Nghiên cứu cải tiến quy trình và ứng dụng phân tích độc tố acrylamide trong cà phê bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ LC MS MS

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ BÍCH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH VÀ ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ ACRYLAMIDE TRONG CÀ PHÊ BẰNG SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ.

Công trình được hoàn thành tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Thành phố

Hồ Chí Minh

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Đình Vũ

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

GS.TS Lê Văn Tán PGS.TS Nguyễn Văn Cường

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Thị Bích Phương MSHV: 20000231

Ngày, tháng, năm sinh: 03/12/1983 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh Ngành: Hoá phân tích Mã ngành: 8440118

I TÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu cải tiến quy trình và ứng dụng phân tích độc tố acrylamide trong cà phê bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

(1) Nghiên cứu cải tiến quy trình phân tích độc tố acrylamide trên nền mẫu cà phê với kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS đáp ứng đầy đủ các thông số thẩm định đáp ứng được tiêu chuẩn hóa Châu Âu CEN và ISO/IEC 17025:2017 (2) Ứng dụng quy trình phân tích để đánh giá thực trạng nhiễm acrylamide trong sản phẩm cà phê hạt rang xay, cà phê hòa tan thương phẩm trên thị trường Thành phố Hồ Chí Minh

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo Quyết định số 622/QĐ-ĐHCN ngày

10/03/2022 của Hiệu trưởng Trường Đại học Công Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 10/09/2022

IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lê Đình Vũ

Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20 …

i

LỜI CẢM ƠN

Luận văn Thạc sĩ ngành Hóa phân tích với đề tài “Nghiên cứu cải tiến quy trình và ứng dụng nghiên cứu độc tố acrylamide trong sản phẩm cà phê bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS” là kết quả của quá trình cố gắng, nỗ lực không ngừng của bản thân và được sự động viên, giúp đỡ hỗ trợ, khích lệ của các quý Thầy Cô, bạn bè đồng nghiệp và người thân trong gia đình trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn đối với TS Lê Đình Vũ đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện đề tài và đã chỉ dạy tận tình trong quá trình học tập tại trường

Tôi chân thành cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Tp

Hồ Chí Minh, các anh chị em đồng nghiệp ở phòng Phân tích sắc ký và bạn Võ Thị Mọng Trinh, anh Lý Tuấn Kiệt, anh Nguyễn Thành Duy, chị Nguyễn Lâm Kiều Diễm, anh Trần Văn Huệ, chị Đặng Thị Kim Hằng, anh Nguyễn Thanh Phong, anh Trương Văn Nhân, các anh chị ở Trường The Coffaholic Roastery và các bạn lớp cao học đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi, khích lệ Tôi trong suốt quá trình học tập

và thực hiện đề tài

Tôi xin được gửi lời cảm ơn các thầy cô phòng sau đại học đã hỗ trợ, hướng dẫn tôi rất nhiều khi học tại trường

ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS) đã được thẩm định và áp dụng để phân tích hàm lượng độc tố acrylamide trong mẫu cà phê Dưới điều kiện tối ưu của thực nghiệm, khoảng tuyến tính phân tích acrylamide từ 50-1000µg/L với giới hạn phát hiện của phương pháp 30 µg/L Hiệu suất thu hồi đạt từ 85,15% tới 97,30% Ở các mức nồng độ khác nhau của acrylamide, độ lặp lại của phương pháp cao thể hiện qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) từ sáu lần thí nghiệm lặp lại nhỏ hơn 3,55%, độ không đảm bảo đo là 12,3% Phương pháp đáp ứng được những nỗ lực về tiêu chuẩn hóa phương pháp được sử dụng để phát hiện độc tố acrylamide trong thực phẩm Thực tế được áp dụng để phân tích một số mẫu cà phê hạt rang trên thị trường Thành phố Hồ Chí Minh Kết quả phân tích thu được cho thấy 51,47% có chứa acrylamide với nồng độ

từ 50,99-560,48 µg/kg trong đó mẫu vượt ngưỡng tối đa cho phép chiếm 10,29% Kết quả còn cho thấy mức độ ô nhiễm acrylamide của cà phê có mức độ rang vừa hơn nhiều so với rang nhạt và rang đậm vừa Điều này cho thấy mức độ ô nhiễm acrylamide trong cà phê rang xay trên thị trường là đáng báo động và cần có các biện pháp kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm đối với cà phê

iii

ABSTRACT

High-performance liquid chromatography-coupled mass spectrometry (LC-MS/MS) has been validated and applied to analyze acrylamide in coffee samples Under optimal experimental conditions, the linear range quantitation for acrylamide was from 50-1000 µg/L with the method detection limit of 30 µg/L At different concentrations of acrylamide, the high repeatability of the method expressed in the relative standard deviation (RSD%) from six replicates is less than 3.55%, and the measurement uncertainty is 12.3% The recovery efficiency ranged from 85.15% to 97.30% The method responds to efforts to standardize the method used for the detection of acrylamide toxins in foods The method is practically applied to analyze some samples of roasted coffee beans on the market in Ho Chi Minh City The analytical results showed that 51.47% of samples contained acrylamide with concentrations from 50.99-560.48 µg/kg, exceeding the maximum allowable threshold, accounting for 10.29% The results also showed that the acrylamide contamination level of coffee with a medium roast level was much higher than that

of light roast and medium dark roast This indicates that the level of acrylamide contamination in roasted coffee in the market is alarming, and there is a need for food safety and hygiene control measures for coffee

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là: Nguyễn Thị Bích Phương, học viên cao học chuyên ngành Hóa Phân tích, lớp CHHOPT10A, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Tôi cam đoan những kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là công trình của tôi với sự hướng dẫn của giảng viên hướng dẫn của TS Lê Đình Vũ, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

Những kết quả nghiên cứu của các tác giả khác được sử dụng trong luận văn đều có trích dẫn đầy đủ

Học viên

Nguyễn Thị Bích Phương

i

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Đối tượng và nhiệm vụ nghiên cứu 3

3.1 Đối tượng nghiên cứu 3

3.2 Phạm vi nghiên cứu 3

4 Phương pháp nghiên cứu 4

4.1 Phương pháp luận 4

4.2 Phương pháp thực hiện 5

4.2.1 Phương pháp tổng hợp và biên hội tài liệu 5

4.2.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu 5

5 Ý nghĩa của đề tài 6

5.1 Ý nghĩa khoa học 6

5.2 Ý nghĩa thực tiễn 7

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 8

1.1.1 Cấu tạo, tính chất của Acrylamide 8

1.1.2 Cơ chế hóa học hình thành acrylamide trong cà phê 9

1.1.3 Hàm lượng acrylamide trong chế độ rang 11

1.1.4 Sức khỏe và tính chất gây hại của acrylamide 13

1.1.5 Quy định về acrylamide 16

1.2 Phương pháp phân tích acrylamide 17

ii

1.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu 17

1.2.2 Phương pháp phân tích 19

1.2.3 Kết quả các phương pháp phân tích 20

1.2.4 Ưu điểm và hạn chế của các phương pháp 22

1.2.5 Kết luận 22

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 23

2.1 Hoá chất, thiết bị 23

2.1.1 Hệ sắc ký lỏng ghép khối phổ 23

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ dùng trong thí nghiệm 23

2.1.3 Hoá chất, chất chuẩn 24

2.2 Chuẩn bị hóa chất, pha động, dung dịch chuẩn 25

2.2.1 Chuẩn bị pha động 25

2.2.2 Chuẩn bị hóa chất 25

2.2.3 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn 26

2.3 Đồng nhất, chuẩn bị mẫu khảo sát 27

2.3.1 Đồng nhất mẫu 27

2.3.2 Chuẩn bị mẫu khảo sát 28

2.4 Nội dung nghiên cứu thực nghiệm 28

2.4.1 Xây dựng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 28

2.4.1Xây dựng phương pháp cho hệ sắc ký hiệu năng cao 29

2.5 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu 30

2.5.1 Chọn khối lượng mẫu xử lý 30

2.5.2Xây dựng phương pháp xử lý mẫu 31

2.6 Thẩm định quy trình phân tích acrylamide 37

2.6.1 Tính phù hợp hệ thống 37

2.6.2 Tính đặc hiệu, độ chọn lọc 37

2.6.3 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn 38

2.6.4 Xác định giới hạn phát hiện 38

2.6.5 Giới hạn định lượng 39

2.6.6 Độ lập lại và độ tái lập 39

iii

2.6.7 Độ đúng của phương pháp 40

2.6.8 Độ không đảm bảo đo 41

2.7 Ứng dụng quy trình định lượng acrylamide trong nền mẫu cà phê hạt và cà phê hòa tan trên thị trường 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Kết quả phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao 43

3.1.1 Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ 43

3.1.2 Xây dựng điều kiện sắc ký lỏng 44

3.2 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu 51

3.2.1 Kết quả của ảnh hưởng nhiệt độ trong quá trình chiết rắn – lỏng 51

3.2.2 Xử lý mẫu với Carrez 53

3.2.3 Dung môi chiết mẫu 55

3.2.4 Quá trình làm sạch với cột chiết pha rắn 56

3.2.5 Kết quả khảo sát dung môi rửa giải 59

3.2.6 Ảnh hưởng của dung môi định mức 61

3.2.7 Ảnh hưởng nền mẫu 62

3.3 Kết quả thẩm định phương pháp phân tích 63

3.3.1 Tính đặc hiệu 63

3.3.3 Khoảng tuyến tính 66

3.3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 67

3.3.5Xác định độ chính xác 68

3.3.6 Xác định độ đúng 69

3.3.7 Xác định độ không đảm bảo đo 70

3.4 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng acrylamide trong cà phê 71

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76

1 Kết luận 76

2 Kiến nghị 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

PHỤ LỤC 88

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN 124

iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo 9

Hình 1.2 Cơ chế hình thành acrylamide trong quá trình có gia nhiệt 10

Hình 1.3 Ảnh hưởng của quá trình rang lên hàm lượng acrylamide 12

Hình 1.4 Cơ chế gây độc thần kinh của acrylamide 14

Hình 1.5 Giản đồ chung cho việc phân tích acrylamide 18

1 Hình 2.1 Các bước thẩm định phương pháp 37

Hình 2.2 Giấy chứng nhận mẫu vật liệu chuẩn 40

1 Hình 3.1 HPLC- MS/MS Agilent Triple Quad 6410 44

Hình 3.2 Sắc ký đồ tối ưu cột sắc ký 45

Hình 3.3 Độ phân giải các cột sắc ký 45

Hình 3.4 Sắc ký đồ các pha động khảo sát 46

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ acid formic trong hệ pha động HCOOH/MeOH 47 Hình 3.6 Độ nhạy khi thay đổi nồng độ acid formic 48

Hình 3.7 Thời gian lưu và độ nhạy của chuẩn arcrylamide nồng độ 500 µg/kg ở các gradient khác nhau 49

Hình 3.8 Thời gian lưu và độ nhảy của IS - AAD3 nồng độ 500 µg/kg ở các gradient khác nhau 49

Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện hiệu suất thu hồi ở các mức nhiệt độ 51

Hình 3.10 Mức ảnh hưởng nền từ phương trình đường chuẩn ở các mức nhiệt độ phản ứng 52

Hình 3.11 Hiệu suất thu hồi với Carrez 53

Hình 3.12 Mức ảnh hưởng nền từ phương trình đường chuẩn có và không có Carrez 54

Hình 3.13 Biểu đồ biểu thị hiệu suất dung môi chiết 55

Hình 3.14 Biểu đồ biểu thị đường chuẩn trong khảo sát dung môi chiết 56

Hình 3.15 Màu sắc của dịch mẫu thu được sau khi xử lý theo bốn loại cột SPE làm sạch 57

Hình 3.16 Hiệu suất thu hồi từ quá trình làm sạch từ cột SPE 57

Hình 3.17 Biểu đồ biểu thị đường chuẩn qua cột SPE tinh sạch 59

Hình 3.18 Biểu đồ biểu thị sự phân bố hiệu suất thu hồi của các dung môi rửa giải60 Hình 3.19 Biểu đồ biểu thị đường chuẩn đối với khảo sát dung môi rửa giải 60

Hình 3.20 Biểu đồ biểu thị diện tích chất chuẩn AA và nội chuẩn AAD3 trong khảo sát dung môi định mức 61

Hình 3.21 Sắc ký đồ chuẩn AA mẫu trắng, mẫu dung môi và mẫu thêm chuẩn 64

Hình 3.22 Sắc ký đồ nội chuẩn AAD3 trong mẫu trắng, mẫu dung môi và mẫu thêm chuẩn 65

v

Hình 3.23 Đồ thị so sánh đường chuẩn trên dung môi và trên dung dịch mẫu trắng

của acrylamide 63 Hình 3.24 Phương trình đường chuẩn trong dung môi 66

vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Đặc tính hóa học của acrylamide 9

Bảng 1.2 Độ hòa tan của acrylamide 9

Bảng 1.3 Lượng acrylamide trong khẩu phần ăn 15

Bảng 1.4 Hàm lượng acrylamide trong một số sản phẩm cà phê 15

Bảng 1.5 Mức chuẩn cho phép sự hiện diện của acrylamide trong sản phẩm cà phê theo Ủy ban Châu Âu 16

Bảng 1.6 Một số phương pháp phân tích acrylamide ở trong nước và quốc tế 21

1 Bảng 2.1 Pha dung dịch chuẩn gốc của acrylamide và acrylamide–d3 26

Bảng 2.2 Chuẩn acrylamide làm việc 27

Bảng 2.3 Cách chuẩn bị các mẫu thêm chuẩn 28

Bảng 2.4 Quy trình xử lý mẫu 32

Bảng 2.5 Qui định tỷ lệ ion phụ so với ion chính theo SANCO/12495/2011 38

Bảng 2.6 Mô tả mẫu nghiên cứu 42

1 Bảng 3.1 Các thông số hoạt động của đầu dò MS 43

Bảng 3.2 Các thông số tối ưu cho ESI-MS/MS 43

Bảng 3.3 Chương trình gradient 49

Bảng 3.4 Các thông số hoạt động của hệ sắc ký lỏng khối phổ 50

Bảng 3.5 Điều kiện khối phổ của acrylamide và IS acrylamide -d3 50

Bảng 3.6 Kết quả giá trị % ME trong khảo sát nhiệt độ phản ứng 52

Bảng 3.7 Ảnh hưởng nền mẫu của acrylamide 63

Bảng 3.8 Tỷ lệ ion acrylamide các điểm trên đường chuẩn của chất chuẩn 65

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát giá trị MDL tại nồng độ 30 µg/kg với 6 lần đo 67

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi, độ lặp, độ tái lặp (TL) của MQL ở nồng độ M+100 µg/kg (n=12) 68

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi, độ lặp lại, độ tái lập ở nồng độ M + 100 µg/kg (n =12); độ M + 400 µg/kg (n =12); độ M + 800 µg/kg (n =12) 69

Bảng 3.12 Kết quả thực hiện 6 lần lặp lại mẫu CRM TYG090RM 69

Bảng 3.13 Độ không đảm bảo đo mở rộng tính theo độ tái lặp phòng thí nghiệm, theo độ lệch chuẩn bias của mẫu cà phê 70

Bảng 3.14 Tóm tắt mẫu nghiên cứu thực tế 72

Bảng 3.15 Kết quả phân tích hàm lượng acrylamide trên mẫu cà phê thực tế 73

vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical

Tạo phản ứng silyl hóa

CAS Chemical Abstracts Service

registration number

Số định danh hóa chất

CE Collision energy Năng lượng va chạm

CEN European Committee for

Standardization

Ủy ban Tiêu chuẩn hóa Châu Âu

CFIA Canadian Food Inspection Agency Cơ quan kiểm tra thực phẩm

Canada

CI

CONTAM

Chemical ionization Contaminants in the Food Chain

Ion hóa hóa học Hội đồng về các chất gây ô nhiễm

Chiết pha rắn phân tán

Cơ quan An toàn thực phẩm Châu Âu

ECD Electro-Chemical Devices Đầu dò bắt điện tử

ESI Electrospray inonization Ion hóa bằng nguồn phun điện tử

FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức nông lương thế giới

FDA Food and Drug Administration Cơ quan Quản lý thực phẩm và

dược phẩm của Hoa Kỳ

GCB Graphitized carbon black Than hoạt tính

GC-MS/MS Gas chromatography tandem mass

spectrometry

Sắc ký khí khối phổ hai lần

HLB Hydrophilic-Lipophilic-Balanced Cân bằng thân nước – thân dầu

HSDB Hazardous Substances Data Bank Ngân hàng dữ liệu về các chất

Liều gây chết trung bình 50%

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Qualification Giới hạn định lượng

MeCN Acetonitril

MeOH Methanol

MgSO 4 Anhydrous magnesium sulfate

MIM Multiple ion monitoring Chế độ chọn tín hiệu một số ion

đặc trưng cho chất phân tích

MRM Multiple relative monitoring Chế độ chọn tín hiệu một số ion

đặc trưng cho chất phân tích bằng khối phổ kép

NaCl Sodium chloride

PSA Primary Secondary Amine Amine bậc 2

PVDF Polyvinylidene Florua Microporous Siêu lọc chất liệu Polyvinylidene

SIM Single ion monitoring Chế độ chọn một tín hiệu ion

SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn

SPME Solid phase microextraction Vi chiết pha rắn

UA-LLE Ultrasound-assisted liquid–

liquid extraction

Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng hỗ trợ sóng siêu âm

UV-Vis Ultraviolet visible spectroscopy Đầu dò tử ngoại khả kiến

và khử caffein là mặt hàng đứng thứ hai về kim ngạch (chiếm 17,3%) và tiêu thụ nhiều nhất tại thị trường này [2] Chế biến cà phê là ngành sản xuất, kinh doanh có sức hấp dẫn và cạnh tranh cao ở Việt Nam Trong giai đoạn 2005-2015, lượng tiêu thụ cà phê của Việt Nam tăng trưởng từ 0,43 kg/đầu người/năm lên 1,38 kg/đầu người/năm và dự báo tăng lên 2,6 kg/đầu người/năm vào năm 2021 Đây là mức tăng trưởng cao nhất trong số các quốc gia đứng đầu xuất khẩu cà phê trên thế giới [3]

Song song với sự tăng trưởng và đa dạng hóa nhu cầu tiêu dùng cà phê, vấn đề ô nhiễm các độc tố trong cà phê có thể xảy ra ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình chế biến cũng được quan tâm nhiều hơn Sự xuất hiện của acrylamide trong thực phẩm nói chung và trong cà phê nói riêng lần đầu tiên được báo cáo bởi các nhà khoa học từ cơ quan thực phẩm quốc gia Thụy Điển và đại học Stockholm vào tháng 4 năm 2002 [4] Sự quan tâm đến acrylamide vì tính độc hại của nó có trong thực phẩm, là khả năng gây ung thư và ức chế thần kinh (IARC 1994) [5] Acrylamide được tìm thấy trong nhiều thực phẩm chiên, nướng, rang do vậy chất này luôn tồn tại trong cà phê rang Hàm lượng acrylamide được tìm thấy ở mức cao nhất trong cà phê hòa tan giá trị trung bình 1499 µg/kg, đối với cà phê hạt là 522µg/kg, theo báo cáo của EFSA năm 2015 [6] Theo một số báo cáo của FAO và WHO năm 2006, acrylamide cũng được phát hiện trong các sản phẩm ca cao và cà

2

phê ở mức lên đến 909 - 4948μg /kg [7] Ở Việt Nam, hiện chưa có số liệu thống kê

về mức acrylamide trong thực phẩm nói chung và sản phẩm cà phê nói riêng Việc đánh giá hàm lượng độc tố acrylamide trong sản phẩm cà phê trên thị trường cung cấp dữ liệu quan trọng trong lĩnh vực an toàn thực phẩm, từ đó có thể đưa ra cảnh báo trong quy trình rang xay và sản xuất công nghiệp nhằm đảm bảo chất lượng và sức khỏe người tiêu dùng

Phương pháp phân tích đầu tiên được các nhà nghiên cứu Thụy Điển sử dụng để phân tích acrylamide trong thức ăn chăn nuôi dựa trên sự tạo dẫn xuất của acrylamide bằng cách brom hóa phân tích sắc ký khí-khối phổ [8] Sau đó có nhiều

kỹ thuật phân tích được phát triển khắc phục những khó khăn trong quá trình tạo dẫn xuất và sử dụng nhiều phương pháp nhanh chóng dành cho nhiều loại mẫu hơn Hội thảo ở Châu Âu về các phương pháp phân tích acrylamide trong các sản phẩm thực phẩm kết luận rằng hiện nay phần lớn các phòng thí nghiệm sử dụng sắc ký lỏng khối phổ và sắc ký khí khối phổ để phân tích acrylamide với ưu điểm cho độ chính xác cao mà không cần phải tạo dẫn xuất trong quy trình phân tích [9] Ở Việt Nam hiện chưa có khuyến nghị chính thức về phương pháp áp dụng để định lượng acrylamide trong thực phẩm Những nỗ lực về tiêu chuẩn hóa các phương pháp được sử dụng để phát hiện và định lượng acrylamide trong các nền mẫu khác nhau vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu nhằm đáp ứng các đợt thử nghiệm thành thạo trên chất chuẩn tham chiếu để đánh giá chất lượng kết quả và xác nhận phương pháp acrylamide là một phần thiết yếu để đạt công nhận theo tiêu chuẩn ISO/IEC

17025 Từ những vấn đề trình bày trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu cải tiến quy trình và ứng dụng phân tích độc tố acrylamide trong cà phê bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS”

3

2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này bao gồm những nội dung như sau:

Thẩm định quy trình phân tích hàm lượng acrylamide trong các nền mẫu cà phê hạt rang hạt, cà phê hòa tan nhằm xây dựng phương pháp phân tích đáp ứng các yêu cầu:

• Đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu lên độ đúng của phương pháp phân tích

• Xây dựng quy trình xử lý mẫu phân tích acrylamide trong các nền mẫu cà phê hạt rang hạt, cà phê hòa tan

• Xác nhận giá trị các thông số của phương pháp định lượng acrylamide trong nền mẫu cà phê hạt: Tính chọn lọc, độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, hiệu suất thu hồi, độ không đảm bảo đo

Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu dịch vụ và mẫu thực tế trên thị trường Thành phố Hồ Chí Minh nhằm đánh giá hàm lượng acrylamide trên sản phẩm cà phê Từ kết quả khảo sát đưa ra khuyến cáo về mức độ ô nhiễm của acrylamide trong sản phẩm cà phê

3 Đối tượng và nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

• Quy trình chiết mẫu phân tích hàm lượng acrylamide trong sản phẩm cà phê

• Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác định giá trị sử dụng phương pháp và ứng dụng phương pháp là mẫu cà phê rang hạt và cà phê hòa tan trên thị trường

3.2 Phạm vi nghiên cứu

• Xây dựng quy trình chiết mẫu xác định hàm lượng acrylamide trên nền cà phê

• Phân tích, đánh giá hàm lượng acrylamide trên 19 mẫu cà phê arabica gồm 2 dạng rang nhạt (Light) và rang đậm vừa (Medium), 23 mẫu cà phê robusta gồm rang nhạt (Light), rang đậm vừa (Medium) và rang đậm (Medium dark), 16 mẫu

4

cà phê hỗn hợp trộn arabica và robusta hoặc arabica, robusta, culi, moka; 10 mẫu cà phê hòa tan Các mẫu này được mua trên thị trường với các nhà sản xuất khác nhau được đóng gói đúng quy cách sản phẩm có thông tin như loại cà phê rang, mức rang, kiểu sơ chế từ nhà sản xuất

• Trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm, Tp.HCM (CASE)

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp luận

Hiện nay có nhiều phương pháp phân tích acrylamide, tùy vào điều kiện của các phòng thí nghiệm khác nhau Tuy nhiên, do mức độ phức tạp của nền mẫu cà phê thành phẩm do quá trình rang, say và chế biến ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác của phép phân tích Điều này thể hiện trong kết quả của công bố về thử nghiệm thành thạo với 6 bài kiểm tra cho các nền thực phẩm, trong đó nền cà phê với 41 mẫu vật liệu thử nghiệm đồng nhất được yêu cầu cho các phòng thí nghiệm trên thế giới có 31 kết quả nộp lại với khoảng giá trị thu được 193-431µg/kg, giá trị đúng là 412µg/kg Những người tham gia được khuyến khích sử dụng phương pháp phân tích được sử dụng thường xuyên trong phòng thí nghiệm và cung cấp chi tiết về thủ tục [10] Do vậy, đánh giá mức độ ảnh hưởng của nền mẫu đến độ chính xác của phương pháp là một vấn đề cần thiết đối với phương pháp xác định acrylamide trong cà phê

Ở Việt Nam hiện chưa ban hành chính thức về phương pháp chuẩn để áp dụng định lượng độc tố acrylamide trong thực phẩm nói chung và trong cà phê thành phẩm nói riêng

Tính đến thời điểm hiện nay, chưa có một công bố chính thức về mức độ ô nhiễm hàm lượng độc tố acrylamide trong cà phê thành phẩm tại Việt Nam nói chung và trên thị trường Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng

4.2.1 Phương pháp tổng hợp và biên hội tài liệu

Nghiên cứu, đọc các tài liệu trong nước và quốc tế công bố các nghiên cứu acrylamide, từ đó tổng hợp, xem xét ưu nhược điểm, khả năng áp dụng các nghiên cứu vào điều kiện thực tế ở phòng thí nghiệm Nghiên cứu nồng độ acrylamide là một trong các chỉ tiêu có yêu cầu trong các mẫu phân tích tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm (CASE), TP HCM

Tìm hiểu các công trình nghiên cứu về việc phân tích acrylamide trong thực phẩm nói chung và trong cà phê nói riêng

Thu thập tài liệu, đánh giá rủi ro của acrylamide đến sức khỏe con người

4.2.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu

Hướng dẫn theo Tiêu chuẩn Việt Nam: TCVN 5250 -2007 [11]; TCVN 12807:2019 [12]; Thông tư 14/2011/TT-BYT [13] Mẫu cần được bảo quản trong túi polyethylene (hoặc có van khí một chiều) tránh thất thoát hàm lượng acrylamide Các mẫu phải được chiết trong vòng bảy ngày và dung dịch chiết phải được phân tích trong vòng một ngày sau khi chiết

4.2.3 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu

Sử dụng toán học xử lý thống kê để xử lý số liệu sau khi phân tích nhằm đảm bảo tính chắc chắn của số liệu nghiên cứu nhằm rút ra những nhận xét và kết luận khoa học khách quan đối với những vấn đề nghiên cứu Các kết quả được sử dụng phần mềm Excel, phần mềm Masshunter của Agilent

6

4.2.4 Phương pháp so sánh

Dùng các số liệu nghiên cứu được so sánh với các số liệu có được từ Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa kỳ FDA; Cơ quan an toàn thực phẩm Châu Âu EU để đánh giá hàm lượng acrylamide trong sản phẩm cà phê

5 Ý nghĩa của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Phương pháp phân tích acrylamide được xây dựng trên nền tảng phương pháp của

Ủy ban Tiêu chuẩn hóa Châu Âu: EN Standard 16618:2015 LC-ESI-MS/MS [14] Xác định acrylamide trong các sản phẩm làm từ khoai tây, các sản phẩm làm từ ngũ cốc và cà phê bằng LC-MS và phương pháp QuEChERS AOAC 2007.01 [15] được tham khảo, chúng tôi cải tiến phân tích trên thiết bị LC-MS/MS được xử lý mẫu đơn giản, sử dụng dung môi thân thiện với môi trường, giảm chất thải nguy hại Việc lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng khối phổ do sự tối ưu và hiệu quả hơn so với sắc ký khí khối phổ, phép đo trực tiếp, không cần dẫn xuất, giúp tiết kiệm thời gian, ít hư hỏng thiết bị

Phương pháp và số liệu của đề tài là nền tảng cho các nghiên cứu liên quan sau này cũng như sử dụng trong công tác giảng dạy, học tập Áp dụng phương pháp đã

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu góp phần cung cấp dữ liệu quan trọng về an toàn vệ sinh thực phẩm đưa

ra những cảnh báo đối với người tiêu dùng, từ đó người quản lí cần có biện pháp để hạn chế rủi ro và những quy định giảm mức hàm lượng độc tố acrylamide trong quá trình chế biến sản xuất và tiêu thụ sản phẩm cà phê

8

Acrylamide là chất hóa học có khối lượng phân tử thấp, độ phân cực cao, có khả năng hòa tan tốt trong nước, có khả năng phản ứng cao và độ bay hơi thấp Chất này được chuyển hóa trong cơ thể thành glycidamide, tác dụng độc học đã được thử nghiệm ở invivo và invitro Cơ quan nghiên cứu ung thư IARC đã phân loại acrylamide thuộc nhóm 2A [5]

Cà phê là mặt hàng nông sản được thương mại hóa nhiều nhất [1] Nhiệt độ rang (120 – 230ºC) và thời gian (10 - 20 phút) rang cà phê ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng hương vị và màu sắc Bên cạnh các chất chống oxi hóa như acid chlorogenic, melanoidin, caffein có lợi cho sức khỏe thì trong cà phê cũng hình thành độc tố không mong muốn là acrylamide trong quá trình chế biến [16, 17] Việc sử dụng cà phê hàng ngày cũng đồng nghĩa với việc vơ thể có thể dung nạp một lượng acrylamide [18] Kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ không tạo dẫn xuất sẽ được áp dụng để định lượng acrylamide trong cà phê, và kỹ thuật này cũng phù hợp với thực

tế phòng thí nghiệm CASE, đáp ứng được tiêu chuẩn hóa Châu Âu CEN và ISO/IEC 17025:2017

1.1.1 Cấu tạo, tính chất của Acrylamide

Acrylamide là chất hóa học với công thức cấu tạo C3H5NO, tên danh pháp IUPAC

là prop-2-enamide (hình 1.1), dạng tinh thể màu trắng, không mùi và có khả năng tan tốt trong một số dung môi theo bảng 1.1 [19]

Độ tan của acrylamide trong dung môi phân cực và không phân cực thay đổi rất lớn ảnh hưởng đến phương pháp phân tích thể hiện trong bảng 1.2 [4]

9

Acrylamide - C3H5NO - Mw = 71.079 g/mol – CAS 79061

Hình 1.1 Công thức cấu tạo Bảng 1.1 Đặc tính hóa học của acrylamide

Nhiệt độ nóng chảy 84,50ºC ± 0,30°C

Tên dung môi Độ hòa tan (g/100ml) ở 30°C

1.1.2 Cơ chế hóa học hình thành acrylamide trong cà phê

Mối quan tâm bắt đầu vào năm 1991 khi Ủy ban khoa học về thực phẩm đã đánh giá acrylamide ở dạng monomer được chuyển hóa trong cơ thể thành glycidamide gây độc tính cho người Acrylamide có trong thực phẩm đã được công bố đầu tiên

• Sự biến đổi của lipid

• Thoái hóa acid amin và protein

• Suy thoái carbohydrate

Phản ứng Maillard giữa các acid amin hoặc protein và carbohydrate [21, 22]

Do đó, acrolein là một tiền chất rất có thể xảy ra của acrylamide Nói chung, protein hoặc acid amin, sau một loạt biến đổi, chẳng hạn như thủy phân, tái sắp xếp và khử carboxyl, cuối cùng dẫn đến acrylamide được thể hiện trong hình 1.2 [22] minh họa dưới đây

Hình 1.2 Cơ chế hình thành acrylamide trong quá trình có gia nhiệt

11

1.1.3 Hàm lượng acrylamide trong chế độ rang

Nhiều loài cà phê hiện đang được canh tác trên thế giới nhằm mang lại giá trị kinh

tế cao hơn Tuy nhiên hai loại cà phê phổ biến là Coffea arabica (Arabica) và Coffea canephora (Robusta) Sau khi rang lên thoạt nhìn trông có vẻ giống nhau về hình thái nhưng thực tế hai dòng cà phê này tạo nên sự khác biệt hoàn toàn về hương vị, gu ẩm thực và giá cả Thông thường, chất lượng của đồ uống cà phê phụ thuộc vào tỷ lệ của cả hai loại trong hỗn hợp [16] Cà phê Robusta được gọi là cà phê có độ chua thấp và đắng cao và cà phê Arabica có hàm lượng axit trong hạt nhiều hơn Cà phê arabica có nhiều mục đích thương mại khác nhau từ loại kém chất lượng cho cà phê hòa tan đến sản phẩm phổ thông và cà phê chất lượng cao (Specialty) Cà phê robusta là nguyên liệu phổ biến hơn cho cà phê hòa tan [17] Fine robusta (dòng robusta được chăm sóc, thu hoạch kỹ lưỡng như arabica) để tăng chất lượng và giá thành Cà phê hòa tan là sản phẩm có thành phần 100% hạt cà phê nguyên chất, do quá trình chế biến trích ly sấy và giữ lại những chất tan trong hạt cà phê, tránh gây nhầm lẫn với cà phê hòa tan tiêu dùng trên thị trường [23]

Rang cà phê là ứng dụng quá trình truyền nhiệt để đem lại hiệu quả cao nhất về hương vị và chất lượng cho hạt cà phê và là một quá trình phức tạp theo quan điểm hóa học, vì hàng trăm phản ứng hóa học diễn ra đồng thời, chẳng hạn như phản ứng Maillard và Strecker, sự phân hủy của protein, polysaccharides, trigonelline và axit chlorogenic [17, 24, 25] Sự hình thành và phát triển acrylamide trong cà phê rang

có thể phụ thuộc vào tỷ lệ diện tích bề mặt, thể tích của cà phê được làm nóng và tương ứng với nhiệt độ rang [24, 25] Acrylamide là một trong những hợp chất hình thành thông qua sự tương tác giữa đường khử và acid amine ở nhiệt độ chế biến cao

và thời gian dài [16, 24] Tùy thuộc vào nhiệt rang (120ºC - 240ºC), khoảng thời gian rang (10 - 20 phút) sẽ tạo ra các mức độ rang nhạt (Light), rang vừa (Medium)

và rang đậm (Dark) Sự hình thành acrylamide bắt đầu nhanh chóng khi bắt đầu quá trình rang và nó giảm ngay sau khi đạt đến mức tối đa, có thể là do bay mất và các phản ứng hóa học [16] Cà phê rang nhạt có thể chứa một lượng acrylamide tương đối cao hơn cà phê rang đậm sau đó giảm dần về cuối quá trình rang, hình 1.3 [26]

12

Hình 1.3 Ảnh hưởng của quá trình rang lên hàm lượng acrylamide

Do đó, mức độ rang là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hàm lượng acrylamide, đối cà phê rang nhạt hàm lượng cao hơn đáng kể so sánh với cà phê rang đậm [16] Ở hai loài cà phê robusta chứa hàm lượng acrylamide cao hơn arabica, các mức được báo cáo đối với hạt cà phê rang rất khác nhau, thường nằm trong khoảng 35–540 µg/kg [16]

Báo cáo của EFSA hàm lượng acrylamide được tìm thấy ở mức cao nhất trong cà phê hòa tan giá trị trung bình 1499 µg/kg, đối với cà phê hạt là 522 µg/kg [6]

Theo cơ sở dữ liệu của Ủy ban Liên minh Châu Âu, cà phê rang xay thành phẩm có mức acrylamide trung bình là 265 - 290μg /kg Ngay cả khi xem xét rằng cấp độ cà phê rang cuối cùng chỉ là gần 10% mức hình thành acrylamide cao nhất, cần phải kết luận rằng chỉ một phần nhỏ của asparagin trong cà phê nhân (0,2–1g/kg) góp phần tạo ra acrylamide Đó là lý do tại sao mối tương quan giữa asparagine và acrylamide trong cà phê ít quan trọng hơn so với các thực phẩm khác [27]

Cơ quan An toàn thực phẩm Châu Âu (EFSA) đã xác nhận rằng acrylamide trong thực phẩm là một mối quan tâm về sức khỏe cộng đồng, đòi hỏi phải tiếp tục nỗ lực

để giảm mức độ phơi nhiễm của nó [28] Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hàm

13

lượng acrylamide trong đồ uống là giống cà phê, độ chín của hạt cà phê, điều kiện rang, bảo quản và cách pha chế [27]

1.1.4 Sức khỏe và tính chất gây hại của acrylamide

Cơ quan Quốc tế nghiên cứu về ung thư (IARC 1994) đã phân loại acrylamide là chất có thể gây ung thư cho người thuộc nhóm 2A, dựa trên khả năng gây ung thư của nó trong loài gặm nhấm [29] Tổ chức y tế thế giới WHO khẳng định rằng acrylamide thuộc nhóm hóa chất không có ngưỡng tác động đáng tin cậy, nồng độ rất thấp cũng sẽ dẫn đến rủi ro thấp, một số rủi ro luôn có khi hóa chất này được tiêu hóa Khả năng gây ung thư của acrylamide cho là tăng khi được tiếp xúc nhiều hơn [30]

Acrylamide là một chất độc thần kinh mạnh đã được báo cáo trong nhiều công trình nghiên cứu, ảnh hưởng đến cả hệ thần kinh trung ương và hệ thần kinh ngoại vi, thể hiện ở hình 1.4 [30] Mức độ của hiệu ứng độc phụ thuộc vào thời gian phơi nhiễm

và tổng liều phơi nhiễm; chỉ có monomer acrylamide là độc hại trong khi các polyme acrylamide là không độc [30] Mức độ phơi nhiễm thấp thường từ các nguồn ô nhiễm thực phẩm, từ chế độ ăn uống hoặc từ môi trường cũng góp phần thúc đẩy và làm tiến triển các bệnh thoái hóa thần kinh ở người Acrylamide kích thích các nhóm tế bào bạch cầu tạo ra các gốc tự do làm giảm nồng độ glutathione trong tế bào Việc tiêu thụ các sản phẩm thực phẩm có chứa acrylamide gây viêm và trạng thái thần kinh căng thẳng, oxy hóa gây xơ vữa động mạch Glutathione là một trong những các chất chống oxy hóa được tạo ra trong cơ thể [31]

Theo quy định của FAO 2005, acylamide được đưa qua đường miệng với liều trên 100mg/kg trọng lượng cơ thể sẽ gây ngộ độc cấp và liều gây chết trung bình LD50 >

150 mg/kg trọng lượng cơ thể [32]

14

Hình 1.4 Cơ chế gây độc thần kinh của acrylamide Theo Báo cáo xu hướng công nghệ của Trung tâm Thông tin và khoa học công nghệ năm 2011 và Ngân hàng thế giới (WB) cho thấy tiềm năng thị trường nội địa của Việt Nam có thể tiêu thụ tới 70.000 tấn/năm, tức là với sản lượng cà phê hàng năm thu hoạch được 700.000 – 800.000 tấn thì lượng cà phê tiêu thụ nội địa của Việt Nam ở mức xấp xỉ 10% từ nguồn nghiên cứu gần đây của WB [6, 33].Thị trường cà phê có 2 phân khúc lớn là cà phê rang xay và cà phê hòa tan Cà phê rang xay chiếm 1/3 thị trường tiêu dùng còn lại là cà phê hòa tan Cà phê là ngành có sức hấp dẫn

và cạnh tranh cao ở Việt nam [3]

ACRYLAMIDE

Tác động lên các

Protein vân động

Thay đổi mức độ dẫn truyền thần kinh

Ức chế trực tiếp

sự dẫn truyền thần kinh

Giảm các protein

vận chuyển ở các sợi

trục xa

Cản trở các quá trình hợp nhất các màng ở đầu cuối dây thần kinh

Sự không dung nạp giữa các túi synap lưu trữ các chất dẫn truyền thần kinh khác nhau được giải phóng ở khớp thần kinh

ĐỘC TÍNH THẦN KINH

15

Về mức tiêu thụ ở Bắc Âu là 10 kg/người/năm, ở Tây Âu là 5-6 kg/người/năm Theo báo cáo ngành Nông nghiệp Việt Nam quý III/2017 của BMI research, từ giai đoạn 2005-2015, lượng tiêu thụ cà phê ở Việt Nam tăng trưởng từ 0,43 kg/người/năm lên 1,38 kg/người/năm và dự báo tăng lên 2,6 kg/người/năm vào năm

2021 [3]

Báo cáo của FAO đưa ra một số nghiên cứu đã được thực hiện để ước tính mức độ tiếp xúc với acrylamide trong chế độ ăn có hàm lượng dao động từ 0,2 - 4 µg/kg/ngày, được tóm tắt trong bảng 1.3 [18] và mức acrylamide trong các sản phẩm cà phê thể hiện ở bảng 1.4 [18]

Bảng 1.3 Lượng acrylamide trong khẩu phần ăn

Quốc gia/ Tổ chức Lượng Acrylamide ước tính trong chế độ

ăn uống (µg/kg thể trọng/ ngày)

Bảng 1.4 Hàm lượng acrylamide trong một số sản phẩm cà phê

Tên thực phẩm Hàm lượng Acrylamide

trung bình µg/kg

Hàm lượng Acrylamide cao nhất µg/kg

16

1.1.5 Quy định về acrylamide

Việt Nam hiện nay chưa có quy định về giới hạn acrylamide trong thực phẩm nhưng có đưa ra “Quy chuẩn thực hành giảm acrylamide trong thực phẩm TCVN 9776:2013” [34]

Năm 2016, Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa kỳ FDA đã đưa ra “Hướng dẫn không bắt buộc về việc đưa ra quy chuẩn giúp nông dân, nhà sản xuất và nhà cung cấp dịch vụ thực phẩm giảm mức acrylamide trong một số thực phẩm nhất định” [35]

EU có những quy định cho các nhà sản xuất thực phẩm, tuy nhiên các nhà xuất khẩu từ nước thứ ba gián tiếp cũng phải tuân thủ các yêu cầu về an toàn thực phẩm [36]

• Quy định số 178/2002 của Nghị viện Châu Âu và của Hội đồng ngày 28/01/2002 thiết lập “ Những nguyên tắc và yêu cầu chung của Luật thực phẩm, thành lập Cơ quan an toàn thực phẩm Châu Âu và quy định thủ tục trong vấn đề

an toàn thực phẩm” (Tài liệu 32002R0178, EUR-Lex) [37]

• Quy định số 852/2004 của Nghị viện Châu Âu và của Hội đồng ngày 29/04/2004 về “Vệ sinh thực phẩm” (Tài liệu 32004 R0852, EUR-Lex) [38]

• Tuân thủ hệ thống quản lý an toàn thực phẩm như ISO 9001, ISO 22000 và các nguyên tắc phân tích mối nguy và kiểm soát điểm tới hạn (HACCP) [36]

EU quy định chất gây ô nhiễm (bảng 1.5 [39]) cần phải đảm bảo ở mức thấp nhất

có thể để không đe dọa sức khỏe con người hoặc ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng sản phẩm

Bảng 1.5 Mức chuẩn cho phép sự hiện diện của acrylamide trong sản phẩm cà phê

theo Ủy ban Châu Âu

Tên sản phẩm thực phẩm Mức chuẩn (µg/kg)

17

1.2 Phương pháp phân tích acrylamide

Từ năm 2002 có rất nhiều nghiên cứu được đăng tải trong hầu hết các tạp chí khoa học về phương pháp phân tích acrylamide trong thực phẩm nói chung và sản phẩm

cà phê nói riêng đến nay Về nguyên tắc, acrylamide được tách ra khỏi nền với dung môi tách, chiết thích hợp, sau đó có một kỹ thuật phân tích phù hợp để xác định hàm lượng acrylamide trong dịch chiết từ đó tính được hàm lượng có được trong mẫu ban đầu [40]

1.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu

Do sự phức tạp của nền mẫu thực phẩm cũng như nền các sản phẩm cà phê, nên quá trình xử lý mẫu ngoài việc đạt được tối đa hiệu suất chiết acrylamide, còn phải làm giảm được càng nhiều tạp chất càng tốt Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu bao gồm chiết bằng dung môi, chiết pha rắn, QuEChERS và tạo dẫn xuất (Bromat hóa, hay BSTFA (tạo phản ứng Silyl hóa)) đã được áp dụng, xem hình 1.5 [41]

Việc lựa chọn quy trình phân tích thích hợp nhất phải dựa trên loại sản phẩm thực phẩm (nền mẫu), cấu trúc acrylamide và tính chất vật lý - hóa học của nó Cà phê là một nền mẫu phức tạp Một số báo cáo về hàm lượng acrylamide trong cà phê bị ảnh hưởng bởi các hợp chất gây nhiễu, cần có một phương pháp để xác định acrylamide trong cà phê để kiểm soát hiệu suất thu hồi trong toàn bộ quy trình xử lý mẫu (chiết xuất và làm sạch), chất nội chuẩn được thêm vào mẫu sau khi đồng nhất

và trước khi tách chiết [40] Chất nội chuẩn được đề nghị là đồng phân với acrylamide, chúng tôi sử dụng acrylamide-d3 làm nội chuẩn

Chiết lỏng - lỏng: Acrylamide hòa tan trong nước, acetone, etanol, n-propanol, ethylacetate không tan tốt trong dung môi không phân cực Vì vậy, nước ở nhiệt độ phòng đã được sử dụng để chiết acrylamide từ các nền mẫu khác nhau, bao gồm cả

cà phê, trong hầu hết các phương pháp phân tích đã được công bố, vì acrylamide là một phân tử nhỏ tan tốt trong nước Chiết xuất acrylamide và kết tủa các chất đồng rửa giải và sau đó được loại bỏ dung môi bằng cách cô đặc và bay hơi bằng máy cô

Kết tủa đồng dịch chiết với thuốc thử Carrez Kali hexacyanoferrat (II) trihydrat (Carrez I) và kẽm sulfat heptahydrat (Carrez II) để thúc đẩy sự kết tủa của polysaccharid và protein [40]

Kỹ thuật QuEChERS (Nhanh chóng, dễ dàng, giá rẻ, hiệu quả, chắc chắn và an toàn) là sự kết hợp muối MgSO4 và NaCl giúp phân tách pha giữa nước và acetonitril một cách dễ dàng hơn Acrylamide chủ yếu tập trung vào lớp acetonitril Ngoài ra, việc sử dụng acetonitril để khử protein và ly tâm để làm sạch dịch chiết [42]

Sản phẩm thực thẩm

Mẫu được đồng nhất + Nội

chuẩn (IS) Dung dịch chiết

Chiết làm sạch Phân tích trực tiếp Sily hóa Bromate hóa

GC-MS(-MS)

GC GC-MS(-MS)

19

Chiết phân tán pha rắn d-SPE với PSA + MgSO4 nhằm loại các hợp chất cản nhiễu

và nước Các loại pha tĩnh để loại tạp nền bao gồm C18, PSA và GCB C18 giúp loại các hợp chất không phân cực và một số nhỏ các hợp chất màu PSA chủ yếu để loại đường, các acid béo, acid hữu cơ trong cà phê Cột GCB loại màu, các hợp chất sterols, polyphenols, pectins, cafein, chlorophylls và carotenoids Tuy nhiên, than hoạt tính trong SPE GCB có nhược điểm làm mất các chất có cấu trúc phẳng Chiết pha rắn SPE : Acrylamide không được giữ lại trong cột, nhưng nhiều thành phần chất nền (không phải là hợp chất ion và các hợp chất ion) có thể gây nhiễu sẽ được giữ lại, làm sạch các chất chiết xuất bằng SPE trước khi tiến hành sắc ký nhằm giảm sự ức chế ion hay còn gọi là hiệu ứng nền và đạt được giới hạn phát hiện thấp (LOD) [42,43]

1.2.2 Phương pháp phân tích

Hội thảo ở Châu Âu về đánh giá chất lượng phân tích đề xác định acrylamide trong các sản phẩm thực phẩm kết luận rằng hiện nay phần lớn các phòng thí nghiệm sử dụng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS và sắc ký khí khối phổ GC-MS để phân tích acrylamide với ưu điểm cho độ chính xác cao, không cần phải tạo dẫn xuất đơn giản hóa quá trình phân tích [39, 44]

Ủy ban Tiêu chuẩn hóa Châu Âu CEN công bố phương pháp phân tích chất gây ô nhiễm trong quá trình (Acrylamide Toolbox 2019) [45], các tiêu chuẩn này là:

• EN Standard 16618:2015 LC-ESI-MS/MS_Xác định acrylamide trong các sản phẩm làm từ khoai tây, các sản phẩm làm từ ngũ cốc và cà phê bằng LC-MS

• CENT/TS 17083:2017 GC-MS_ Xác định acrylamide trong các sản phẩm làm

từ khoai tây, các sản phẩm làm từ ngũ cốc và cà phê bằng GC-MS

FDA đã công bố một phương pháp dự thảo để phân tích của acrylamide trong thực phẩm bằng LC -MS/MS [46]

20

Sáng kiến của Hiệp hội các cộng đồng phân tích AOAC (2021) đang đề xuất thành lập nhóm để phát triển tiêu chuẩn đồng thuận tự nguyện để xác định acrylamide phương pháp phân tích cho nền mẫu thực phẩm [47]

Kiểm tra công nhận (ISO/ IEC 17025: 2017) và các phương pháp phân tích đã được xác nhận thông qua CEN tạo ra những đánh giá chính xác hơn về mức acrylamide trong sản phẩm cuối cùng [44]

1.2.3 Kết quả các phương pháp phân tích

Nhiều nghiên cứu đươc đăng tải trong hầu hết các tạp chí khoa học về phương pháp phân tích acrylamide trong thực phẩm từ năm 2002 đến nay

21

Bảng 1.6 Một số phương pháp phân tích acrylamide ở trong nước và quốc tế

Tác giả Xử lý mẫu Làm sạch Thiết bị

Năm công

bố

Giới hạn phát hiện / định lượng

Đào Hải Yến

và cộng sự

[48]

Thực phẩm chế biến (snack , phở khô, bánh gạo, mì

ăn liền, bánh quy) Chiết : MeCN

n-Hexane Muối QuEChERS SPE: Oasis MCX

UPLC-MS /

LOD: 1 µg/kg LOQ: 3 µg/kg

PSA MgSO4 LC-MS-MS 2014

LOD: 6 ng/g LOQ: 21 ng/g

Andrzejewski

và cộng sự

[50]

Cà phê hạt, cà phê hòa tan Chiết: H2O

SPE: HLB của Oasis LC-MS-MS 2004 LOD: 10 µg/kg

Gokmen và

cộng sự [51]

Snack khoai tây,

cà phê hạt Chiết : MeOH

Bước 1:

Carrez I, II Bước 2:

SPE HLB Oasis

LC-MS-MS 2005

LOD: 2 µg/kg LOQ: 10 µg/kg

Bagdonaite và

cộng sự [52]

Cà phê rang Chiết: H2O khử béo bằng Hexan

SPE :Bond Elut-Accucat

LC-MS-MS 2008 LOD: 3 µg/kg

Soares và cộng

sự [53]

Cà phê, cà phê hòa tan

Chiết 1: H2O Chiết 2: EtOH Dẫn xuất: Brom hóa trong 1 giờ

Bước 1 : Carrez I, II Bước 2 : SPE : C18

Chiết : MeCN Dẫn xuất :100 μL

TMCS ở 70oC/60 phút

GC-MS 2019 LOD: 1 µg/kg

LOQ: 5 µg/kg

22

1.2.4 Ưu điểm và hạn chế của các phương pháp

Phương pháp sắc ký khí tạo dẫn xuất: Dựa trên sự tạo dẫn xuất của chất phân tích

và sự phân tách bằng sắc ký khí với đầu dò ECD hay MS để định lượng [40, 54]

Ưu điểm: nhanh chóng, chi phí thấp

Hạn chế: Quá trình khử dẫn xuất tốn thời gian, công sức, có độc tính cao, không ổn định hoặc không hoàn toàn, và dương tính giả do phản ứng phụ hoặc cản trở từ thuốc thử tạo dẫn xuất

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ:

Ưu điểm: thiết bị hiện đại, xử lý mẫu nhanh chóng, không tạo dẫn xuất

Hạn chế: Chi phí cao, thiết bị đắt tiền

1.2.5 Kết luận

Trong bối cảnh với những quy định khác nhau và những phương pháp tiêu chuẩn hay không tiêu chuẩn thì việc hướng đến tuân thủ các mức giới hạn độc tố tối đa cho phép theo quy định và hàm lượng thấp nhất cho một phép định lượng là những thách thức mà các phòng thí nghiệm và các nhà sản xuất thực phẩm phải đối mặt và củng cố phát triển hơn Việc xây dựng một phương pháp độ nhạy tốt sẽ cho phép ứng dụng rộng rãi trên nhiều nền mẫu khác nhau, giảm thiểu các ảnh hưởng từ nền mẫu và đảm bảo đáp ứng các thông số của phương pháp định lượng để cung cấp độ chính xác cao hơn trong định lượng acrylamide

23

Cà phê là một nền mẫu phức tạp với sự liên kết và ngăn chặn ion Nhiều phương pháp được tối ưu hóa để xác định acrylamide Chuẩn bị mẫu bao gồm xác định hàm lượng acrylamide và loại bỏ các hợp chất gây nhiễu là bước quan trọng trong quá trình phân tích Phương pháp phân tích acrylamide của đề tài được xây dựng trên nền tảng phương pháp của Ủy ban Tiêu chuẩn hóa Châu Âu: EN Standard 16618:2015 LC-ESI-MS/MS [14] Xác định acrylamide trong các sản phẩm làm từ khoai tây, các sản phẩm làm từ ngũ cốc và cà phê bằng LC-MS và phương pháp QuEChERS AOAC 2007.01 [15] được tham khảo, chúng tôi cải tiến phân tích trên thiết bị LC-MS/MS Theo quy định 2017/2158/EU thiết lập các biện pháp giảm thiểu và mức chuẩn cho phép sự hiện diện của acrylamide trong cà phê, yêu cầu giá trị sử dụng phương pháp phân tích acrylamide phải tuân theo các tiêu chí và nhằm đáp ứng tiêu chuẩn hóa Châu Âu CEN [39] và ISO/IEC 17025:2017

2.1 Hoá chất, thiết bị

2.1.1 Hệ sắc ký lỏng ghép khối phổ

Hệ thống LC-MS/MS của hãng Agilent, Mỹ bao gồm

• Bơm gradient Binary pump SL

• Bộ tiêm mẫu tự động HiP-ALS

• Hệ điều nhiệt TCC-SL

• Đầu dò Triple Quad LC-MS/MS 6410

• Cột Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (100 mm × 2.1 mm,1.8 μm) và cột bảo vệ hoặc tương đương

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ dùng trong thí nghiệm

• Máy lắc (IKA, Đức)

• Máy vortex (IKA, Đức)

24

• Máy ly tâm (Hermle, Đức)

• Máy xay mẫu (Philips, Indonesia)

• Bồn siêu âm (Elima, S 300 H, Đức)

• Máy cô đặc dung môi (Mivac, Đức)

• Cân phân tích (Sartorius, Đức)

• Màng lọc nylon 0,2 µm (CNW, Trung Quốc)

2.1.3 Hoá chất, chất chuẩn

Tất cả các hóa chất được sử dụng trong đề tài đều đạt được độ tinh khiết dùng trong hóa phân tích

• Nước cất 2 lần loại ion

• Acetonitril HPLC của Merck, tinh khiết ≥ 99% hoặc tương đương

• Methanol của Merck, analytical grade tinh khiết ≥ 99% hoặc tương đương

• Acid Formic của Merck, tinh khiết ≥ 99% hoặc tương đương

• Ethyl Acetate của Scharlau, tinh khiết ≥ 99% hoặc tương đương

• Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate

• Zinc sulfate heptahydrate

• Chuẩn Acrylamide ≥ 99% của Sigma-Aldrich hoặc tương đương

• Nội chuẩn Acrylamide-d3 (2,3,3-d3-2-propenamide) ≥ 99% của TRC hoặc tương đương

• Mẫu CRM: Fapas ® Reference material data sheet TYG090RM, matrix coffee

instant

• Cột Bond elut C18 (500mg/6mL) của Agilent hoặc tương đương

25

• Cột Strata X-C Polymeric (Strong Cation, 30mg, 3mL) của Phonomenex hoặc tương đương

• Cột SPE Oasis HLB ( 60 mg, 3 mL) của hãng Water

• Cột GCB/PSA của hãng CNW Technology

2.2 Chuẩn bị hóa chất, pha động, dung dịch chuẩn

2.2.1 Chuẩn bị pha động

• Pha động 1: dung dịch muối amoni acetate 5 mM CH3COONH4 Cân 0,385 gam muối CH3COONH4 cho vào bình định mức 1 L làm đầy đến vạch bằng nước cất loại ion, lắc đều Đánh siêu âm 30 phút

• Pha động 2: H2O 0,1%HCOOH : Cho nước cất vào bình chứa 1000 mL đến đầy vạch chứa sẵn 1 mL HCOOH, lắc đều, đánh siêu âm 30 phút

• Pha động 3: Dung dịch MeCN, lắc đều Đánh siêu âm 30 phút

• Hỗn hợp MeOH/H2O (1/1, v/v): Dùng ống đong lấy 100 mL MeOH cho vào bình chứa đã có sẵn 100 mL nước cất loại ion Lắc đều

Lưu ý: tất cả các đơn vị về tỷ lệ thể tích trong đề tài này là v/v