Nghiên cứu tách chiết và phân tích cấu trúc kháng sinh thu được từ chủng xạ khuẩn STREPTOMYCES SP KCTC 0041BP sau khi đã đột biến mất GEN MIII

Vì the định nghĩa kháng sinh đã được thay đối: “Kháng sinh là tát củ các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tống hợp với nong độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triên hoặc

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hưóng dẫn :Th.s Nguyễn Thị Ngọc Anh Sinh viên thục hiên :Nguyễn Hoài Linh

em trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu cùa mình.

Em xin chân thành cảm ơn TS Tạ Thị Thu Thúy - Chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học - Viện Đại Học Mờ Hà Nội, cùng toàn thê các thay cô giáo, anh chị kĩ thuật viên các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh học phân tứ đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu Bước đầu tìm hiếu, thực hiện đề tài với von kiến thức còn hạn che và nhiều bỡ ngỡ Mặc dù bân thân đã có nhiều cố gắng, nhưng không thế tránh khỏi những thiều sót nên em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý Thây - Cô đê bài khóa luận của ém được dầy dụ hqn.

Em xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Hoài Linh.

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC HÌNH V DANH MỤC CÁC BÁNG vi

MỚ ĐÂU 1

PHÁN 1: TỎNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tông quan vê kháng sinh 4

1.1.1 Lịch sử về kháng sinh 4

1.1.2 Định nghĩa về kháng sinh 4

1.1.3 Phân loại kháng sinh 5

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 6

1.1.5 Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh 7

1.2 Tổng quan về xạ khuấn Streptomyces 9

1.2.1 Vai 9 1.2.2 Giới thiệu về xạ khuấn Streptomyces 10

1.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh ớ xạ khuẩn 10

1.3 Xạ khuẩn Streptomyces sp K.CTC 0041BP 11

1.3.1 Đặc điểm nuôi cấy 11

1.3.2 Đặc điếm sinh lý, sinh hóa 13

1.3.3 Khá năng kháng khuân với một số vi sinh vật kiếm định 13

1.3.4 Phân loại 13

1.4 Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041 bp đã được đột biến GerMIII 13

1.5 Tổng quan về kháng sinh dyhidrochalcomycin 14

1.5.1 Cấu trúc cùa dyhidrochalcomycin 15

1.5.2 Vai trò và hoạt tính sinh học 15

1.5.3 Các nghiên cứu về dihydrochalcomycin 16

1.6 Đại cương về gen gerMIII (2-O-methyltransferase) 21

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cửu 23

2.1 Vật liệu hóa chất và thiết bị 23

2.1.1 Vật liệu 23

2.1.2 Hóa chất 23

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 24

2.1.4 Thiết bị 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy chủng vi sinh vật 25

2.2.2 Phương pháp bảo quản giống 27

2.2.3 Phương pháp tách chiết kháng sinh thô bằng dung môi hữu cơ 27

2.2.4 Phương pháp thư hoạt tính kháng sinh bằng khoanh giấy lọc 29

2.2.5 Phương pháp sac ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) 30

2.2.6 Phương pháp Prep - TLC (Prepare TLC) 31

2.2.7 Phương pháp sắc ký lóng kết hợp khối phố (Liquid Chromatography Mass) 33

2.2.8 Phương pháp ion h^tia 0iện ESI (Electrophox^si^ Spray ^jnization) 34

PHÀN 3: KÉT QUA VÀ THAO LUẠN 35

3.1 Tách chiết kháng sinh thô bang dung môi hữu cơ 35

3.2 Thừ hoạt tính kháng sinh bang phương pháp khoanh giấy lọc 36

3.3 Tthừ hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lóp móng TLC 38

3.4 Tinh sạch kháng sinh bàng Prep - TLC (Prcpare-TLC) 40

3.5 Ket quả phân tích kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lóng kết hợp khối phố (LC-Mass) và phương pháp ESI-Mass 41

3.6 Quy trình tách và thu nhận kháng sinh thô quy mô phòng thí nghiệm 43

3.7 Qui trình tinh sạch quy mô phòng thí nghiệm 45

PHẦN 4: KÉT LUẬN VÀ DỀ XUẤT 46

4.1 Kết Luận 46

4.2 Đe Xuất 46

TÀI LIỆU THAM KHÁO 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Khuân lạc cua chùng Streptomyces sp KCTC 004IBP trênmôi trườngISP2 12Hình 1.2 Hình dạng KTKS và KTCC của chúng Streptomyces sp KCTC 004IBP phóng đại (x 4.500-15.000) 13Hình 1.3.Cấu trúc cùa Dihydrochalcomycin 15Hình 1.4 Dự đoán con đường sinh tổng hợp gốc đường khứ và bước cuối hoàn thành cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin 19Hình 1.5 Nhóm gen sinh tổng hợp dihyrochalcomycin phân lập từpGERI-5 cosmid 22Hình 3.1 Phân pha chiết dịch kháng sinh 35Hình 3.2 Sản phấm kháng sinh của các chùng đã đột biến sau khi quay cô 36 Hình 3.3 Ket quà thử hoạt tính kháng sinh của các chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP đã đột biến 37Hình 3.4 Kết quà kíềni tfa\:hặy TLC c&t chủng kỉreịttòìnyces sp KCTC 0041BP(W) và các chúng đột biến M3-1-10(10), M3-8-I3(13) 38Hình 3.6 Kết quả thứ hoạt tính kháng sinh sau khi tinh sạch 40Hình 3.5 Kct quá thứ hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chúng

xạ khuấn Streptơmyces sp KCTC 0041BP ban đầu(W) và các chúng đột biến M3-l-10(10), M3-8-13(13) 39Hình 3.7 Ket quả chạy TLC sau khi tách khói bột silicagel 41Hình 3.8A và hình 3.8B: Phân tích cấu trúc phân tứ Dihydrochalcomycin bàng LC-Mass 42Hình 3.9A và hình 3.9B: Phân tích cấu trúc cùa dẫn xuất kháng sinh từ chùng đột biến gen GerMIlI 43Hình 3.10 Sơ đồ quy trình thu nhận kháng sinh thô 44Hình 3.11 Sơ đồ quy trình tinh sạch quy mô phòng thí nghiệm 45

DANH MỤC CÁC BANG

Bảng 1.1 Dự đoán chức năng cùa các gen ORFs trong nhóm gen sinh tống hợp dihydrochalcomycin 17Bảng 3.1 Ket quà thứ hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces sp KCTC 004IBP ban đầu và các chúng đột biến M3-8-13, M3-1-10 37Bàng 3.2 Kết quả thừ hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chùng đột biến M3-1-10, M3-8-13 và chủng wild type 38

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

MỞ ĐẦU

Bệnh nhiễm khuấn là một trong những nguyên nhân hàng đầu đe dọa đến sự

an toàn cùa con người Những trận dại dịch không những cướp đi sinh mạng con người mà thậm chí còn dẫn đến sự diệt vong cùa một đế chế hùng mạng Chính điều

đó đã thôi thúc các nhà khoa học trên thế giới phái tìm ra được một chất có khã năng phòng chong và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn

Ngày nay với sự phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học đã tìm ra rất nhiều chất kháng sinh (CKS) phục vụ đời sống con người Trong số hơn 10.000 CKS được tìm ra thì có khoáng 2.000 chất do thực vật tạo ra khoảng 8.000 chất là kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp trong đó xạ khuẩn tồng hợp trên 80% 1111

Tuy nhiên, do việc sử dụng các CKS không hợp lý đã làm xuất hiện hiện tượng kháng kháng sinh, số lượng các vi khuẩn kháng với chất kháng sinh ngày càng gia tăng Vì vậy, đi kèm với các biện pháp sử dụng kháng sinh an toàn, hợp lý thì việc nghiên cứu sàn xuất ra các chat kháng sinh mới có nhiều đặc tính ưu việt thựcsựrấtcầnthiểpi^ viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Xạ khuấn Streptomyces sp KCTC0041BP dang dược nghiên cứu ở nhiều

nước như Hàn Quốc, Việt Nam Đây là chùng hoang dại sinh tồng hợp ra Dihydrochalcomycin và đã được phân lập xác định cấu trúc hóa học bời nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc 119]

Kháng sinh Dihydrochalcomycin (C35H58O14) là kháng sinh thuộc nhóm Macrolide 16C, được sứ dụng trong điều trị nhiễm trùng đường hô hấp Kháng sinh Dihydrochalcomycin được tách chiết từ chũng xạ khuân Streptomycessp KCTC 004IBP có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gr' (Gram âm) và Gr+ (Gram dương) bang cách liên kết vào tiểu phần 50S cùa ribosome, ngăn càn quá trình sinh tống hợp protein của vi khuấn Nhiều nhà khoa học đã và dang quan tâm nghiên cứu về loại kháng sinh này bới nhiều ưu điếm vượt trội cùa nó như ít độc, dung nạp lốt, thái trừ nhanh, có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh và đặc biệt chưa xuất hiện hiện tượng kháng thuốc

Các nhóm nghiên cứu trên thế giới xác định toàn bộ nhóm gen cùa xạ khuấn này Toàn bộ nhóm gen tham gia sinh tống hợp có chuỗi trình tự là 75.5kb và có khoảng 23 ORF chứa thông tin di truyền và mã hóa của các gen tham gia con đường tông hợpDihydrochalcomycin: gerữ, gerMl, gerN, gerR gerPl, gerP2, gerG gerE

gcrD, gerF, gerM2, gerP3, gerH, gerK 1 gerM3, gerĩ 1, gerK, gerS 1, gerS2, g<?rS3, gerS4 gerS5, gerỴ, gerT2, gerK2 Hiện nay, đã có một so gen được nghiên cứu chứng minh chức năng cùa chúng là: gé/Tl, gerT2, gcrKl, gerF, gerR ge/'M2,

gerMl [1], [4], [5], [13]

Trong 31 gen tham gia vào quá trình sinh tống hợp kháng sinh Dihydrochalcomycin, gen gerMIII có chức năng mã hóa tồng hợp enzyme 2- O- mcthyltransferasc.Enzyme2-O-methyltransfcrasc (GcrMIll) cùng với 3-0- methyltransferase (GerMII) sẽ xúc tác phán ứng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí c2, c3 tạo gốc đường D-mycinose

Gen gerMIII đã có khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu tạo đột hiến gen mã hóa cho enzyme 2 - O-me^l^^fepa^a(gen GerM.3 bhang phương pháp tiếp hợp trên xẹt khuân Streptonryces sp KCTC0041BP'' - Ngô Văn Luân (2013) Sau khi đã đột

biến gen gerMlII và đã được chứng minh bang sàng lọc trên mồi trường có bố sung kháng sinh Apramycin và Neomycin tạo chúng đột biến có trao đồi chéo đơn và chúng có trao đối chéo kép Tuy nhiên mới bước đầu sàng lọc chùng đột biến có trao dối kép làm mat gen ger Mil Đố chứng minh đột biến mat gen ger MII và làm

rõ hơn chức nâng cùa gen ger MIL năm 2014 khóa luận toi nghiệp “Bước đầu nghiên cứu tách chiết và kiếm tra sán phàm kháng sinh cùa chúng xạ khuẩn đột hiến gen ger Mil từ chùng Streptomyces sp KCTC 004IBP han đầu” - Nguyền Thị

- Tách chiết và thứ hoạt tính kháng sinh thô cũa chủng xạ khuân Streptomyces

sp KCTC 004IBP đã đột biến mất gen gcrMIII

- Phân tích cấu trúc kháng sinh thu được từ chúng xạ khuấn Streptomyces sp KCTC004IBP

Nội dung thực hiện:

- Tách kháng sinh thô bằng phương pháp quay cô chân không

- Xác định hoạt tính kháng sinh bang phương pháp khoanh giấy lọc

- Xác định hoạt tính kháng sinh bàng phương pháp chạy sắc ký bản móng TLC

- Nghiên cứu tách và tinh sạch kháng sinh bang Prep-TLC(Preparative-TLC)

- Phân tích kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp phối khổ ( LC- Mass) và phương pháp ESI-Mass

- Xây dựng quy trình tinh sạch kháng sinh thô trong phòng thí nghiệm

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

PHÀN 1: TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về kháng sinh.

Năm 1938 Fleming nhận được thư cùa hai nhà khoa học từ trường Đại học Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị được hợp tác với ông đế tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về penicillin và họ đã thứ nghiệm thành công penicillin trên chuột vào 1940

Năm 1941, nhóm đã chọn đưực loại nấm Penicillium ưu việt nhất là chúng

Penicillum chrysogenium, chế ra loại penicillin có hoạt tính cao hơn cả triệu lần

Tuy nhiên, với sự phát triển của khoa học người ta có thể tống họp bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tống hợp nhân tạo các chat có tính kháng sinh: sulfamid quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được tế bào ung thư (actinomycin) Vì the định nghĩa kháng sinh đã được thay đối: “Kháng

sinh là tát củ các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tống hợp với nong độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triên hoặc tiêu diệt đổi với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên con người, động vật và thực vật hằng con đường cung cấp chung”[3].

Đe biếu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml dung dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phấm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng sinh Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiếu hoà tan trong một thế tích môi trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiếm định trong thời gian xác định[3] Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI penicillin = 0,6 pg, còn 1 UI streptomycin = 1,0 pg (Hopwood, 2007)

1.1.3 Viện Đại học Mớ Hà Nội

Việc phân loại nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục các CK.S do việc tìm ra các CKS ngày càng nhiều Nhờ đó tiết kiệm thời gian khi nghiên cứu các CKS mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác dụng và khá năng ứng dụng trong công tác chữa bệnh

Có thè phân loại kháng sinh dựa trên nhiêu phương diện như phô tác dụng, cơ chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh tồng hợp hay cấu trúc hóa học Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái nhìn tống quát nhất đối với các nhóm kháng sinh

Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính [3]:

- Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrate

- Nhóm 2: Các lactonemacrolide

- Nhóm 3: Các kháng sinh quinolone và dần xuất

- Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid

- Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ

- Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy

- Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no

- Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm

- Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thăng

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh.

Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phàn ứng tống hợp rất khác nhau cùa tế bào vi sinh vật gây bệnh Chúng liên kết vào các vị trí chính xác hay các phân từ đích cùa tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng trao đối chất làm

ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh

Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong nhiều trường hợp người ta vần chưa biết được chính xác het Có 6 mức tác dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: tác dụng lên thành tế bào, tác dụng lên màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tống hợp DNA, tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, tác dụng lên sự trao đối chất hô hấp và cuối cùng là tác dụng KnSự.rao<lỔichí1j<fflíg1gịịíl[ụ.iện Đạị học Mớ Hà Nội

1.1.4.1 ức che quá trình tồng hợp thành tế bào của vi khuẩn.

Các P-Lactam ngăn càn sự tông hợp các mucopeptide, làm rôi loạn quá trình nhân lên của vi khuẩn Khi có mặt kháng sinh, vi khuấn có thế vẫn tiếp tục nhân lên với vách không hoàn chinh hoặc không có vách nhưng chúng dễ bị tiêu diệt bởi thực bào, nhân tố lý hóa học

Xycloserin tác động bằng cách ngăn cán tập hợp các tetra và pentapeptide do

ức chế enzym tồng hợp D-alanin

Bacitracin: thay đôi tính thẩm thấu chọn lọc cúa màng nguyên tương của vi khuẩn

1.1.4.2 ức chế chức năng của màng tế bào.

Thay đồi chức năng năng lượng, ánh hường sự hô hấp tế bào: gramicidin, sideromycin

Kháng sinh gan lên màng tế bào chat làm thay đổi cân bằng thấm thấu cùa màng tế bào như kháng sinh polypeptide: polymycin, colistin và kháng sinh chống nam nistatin

1.1.4.3 ưc chê quá trình sinh tông hợp protein.

Nhóm aminoglycoside gan với receptor trên tiếu phần 30S của ribosome, ngăn cản phức hợp khởi đầu hoạt động bình thường, can thiệp tiếp cận tRNA làm cho quá trình dịch mã không chính xác

Nhóm chloramphenicol gắn với tiếu phần 50S cùa ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide mới thành lập

Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S cũa ribosome làm ngăn cán sự thành lập phức hợp đầu tiên đế tống hợp chuồi polypeptide

1.1.4.4 ức chế quá trình tong hợp nucleic acid.

Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn càn quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin)

Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thế duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi cùa DNA.Nhóm sulfanyde^^ai^ti^icj giống PẠBẠ(paminọbenzoni^ acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cán quá trình tống hợp nucleic acid

Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác có quá trình tạo nhân purine làm ức chế quá trình tạo nucleic acid

1.1.4.5 ức chế quá trình trao đôi chat folate.

Folic acid là cơ sở cho sự tông hợp methionine, purine và pyrimidine, từ đó tông hợp nên protein và các acid nucleic của vi khuân Sulfamid và trimethoprim có cấu trúc hoá học tương tựp-aminobenzoic acid (PABA) và folic acid Khi sứ dụng, sulfamid đối kháng cạnh tranh với PABA một tiền chất đề tống hợp folic acid, sẽ gây thiếu purine, nucleic acid Trimethoprim ức chế dihydrofolate reductase ngăn quá trình chuyên hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate (dạng hoạt động cúa folic acid), làm cho sự hoạt động cùa tế bào bị rối loạn

1.1.5 Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh.

Những năm 1940 - 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim cứa việc nghiên cứu CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như : gramixidin tiroxidin do Rene

Jules Dobos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman phát hiện nãm 1941, erythromycin do Gurre phát hiện năm 1952 Cùng với việc phát hiện ra các CK.S mới, công nghệ lên men sàn xuất CKS cũng ra đời và dần được hoàn thiện [21 ].

Ngay từ những năm 1950 CKS đã được nghiên cứu sứ dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng CKS thu hút được sự quan tâm cùa các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên the giới.Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vần diễn ra nhanh chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp lại nhiều nước trên the giới vẫn liên tục phát triển được hàng loạt các CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiền

Năm 1999 một chất kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh Đó là kháng sinh loposomal HA - 92, được tách từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL - 312.Năm 2003, nhiều ng^c ựêp thế.giợi ^ẫn tiệp tục phát, hi^n được hàng loạt các CKS mới Tại Nhật Bán, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã được tách chiết từ

xạ khuấn Streptơmycessp TP - A0356 bằng phương pháp sắc ký cột CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển cùa nam Aspergillus fumigalus và Candida

albicans. Ngoài ra chất này còn có khá năng chống lại các tế bào ung thư [5].Năm 2007, tại Hàn Quốc dã phân lập được loài xạ khuân Streptomyces sp C684 sinh CKS laidlomycin, chat này có thế tiêu diệt cà những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuấn kháng vancomycin [28]

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hồ trợ cúa nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt được những thành tựu rực rỡ Đe sàn xuất CKS con người không chi tìm kiếm những chúng vi sinh vật sinh CKS từ tự nhiên mà còn cái tạo chúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gcn, gây dột biến định hướng, chọn dòng gene sinh tồng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần đế tạo ra các chủng có hoạt

tính kháng sinh cao đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngan [10], [26]

1.2 Tong quan về xạ khuân Streptomyces.

1.2.1 Vai trò của xạ khuân trong tự nhiên

Xạ khuấn (Actinobacteria) thuộc chúng vi khuấn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất nước, rác, phân chuồng, bùn thậm chí

cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nam mốc không phát triền được

Theo Waskman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9-45% tổng số vsv [22]

Sự phân bố cùa xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng

có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn

có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm

Trong quá trình trao đồi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ như các loại vitamin nhóm B (Bl, B^2j)^n\0k^ acid hựụ cơ như acid lactic, acid acetic; acid amin như acid glutamic, metionin tryptophan, lizin

Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuấn là khá năng hình thành chat kháng sinh 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuân sinh ra [3], Trong sô dó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actìnoplanes,

Streptoverticillium, Streptosporangium Điều đáng chú ý là các xạ khuân hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi

Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước Dùng đe sàn xuất nhiều enzym như proteaza amylaza, xenluloza một số axit amin và axit hữu cơ

Một số xạ khuẩn có thề gây bệnh cho người, động vật Các bệnh này được gọi tên chung là Actinomycosis [11]

1.2.2 Giới thiệu về xạ khuẩn Streptomyces.

Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và Hcnrici đặt tên năm 1943 [27]

Đường kính sợi xạ khuẩn khoáng 1 - 10 ụ 111, khuấn lạc thường không lớn và

có đường kính khoáng 1 - 5 mm Khuấn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất,

Bề mặt khuẩn lạc thường được phú bới khuẩn ti khí sinh dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước

Xạ khuấn chi Streptomyces sinh sàn vô tính bàng bào từ Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tứ và chuồi bào tứ Cuống sinh bào tứ có những hình dạng khác nhau tùy loài: thang, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng Bào tư được hình thành trên cuống sinh bào tứ bang hai phương pháp phân đoạn và cat khúc Bào tứ

xạ khuấn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 pm Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào (ứbiêuhiện eáe d^^^^Viện Đại h?c Mở Hà Nội

Màu sac cúa khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tìiy theo nhóm

Streptomyces, màu sắc này cũng có thế biến đối khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau Vì vậy mà ủy ban Quốc te về phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuấn và phương pháp chung đề phân loại nhóm vsv này

Các loài xạ khuân thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gr (+), hiếu khí, dị dường các chat hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là 25-30°C, pH tối ưu 6,5 - 8,0 Một số loài có thế phát triền ờ nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn

ưa nhiệt và ưa lạnh) Chi xạ khuấn này có khá năng tạo thành số lượng lớn các CKS

ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật [23]

Một trong những tính chất cùa các CKS có nguồn gốc từ vsv nói chung và từ xạ khuân nói riêng là có tác dụng chọn lọc Mỗi CKS chi có tác dụng với một nhóm vsv nhất định Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ khángkhuẩn rộng Khá năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc diêm quan trọng đô phân loại xạ khuân.

Có nhiều quan điềm khác nhau về khá năng hình thành CKS Một số tác già cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho vsv tồn tại trong môi trường tự nhiên, số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi trường dinh dường Hau hết các tác giá cho rằng kháng sinh là sán phâm chuyến hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bang cùa chu kỳ sinh trường [14]

Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và vsv sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chi theo một số con đường nhất định

- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzym

- CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóạ sơ cấp khác nhau

- CKS được hình thành bang con đường polyme hóa các chất chuyến hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đôi qua các phân ứng enzym khác

Nhiều chủng xạ khuân có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tong hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gcnc, ngoài các gcnc chịu trách nhiệm tống hợp CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tồng hợp các tiền chat, enzym và cofactor

1.3 Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP.

1.3.1 Dặc diem nuôi cấy.

Năm 1996 chung Streptomyces.spKCTC 0041BP có khà năng tạo CKS Dihydrochalcomycin được Kim và cs phân lập tại Hàn Quốc Đặc điểm nối bật cùa

xạ khuân là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngàn (chì trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi mánh, đường kính thay đối trong khoảng 0,2 - 2 pm

Xạ khuấn Streptomyces sp.KCTC 0041BP sinh sân vô tính bằng bào tứ Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống bào tử và chuồi bào tử Cuống sinh bào tử có hình thắng hoặc lượn sóng (Rf - Rectiflexibiles) Bào tứ được hình thành trên cuống sinh bào tử bang hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc Bào tử có hình bẩudục, hình lăng trụ hình cầu với đường kính khoáng 1,5 pm Bề mặt bào tử trơn nhẵn Sm (Smooth) Màng bào tư có nếp nhăn trên môi trường ISP2.

Khuẩn lạc thường không lớn, có đường kính khoảng 1 - 5 mm Khuẩn lạc ran chác, mọc đâm sâu vào cơ chất Be mật khuẩn lạc thường dược bao phú bời khuẩn ti khí sinh dạng nhung, dày (Hình 1) Nó có khá năng phát triển tốt trên môi trường ISP1 ISP2, ISP4 Gause 2 và R2YE, đặc biệt là môi trường ISP2 và R2YE

Mớ Hà Nội

Hình 1.1 Khuân lục cùa chúng Streptomyces sp KCTC 004IBP trên

môi trường ISP2.

Hình 1.2 Hình dạng KTKS và KTCC cùa chúng Streptomyces sp KCTC 004 IBP

phóng đại (X 4.500-15.000).

1.3.2 Dặc diem sinh lý, sinh hóa.

Chúng Streptomyces sp KCTC 004IBP có thê sinh trường trong dài nhiệt độ

25 - 32 °C, thích hợp nhất ở 28 - 30 °C và hoàn toàn không phát triển được ở 37 °C hoặc cao hơn

Chúng phát triển tốt ở khoáng pH = 6 -ỉ- 9 Ở pH< 6 hoặc pH > 9 thì chúng phát triền kém hoặc không phát triền Chúng Streptomyces sp KCTC 0041BP hình thành sac to melanin trên môi trường thạch tyrosine (ISP-7)

1.3.3 Khá năng kháng khuẩn với một số vi sinh vật kiếm định.

Xạ khuẩn Streptomyces sp.KCTC 004IBP sinh kháng sinh có khá năng ức chế

vi khuẩn Gr (+) và vi khuẩn Gr (-) Tuy nhiên, kháng sinh này có khá năng ức chế cao hơn đối với vi khuẩn Gr (+) Điều này được giài thích bời vi khuẩn Gr (-) có lớp thành te bào dày và nhiều lớp hơn so với vi khuẩn Gr (+), vì vậy chúng ít chịu ành hưởng bời kháng sinh hon^ Tropg; e^ic vi khu^n Gr+ đựợc nghiêỉỊ cứu, khà năng ức chế vi sinh vật của xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 004IBP lên vi khuẩn Bacillus

cereus là lớn nhất (D = 21.33 mm), tiếp theo là vi khuan Bacillus subtilis (D = 19,50 mm) 11 ]

1.3.4 Phân loại.

Khi dối chiếu với các khóa phân loại khác nhau, chúng Streptomycessp.K.CTC 004IBP rất giong với loài Streptomyces bikiniensis Theo khóa phân loại cứa Waksman năm 1961, loài này thuộc nhóm cuống sinh bào từ thắng, không phân nhánh; trong môi trường đạm đều có sắc tố màu nâu sẫm tới màu đen melanin dương tính; khuấn ty khí sinh từ màu trắng lới màu xám

1.4 Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041 bp đã được đột biến GerMIII.

Gen GerMIII thuộc nhóm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng sinh Dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuân Streptomyces sp KCTC 004IBP dã được đãng bàn quyền trên gen bank với mã số AY 118081

Trong 31 gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp gen GerMIII được dự đoán với chức năng là mã hóa, tông hợp enzyme 2-O-methyltransferase Enzyme 2- O-methyltransferase (GerMIII) cùng với 3-O-methyltransferase (GerMIII) sẽ xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí C2, C3 tạo gốc đường D-mycinosc.Theo kết quà nghiên cứu, hoạt tính và chức năng của gen GerMIII đã được chứng minh bàng phương pháp đột biến gen (tiếp hợp gen) đế tạo chủng xạ khuấn đột biến không có chứa gen GerMlII.

Tiếp tục phân tích đánh giá sàn phâm trung gian từ chùng xạ khuấn đột biến gen GerMIlI, tách chiết và tinh sạch hợp chất có hoạt tính sinh học mới

1.5 Tổng quan về kháng sinh dyhidrochalcomycin.

Macrolide là kháng sinh dược sừ dụng đế chống nhiều vi khuẩn là cầu khuân Gr+ hiếu khí và kị khí, tác dụng tốt với vi khuẩn nội bào (Mycoplasma Rickettsia,

Chlamydia), điều trị nhiễm trùng gây ra bời Haemophilus influenzae, nhiễm trùng đường hô hap và nhiễm trùng mô mềm Kháng sinh macrolide là sán phẩm tự nhiên chiết xuất lự x^khuẩn phổ kháng kỊtụẩn rộng hơn so vớikháng sinh penicillin, có khá năng tham sâu vào O mù nên là một chọn lựa tốt cho phòng ngừa nhiễm khuấn hô hấp, có tác dụng hiệp lực với polypeptide, sulfamid Nhóm macrolide có độc tính rất thấp, thường chi sốt, nôn mửa, dị ứng da.Kháng sinh macrolide cấu tạo gồm một vòng lactone lớn (có từ 12-16 nguyên

tử C) gan với các phân từ đường bằng các liên kết glycosidic Dựa vào so nguyên tứ

c trong vòng lactone, kháng sinh macrolide được chia thành 3 nhóm: macrolide 12C, 14C và 16C Trong đó, kháng sinh nhóm macrolide 16C có vai tròquan trọng nhất với nhiều ưu điếm vượt trội hơn so với macrolide 12C và 14C vì kháng sinh nhóm này chưa xuất hiện hiện tượng kháng thuốc cúa vi khuấn [22]

Có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rang kháng sinh thuộc nhóm macrolide có khả năng ức chế cạnh tranh trung tâm hoạt động cúa enzyme petidyltransferase của tế bào vi khuẩn như carbomycin, spiramycin, chalcomycin nhưng duy nhất chí có kháng sinh macrolide 16C có thề liên kết trực tiếp với trung tâm hoạt động cúa enzyme peptyltransfcrase và từ dó bât hoạt quá trình tông hợp protein của vi khuân

Với nhiều ưu điếm như vậy kháng sinh nhóm macrolide 16C là nhóm kháng sinh đang được nồ lực nghiên cứu bời rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới với mục tiêu chính là: tạo ra các kháng sinh không bị ảnh hướng bời cơ chế kháng thuốc của vi khuân và từ đó nghiên cứu và phát triên nhóm kháng sinh polyketidc synthase (PKS) thế hệ mới.

1.5.1 Cấu trúc cùa dyhidrochalcomycin.

Dihydrochalcomycin có công thức phân tử là (C35H58O14), tan trong Aceton, Benzen, Chloroform, Ethylacetat, Methanol, không tan trong nước và n - Hexan (Kimvàcs, 1996)

Dihydrochalcomycin thuộc nhóm kháng sinh macrolide 16C, là sán phẩm trao đôi chât bậc 2 của chúng xạ khuân Streptomyces sp KCTC 004IBP được tách chiết lần đầu tiên và xác định cấu trúc năm 1996

Mycinose

Dihydrochalcomycin

Hình 1.3 Cấu trúc cùa Dihydrochalcomycin 119].

về cấu trúc, kháng sinh dihydrochalcomycin cấu tạo gồm 3 thành phần chính: Trung tâm là macrocylic lacton, phẩn trung tâm được gắn với 2 gốc đường khứ là D-mycinose và D-chalcose lần lượt tại vị trí C20 và C5 thông qua cầu nối O- glycosydic Hai gốc đường này tham gia tạo tính tan và tính gắn với đích tác dụng thuốc có vai trò vô cùng quan trọng trong việc thê hiện hoạt tính sinh học trong các chất chứa nó và trong kháng sinh này (Ta Thi Thu Thuy và cs, 2008) [ 14|

1.5.2 Vai trò và hoạt tính sinh học.

Qua nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, kháng sinh dihydrochalcomycin đã biêu hiện hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh có thế ức chế và tiêu diệt cá vi khuấn Gr' và Gr+ Đã phân lập thành công chung xạ khuan Streptomyces sp KCTC 004IBP tạo

ra chat kháng sinh này, đồng thời cấu trúc hóa học cùa kháng sinh này cũng được xác định bời nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc, kháng sinh này được xác định là chất dần xuất của kháng sinh chalcomycin đã được xác định trước đó bởi nhóm nghiên cứu khác [15],[20], Mặc dù toàn bộ cơ chế tác dụng cúa dihydrochalcomycin chưa được nghiên cứu hoàn toàn đầy đú nhưng một số nghiên cứu đã khẳng định hoạt tính sinh học cũa dihydrochalcomycin hoàn toàn tương tự như hoạt tính cùa kháng sinh chalcomycin và mycinamycin [18]

Nghiên cứu về cấu trúc tinh the phóng xạ đê xác định cơ chế hoạt động cúa kháng sinh, nhóm của Hansen đã chứng minh được cấu trác nhân macrocyclic lactone cúa kháng sinh này hình thành phức hệ và gắn với tiểu phần lớn cúa ribosome vi khuẩn tại điếm tách chuồi polypeptide ra khói tâm hoạt động cùa enzyme peptidyltransferase Tìr đó kháng sinh này có hoạt tính ức chế sinh tống hợp

Viên Đại học Mớ Hà Nội

1.5.3 Các nghiên cứu về dihydrochalconiycin.

1.5.3.1 Lập thư viện gen và giải trình tự nhóm gen sinh tông hợp dyhidrochalcomycin.

Qua thời gian nghiên cứu cấu trúc dihydrochalcomycin, kháng sinh này dược xác định cấu trúc bằng phương pháp phô cộng hường từ hạt nhân (NMR - Nuclear Magnetic Resonance) và được phân loại thuộc nhóm kháng sinh PKS loại I Nhóm nghiên cứu đã tách và lập được thư viện gen, tách được nhóm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.KCTC 004IBP Toàn bộ nhóm gen tham gia sinh tống hợp có chuồi trình tự là 75,5kb đã được xác định trong đó có chứa 23 ORFs chứa thông tin di truyền, mã hóa cho các gen tham gia con đường sinh tồng hợp dihydrochalcomycin Đồng thời các gen này cũng được dự đoán cấu trúc (Báng 1.1) Trình lự các gen này đã được đăng bàn quyền trên GenBank với mã số AY118081 [II]

Băng 1.1 Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng họp

dihydrochalcomycin.

Tên Số amino acid Dự doán chức năng trong nhóm gen sinh tồng hợp

Gerl 608 Transferase protein

Gcr2 684 Hypothetical protein

Ger3 331 Hypothetical protein

Gcr4 308 Conserved hypothetical protein

GerA 334 Oxidoreductase

GerB 381 3,4-dehydratase like protein

GcrMI 271 O-mcthyltransferase

GerN 485 NDP-4,6- dideoxyhexose 3,4-enoyl reductase

GerR 823 Beta glucosidase

GcrPI 401 Cytochrome P450 hydroxylase

GerPlI 407 Cytochrome P450 hydroxylase

GerG 274 Type 11 thioesterase

GerD 323 dTDP-glucose 4.6- dehydratase

GerE 295 Alpha-D-glucose - 1-phosphate thymidyltransferase

GerS3 3734 PKS[M4(KS,AT, KR* ACP) M5(KS, AT DH ER KR CP1GerS4 1618 PKS [M6(KS.AT.KR.ACP)J

GerS5 1357 PKS (M7(KS,AT.ACP), TEI]

GerY 404 NDP - hexose-3,4-isomerase

GerTll 425 Glycosyltransferase

GerK2 248 Post-PKS reductase

Ger29 580 Putative transcriptional regulator

1.5.3.2 Tách và dự đoán chức năng nhóm gen tham gia sinh tổng hợp đường chalcose và D-mycinose.

D-Các gen tham gia sinh tống hợp đường khứ D-chalcose và D-mycinose đã được xác định và giãi trình tự lừ pGERI-5 cosmid So sánh độ tưong đồng về trình

tự các chuồi amino acid cùa các gen trong cosmid với trình tự amino acid cũa các gcn đã biết trên ngân hàng gen thế giới GcnBank Các gcn tham gia sinh tổng hợp 2 gốc đường khứ này đã được dự đoán cấu trúc, từ đó dự đoán được con đường sinh tống hợp gốc đường này.

Trong con đường sinh tổng hợp, dTDP-4-keto-6-deoxyglucose là gốc đường trung gian cho quá trình tong hợp cả 2 gốc đường chalcose và mycinose, được tồng hợp từ glucose-1-phosphate với hoạt tính xúc tác của các enzyme GerD có chức năng là dTDP-glucose synthase và GerE có chức năng là dTDP-glucose 4,6- dehydartase

Quá trình sinh tống hợp đường D-chalcose bẳt đầu từ gốc đường trung gian 4- kcto-6-deoxyglucosc với hoạt tính xúc tác của các enzyme 3,4-isomcrase (GcrY) đô tạo đồng phân, tiếp theo là phàn ứng loại nhóm OH bới 3,4-dehydratase (GerB) và phàn ứng khứ của enzyme 3,4-enoylreductase (GerN) để tạo ra 3-keto-4.6- dideoxygluco.se Sán phẩm tại vị trí 3-keto sẽđược chuyển thành 3'-OH nhờ enzyme 3-ketoreduc^ev dTDP-^,6-(^ideoxy glucose T'ếp đó’ gốcđường này được chuyến đến nối với nhân macrolide tại vị trí c5 nhờ hoạt tính xúc tác cùa chalcosylglycosyltransferase (GerTII) và cuối cùng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí Ọí nhờ hoạt động cùa enzyme O-methyltransferase (GerMI) tạo gốc đường D-chalcose

Gốc đường D-mycinose đã được nghiên cứu trong cấu trúc kháng sinh tylosin

vì vậy con đường sinh tông hợp đã được chứng minh trong các nghiên cứu vê kháng sinh này [2] Phân ứng sinh tồng hợp được bắt đầu từ dTDP-4-keto-6-deoxyglucose

đế tạo thành dTDP-D-allose với xúc tác cúa hai enzyme 3-epimerase (GerF) và 4- ketoreductase (GerKI) Tiếp theo là phán ứng gán gốc đường allose vào nhân macrolacton tại vị trí C2|) nhờ hoạt tính xúc tác cúa glycosyltransferase (GerTI).Cuối cùng hai enzyme 2-0-methyltransferase (GerMIII) và 3-0-methyltransferase (GerMlI) xúc tác phàn ứng methyl hóa nhóm OH tại vị trí c2, Cj tạo gốc dường Đ- mycinose

Bước cuối cùng hoàn thành cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin với hoạt động cùa enzyme hydroxylase (GerPI)xúc tác gắn nhóm OH vào vị trí Cj, và enzyme epoxidase (GerPII) với hoạt tính tạo vòng lacton tại vị trí C|2-C|3 cũa vòng dihydromacrolacton [ 10].

Hình 1.4 Dự đoán con đường sinh tổng họp gốc đường khử và bước cuối hoàn

thành câu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin [10J.

1.5.3.3 Sinh tổng họp dTDP-6-deoxy-p-D-allose, chứng minh hoạt tính của dTDP-4-keto-6-deoxyglucose reductase (GerKI).

Trong nghiên cứu này nhóm đã chứng minh hoạt tính và vai trò cùa gen GerKI trong sinh tông hợp D-mycinose GerKI mã hóa cho enzyme 4-kctoreductase, tham gia phân ứng xúc tác chuyền gốc đường 4-keto-6-deoxyglucose thành 6-deoxy-D- allose Cùng với kết quà này sán phâm được tạo thành dó là dTDP-6-dcoxy-D- allose đã được xác định cấu trúc bang phân tích NMR và HPLC (sắc ký lóng hiệu năng cao) Kết quà nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học rất quan trọng bởi vì đây là

đường khử hoàn toàn mới lần đầu tiên được tồng hợp nhờ phản ứng enzyme invitro

và nhờ đó đã tìm ra phương pháp sinh tống hợp một gốc đường quan trọng [10],

1.5.3.4 Chứng minh hoạt tính cùa gen glycosyltransferases GerTl và GerTll bằng phương pháp gây đột biến gen.

Theo kết quà nghiên cứu hoạt tính và chức năng cùa gen GerTI và GerTII đã được sáng tó bàng phương pháp đột biến gen đế tạo chúng đột biến không có chứa GerTI và GerTII Chức năng cúa gen này là mã hóa cho sinh tống hợp enzyme glycosyltransferase Các enzyme này tham gia vận chuyến và gắn gốc đường mycinose

và chalcose vào nhân macrolacton Phân tích đánh giá sán phẩm trung gian từ chúng đột biến, nhóm nghiên cứu còn chứng minh được bước cuối cùng cũa quá trình hình thành kháng sinh và thu được hợp chất có hoạt tính sinh học mới [ 10J

1.5.3.5 Nghiên cứu biếu hiện gen GerF trong nhóm gen sinh tong hợp gốc đường khứ dTDP-6-deoxy-D-aỉlose.

Ket quá nghiên cứu biếu hiện gen GerF trong tế bào vi khuẩn E. coli

BL21(DE3)đã chứng mipb họạặ ựph hóa qh,^ enzyme keto-6-deoxyglucose 3-epimerase, xúc tác tạo đồng phân quang học chuyển vị trí -

dTDP-4-OH ở vị trí C ị cùa đường dTDP-4-keto-6-deoxyglucose, tham gia vào chuyển hóa đường dTDP-4-keto-6-deoxyglucose thành đường dTDP-6-deoxy-D-allose trong quá trình sinh tống hợp đường khứ D-mycinose trong cấu trúc kháng sinh

dihyđrochalcomycin Ket quả enzyme GcrF được biếu hiện thành công trên E coli

BL21 (DE3) có khối lượng phân tử là 38kDa đồng thời xác định được điều kiện thích hợp đế biểu hiện gen GerF và enzyme này được sinh ra ờ dạng tan là ờ 26°c, trong 8h, nồng độ IPTG lOmmoll 10]

1.5.3.6 Nghiên cứu gây đột biến gen gerMl mã hóa cho enzyme

của chùng xạ khuân Streptomyces sp.KCTC 0041BP bằng phương pháp tiếp hợp.

methyltransfera.se

Trong kết quá nghiên cứu này đã chứng minh dược chức năng cùa gen gcrMI trong con đường sinh tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin của chùng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 004IBP Chức năng cùa gen gerMl là mã hóa sinh tông

hợp enzyme O-methyltransferase, xúc tác phán ứng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí của đường dTDP-4.6-didcoxyglucose tạo gốc đường D-chalcose trong cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin Kết quá tạo được vector đột biến gen gerMI trong vector pKCl 139 và biến nạp thành công vào tế bào E coli ET 12567/pUZ8002[ 14J

1.5.3.7 Nghiên cứu tạo đột hiến gen mã hóa cho enzyme 2-O-methyltransferazữ (gen gerMlll) băng phương pháp tiếp hợp trên xạ khuân Streptomyces sp KCTC 0041BP.

Ket quá đã tiếp hợp chuyến gen Plasmid pKC 1139 chứa đoạn gen đột biến UM3 - NeoR - DM3 vào tế bào xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041 hoang dại trên môi trường MS agar thành công Sàng lọc được các chúng xạ khuẩn trên môi trường R2YE có bô sung kháng sinh Neo và Apr đê tạo chúng có trao đôi chéo đơn

và trao đổi chéo kép

Kết quà tạo được vector đột biến gen gerMlII trong vector pKCl 139 và biến nạp thành công vào tế bào E coli ET 12567/pUZ8002f 131-

1.5.3.8 Bước đầu ngl^ê-Ịi.c^ụ píc^.chiẹt vày^iẹn^ tra sận phàm kháng sinh của chúng xạ khuan Streptomyces sp KCTC 004 IBP.

Nhóm đã bước đầu tách chiết thành công AND tổng số của chùng xạ khuấn

Streptomyces sp KCTC (X141BP sau đột biến Đã sàng lọc được các chủng M3-1-

10, M3-8-21, M3-3-13 có xảy ra quá trình trao đối chéo kép làm mất gen gerMHI bang phàn ứng nhân gcn PCR thành công với các cặp mồi đặc hiệu Giài trình tự gen chứng minh chúng xạ khuấn đã đột biến gen ger MII thành công Bước đầu chứng minh được chức năng cùa gen ger Mill trong con đường sinh tống hợp kháng sinh dihydrochalcomycin cúa chúng xạ khuân Streptomyces sp KCTC 0041BP

1.6 Đại cương về gen gerMIII (2-O-niethyltransferase).

Gen gerMIII thuộc nhóm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin từ chúng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 004IBP Toàn

bộ nhóm gen sinh tong hợp có chuồi trình tự là 75.5kb , trong dó có 23 ORFs chứa thông tin di truyền mã hóa các gen tham gia vào con đường sinh tống hợp kháng