Nghiên cứu khả năng đối kháng nấm bệnh ở cây tiêu của một số vi khuẩn được phân lập từ đất trồng tiêu tại tây nguyên

Tuy nhiên, biện pháp này lại có nhiều mặt tiêu cực, ví dụ như các loại thuôc hóa học dùng đê trừ nấm cho cây chứa rât nhiêu thành phân độc hại cho môi trường, cho con người, gây ảnh hưởn

Trước hết, tôi xin gừi lời cám ơn đến PGS TS Phạm Việt Cường, viện trướng Viện nghiên cứu KH Mien Trung, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, thực hành thí nghiệm trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin bày tó lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc, ThS Trần Thị Hồng và các anh chị Phòng Công nghệ sinh học, viện Hóa sinh biến và Trung tâm sinh học phân tứ Nghĩa Đô (Viện nghiên cứu KH Miền Trung) đã tận tình chi báo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.

Tôi cũng xin cám ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại Học Mớ Hà Nội, những người đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian tôi học tập tại trường.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cám ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tồi trong quci trình họe tựp vh nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 4 tháng 5 năm 2015

Sinh viên.

Nguyễn Hồng Hạnh.

STT CHỦ VIẾT TÁT TÊN DÀY DỦ

10 NBCI National Biological Control Institute

Băng 2.1: Tên mẫu và địa điếm lấy mẫu 17Băng 2.2 : Trình tự và thông số cặp mồi đế khuếch đại gen 16S rRNA cho vi khuấn 18Bảng 2.3 : Thành phần phản ứng PCR cho vi khuần 22

Bảng 3.1: Khá năng kháng nam F.oxysporum cùa các chủng vi khuẩn 24

Bàng 3.2 Khả năng cùng sinh trưởng trên môi trường MPA của các chúng vi khuấn tuyển chọn 27

Băng 3.3: Khả năng kháng nấm R.solani của các chúng vi khuấn 28

Bâng 3.4 Khả năng cùng sinh trường trên môi trường MPA cùa các chúng vi khuẩn tuyến chọn 30Bảng 3.5: Một số đặc điếm hình thái cùa các chúng đối kháng 31Bảng 3.6: Ket quá xác định tỷ lệ A260/A280 và nồng độ ADN (pg/ml) của các chủng

vi khuẩn nghiên cứu 33

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Hình 1.1: Triệu chứng cây Tiêu mắc bệnh chết nhanh 8

Hình 1.2: Triệu chứng cây ticu mac bệnh chết chậm 9

Hình 1.3: Triệu chứng cây cà phê bị bệnh thối rễ tơ 10

Hình 1.4: Triệu chứng cây cà phê bị bệnh thối rề cọc 11

Hình 3.1: Khă năng đối kháng F.oxyporum cúa các chúng vi khuấn phân lập 25

Hình 3.2: Hình thái cùa 4 chúng vi khuẩn đối kháng nấm F.oxyporum 26

Hình 3.3: Khá năng đối kháng nam Rhizoctonia solani của các chúng vi khuân phân lập 29

Hình 3.4: Hình thái của các chùng vi khuẩn phân lập đối kháng với nấm R.solani.29 Hình 3.5: Điện di đồ ADN tống so cúa 5 chúng vi khuấn nghiên cứu 33

Hình 3.6: Điện di đồ sán phẩm PCR cùa 5 chùng vi khuẩn VK5 CM5crk, VK10 CM4crk VK5 CS|trk, BX 101 CS]trk.CF III EHjcd 34

Hình 3.7 Kết quả so sánh trình tự 16S rADN của chùng VK10 CM4 CrK bàng BLAST 35

Hình 3.9: Kết quíj-ỊSft|.sệij|i tr'mh tự 16S rApN cua chúng Ỵ^5CM5 CrK bàng BLAST : ’ ' 37

Hình 3.10: Cây phát sinh chúng loại cúa VK5CM5 CrK 37

Hình 3.11: Kết quà so sánh trình tự 16S rADN cúa chủng Vk5CSl TrK bàng BLAST 38

Hình 3.12: Cây phát sinh loài cùa chùng VK5CS1 Trk 39

Hình 3.13: Ket quả so sánh trình tự 16S rADN của chủng Bx-101 CS|trk bang BLAST 40

Hình 3.14: Cây phát sinh chúng loại chúng Bx-101 cs,tfk 40

Hình 3.15: Kết quả so sánh trình tự 16S rADN cùa chúng Bx-101 CS|trk trên BLAST 42

Hình 3.16: Cây phát sinh chúng loại chúng CFIII EHỵcđ 42

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẢT

DANH MỤC BÁNG

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐÒ THỊ

MỤC LỤC

MỎ ĐÀU 1

CHUÔNG 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Dặc điểm của một số vi nấm gây bệnh ỏ' thực vật 3

1.1.1 Khái quát về nấm bệnh 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, cơ chế gây bệnh và biếu hiện của Fusarium oxysporum 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, cơ chế gây bệnh và biếu hiện cúa Rhizoctonia solani 5

1.2 Tổng quan về cây Tiêu 6

1.3 Một số bệnh chính trên cây Tiêụ\ Ị Ị^<; VU»'-ị'k4"\v>t 7

1.3.1 Bệnh chết nhanh 7

1.3.2 Bệnh chết chậm 8

1.3.3 Tuyến trùng 9

1.3.4 Bệnh thối rề tơ (Tuyến trùng và nấm Fusarium spp., Rhizoctonia spp) trên cây cà phê 10

1.3.5 Bệnh thối rễ cọc (Tuyến trùng Pratylenchus coffea và nấm Fusarium spp) trên cây cà phê 10

1.4 Tinh hình nghiên cứu về các loại vi sinh vật gây hại cho tiêu và biện pháp phòng trừ trong và ngoài nước 11

1.4.1 Tinh hình nghiên cứu về các loài vi sinh vật gây hại cho tiêu và biện pháp phòng trừ ngoài nước 11

1.4.2 Tinh hình nghiên cứu về các loài vi sinh vật gây hại cho tiêu và biện pháp phòng trừ trong nước 13

CHƯƠNG 2: VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúu 17

2.1 Đối tượng, vật liệu, hóa chất và thiết bị 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cửu 17

2.1.3 Hóa chất, thiết bị và môi trường nuôi cấy 18

2.2 Phưoug pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 20

2.2.2 Phương pháp nhuộm Gram 20

2.2.3 Phương pháp đục lỗ xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch nuôi 21

2.2.4 Phương pháp sinh học phân tử 21

2.2.4.1 Quy trình tách chiết ADN genom vi khuẩn 21

2.2.4.2 Xác định nồng độ ADN nhờ máy quang phố tử ngoại 22

2.2.4.3 Kỹ thuật PCR 22

2.2.4.5 Điện di ADN trên gel agaroza 22

2.2.4.Ó Xác định trình tự nucleotit của gen 23

2.2.4.7 Xừ lý trình tự ADN và phân tích số liệu bằng phần mềm máy tính 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính đối kháng 24

3.2 Tách dòng và giải trình tụ gen mã hoá 16s rADN cùa các chúng vi khuấn nflr 1011 \ 1211 Đặl HOC MCH-la 1N0I „ 3.2.1 Tách ADN genome từ vi khuẩn 33

3.2.2 Nhân gen 16S ADN riboxom 34

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHÁƠ 46

LÒI CAM ĐOAN 49

Hiện nay, thế giới và Việt Nam quan tâm rất nhiều đến các bệnh ờ cây do vi sinh vật gây ra, bới bệnh cây gây ra những tốn thất rất lớn cho nền nông nghiệp trên toàn thế giới, đặc biệt cho các loại nông sản chú yếu Sản lượng hồ tiêu tại Việt Nam chiếm khoáng 12% tổng sàn lượng nông nghiệp trên thế giới Nấm gây hại thực vật có tới hàng chục ngàn loài, vi rút có tới hơn 1000 loài và 600 loài vi khuân gây bệnh thực vật Thiệt hại do nấm hại cây chiếm khoảng 80% tống thiệt hại mùa màng, trong đó bệnh do Fusarium, Rhizoctonia solani gây ra chiếm tỷ lệ tương đối lớn Đây là các tác nhân chú yếu gây nên bệnh chết héo, tắc mạch dẫn và thoi rề thối thân ở nhiều loại cây trồng như : lạc, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu, bông [28]

Đối với nước ta nền nông nghiệp chiếm vai trò rất quan trọng trong việc phát triển kinh tế nên bệnh cây là một vấn đề rất được quan tâm Cây trồng không chi cung cấp lương thực thực phẩm, duy trì đời sống cho người dân, mà còn tạo ra hàng hóa có giá trị xuất khấu cao, đặc biệt là các cây công nghiệp như: tiêu, bông, cà phê Tuy nhiên nầng suất và chất lượng cây trồng đã và đang phải đối mặt với rất nhiều vấn đề hết sức khó khăn, đặc biệt là bệnh do nấm gây ra

Biện pháp được người dân chú yếu sứ dụng đế phòng, tránh và chữa các loại bênh cây là biện pháp hóa học Tuy nhiên, biện pháp này lại có nhiều mặt tiêu cực,

ví dụ như các loại thuôc hóa học dùng đê trừ nấm cho cây chứa rât nhiêu thành phân độc hại cho môi trường, cho con người, gây ảnh hưởng đến đất trong, chất lượng cúa cây trồng và chi phí cao Ngoài ra, sừ dụng lâu dài hóa chất làm cho đất đai bạc màu, ánh hưởng tiêu cực tới các sinh vật có ích, tạo ra các loại sinh vật gây hại kháng thuốc, kết quá là việc sản xuất nông nghiệp rơi vào tình trạng khó khăn Đặc biệt là khu vực Miền Trung, cây tiêu và cây cà phê thường bị thối cố rễ do

Fusarium oxysporum, R solani, Phytophthơra và một số tác nhân khác [ 1 ].

Đế có thề khắc phụ những vẫn đề do thuốc hóa học gây ra, hiện nay các nhà khoa học đã chú ý đen một nguồn tài nguyên lớn hơn - nguồn tài nguyên vi sinh vật hữu ích, có tiềm năng trong bào vệ môi trường sinh thái Việc ứng dụng các vi sinh vật hữu ích không chi giúp đem lại hiệu quá tiêu diệt nguồn bệnh cao, an toàn, sàn

thái, mà còn giảm phẩn lớn lượng thuốc hoá học sử dụng.

Tây Nguyên là vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa với đặc trưng là nóng ấm Với lợi thế về đất đai và khí hậu, Tây Nguyên là vùng có thể phát triền nhiều loại cây công nghiệp và cây ăn quà có giá trị kinh tế cao như cà phê, ca cao 110 tiêu, sầu riêng Tuy nhiên, ngoại trừ cây cà phê thì đây cũng là các cây rất mẫn cảm với bệnh do nấm Phytophthora gây ra Hiện người dân cùa các vùng trồng cây công nghiệp chú yếu sứ dụng hóa chat đế phòng và chống bệnh cho tiêu, cà phê Mặc dù hiệu quá chữa bệnh cao, nhanh chóng nhưng cũng dề lại những tác hại không lường cho môi trường, ánh hưởng tới chất lượng xuất khau của sàn phẩm Vì vậy, biện pháp sứ dụng vi sinh vật đối kháng sẽ là một trong những giải pháp tiềm năng, thiết thực đe có một nền sán xuất nông nghiệp bền vừng [7 ]

Với ý nghĩa thực tiễn trên tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: ’’Nghiên cún khả năng đối kháng nấm bệnh ở cây tiêu của một số vi khuấn được phân lập tù' đất trồng Tiêu tại Tây Nguyên”.

Thư viện Viên Đại học Mớ Hà Nội

Mục tiêu nghiên cứu của Luận văn:

Có được các chúng vi khuân đối kháng nguồn bệnh nấm hại tiêu có tiềm năng

sứ dụng trong thực tế

Nội dung nghiên cứu

Phân lập và tuyền chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính đoi kháng cao với

nam F.oxysporum, R.solani từ đất trồng cây tiêu ờ Tây Nguyên

Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tứ (giái trình tự gen 16S ADN riboxom); nghiên cứu quan hệ phát sinh loài cúa các chùng triển vọng

1.1 Đặc điểm của một số vi nấm gây bệnh 6’ thực vật

Hiện nay có khoảng hơn 80.000 loài nấm được biết có khá năng gây bệnh cho cây trong, phần lớn sống theo kiều bán hoại sinh, trong đó có một vài loài nấm có thể gây hại nhiều loại cây trồng Nấm là sinh vật dị dường, nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống lấy từ các chất hữu cơ, chúng tập trung ờ các tầng đất phíatrên do các chất hữu cơ ờ đây phong phú Nấm chịu tác động

môi trường như: nông độ ion H , chê độ nước, nhiệt độ, câu trúc đât Bệnh do nam

chính của các yếu tố

gây ra rất khó phòng trừ vì chúng có khá năng tồn tại lâu trong đất Hơn nữa, nhiều loại nam có thể phát triển trong khoảng pH rất rộng, từ pH axil cho den pH kiềm cao [4]

Trong các bệnh có nguồn gốc do nấm F.oxysporum, F.solani, Phytophthora

sp là những loài gây thiệt hại nhất cho cây trồng Chúng có khà năng sống hoại sinh, chống chịu với các hoạt động đối kháng của các vi sinh vật trong đất, kết quà

đã dần đến sự gia tăng số lượng bệnh trong điều kiện địa lý, sinh thái khác nhau[7]

1.1.2 Đặc điếm hình thái, sinh lý, Cff chế gây bệnh và biểu hiện của Fusarium oxysporum.

Đặc điếm hình thái, sinh lý cùa Fusarium oxysporum.

Chi Fusarium bao gồm trên 30 loài, trong đó loài F.oxysporum là loài phố

biến và cũng là loài gây bệnh nguy hiềm nhất ờ cây trồng F.oxysporum gây ra hiện tượng tắc mạch dẫn của cây, là nguyên nhân trực tiếp của bệnh thối thân, thối rễ ờ

đoạn sinh trường của cây.

F.oxyporum là loại nấm đa bào phân nhánh, màu sac tản nấm trắng, phớt hồng Trong quá trình sinh sản chúng sinh ra hai loại bào tứ khác nhau: Bào tư hậu

và bào tứ phân sinh Bào từ hậu có màu sẫm, vó dày có hình ovan, được hình thành

từ sợi nấm hay từ bào tứ lớn Bào tử phân sinh có 2 loại: Bào tứ loại lớn: có hình lưỡi liềm hoặc bầu dục, ngắn thăng, hoặc cong nhẹ thường có ba ngăn ngang, 0 màu da cam; Bào tứ loại nhó: dạng đơn bào, hình elip hoặc quà thận, hình thành bọc giá trên cành đơn nhánh, không màu Cành bào từ nhiều nhánh, bào tư phân sinh mọc thành từng cụm 2 đến 3 chiếc trên đinh cành Kích thước tán phụ thuộc vào nhiệt độ Ớ 25°c tàn phụ có kích thước khoáng 3.5cm ờ 30° khoảng 2.8cm Tán có màu nhạt hoặc tím đậm Nấm vẫn có thế mọc được ở 42°c trên các môi trường thông thường Dưới 20°C nấm vần mọc nhưng phát triển chậm Nhiệt độ tối thích là

25 - 30°C, phát triển trong 4-5 ngày và ờ độ ấm rất cao 90-95% [ 17]

Cơ chế gây bệnh và biểu hiện:

F.oxysporum lằ ibặi nấm^phạm vi ký chủ rộng, có mật ộ hầu hết các vùng trồng trọt trên the giới Ở Hawaii, vật chú cùa nấm này là khoai tây, mía, cây họ cà phê, hạt tiêu bông Chúng gây bệnh đố rạp ớ nhiều loại thực vật như cà phê, hạt tiêu, cọ dừa, lúa, cà chua, dưa chuột

Có the khái quát cơ chế gây bệnh cùa F.oxysporum như sau: Sau khi xâm nhập, F.oxysporum lan tràn khắp thực vật nhờ một ống chứa đầy bào tử hoặc sợi khuẩn ty Sợi khuấn ty tiến đến hệ thống xylem, từ đây chúng tiếp tục lan lới hệ thống gân lá, nhờ dòng nhựa, chúng đi tới toàn bộ hệ thống mạch cúa thực vật Nấm phát triển mạnh, ánh hưởng tới việc cung cấp nước và chất khoáng khiến cho lá cây chuyến sang màu vàng, bắt đầu từ rề, thân phía dưới bị thối dan lên phía trên Quá trình héo rũ lan nhanh ngày qua ngày cho đen khi thực vật đố rạp xuống và kết quà

là cây bị chết Biếu hiện rõ nét trong suốt giai đoạn lừ khi cây ra hoa cho đến khi kết trái.[17J

Rhizoctonia solani.

Dặc điêm hình thái, sinh lý của Rhizoctonia solani.

Rhizoctonia solani thuộc bộ nấm trơ (Mycelia sterilia), lớp nấm bất toàn (Fungi imperfect!) Giai đoạn sinh sản hữu tính được gọi là Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk, thuộc lớp nấm đám Basidiomycetes, là nấm ký sinh không chuyên tính, có phô ký chủ rộng [21],

Ở giai đoạn vô tính, nấm phát triển ờ dạng sợi, tạo hạch Sợi nấm khi còn non không màu khi già chuyến sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu Sợi nấm đa bào,

có đường kính từ 8- 13 pm, phân nhánh tương đối thắng góc, chỗ phân nhánh hơi that lại, và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh (Vũ Triệu Mân và Lê Lương

Tề, 1998) R solani có 3 loại sợi nấm: sợi nấm bò (runner hyphae), sợi nấm phân

nhánh (lobate hyphae), và các tế bào dạng chuồi (moniloid cells) (Nguyễn Thị Tiến

Sỹ, 2005) Lúc già, các tế bào tách ra và biến thành hạch Đặc điếm cùa hạch rất thay đổi Hạch nấm khi còn non có màu tráng nhưng khi về già có thể có màu nâu,

nâu đen nâu xám tren VO co long Hạch narrr co hình dạng phức tạp, co khi hình cầu, đáy phẳng bề mặt hạch không trơn mà lồi lõm (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) Đường kính hạch nam từ 1- 6 mm Từng hạch nấm có the liên kết với nhau lại tạo thành hạch nấm to (Ou, 1983) Hạch nấm khi còn non có thể chìm dưới nước nhưng khi già có the nổi lên do tế bào phía ngoài hạch trờ nên rồng (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) Bào từ hậu ít gặp, chi phát sinh khi có độ ấm rất cao Sinh sán hữu tính tạo đăm đơn bào, không màu, hình bầu dục, có từ 2- 4 bào từ đám, hình trứng hoặc hình bầu dục dẹt Ớ nước ta chưa thay dạng sinh sàn hữu tính (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998) Bào từ đảm không có khả năng tồn tại lâu nhưng có vai trò lớn trong sự biến đổi di truyền cùa nấm (Ho Viet Thế, 2005)

Cơ chê gây bệnh và biêu hiện:

R solani xâm nhập ký chủ và gây bệnh mạnh nhất trong điều kiện nhiệt độ tương dối cao (25 - 30°C), ẩm độ 90% đến bão hòa, mưa liên tục Kỹ thuật canh tác: mật độ cây, chăm sóc, phân bón, thủy lợi đều liên quan đến phát sinh bệnh Nấm xâm nhập vào mô cây qua khí khổng hoặc có thố xuyên trực tiếp qua cutin

tối thích 3I°C, độ ấm tương đối 70- 90% (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) Nấm R

solani pho biến ờ nhiều nơi và có thể gây bệnh cho trên 180 loại cây thuộc 60 họ thực vật khác nhau [21]

1.2 Tổng quan về cây Tiêu.

Hồ tiêu ( Piper nigrum L.) thuộc họ Piperaceae, là một loại cây dây leo thân

gỗ lâu năm Hồ tiêu có nguồn gốc từ Ấn Dộ Indonesia Malaysia Nam Mỹ và Tây

Án nhưng cũng được trồng rộng rãi ờ các vùng nhiệt đới

Cây Hồ tiêu [Piper nigrum) được trồng ớ Việt Nam từ thế kỷ 17 nhưng sân xuất hồ tiêu chi thực sự phát triển mạnh từ sau năm 1997 khi giá hồ tiêu trên thị trường tăng nhanh Năm 1998 cà nước có 9.800 ha hồ tiêu, sau 7 năm (2004) đã có 52.500 ha, tốc độ tăng trên 6000 ha/năm, đưa Việt Nam trở thành nước sản xuất, xuất khấu hồ tiêu hàng đầu thế giới (chiếm 35% sàn lượng và gần 50% thị phần thế giới, giá trị xuất khấu niên vụ 2005 đạt 150 triệu USD VPA) Hiện nay, diện tích

hồ tiêu vẫn tiếp tục tăng, năm 2012, cà nước dã trồng trên 58.000 ha, vượt 8000 ha

ini r V ện V lện t)ạí nọc MU Ha ĨNộĩ

so với chỉ đạo cúa Chính phủ

Cây hồ liêu ưa điều kiện khí hậu nống ấm Nhiệt độ thích hợp là 25-28°C, lượng mưa hàng năm yêu cầu vào khoáng 1200-2500mm Tiêu có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau như đất sét pha đất đõ bazan đất xám Đất trồng tiệu cần

có độ dày từ 80-100 cm mạch nước ngầm 2m, kết cấu tơi xốp thành phần cơ giới

từ nhẹ đến trung bình dề thấm và thoát nước và độ chua thích hợp từ 5-6

So với nhiều loại cây công nghiệp, hồ tiêu là cây truyền thong và cũng vừa là cây công nghiệp mũi nhọn của Tây Nguyên Tuy mới phát triền cây hồ tiêu trong vòng 15 năm trờ lại đây nhưng các tinh Tây Nguyên đã nhanh chóng trờ thành vùng sản xuất hồ tiêu lớn thứ hai trong cà nước sau các tinh miền Đông Nam bộ Đak Lắk, Gia Lai, Đắk Nông đang trở thành những vùng hồ tiêu lớn cùng với Phú Quốc, Đồng Nai Bà Rịa-Vũng Tàu Bình Phước ở miền Đông Nam bộ Đen nay, các hộ trồng hồ tiêu ờ các tinh Tây Nguyên đã tăng diện tích cây hồ tiêu lên trên 15.300 ha trong đó có 70% diện tích đã dưa vào khai thác, với sản lượng mồi năm dạt trên 32.255 tấn tiêu hạt Tận dụng lợi thế về tiềm năng đất đai, khí hậu người dân ờ các

chuyển vườn tạp, nương rẫy gieo trồng cây lúa cạn hiệu quà kinh tế thấp sang trồng cây hồ tiêu mang lại hiệu quá kinh tế cao gấp nhiều lần Tại các vùng trọng điểm trong cây hồ tiêu của các tinh Gia Lai, Đắk Lak, Đắc Nông có nhiều hộ gia đình đồng bào các dân tộc đạt năng suất tiêu từ 7 đến 8 tấn tiêu den/ha Niên vụ tiêu vừa qua, giá tiêu hạt tăng cao, nhiều hộ gia đình thu lãi lớn, có gia đình thu trên 1 tý đồng Chính cây hồ tiêu đã góp phần làm thay đối cuộc song từ khó khăn trờ nên đủ

ăn và giàu có cho bao phận người trên vùng đất đó bazan Tây Nguyên |2|.Tuy nhiên hệ lụy tất yếu của việc lạm dụng hóa chất trong sàn xuất hồ tiêu là dịch hại phát sinh tràn lan, nguy hiếm nhất là các bệnh chết nhanh, chết chậm, tuyến trùng, rệp sáp thậm chí có cã bệnh “Tiêu điên” không thế phòng trừ nhiều vườn tiêu đã suy kiệt trầm trọng, tuồi thọ vườn tiêu giám han, thậm chí bị mất trang, hơn nữa tồn dư hóa chất trong sản phẩm là điều khó tránh khỏi Nhiều nghiên cứu gần đây đã khăng định đế bào đam sàn xuất nông nghiệp bền vững nhất là đối với các nước nhiệt đới, cần thiết phái giảm thiểu hợp lý phân vô cơ, đặc biệt chú trọng sứ dụng phân hữu cơ.riiư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

1.3 Một số bệnh chính trên cây Tiêu

Ỉ.3.Ì Bệnh chết nhanh

Nói đến cây tiêu trước hết là nói đến bệnh hại, trong đó quan trọng nhất vẫn là bệnh thối gốc-chết dây hay còn gọi là chết nhanh (Quick wilt, Phytophthora footrot) Sờ dì gọi như vậy là từ khi thấy cây tiêu “buồn”, dây bị héo, xuống lá rồi chuyến vàng, rụng ào ạt chỉ đê lại dây, cành trơ trọi (tất cà các triệu chứng trên diễn

ra trong vòng 7-10 ngày) sau đó cây chết trong vòng vài tuần lễ [16]

Quan sát cây bệnh được nhố lên thì thấy toàn bộ rề bị thối đen nhất là phan cố

rễ, thân sát mặt đất bị thối rã, vó bong ra, có mùi hôi nhẹ Một khi xuất hiện bệnh sẽ làm chết hàng loạt nọc tiêu do đó việc phòng trị rất khó khàn, tốn kém và ít mang lại hiệu quà vì khi triệu chứng biếu hiện ra bên ngoài thì có nghĩa là bộ rễ tiêu đã bị nam tấn công từ 1 - 2 tháng trước

Bệnh thối gốc-chết dây do một loại nấm sống dưới đất, thích ẩm gọi là

Phytophthora parasitica var piperana, nam bệnh này chù yếu phát sinh, phát triển

và lây lan trong mùa mưa, nhất là giai đoạn giữa và cuối mùa mưa Thông thường

nam Phytophthora kết hợp với các loại nấm khác sống trong đất như Pythium,

Fusarium Rhizoctonia cùng tấn công lên tiêu làm cây tiêu chết rất nhanh Nấm bộnh có thể xâm nhập hầu hết các bộ phận cùa cây như lá, rể, thân, nhánh đặc biệt

là các bộ phận nằm trong và sát mặt đất [3]

Vào mùa mưa, mầm bệnh có trong đất được nước ban tung tóe lên trên Thông thường các lá phía dưới thấp bị bệnh trước sau đến các lá phía trên , lá bệnh vàng rụng xuống và tiếp tục chu kỳ lây lan bệnh nhờ nước

1.3.2 Bệnh chết chậm

Ngoài bệnh Chet nhanh trên tiêu can lưu ý đến một bệnh quan trọng khác đó là bệnh “chết chậm”, sở dĩ gọi như thế vì từ khi thấy cây sinh trường chậm, èo uột, xuống lá, đốt rụng, rễ, gốc thối phần mạch dẫn nhựa thân dây có màu nâu đen đến khi cây chết, quá trình này kéo dài vài ba tháng đến cà năm

Bệnh “chết chậm” do một loại nấm sống trong đất gọi là Fusarium oxysporum gây ra, bệnh xuất hiện và gây hại nặng trên những vườn tiêu bị ngập úng, thoát thúy kém, ít thoáng khí, bón thừa đạm Việc phòng trị bệnh chết chậm cũng tương tự như bệnh chết nhanh [3].

1.3.3 Tuyến trùng [828] Viện Đại học Mơ I là Nội

Tuyến trùng là đối tượng dịch hại khá pho biến và gây thiệt hại rất lớn đối với các quốc gia trồng tiêu trên thế giới, chi tính riêng tuyến trùng Meloidogyne spp đã gây thiệt hại dến 16% ở các nước Đông Nam Châu Á (Sasscr, 1979) Có đến 36 loài tuyến trùng kí sinh gây hại đã được báo cáo, trong đó có hai đối tượng quan trọng nhất là: Radopholus similis và Meloidogyne spp (Koshy and Gcctha, 1992) Loài Radopholus similis gây bệnh vàng lá được xem là phổ biến nhất, loài này làm chết 22 triệu trụ tiêu trong suốt 22 năm tại vùng đáo Bangka của Indonesia (Christie, 1957;1959) Ớ Ản Độ loài tuyến trùng này được xác định có liên quan rất chặt chẽ với bệnh héo chết chậm (slow-wilt) với mật so từ

250 cá thể/lg rề (Van der Vecht, 1950; Mohandas and Ramana, 1987b; Ramna

et al., 1987a) Theo Mai (1985), bệnh vàng lá tiêu là do phối hợp giữa loài tuyến trùng này và nấm bệnh gây ra, bệnh này đã giết chết ngành công nghiệp tiêu đen ớ nhiều nơi cúa Indonesia Trên cây tiêu ờ Sumatra của Indonesia mức

độ quẩn thế 2 con/100g đất và 25 con/10g rề được ghi nhận gây bệnh vàng lá (Koshy, 1992)

nấm Pythium sp và Fusarium sp., tuyến trùng chích hút tạo vết thương vùng rễ cây tiêu gây nên các vết thương tạo cơ hội cho nấm Fusarium tấn công rề tiêu [8] Năng suất tiêu sẽ giám nghiêm trọng với sự kết hợp của hai tác nhân tuyến trùng rễ Meloidogyne và virus Các động tác làm cỏ vệ sinh vườn cũng vô tình tạo vết thương cho nấm xâm nhập.

1.3.4 Bệnh thối rễ tơ (Tuyến trùng và nấm Fusarium spp., Rhizoctonia spp) trên cây cà phê

Bệnh xuất hiện trên vườn Cà phê kinh doanh lần kiến thiết cơ băn nhưng chủ yếu là Cà phê kinh doanh Hệ thống rề tơ bị thối và chết dần từ phần chóp rễ làm cây không hút dược nước và dinh dưỡng héo dần rồi chết Trên Cà phê kinh doanh

do có hệ thống rễ nhiều nên cây có biếu hiện vàng lá và chết chậm hơn sơ với cây còn nhó thời kỳ kiến thiết cơ bàn [1,3]

Hình 1.3: Triệu chúng cây cà phê bị bệnh thối rễ tơ

1.3.5 Bệnh thối rễ cọc (Tuyến trùng Pratyỉenchus coffea và nám Fusarium

spp) trên cây cà phê

Bệnh xuất hiện chú yếu trên Cà phê kiến thiết cơ bán trồng lại trên đất khai hoang từ các vườn Cà phê già cỗi hay các vườn Cà phê bị bệnh thối rề tơ Rề cọc cúa cây bị thối và đứt ngang, bộ rễ tơ gần mặt đất phát triển mạnh Do đó cây vàng

lá rất rõ vào cuối mùa mưa, đầu mùa khô Cây bị bệnh rất dỗ nhổ lên bang tay, ờ những cây bị bệnh nặng rề tơ cũng bị thối [1,3]

1.4 Tình hình nghiên cún về các loại vi sinh vật gây hại cho tiêu và biện pháp phòng trừ trong và ngoài nước.

1.4.1 Tình hình nghiên cứu về các loài vi sinh vật gây hại cho tiên và biện pháp phòng trừ ngoài nước.

Có rất nhiều loài vi sinh vật gây hại cho cây tiêu, trong số đó thì nấm

Fusarium spp là loài gây bệnh điển hình nhất Loài này gây ra bệnh tiêu chết chậm cho nhiều nước ớ khu vực châu Á, châu úc Ngoài ra còn có một số loài nam khác

Tại Indonesia, thối chân Phytophthora, được coi là căn bệnh tàn phá nhất cúa hạt tiêu đen, dã dược báo cáo đố gây ra thiệt hại từ 5-10% lượng cây trồng (Kueh, 1990) và lên đến 95% thiệt hại đối với cá nhân nông dân (Manohara et al 2004) Nhiễm trùng đầu cho thấy các tổn thương với những đốm nâu trên lá gần mặt đất, trờ thành fimbriate tôn thương lá cạnh cụ thề Các bệnh thường là không bị nông dân và kỹ thuật viên phát hiện cho đến khi phần trên của cây tiêu xuất hiện triệu chứng lá vàng, héo khi nhiễm trùng đã ở giai đoạn nặng, với hầu hết các rễ bị mục nát và thân ngầm bị ton thương có màu hơi nâu đen Đế ngăn chặn bệnh trên cây Tiêu người ta đã trồng tiêu xem cạnh với cà phê Lợi the cùa việc trồng xen canh

hồ tiêu, cà phê là nông dân cung cấp đù nước cho cà phê và một số ít nước cho tiêu, vì vậy không xảy ra tình trạng ngập úng ở vùng rễ cùa cây, và tỳ lệ cây bị bệnh Phytophthora giảm đáng kề [14]

Việc nghiên cứu tạo các giống tiêu chống chịu bệnh cũng đã được tiến hành Hai loài tiêu p nigrum L và p colubrinum được lai với nhau bằng cách sừ dụng

sâu bệnh tốt hơn so với cây bố mẹ [14],

Ở Àn Độ thành phan sâu hại trên cây hồ tiêu có khoáng 56 loài tấn công lên nhiều bộ phận như rễ, thân, lá, cánh hoa, và hạt Côn trùng hiện diện trong đất gây hại trên rề cây hồ tiêu gồm có sùng đất Holotrichia fissa, mối Coptotermes

curvignathus Holgmt Sùng đất chi thinh thoáng xuất hiện gây hại rễ cây tiêu còn non, và thường gây hại nặng trong các vườn tiêu có trồng xen với một số cây trồng khác, vì vậy hai loại côn trùng này được xem là loài gây hại thứ yếu (Devassahayam, 2000) [12]

Ở Mã Lai, rệp sáp già Ferrisia virgata là tác nhân lan truyền bệnh virus PYMV (Piper Yellow Mottle Virus), cây ớt Capsicum annuum có biểu hiện các lá

bị quăn queo khi được lây nhiễm nhân tạo với hai loài rệp Aphis gossypii và Myzus

persicae đã sống trên cây tiêu bị bệnh (Eng và ctv 1993) Õ Srilanka, theo de Silva (1996) loài rệp sáp già Pianococcus citri có khá năng lan truyền bệnh PYMV Triệu chứng khảm vàng lá cây tiêu là một hồn hợp của PYMV và CMV (Cucumber Mosaic Virus) PYịMỴi duyCpX^c địnhịlà^tácỊ nhân gây bệnh chính, lây truyền bời việc cat ghép, vectơ lan truyền có thế ke thêm là bọ xít lưới Diconocoris distant!

[18,23],

Ở bang Kerala (Àn Độ), hai loại bệnh virus phát triền gây hại trên cây tiêu, dòng virus gây khăm cây dưa leo (cucumber mosaic virus, CMV-Pn) và virus mốc vàng (pepper yellow mottle virus, PYMV) Hai loại virus này làm cho cây sinh trường chậm và cho năng suất kém Bệnh có thế truyền qua dịch cây, các động tác cắt ghép, dụng cụ, và qua côn trùng vectơ như rầy mềm (Aphis gossypii) (Govindan

và cộng tác viên, 2(X)3) Biện pháp loại bó tàn dư thực vật có thế mang trứng, sâu non, và nhộng cùa sâu đục thân Lophobaris piperis, bọ xít lưới Dicơnocoris hewitte,

và bọ xít mép Dasynus piperis là biện pháp khá thi mặc dù theo đánh giá, các dịch hại này ít gây giám năng suất trực tiếp (Gumbek 2002) [25,27]

Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật đối kháng trong kiếm soát nguồn bệnh:

Eng (2001) cho rằng có thề sử dụng biện pháp sinh học để phòng bệnh cho tiêu, ví dụ như sử dụng nấm Verticilium chlamydosporium và Paecilomysec

lilacinus ký sinh trên trứng tuyến trùng để phòng trừ tuyến trùng rễ [18] Biện pháp

hoạt động của các tác nhân phòng trừ sinh học có sẵn trong môi trường rễ tiêu, nhất

là các loài nấm Paecilomysec lilacinus và Pasteurìa penetrans Theo Eng (2002) tuyến trùng Meloidogyne có liên quan đến bệnh do nấm Pythium sp và Fusarium

sp gây ra Tuyến trùng chích hút rễ, gây nên các vết thương vùng rề cây tiêu, tạo cơ

hội cho nam Fusarium tan công rễ tiêu Năng suất tiêu sẽ giâm nghiêm trọng khi có

sự kết hợp cũa hai tác nhân gây bệnh là tuyến trùng rễ Melơidơgyne và virus Các động tác làm cỏ vệ sinh vườn cũng vô tình tạo vết thương trên cây tiêu cho nấm xâm nhập (19]

Khi nghiên cứu biện pháp phòng trừ sâu bệnh gây hại hồ tiêu Edwin (1990) cho thấy trong cây neem (Azadirachta indica) có hoạt chất làm giảm quần thể dịch hại chất này có thề thay thế hoá chất báo vệ thực vật, bào vệ sinh vật có ích không gây ô nhiễm môi trường đáp ứng được yêu cầu phòng trừ tông hợp (Disthaporn et al., 1996) Ớ Philippines và Nhật Bân khi sử dụng cây cúc vạn thọ (Tagetes erecta) trồng vào các khoáng trống giữa các cây trồng có thế kiếm soát rất tốt quần thề tuyến trùng (Romulo 1987) Hướng kiếm soát sâu bệnh hại trên hồ tiêu đặc biệt là tuyến trùng đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và áp dụng Cho đến nay các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện được khoảng 250 loài vi sinh vật gây hại tuyến trùng, trong dó có 200 loài là nấm sống xung quanh vùng đất rễ cây (Kerry, 1987)[21 ] Một số loài cùa giống nấm Trichoderma đã được thừ nghiệm như là một trong những tác nhân kiềm soát sinh học chống lại một số tác nhân gây bệnh và tuyến trùng kí sinh (Chet, 1990) Năm 1989, Windham et al đã báo cáo khâ năng sinh sàn cùa loài tuyến trùng nốt sần M arenaria giám xuống khi đất được xừ lý trước bang Trichoderma harzianum và T koningii Bang nhiều thí nghiệm, kết quả nghiên cứu cùa Sharon et al (2001) xác nhận T harzianum có khá năng kiêm soát tuyến trùng M javanica rất tốt

1.4.2 Tỉnh hình nghiên cún về các loài vi sinh vật gây hại cho tiêu và hiện pháp phòng trừ trong nước

Vi sinh vật gây hại trên cây 110 tiêu ở Việt Nam được ghi nhận từ những năm đầu the kỳ 20, diện tích trồng tiêu (tính bang số lượng trụ tiêu) ở Hà Tiên, Phú Quốc Rạch Giá, và Bà Rịa từ 930.000 trụ năm 1910 giâm xuống còn khoáng

Barat (1952) tập trung nhiều vào biện pháp canh tác, dù vậy ông đã tìm thấy một

số loài nam gây bệnh cho tiêu như Phytophthora sp., Pythium complectens,

Fusarium solani var minus, Botryodiplodia theobromae, Gloeosporium sp., Pestalozzia sp [ 16],

Bệnh rụng lóng tiêu thường do nấm Rhizoctonia solani Kuhn [9], Nấm Rhizoctonia trong mùa mưa hay ờ điều kiện ẩm độ cao, thường làm cho các lá

và đọt non bị thối, sũng đcn, bệnh lan dần vào lóng, làm cho các lóng bị rụng dần từ trên xuống dưới Khi lóng rụng thì hai đấu mắt lóng bị thâm đen, nhưng phần giữa lóng còn màu xanh [18] Đế trị bệnh này, dùng Validacine pha ớ nồng độ 2 phần ngàn hay Rovral 12phần ngàn đe xịt khi có bệnh Neu không có hai loại thuốc này dùng Copper zinc xịt 1 tuần/lần

Theo đánh giá cùa Cục Báo vệ Thực vật (2007), trên cây tiêu có 17 loại bệnh gây hại, trong đó bệnh: thán thư, cháy đen lá, mốc hồng, tuyến trùng, virus, chết nhanh, chết chậm gây hại nặng và khá phố biến ở nhiều vùng Các bệnh khác như nấm mạng nhện, tầo đồ rụng gié chết thSn thốỉ rễ dò vi khuân khô vằn là những bệnh tuy có xuất hiện nhưng tác hại không lớn [ 1 ]

Nhìn chung bệnh hại hồ tiêu hiện nay đang là mối lo cùa rất nhiều người kế

cả các nhà quãn lý và người sán xuất Hàng nãm, bệnh hại thường xuất hiện khá phố biến và chủ yếu vào giai đoạn giữa và cuối mùa mưa, gây thiệt hại rất lớn cho người trồng tiêu Nhiều nhà khoa học, nhiều công trình nghiên cứu đã tập trung tìm hiều tác nhân gây hại và xây dựng các biện pháp phòng trừ, tuy nhiên trong thực tế các vườn tiêu bị nhiễm bệnh và chết vần không giàm

Nguyễn Tăng Tôn (2005) cho ràng, bệnh chết nhanh do nam

Phytophthora capsici là bệnh quan trọng nhất hiện nay trên cây tiêu ở Việt Nam Ngoài ra một số nấm gây bệnh khác như Fusarium spp., Pythium sp.,

Rhizoctonia solani cũng là các tác nhân quan trọng Phân hữu cơ không những giúp cho đất tơi xốp, mà còn là điều kiện cần thiết cho bộ rỗ tiêu sinh trường tốt, ngoài ra còn cung cấp lượng lớn vi sinh vật vào trong đất, tạo cân bang sinh học cho vùng đất quanh cây liêu [6] Việc sử dụng các loại phân hữu cơ như

trên cây tiêu so với không bón phân Với một số loại phân hữu cơ chất lượng cao khi bón cho hồ tiêu, khả năng khống chế quần the tuyến trùng Meloidogyne rất có

ý nghĩa so với không bón

Năm 2012, đề tài “Nghiên cứu săn xuất và sứ dụng một số chế phẩm sinh học nhằm nâng cao năng suất cây hồ tiêu ở Quàng Trị” do Th.s Phạm Thị Thúy Hoài chù nhiệm, đã được triển khai và thu được những kết quà khá quan tại các huyện trồng hồ tiêu chính ờ Quảng Trị Đe tài đã xây dựng quy trình lên men săn xuất chế phẩm vi sinh đối kháng phù hợp với cây hồ tiêu tại Quáng Trị Sứ dụng cơ chất cám gạo cho lên men ran các chùng vi sinh vật đối kháng bao gồm 2 loài vi khuẩn B subtilis và ỡ flexus; nấm Penicilium oxalicum; xạ khuân S.diastatochromogenesơ

17J Các chế phẩm được kháo nghiệm trên quy mô diện hẹp và diện rộng đối với cây hồ tiêu tại Quáng Trị cho thấy công thức kết hợp xử lý chế phấm vi sinh vật và chc phàm sinh học Chitosan đạt hiệu quà cao nhất Hiệu lực phòng trừ của các chế phẩm đối với tỷ lệ bệnh đạt từ 22.49% đến trên 72,45%

Nghiên cứu ừng dụng vi khuân đối kháng trong kiểm soát nguồn bệnh:

Hiện nay, biện pháp hóa học được sứ dụng phố biến và xem như hìru hiệu nhất trong phòng trừ bệnh cho cây trồng Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp trong đó có thuốc trừ nấm ngày càng nhiều gây ảnh hướng xấu đến môi trường và làm giảm chất lượng sản phẩm khi dư lượng thuốc cao, chi phí phòng trị bệnh cao

Ngoài ra, hóa chất sữ dụng lâu dài làm cho đất đai bạc màu, làm chết các sinh vật có ích, làm tăng khà năng kháng thuốc cùa sinh vật gây hại, kết quá là việc sán xuất nông nghiệp rơi vào tình trạng khó khàn Đặc biệt là khu vực Miền Trung, cây tiêu và cây cà phê thường bị thối co rề do Fusarium oxysporum, F solani ,

Phytophthora và một số tác nhân khác [3,4] Năm 2012, các nhà Khoa học tại Đại học Nông lâm Huế dã nghiên cứu (hành công giái pháp phòng trị bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu bang che phẩm sinh học Pseudomonas Giải pháp trên đã được áp dụng thứ nghiệm tại nhiều vườn tiêu ờ Quáng Trị, Đak Lak và cho kết quâ phòng bệnh rất cao Qua nghiên cứu, tìm hiếu, phân lập, các nhà Khoa học đã phát hiện trong rễ cây hồ tiêu có vi khuan Pseudomonas, là vi khuấn có khá năng ức chế

Đây được xem là một phát hiện mang tính đột phá mang đến sự thành công sau này Thực tế cho thay có nhiều che phẩm sinh học đã được bà con nông dân áp dụng, tuy nhiên do một số lý do kết quá không được cao.

Theo TS Trần Thị Thu Hà, chế phẩm pseudomonas dùng đế phòng bệnh hơn

là chữa bệnh, thực hiện phòng bệnh trước mùa mưa (mùa mưa là thời điếm cao nhất cùa bệnh chết nhanh), dùng đế tưới vào thân, gốc và bón lót giống như sử dụng các loại phân hóa học nên rất dễ sứ dụng Nếu áp dụng đúng kỹ thuật có thề giảm tì lệ cây chết do bệnh xuống từ 15 - 35% Bên cạnh đó vi khuẩn

Pseudomonas còn tiết ra chất kích thích sinh trường idole acetic acid, kích thích cây trồng sinh trường phát triển mạnh, tăng sức đề kháng chống bệnh [26] Chế phẩm này giúp người nông dân chủ động sán xuất với ưu điếm giá thành rất thấp, thấp hơn 2 - 3 lần so với các phương pháp khác, lại không gây ô nhiễm môi trường, không độc Tuy nhiên chế phẩm này mới chi được nghiên cứu và sàn xuất theo điều kiện khí hậu cùng như môi trường đất và vi sinh vật gây hại trên địa bạn tỉnh Quàng Trị Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

2.1 Đối tưọTig, vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cún

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn được phân lập từ đất trồng tiêu tại Tây Nguyên

Các mẫu đất đtrợc lấy vào ngày 12 tháng 01 năm 2014 ờ Tây Nguyên Đất được lấy

ờ tang mặt, độ sâu từ 5 - 30cm Lượng đất lấy mồi lần từ 40 - 50g Mầu đất được đựng trong túi nilon polypropylen vô trùng Các mẫu sau khi lấy được ghi nhãn nơi lấy, ngày lấy và người thu mầu Mầu đất sau khi thu được gửi ngay tới phòng thí nghiệm đê tiến hành phân lập.Trong phòng thí nghiệm, mẫu được chia nhò cho vào các túi nilon sạch (khoảng 10g/ túi) Một số mầu giữ ờ 4°c sẽ được phân lập ngay, còn lại được giữ ờ -20°C.Tên mầu và địa điểm lấy mầu trên bâng 2.1:

Bảng 2.1: Tên mẫu và địa điểm lấy mẫu

SI 1 Tên mẫu Địa điếm lấy mẫu SI 1 Tên mẫu

HrÝ I1A 1

Địa điềm lấy mẫu

2 CM3 |Cđ Cư M'gar - DăkLăk 17 CMjjcr Cư M’gar - DăkLăk

3 CM2|Cđ Cư M’gar - ĐăkLăk 18 CMiicr Cư M’gar - ĐăkLăk

4 CM|C'đ Cư M'gar - ĐăkLăk 19 CM|Cr Cư M’gar - ĐăkLăk

5 CSitđk Chư Sê-Gia Lai 20 CS|trk Chư Sê - Gia Lai

6 cs2tđk Chư Sê - Gia Lai 21 cs2ưk Chư Sô - Gia Lai

7 cs.,tđk Chư Sê - Gia Lai 22 CS.M Chư Sê - Gia Lai

8 CM4cđk Cư M'gar - ĐãkLăk 23 CMjcrk Cư M'gar - ĐăkLăk

9 CMjcdk Cư M'gar - ĐãkLăk 24 CMscrk Cư M'gar - ĐăkLăk

10 CM6cđk Cư M'gar - ĐăkLăk 25 CMfiCrk Cư M’gar - ĐăkLăk

11 EH3.|tđ Ea H'Leo, ĐăkLảk 26 EHj|tr Ea H'Leo, ĐăkLăk

12 EH|tđ Ea H’Leo, DăkLăk 27 EHợcđ Ea H’Lco ĐăkLãk

13 CM^cdk Cư M’gar - DăkLăk 28 EH,ư Ea H’Leo, DăkLăk

14 CS3jtr Chư Sê - Gia Lai 29 cs.,.2tđ Chư Sê-Gia Lai

15 CM|tl CưM'gar-ĐăkLăk 30 EH,tđ Ea H'Leo ĐăkLăk

Các chùng nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani gây bệnh hại cây trồng từ bộ sưu tập giống cùa Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quáng Trị - Viện nghiên cứu KH Miền Trung

Các cặp mồi để khuếch đại gen 16s rADN ( cặp mồi 16sF, 16sR dùng cho vi khuẩn) [221

Bảng 2.2 : Trình tụ- và thông số cặp mồi đe khuếch đại gen 16S rRNA

cho vi khuẩn

2.1.3 Hóa chất, thiết bị và môi trường nuôi cấy.

Các loại hóa chất: Yeast Extract (DISCO-Mỹ); EDTA; SDS; Tris (Sigma-

Mỹ); Acid acetic Ampicillin (Méck-Đức); Agar (Sigma, Mỹ); Con tuyệt đôi; Ethidium bromide, tryptone, X-gal; Meat Extract, nước cất, chloroform, TAE, isoamylalcohol, EDTA, ethanol, parafil lòng, NaCl 0.85%

Vật liệu và hóa chất cho phương pháp nhuộm Gram:

+ Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet): 2g tím kết tinh hoà tan trong 20

ml etanol 95% + 0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc Bào quán trong lọ tối, sứ dụng vài tháng.+ Dung dịch lod: Hoà tan 1 g lod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đù 300ml Bào quân trong lọ tối

+ Dung dịch tay màu: Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton

+ Dung dịch nhuộm bố sung: Chuấn bị sẵn dung dịch Safranin o 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) đề có dung dịch 0,5%

+ Dung dịch Chloroform: Isoamylalcohol =24:1

+ Dung dịch TE

Tris-HCl :10mM pH=8.0

EDTA :lmM

+ Dung dịch đệm dành cho điện di:

Dung dịch đệm điện di TAE IX được lấy từ dung dịch TAE 50X gốc có thành phần:

+ Dung dịch nhuộm gel: Ethidium bromide (EtBr)

Dung dịch gốc: 10mg/ml Pha Ig EtBr với 100ml nước cất, khuấy từ cho tan đều, giữ trong lọ tối màu ở nhiệt độ phòng

Khi sừ dụng pha 20pl dung dịch gốc trong 100ml đệm TAE IX

+ Đệm tra mầu (loading buffer) 5X:

Rad); bộ điện di (Bio-Rad ), tú cấy vô trùng (Sanyo); pipettman các loại (Gilson), nồi khử trùng (Nhật Bán),

2.2 Phuong pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Mầu đất được nghiền nhỏ trong cối chày sứ (đã khứ trùng), loại bó rác hòa 10 gram trong bình nón chứa 90ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 200 vòng/phút trong 10 phút đen 20 phút Lay 1 ml dung dịch chuyến sang ống nghiệm có 9 ml nước muối sinh lý vô trùng, và tiếp tục pha loãng tới 10 \ 10 4, 105 Từ các ống nghiệm với nồng độ pha loãng khác nhau (10'\10'4, 10’5), cấy trài 100 pl lên môi trường MPA hoặc King B (đe phân lập vi khuẩn) Nuôi ớ 37°c, sau I ngày quan sát

sự phát triên cùa các khuân lạc

2.2.2 Phương pháp nhuộm Gram

+ Nhuộm bố sung bàng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rừa nước, đế khô trong không khí

+ Soi kính: dùng vật kính dầu lOOx

-Ket quả:

Vi khuẩn Gram dương (+) bắt màu tím Gram âm (-) bắt màu đỏ

Các chúng vi sinh vật được nuôi cấy trong bình nón dung tích 250ml có chứa 100ml môi trường dịch thể, lấc trên máy lắc 220 vòng/phút Sau 1-2 ngày Sau đó lấy dich lọc trong nhó 15()pl dịch vào lỗ thạch đã đục sẵn trong đìa peptri đã cấy vi sinh vật kiểm định Đe lu lạnh 30 phút cho chất kháng sinh khuếch tán vào thạch, rồi đem đi nuôi ấm ờ 37°c Đọc kết quà sau 24 giờ ớ 37°c.

Hoạt tính kháng sinh cúa mỗi chủng xạ khuẩn được xác định theo kích thước vòng vô khuẩn:

HTKS = D - d (mm),Trong đó: D là đường kính vòng vô khuân,

d là đường kính của lỗ thạch

2 2.4 Phương pháp sinh học phân tử

2 2.4 Ị Quy trình tách chiết ADN genom vi khuân.

+ Ly tâm huyền dịch vi khuẩn, loại bò dịch nối

+ Cặn tế bào được hòa lại trọng dung dịch 0ệtn TẸ 10; 1 '(Tựs HC1 + EDTA)+ Bổ sung SDS 10% và proteinaza K, đáo đều, ù ớ 37°c sau Ih để phá vỡ tế bào và loại bó protein

+ Bổ sung NaCl 5M, đáo đều ù ở 65°c trong 10 phút

+Chiet ADN bang dung dịch chloroform:isoamylalcohol (24:1) và phenol.+ Ly tâm thu dịch nồi nam trên lớp xác tế bào

+ Chiết lại ADN bàng chloroform : izoamylalcohol (24:1) và phenol.+ Túa ADN bằng cách bố sung NAOAc 3M, cồn 100% và giữ ờ 2()°c tối thiểu trong Ih

+ Ly tâm loại bó dịch nổi, rửa cặn ADN bằng cồn 70% làm khô ADN.+ Hòa lại cặn trong đệm TE chứa ARNaza (100pg/ml), ù ớ 37°c trong Ih để loại ARN

+ Nồng độ và độ sạch cùa ADN được xác định bàng phổ hấp phụ trên máy quang phố tư ngoại và điện di trên gel agaroza 1 %