Bộ khoa học và công nghệ - Bộ Y tế Trung tâm khoa học sản xuất văcxin sabin ================================================= Đề tài độc lập cấp nhà nớc Bớc đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất văcxin sởi tại việt nam qui mô phòng thí nghiệm 5836 20/7/2006 Hà nội 2002 2 Đề tài độc lập cấp Nhà Nớc Bớc đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất văcxin sởi tại việt nam qui mô phòng thí nghiệm Chủ nhiệm đề tài: GS.TSKH. Nguyễn Văn Mẫn Phó chủ nhiệm đề tài: GS.TS. Huỳnh Phơng Liên Cố vấn khoa học: GS.TSKH. Hoàng Thuỷ Nguyên GS.TS KH. Đặng Đức Trạch Cán bộ tham gia: TS. Nguyễn Đăng Hiền ThS. Cao Xuân Thịnh ThS. Hoàng Thanh Hơng CN. Đặng Mai Dung BS. Đoàn Văn Lu TS. Nguyễn Thị Quỳ BS. Nguyễn Anh Thu CN. Trần văn Dụ CN. Nguyễn Thanh Thuỷ BS. Nguyễn Thị Thờng BS. Nguyễn Thị Thắng Các cơ quan tham gia: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng 3 Chữ viết tắt ADN Deoxyribonucleic Acid (Axit deoxyribonucleic) ARN Ribonucleic Acid (Axit ribonucleic) Bộ KHCN&MT Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trờng BTP Bán thành phẩm CCID 50 Cell Culture Infective Dose 50% (Liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy) CEC Chicken Embryonate Cell (Tế bào phôi gà) CGI Cell Growth Index (Chỉ số phát triển tế bào) CMF Hanks Ca and Mg Free Hanks (Hanks không có ion Ca và Mg) CPE Cytopathic Effects (Tác dụng huỷ hoại tế bào) FBS Fetal Bovine Serum HA Hemagglutinin HAM Human Amniotic Membrane (Tế bào màng ối ngời) HK Human Kidney Cell (Tế bào thận ngời) KB Human rhinopharyngeal cancer epithelial cells (Tế bào ung th biểu mô mũi hầu ngời) KHT Kháng huyết thanh KN Kháng nguyên MMR Văcxin phối hợp Sởi, Quai bị, Rubella MT Môi trờng 4 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymeraza) SCD Soybean Casein Digest SPF Specific Pathogen Free (Không có tác nhân gây bệnh đặc hiệu) SSPE Hội chứng viêm não sơ cứng bán cấp TB Tế bào TCMR Tiêm chủng mở rộng TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) 5 mục lục Trang Chơng 1: Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 2 1.3. Nội dung nghiên cứu 2 1.3.1. Sản xuất vắcxin sởi qui mô phòng thí nghiệm 2 1.3.2. Đánh giá chất lợng vắcxin 2 Chơng 2: Tổng quan tài liệu 2.1. Virút học 3 2.2. Lâm sàng bệnh sởi 5 2.2.1. Đặc điểm của ban sởi 5 2.2.2. Tiến triển điển hình của bệnh sởi 5 2.2.3. Triệu chứng xuất tiết của bệnh sởi 6 2.3. Quá trình nhân lên của virút sởi 6 2.4. Đáp ứng miễn dịch 7 2.5. Sinh bệnh học 8 2.6. Dịch tễ học bệnh sởi 9 2.6.1. Đặc điểm dịch tễ của bệnh sởi 9 2.6.2. Tình hình mắc bệnh sởi ở Việt Nam 11 2.7. Vắcxin sởi 12 2.7.1. Lịch sử của vắcxin sởi 12 2.7.2. Tình hình sản xuất vắc xin sởi trên thế giới 12 2.8. Sử dụng vắcxin sởi 14 Chơng 3: Vật liệu và phơng pháp 3.1. Qui trình sản xuất vắcxin sởi 16 6 3.2. Vật liệu và phơng pháp sản xuất 16 3.2.1. Chủng virút Hu-191 16 3.2.2. Trứng gà SPF 17 3.2.3. Trang thiết bị và dụng cụ cần thiết 18 3.2.4. Các loại môi trờng cần thiết 18 3.2.5. Phơng pháp thực nghiệm 20 3.3. Phơng pháp kiểm tra chất lợng vắcxin sởi 24 3.3.1. Kiểm tra vô trùng 25 3.3.2. Thử nghiệm nhận dạng virút sởi 25 3.3.3. Thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá 26 3.3.4. Thử nghiệm an toàn chung cho vắcxin thành phẩm trên súc vật 27 3.3.5. Thử nghiệm an toàn trên súc vật cho mẻ gặt đơn sau lọc 28 3.3.6. Thử nghiệm quan sát tế bào chứng 28 3.3.7. Thử nghiệm hấp phụ hồng cầu 29 3.3.8. Thử nghiệm tìm virút ngoại lai của mẻ gặt trên nuôi cấy tế bào 29 3.3.9. Thử nghiệm tìm virút ngoại lai của nớc nổi trên nuôi cấy tế bào.30 3.3.10. Thử nghiệm xác định hàm lợng Albumin bò tồn d 31 3.3.11. Thử nghiệm phát hiện Mycoplasma 31 Chơng 4: Kết quả và bàn luận 4.1. Kết quả sản xuất 33 4.1.1. Kết quả quá trình ấp trứng gà 33 4.1.2. Kết quả của quá trình tách và nuôi cấy tế bào 34 4.1.3. Kết quả quan sát tế bào 35 4.1.4. Kết quả đếm tế bào 36 4.1.5. Kết quả sử dụng tế bào 37 4.1.6. Kết quả tìm hiểu yếu tố ảnh hởng tới gây nhiễm virút 37 4.1.7. Vắcxin bán thành phẩm 39 4.1.8. Kết quả sản xuất vắcxin thành phẩm 41 4.2. Kết quả kiểm tra chất lợng 42 4.2.1. Kết quả kiểm tra nuôi cấy tế bào 42 4.2.2. Kết quả kiểm tra mẻ gặt đơn trớc lọc 44 7 4.2.3. KiÓm tra v¾cxin b¸n thµnh phÈm 46 4.2.4. KiÓm tra v¾cxin thµnh phÈm 49 Ch−¬ng 5: KÕt luËn 8 Chơng 1: Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Bệnh sởi là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây qua đờng hô hấp, tốc độ lan truyền nhanh và dễ gây dịch, thờng 100% ngời bị nhiễm virút sẽ phát bệnh nếu nh cha có miễn dịch với sởi. Thể nhẹ là sốt, phát ban sau khoảng 1 tuần ban hết, trẻ có thể hồi phục hoàn toàn. Bệnh có thể trở thành ác tính. Bệnh tiến triển nhanh và gây tử vong do suy hô hấp, viêm cơ tim cấp, giảm tiểu cầu gây xuất huyết nội tạng Do điều kiện kinh tế xã hội của nớc ta còn khó khăn, các phơng tiện và thuốc men điều trị còn hạn chế đặc biệt là các vùng sâu vùng xa do đó tỷ lệ tử vong do sởi còn cao và tỷ lệ biến chứng do sởi lớn. Những biến chứng do sởi nh ỉa chảy, viêm phổi, viêm tai giữa, cam tẩu mã, nặng hơn có thể viêm não cấp, viêm não xơ cứng lan toả gây tử vong và để lại các di chứng về thần kinh. Theo số liệu của chơng trình Tiêm chủng mở rộng năm 1999 tỷ lệ mắc bệnh sởi trong cả nớc ở mức 18,84/100.000 dân. ở vùng núi phía bắc, miền Trung, Tây Nguyên tỷ lệ này còn cao hơn, có nơi từ 50-409/100.000 dân. Bệnh sởi là một trong 10 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ tử vong cao ở nớc ta. Bệnh sởi phòng ngừa đợc bằng văcxin. Hiệu lực bảo vệ của văcxin sởi đạt trên 90%. Nhiều nớc trên thế giới đã khống chế đợc bệnh sởi nhờ sử dụng văcxin. ở Việt Nam nhờ thực hiện tiêm phòng sởi cho trẻ dới một tuổi mà tỷ lệ mắc đã giảm đi rõ rệt từ 30,9 trờng hợp/100.000 dân năm 1987 xuống còn 18,84/100.000 dân năm 1999. Văcxin sởi bất hoạt, kể từ khi ra đời những năm đầu thập kỷ 60 đã nhanh chóng bị loại bỏ vì khả năng bảo vệ kém. Hiện nay tất cả các nhà sản xuất trên thế giới đều sản xuất văcxin sởi sống giảm độc lực. Có nhiều chủng virut nổi tiếng đợc sử dụng hiện nay nh AIK-C, CAM, Schwarz, TD97 đợc sử dụng ở Mỹ, Nhật, Pháp, Bỉ; chủng L-16 đợc sử dụng ở Nga, Đức; chủng Hu191 đợc sử dụng ở Trung Quốc Tất cả các chủng này đều có độ an toàn cao và khả năng bảo vệ tốt. 9 Việt Nam đã sản xuất đợc nhiều loại văcxin phục vụ cho công tác phòng bệnh. Trong 10 loại vắcxin thiết yếu đợc dùng trong chơng trình TCMR hiện nay chúng ta đã tự sản xuất đợc 9 trừ vắcxin sởi. Nhu cầu về văcxin sởi ở nớc ta rất cao, đặc biệt khi thực hiện chơng trình khống chế bệnh sởi. Theo khuyến cáo của TCYTTG, mỗi trẻ cần đợc tiêm 2 mũi văcxin sởi thay cho 1 mũi trớc đây. Nh vậy nhu cầu về vắcxin sởi sẽ lên tới 6 - 7 triệu liều một năm. Để đáp ứng đợc nhu cầu này chúng ta sẽ phải hoàn toàn nhập ngoại. Nh vậy là sẽ tốn kém và thụ động. Chính vì vậy mà Bộ KH CN&MT và Bộ Y tế đã giao cho chúng tôi thực hiện đề tài này với nội dung "Bớc đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất vắcxin sởi tại Việt Nam qui mô phòng thí nghiệm" để dần từng bớc chúng ta sẽ sản xuất đợc vắcxin và cung cấp đủ cho nhu cầu trong nớc. 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Xây dựng qui trình và sản xuất ra vắcxin sởi qui mô phòng thí nghiệm 1.2.2. Thử nghiệm, đánh giá chất lợng vắcxin sởi ở mức độ phòng thí nghiệm. 1.3. Nội dung nghiên cứu 1.3.1. Sản xuất vắcxin sởi qui mô phòng thí nghiệm - Nuôi cấy tế bào phôi gà một lớp - Tiến hành gây nhiễm virút : Xác định nồng độ gây nhiễm, qui trình gây nhiễm, thời điểm thích hợp để thu hoạch vắcxin cho có hiệu quả cao - Đông khô vắcxin 1.3.2. Đánh giá chất lợng vắcxin - Kiểm tra tác nhân ngoại lai có trong tế bào - Kiểm định mẻ gặt đơn - Kiểm định vắcxin bán thành phẩm trớc lọc - Kiểm định vắcxin bán thành phẩm cuối cùng - Kiểm định vắcxin thành phẩm. 10 Chơng 2: Tổng quan tài liệu 2.1. Virút học Virút sởi thuộc giống Morbillivirus họ Paramyxoviridae phân họ Pneumovirinae. Vật liệu di truyền là ARN một sợi âm. Virút có hình cầu không đồng nhất với kích thớc từ 150-200nm. Vỏ virút bao gồm 2 lớp Lipit. Trên bề mặt có 2 glycoprotein H và F chúng tạo nên những gai nhô lên trên bề mặt virút. Protein H (hemagglutinin) có chức năng hấp phụ hồng cầu và bám dính lên bề mặt tế bào trong khi đó protein F (fusion) tạo ra các cầu nối liên kết các tế bào với nhau. Protein M (matrix) tạo nên một lớp nền ở bên trong vỏ. Protein NP tạo nên các nucleocapsit bao quanh ARN hình xoắn ốc. Protein P (photphorynate) và L (large) cũng đợc chứa trong nucleocapsit và liên quan đến quá trình sao chép của ARN. Hình 2-1: Sơ đồ cấu tạo của hạt virút sởi H: Hemagglutinin protein ; F: Fusion protein; M: Matrix protein; L: Large protein: NP: Nucleoprotein, P: Photphorynate protein Lớ p Li p it kép H &F M ARN L P N P [...]... tìm ra phơng pháp bảo quản tốt trong quá trình sản xuất 2.4 Đáp ứng miễn dịch Kháng thể xuất hiện ngay khi ban xuất hiện Xuất hiện sớm nhất là IgM, tiếp theo là IgG và IgA trong huyết thanh và trong dịch tiết Cả IgM và IgG đợc sản sinh ra trớc tiên nhng IgM đạt đỉnh cao vào ngày thứ 7 đến ngày thứ 10 sau khi xuất hiện ban, sau đó giảm nhanh và không tồn tại sau 4 tuần Sự có mặt của IgM chứng tỏ bệnh... phòng 21 Chơng 3 Vật liệu và phơng pháp 3.1 Qui trình sản xuất vắcxin sởi Trứng gà SPF ấp tại 38oC/9 ngày Trypsin hoá phôi gà Nuôi cấy tế bào một lớp Sau 2 ngày tế bào phát triển kín một lớp Gây nhiễm virút/33oC Sau 3 ngày Rửa tế bào đã nhiễm virút Thay bằng môi trờng duy trì/33oC Sau 3-4 ngày Khi CPE đạt 3+ Giữ 5oC/ qua đêm Gặt, Lọc, Cho chất bảo quản Đóng lọ, Đông khô 3.2 Vật liệu và phơng pháp sản. .. đông khô Virtis - Mỹ 3.2.4 Các loại môi trờng cần thiết 3.2.4.1 Dung dịch trypsin STT Thành phần hóa học Hng sản xuất số g/l 1 NaCl Sigma 80 2 KCl Merck 2 3 KH2PO4 Merck 2 4 Na2HPO4.12 H2O Merck 11,5 5 Red Phenol BDH 0,02 6 Trysine Gibco 1,25 Kháng sinh: Kanamycin Chống nấm: Fugizon Nớc cất 2 lần vừa đủ 1 lít 24 3.2.4.2 Môi trờng Earle STT Thành phần hoá học Hng sản xuất số g/l 1 NaCl Sigma 136 2 KCl... 20 7 Red Phenol BDH 0,02 Kháng sinh : Kanamycin Chống nấm : Fugizon Nớc cất 2 lần vừa đủ 1 lít 3.2.4.3 Môi trờng phát triển LH (0,2% Lactabumin Hydrolyzat - 3% huyết thanh bê) - Lactabumin Hydrolyzat : 2 g/l - Huyết thanh bê : 30 ml/l - Môi trờng Earle : vừa đủ 1 lít 3.2.4.4 Môi trờng duy trì: 199 (Sigma) 3.2.4.5 Môi trờng bảo quản STT Thành phần hoá học Hng sản xuất Số g/l 1 Sodium Glutamat Labosi 16... quốc cấp giấy phép sử dụng làm chủng 20 gốc năm 1965 Văcxin dùng cho ngời đợc sản xuất từ đời cấy truyền thứ 22 đến đời thứ 32 Chủng này hiện nay đợc dùng ở viện văcxin và huyết thanh Bắc Kinh và viện văcxin và sinh phẩm Vũ Hán Trung Quốc Trong một nghiên cứu về huyết thanh học và dịch tễ học sau khi tiêm văcxin sởi đợc sản xuất từ chủng Hu191 trên 503 trẻ từ 6 đến 15 tháng tuổi, từ năm 1991 đến 1998... bị nhiễm xuất hiện virút trong máu và các hạt virút lan truyền khắp cơ thể Vì biểu mô liên kết chỉ có 1 hoặc 2 lớp tế bào nên chúng bị huỷ hoại trớc tiên, chỉ 9-10 ngày sau khi bị nhiễm Sau đó các triệu chứng bệnh cấp tính xảy ra nh ho, chảy nớc mũi, phù nề mô liên kết, sốt cao, xuất 15 hiện hạt Koplik Các triệu chứng này giảm đi khi ban xuất hiện Cũng trong giai đoạn này, trong máu ngoại vi xuất hiện... Vắcxin sống giảm độc lực lần đầu tiên đợc giới thiệu cũng vào năm 1963, 1967, 1969 Đến năm 1971 18 vắcxin sởi sống giảm độc lực kết hợp với quai bị, Rubella đợc chính thức đa vào sử dụng 2.7.2 Tình hình sản xuất vắc xin sởi trên thế giới 2.7.2.1 ở Nhật Bản Trớc kia sử dụng vắcxin sởi chết, nhng sau đó huỷ bỏ vì có phản ứng phụ và xuất hiện thể sởi không điển hình Hiện nay đang sản xuất và sử dụng vắcxin... để sản xuất vắc xin này Mỗi chủng đều thích nghi ở nhiệt độ thấp, nhng độ nhậy cảm nhiệt độ của vắcxin phụ thuộc vào chủng virút dùng để sản xuất 1970 1975 1980 1985 Schwarz 1990 Schwarz FF8 CAM - 70 AIK - C TD 97 Chủng AIK - C và Schwarz FF8 có nguồn gốc từ chủng Edmonston Chủng CAM - 70 và TD - 97 có nguồn gốc từ chủng Tanabe là chủng đợc phân lập ở Nhật Lịch sử các chủng gốc đang đợc sử dụng để sản. .. Chống chỉ định : Những ngời nhiễm HIV nên tránh không tiêm chủng vắcxin Sởi Hiện tại có hai loại vắcxin sởi : vắcxin sởi sống giảm độc và vắcxin sởi chết Vắcxin sống giảm độc rất có hiệu quả phòng bệnh sởi, do vậy nó đợc tiêm cho trẻ em 9 tháng tuổi để phòng bệnh sởi ở mọi hình thái lâm sàng Vắcxin chết, trong quá trình sản xuất đã phá huỷ protein kháng nguyên hoà màng, do vậy kháng thể hình thành sau... kiểu thứ III Dịch xảy ra không liên tục và không theo một qui tắc nào cả Kiểu I Kiểu II Kiểu III 17 2.6.2 Tình hình mắc bệnh sởi ở Việt Nam Bệnh sởi đã giảm đáng kể kể từ khi chơng trình TCMR đợc thực hiện ở nớc ta Tuy nhiên, trong những năm gần đây các vụ dịch sởi vẫn xảy ra rải rác tại nhiều địa phơng trong cả nớc Bệnh sởi xảy ra quanh năm, xuất hiện nhiều trong mùa xuân, thấp nhất vào mùa hè - thu . dung "Bớc đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất vắcxin sởi tại Việt Nam qui mô phòng thí nghiệm& quot; để dần từng bớc chúng ta sẽ sản xuất đợc vắcxin. 2 Đề tài độc lập cấp Nhà Nớc Bớc đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất văcxin sởi tại việt nam qui mô phòng thí nghiệm Chủ nhiệm đề tài: GS.TSKH.