nước cất đến 100ml , lắc đều, để lắng 30 phút Lọc thu dịch trong

+ Chuẩn bị mẫu phản ứng enzym

Cho vào bình nón A 20 ml dung dịch enzym, tiếp theo cho 25 ml dung dịch H2O2

0,1%, giữ 30ºC trong 30 phút, thêm 5 ml H2SO410%, chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1phút

7

Cho vào bình nón B 20 ml dung dịch enzym, đặt vào nồi cách thủy đang sôi 5 phút

để bất hoạt enzym Lấy ra để nguội, thêm 25 ml dung dịch H2O2 0,1%, thêm 5 ml

H2SO410%, chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền

4 Tính toán kết quả

+ Số mg H2O2 bị phân hủy bởi catalase trong 1g khoai tây (X)

X =

A, B là thể tích KMnO4 đã chuẩn độ trong bình A và B tương ứng V1, V2 là thể tích enzym ban đầu lấy xác định

a Số gam nguyên liệu lấy nghiên cứu 1,7 hệ số phản ứng tính theo H2O2 tính theo phương trình phản ứng (2) + Số đơn vị catalase trong 1 gam khoai tây trên 1micoromol H2O2 phân giải sau 1 phút:

Y =

30 là thời gian enzym tác dụng 0,034 là khối lượng 1µmol H2O2



8

BÀI 4: PHÁT HIỆN CÁC SẢN PHẨM ĐƯỜNG, PROTEIN, ACID AMIN TRONG

NƯỚC TIỂU 4.1 Nhận biết protein

4.1.1 Kết tủa protein bằng muối trung tính

+ (NH4)2SO4 là muối trung tính, vừa có tác dụng trung hòa điện ( các ion tác dụng tương hỗ với các nhóm điện tích trái dấu), vừa loại bỏ lợp vỏ hydrat của phần từ keo protein, do đó làm kết tử protein Phan rứng kết tủa này có tính thuần nghịch, các protein khác nhau bị kết tủa ở nồng độ muối khác nhau

+ So với albumin, globulin có độ tan kém hơn nên kết tủa trước, khi hòa tan sẽ tan chậm hơn

- nguyên liệu và hóa chất

+ Lòng trắng trứng pha loãng: lấy lòng trắng trứng 1 quả cho vào 0,5 lít nước cất,

cho thêm 3 g NaOH tinh khiết, khuấy đều

+ Chuẩn bị dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa: cân 8g tinh thể amoni-sulfat

(NH4)2SO4 , hòa tan từ từ trong 10 ml nước cất cho tới khi tinh thể không bị hòa

tan Lọc bằng giấy lọc

- Tiến hành:

+ Cho vào ống nghiệm 5ml lòng trắng trứng + 5ml dd (NH4)2SO4 bảo hòa, lắc

đều đến khi dung dịch bán bảo hòa và xuất hiện kết tủa

+ Để 5 phút, lọc thu kết tuả và dịch vào 2 ống nghiệm khác nhau (thấm ướt giấy

lọc bằng dd (NH4)2SO4)

+ Cho vào dịch lọc 3g tinh thể (NH4)2SO4 (nếu dịch lọc là 4 ml) cho đến khi dung

dịch bảo hòa, lắc, kết tủa,lọc, thu kết tủa

+ Thêm vào mỗi ống kết tủa từ 2-3ml nước cất, lắc đều, so sánh sự hòa tan kết

tủa (chú ý nên lấy lượng kết tủa tương đối bằng nhau vì kết tủa của globulin

thường nhiều hơn albumin)

9

Kết quả?

Giải thích?

4.1.2 Kết tủa protein bằng axit hữu cơ (kết tủa không thuận nghịch)

+ TCA (tricloacetic acid) là một muối hữu cơ có tác dụng làm biến tính protein (thay đổi tính tan, hoạt tính sinh học, cấu trúc ), khi đó protein đông tụ lại thành dạng keo không hòa tan (kết tủa không thuận nghịch) Các nhận tố khác cũng gây biến tính protein như nhiệt độ cao, acid vô cơ đặc, một số acid hữu cơ, kiềm đặc, muối kim loại nặng nồng độ cao + Phản ứng này được sử dụng rộng rãi trong thực tế để phát hiện hoặc loại bỏ protein khỏi dung dịch, phát hiện protein tỏng nước tiểu ( độ nhạy tới 0,0015%)

- Nguyên liệu – hóa chất

+ Dung dịch lòng trắng trứng 5%, Tricloacetic (CCl3-COOH) 10%

+ Ống nghiệm, pipet

- Tiến hành:

+ Cho 1 ml dung dịch lòng trắng trứng 5% vào ống nghiệm

+ Thêm 5 – 10 giọt dung dịch trichoacetic acid (TCA) 10% lắc đều Quan sát hiện tượng

Kết quả?

Giải thích?

2 Dùng phản ứng Trommer hoặc phản ứng với thuốc thử Fehling để phát hiện

đường khử trong nước tiểu

- Phân biệt đường đơn (glucose) và đường đôi (saccharose)

Phản ứng với thuốc thử Fehling, Benedict hay tráng gương đều là những phản ứng chứng minh glucose có tính khử, phân biệt gluose với sucrose Phản ứng Benedict và tráng gương có thể thực hiện dễ dàng, hóa chất dễ chuẩn bị (chú ý tránh để AgNO3 dây ra tay)

- Phản ứng với thuốc thử Fehling

10

Trong thuốc thử Fehling, muối tactrat có vai trò tạo phức với Cu2+ tạo ion phức [Cu(C4H4O6)2]2- (khiến Fehling có màu xanh lơ) nhằm ngăn cản sự tạo thành kết tủa Cu(OH)2 trong thuốc thử

Khi tác dụng với glucose (HO−CH2−(CHOH)4−CH=O, có chứa gốc andehyte) hoặc các chất chứa gốc andehyte, thuốc thử này tạo kết tủa Cu2O đỏ Phản ứng xảy ra khi đun nóng: 2Na2[Cu(C4H4O6)2] + NaOH + R−CHO + H2O → Cu2O + R−COONa + 2H2C4H4O6 + 2Na2C4H4O6

- Dụng cụ Nguyên liệu và hóa chất:

Nước tiểu, thuốc thử Fehling

- Tiến hành

Cho vào ống nghiệm 3ml nước tiểu, thêm 1ml thuốc thử Fehling, đun sôi trên đèn cồn trong 3 phút Nếu thấy có kết tủa đỏ chứng tỏ trong nước tiểu có đường, cần phải điều trị bệnh tiểu đường và ăn rút lượng chất đường bột

3 Phát hiện protein trong nước tiểu

Ở người bình thường, trong nước tiểu không có protein Trong những trường hợp bệnh lí, hoặc ở trạng thái sinh lí đặc biệt (ví dụ phụ nữ thời gian có mang), số lượng protein thải ra trong một ngày đêm qua đường nước tiểu tăng từ vài gam đến hàng chục gam Các protein này thường là anbumin hoặc là globulin Dùng các tác nhân gây kết tủa protein như nhiệt độ cao, axit vô cơ hay axit hữu cơ để phát hiện protein trong nước tiểu

Nguyên liệu và hóa chất: nước tiểu, HNO3 đặc, axit sunfosalixilic 20%

Thực hành:

Lấy 3 ống nghiệm Cho vào mỗi ống 2ml nước tiểu Đun sôi ống thứ nhất trên đèn cồn, nếu có protein sẽ có kết tủa (dạng vẫn)

Ống thứ hai cho từ từ theo thành ống nghiệm 1ml axit HNO3 đặc

Ống thứ ba cho vào 5 giọt axit sunfosalixilic 20%

Nếu có kết tủa trắng hoặc dạng vẩn thì nước tiểu có protein, nếu không có kết tủa thì đó

là nước tiểu của người khỏe manh, bình thường

11

4 Phát hiện axit amin trong nước tiểu

Axit amin là sản phẩm của sự phân giải protein trong tế bào, cũng có thể do được cung cấp qua thức ăn Ngoài những hướng chính là tham gia sinh tổng hợp protein, hoặc bị oxi hóa thành CO2, H2O, một phần nhỏ axit amin cũng bị thải ra ngoài cơ thể qua nước tiểu Ở những cơ thể đang lớn, khỏe mạnh, bình thường, lượng axit amin thải ra ngoài rất ít, không đáng để, còn ở những cơ thể bệnh lí hoặc cân bằng nito âm thì axit amin thải ra nhiều hơn

Ninhydrin là một hợp chất dicarbonyl chứa một vòng thơm với một vòng dị vòng được gắn vào nó, nguyên tử thứ hai trong đó có 2 nhóm hydroxyl (OH - ) Phản ứng ninhydrin được sử dụng chủ yếu để xác định trực quan hàm lượng các hợp chất amino:

• axit amin α (bao gồm protein) ;

• đường amin;

• các ancaloit chứa nhóm NHNH 2 và -NH;

• các amin khác nhau

Các acid amin và peptid khi phản ứng với ninhdrin sẽ bị dezamin hóa, oxy hóa và decacboxyl hóa tạo thành NH3, CO2 và andehyt tương ứng, sản phẩm ngưng kết có màu xanh tím theo phương trình hình 4.1

Hình 4.1 Phản ứng ninhydrin và acid amin

- Nguyên liệu và hóa chất: nước tiểu, ninhidrin 0,1%, giấy lọc

- Tiến hành: