--- LUẬN VĂN THẠC SỸ KH OA HỌC LÂM NGHIỆP ĐỖ QUỲNH LIÊN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN ADN MÃ VẠCH VÀ NHÂN GIỐNG LAN PHI ĐIỆP TÍM HÒA BÌNH Dendrobium anosmun Lindley BẰNG KỸ THUẬT
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Giới thiệu chung về cây Phi điệp tím Hòa Bình
Cây Phi điệp tím Hòa Bình, còn gọi là Giã Hạc hoặc Giả Hạc, có tên khoa học là Dendrobium anosmun Lindley, là một loại phong lan thuộc dòng lan hoàng thảo với thân gồm nhiều giả hành mọc thành bụi và phân đốt như đốt tre nứa Loài lan này thích khí hậu nhiệt đới, phân bố chủ yếu ở các nước Đông Nam Á như Thái Lan, Lào, Việt Nam và Campuchia; tại Việt Nam, nó có mặt ở các tỉnh như Cao Bằng, Hòa Bình, Phú Thọ, Thanh Hóa, Tây Ninh Đặc điểm nhận biết của Phi điệp tím Hòa Bình là hình dạng, màu sắc, hương thơm và vẻ đẹp độc đáo riêng biệt so với các loại phi điệp tím khác, nổi bật với cánh hoa to hơn, màu sắc và hương thơm đặc trưng.
Bảng 1.1 Vị trí phân loại của chi Dendrobium
Hình 1.1 Ảnh lan Phi điệp tím Hòa Bình
1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây Phi điệp tím Hòa Bình
Phi điệp tím Hòa Bình có thân thong, có thể dài tới 2 mét, buông rũ xuống và mọc thành từng cụm thuộc nhóm đa thân, thân có giả hành chứa diệp lục, nhằm dự trữ nước và chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới Thân cây chia thành nhiều đốt, mỗi đốt chứa một mắt ngủ, với độ dài phụ thuộc vào tuổi, môi trường và điều kiện sống của cây Màu sắc thân đa dạng từ xanh, chấm tím đến tím đậm theo từng giai đoạn phát triển, đường kính thân có thể lên tới 1,5 cm vào mùa nghỉ Thân già của các đời trước thường khô teo, có màu nâu tím hoặc vàng như rơm, phản ánh quá trình lão hóa của cây.
- Lá: Lá đơn mọc cách, xếp so le, mọng nước, dài 10-15cm, rộng từ 3-4 cm Mép lá nguyên, hệ gân song song, đầu lá nhọn [11]
- Rễ: Phi điệp tím Hòa Bình thuộc loại rễ bì sinh, đường kính nhỏ khoảng 1,5-2mm, có hình trụ Rễ rất dài, chóp rễ có màu xanh [11]
Hoa Phi điệp tím không chỉ mọc trên các giả hành mới mà còn xuất hiện trên các giả hành cũ, thể hiện sự phát triển đa dạng của loài Hoa Phi điệp tím Hòa Bình nở vào cuối xuân đầu hè (tháng 4-6), với hoa to đến 10cm, thường mọc từ 1-3 chiếc ở các đốt đã rụng lá, tạo điểm nhấn đặc biệt Trên cánh hoa có lớp lông mịn và ánh kim lấp lánh, trong khi lưỡi hoa thường có hai mắt tím đậm, tăng tính thẩm mỹ và sự quyến rũ Hoa có mùi thơm ngào ngạt và kéo dài từ 2-3 tuần lễ, giúp thu hút các loại thụ phấn Một cây khỏe mạnh có thể ra tới 50-70 hoa trên một đợt nở, minh chứng cho vẻ đẹp và sức sống mãnh liệt của loài hoa này.
Quả của Phi điệp tím Hòa Bình là loại quả nang, nở ra theo 3-6 đường nứt dọc khi trưởng thành Khi chín, quả nở ra nhưng các mảnh vỏ vẫn còn dính lại ở phần đỉnh và gốc, giúp bảo vệ bên trong Bên trong quả chứa nhiều hạt, và khi đạt độ chín, hạt có màu vàng, góp phần vào quá trình sinh sản của loài hoa này.
Hạt giống được cấu tạo bởi một phôi chưa phân hóa, chứa đầy không khí nhằm giảm trọng lượng, giúp dễ dàng phát tán qua gió Các hạt này rất nhiều và nhỏ, với tổng trọng lượng của tất cả hạt trong một quả chỉ bằng một phần mười milligram, nhờ đó chúng dễ dàng lan truyền rộng rãi trong môi trường.
1.1.3 Một số điều kiện sinh thái
Phi điệp là loại cây yêu thích ánh sáng, có thể trồng ở nơi có nhiều ánh sáng tự nhiên, giúp cây phát triển tốt Tuy nhiên, cần tránh phơi cây dưới trời nắng nóng kéo dài cả ngày để không làm rễ bị cháy hoặc gây hại cho lá non Việc chăm sóc đúng cách sẽ giúp cây phát triển khỏe mạnh và duy trì vẻ đẹp rực rỡ.
Nên sử dụng lớp lưới che bảo vệ cây để đảm bảo cây hấp thụ đủ ánh sáng cần thiết hàng ngày, giúp cây phát triển khỏe mạnh Trồng cây ở nơi quá râm có thể khiến cây quặt quẹo, lá xanh sẫm và thân lá còi cọc, đặc biệt vào mùa đông Thiếu ánh sáng mặt trời khiến cây khó ra hoa và phát triển tự nhiên.
Lan Phi Điệp Tím chịu nhiệt tốt, có thể chịu nhiệt độ lên đến 38°C vào mùa nóng và nhiệt độ xuống thấp tới 3-3,5°C vào mùa lạnh Tuy nhiên, để cây ra hoa đúng mùa, nhiệt độ vào mùa đông không nên kéo dài dưới 15-16°C trong khoảng 4-6 tuần, tránh gây ảnh hưởng đến quá trình ra nụ của lan.
1.1.3.3 Độ ẩm và độ thông thoáng
Phi điệp tím cần duy trì độ ẩm khoảng 60-70% trong giai đoạn các thân non phát triển để đảm bảo sức khỏe và sự trưởng thành của cây Ngoài ra, loài này thích sống trong điều kiện thoáng gió nhằm hạn chế các bệnh về nấm và giúp cây phát triển toàn diện.
Nước là yếu tố thiết yếu giúp lan phát triển khỏe mạnh và ra hoa đều Trong mùa hè, khi lan ra mầm non và mọc khỏe, nên tưới nước 2-3 lần mỗi tuần để duy trì sự sinh trưởng Vào mùa thu, khi cây đã ngừng tăng trưởng, cần giảm lượng nước, chỉ tưới 1 lần mỗi tuần để tránh làm teo thân cây Trong mùa đông, thời điểm chuẩn bị ra hoa, không cần tưới nước nữa, nhưng nếu độ ẩm thấp, nên phun sương 1-2 lần mỗi tháng để duy trì độ ẩm cần thiết cho lan.
Phi điệp tím cần được cung cấp lượng dinh dưỡng phù hợp để phát triển khỏe mạnh, đặc biệt là các thành phần như N-P-K cùng các nguyên tố trung và vi lượng Sử dụng phân NPK với tỷ lệ 10-20-30 ở nồng độ 3g/L định kỳ hàng tuần giúp cây sinh trưởng tốt Khoảng 2 tháng trước khi ra hoa, nên phun phân NPK với tỷ lệ 15-20-25 ở nồng độ 2g/L, mỗi tuần một lần, và dừng bón khi hoa tàn để đảm bảo cây chuẩn bị tốt cho quá trình ra hoa.
Lan Phi điệp tím Hòa Bình là món trang sức đẹp nhất do thiên nhiên ban tặng, với màu sắc quyến rũ, cánh hoa phủ lông mịn và ánh kim bắt mắt Hoa có hương thơm ngào ngạt, lâu tàn, và thân cây cao, khỏe, rất siêng hoa, cho nhiều hoa trên một giả hành Chính vì đặc điểm nổi bật này, Phi điệp tím Hòa Bình được người dân sử dụng để thưởng lãm vẻ đẹp tự nhiên, làm cảnh, trang trí và tạo điểm nhấn cho không gian sống.
Khác với các dòng lan Phi điệp khác, Phi điệp tím Hòa Bình nổi bật với vẻ đẹp lạ, độc đáo, mang lại giá trị kinh tế cao Loài lan này đã chiếm vị trí quan trọng trong các sự kiện như hội nghị, đám cưới, bàn tiệc và trang trí cô dâu.
Phi điệp tím Hòa Bình được khai thác và bán với giá rất cao Năm 2019 giá lan Phi điệp tím tính theo kg vào khoảng 6 - 7 triệu/kg
Ngoài ra Phi điệp tím Hòa Bình được dùng để chiết xuất tinh dầu thơm trong công nghệ mỹ phẩm mang lại giá trị cho con người
Lan Phi điệp tím Hòa Bình không chỉ đẹp làm cảnh mà còn có tác dụng chữa bệnh, ít người biết đến Loài lan này được sử dụng trong điều trị các bệnh về da, giúp giảm các triệu chứng da liễu, đồng thời hỗ trợ phục hồi thể trạng suy nhược, thần kinh suy yếu, giúp giảm đau họng và tăng cường sức đề kháng cho cơ thể Nhờ những lợi ích này, Lan Phi điệp tím Hòa Bình ngày càng được nhiều người quan tâm và ứng dụng trong y học dân gian.
Tổng quan về ADN mã vạch
Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời, xây dựng hệ thống phân loại sinh vật và thực vật toàn diện dựa trên sự khác biệt hình thái của các cơ quan trong cơ thể, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa) Tuy nhiên, phương pháp này gặp khó khăn khi xác định mẫu vật trong giai đoạn phát triển chưa ra hoa hoặc có đặc điểm giống nhau do thích nghi môi trường, cũng như khó phân biệt ở các bậc phân loại thấp như loài và dưới loài Ngoài ra, việc phân loại hình thái thường chỉ do các chuyên gia thực hiện, tốn nhiều thời gian và công sức.
Kể từ giữa những năm 1990, phương pháp phân loại học phân tử ra đời dựa trên sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, sử dụng dữ liệu về hệ gen (DNA) và các sản phẩm như protein để nghiên cứu đa dạng sinh học và mối quan hệ tiến hóa Tùy mục đích, người nghiên cứu có thể chọn các gen hoặc đoạn DNA khác nhau để phân tích, từ đó xây dựng cây phát sinh chủng loại và nhận diện các cấp độ phân loại loài hoặc chi Trong lĩnh vực thực vật, các phương pháp chỉ thị phân tử như kỹ thuật enzyme giới hạn, RFLP, DNA fingerprinting, PCR và mã vạch DNA ngày càng phổ biến, dựa trên sự giống nhau về cấu trúc hóa học của DNA cùng với sự khác biệt về trình tự các cặp base giữa các loài.
Năm 2003, nhà nghiên cứu Paul Hebert từ đại học Guelph, Canada, đã đề xuất phương pháp xác định loài dựa trên ADN mã vạch (DNA barcode) DNA mã vạch là trình tự nucleotide ngắn có nguồn gốc chung, bao gồm vùng bảo thủ ít biến đổi và vùng thay đổi theo quá trình tiến hóa Việc chọn vùng trình tự làm ADN mã vạch cần đảm bảo có độ dài phù hợp, không quá ngắn để giữ đa hình giữa các taxon và không quá dài để dễ dàng giải trình tự, kể cả trong điều kiện chưa tối ưu Ngoài ra, vùng này không nên là vị trí dị hợp để dễ nhân bản và phân tích, đồng thời cần thuận lợi trong so sánh dựa trên các điểm khác biệt về nucleotide, tránh các đoạn lặp microsatellite giảm chất lượng trình tự.
ADN mã vạch giúp xác định sự khác biệt di truyền giữa các sinh vật dựa trên mức độ biến đổi trong trình tự ADN Dù hai mẫu vật của các loài có thể trông rất giống nhau về hình thái bên ngoài, ADN mã vạch vẫn cho phép phân biệt chính xác chúng Công nghệ này được ứng dụng trong việc nhận dạng các loài đã được mô tả và phát hiện các loài mới chưa được nghiên cứu, mang lại lợi thế lớn trong nghiên cứu đa dạng sinh học và bảo tồn loài.
Mã vạch ADN là công cụ hiệu quả cho nghiên cứu phân loại, giám định sinh vật như động vật, thực vật, nấm, vi sinh vật và virus Việc xác định loài bằng mã vạch ADN giúp phân biệt các loài sinh vật một cách chính xác, đặc biệt khi quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ rõ để định danh hoặc phân biệt loài.
Việc sử dụng ADN mã vạch để nhận dạng các loài trên quy mô toàn cầu ngày càng trở nên quan trọng, giúp xác định chính xác và nhanh chóng các loài sinh vật Sau hơn 10 năm nghiên cứu, đã có hơn 6.000 công trình khoa học được công bố với khoảng 5 triệu trình tự ADN mã vạch của các loài sinh vật theo dữ liệu từ BOLD Để chuẩn hóa việc sử dụng ADN mã vạch trên phạm vi quốc tế, cộng đồng khoa học đã nỗ lực xác định các vùng trình tự ADN phù hợp làm mã vạch có khả năng phân biệt đồng thời nhiều loài khác nhau, góp phần nâng cao hiệu quả trong lĩnh vực sinh học phân loại và bảo tồn đa dạng sinh học.
Một ADN mã vạch điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau:
- Có tính phổ biến cao (dễ dàng nhân bản và giải trình tự)
- Trình tự có tính đặc hiệu cao
- Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [26]
Mỗi đoạn mã vạch có đặc trưng riêng biệt giúp phân biệt sinh vật ở các cấp độ khác nhau như chi, họ, loài và dưới loài Các đoạn ADN mã vạch thường nằm trong hệ gen nhân (như 18S, 5.8S, 26S, ITS), hệ gen ty thể (như Cytb, CO1) hoặc hệ gen lục lạp, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và phân loại chính xác các sinh vật.
Hiện tại chưa có đoạn DNA nào được sử dụng làm mã vạch chung cho tất cả các loài sinh vật, thay vào đó, cần lựa chọn các đoạn DNA đặc trưng phù hợp với từng đối tượng giám định để đạt hiệu quả cao hơn Việc phối hợp các đoạn DNA mã vạch khác nhau sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong xác định loài Tùy thuộc vào mục đích và đối tượng nghiên cứu, các đoạn DNA mã vạch phù hợp sẽ được lựa chọn một cách hợp lý để tối ưu hóa kết quả phân tích.
1.2.2 Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật
Các trình tự mã vạch được nhân bản từ ADN hệ gen của bố mẹ dự kiến cung cấp nhiều hơn thông tin về các loài cần xác định Tuy nhiên, việc khuếch đại PCR từ gen nhân gặp khó khăn do gen nhân chủ yếu là đơn gene hoặc có số lượng bản sao thấp, đặc biệt khi ADN hệ gen bị suy thoái hoặc chất lượng thấp sau quá trình tách chiết Ngoài ra, khả năng phân biệt các loài dưới mức loài do sự bảo toàn gen chức năng cũng hạn chế số lượng gen nhân có thể sử dụng trong xác định loài bằng chỉ thị ADN mã vạch.
1.2.2.2 Vùng gen mã hóa ribosome
Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa phần ARN của ribosome, mang trình tự có tính bảo thủ và đa dạng để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắp xếp thành các đơn vị lặp lại ngẫu nhiên, chứa DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S xen kẽ với các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S Vùng mã hóa của ba gen rDNA có mức độ bảo tồn cao hơn các vùng ITS, và các đơn vị rDNA thường được lặp lại hàng nghìn lần, tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể Một đặc điểm nổi bật của rDNA là các đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hóa độc lập mà tiến hóa phối hợp, giúp duy trì mức độ ổn định cao trong loài mặc dù có sự khác biệt giữa các loài.
Hiện nay, vùng ITS của gen nhân được xem là công cụ quan trọng để đánh giá quá trình phát sinh loài ở thực vật và động vật nhờ tính phổ biến trong tự nhiên, khả năng kế thừa từ bố mẹ và mức độ biến đổi cao do ít hạn chế chức năng Các nghiên cứu gần đây về cây sinh sản hữu tính và vô tính đã chỉ ra sự biến đổi trong số lượng bản sao của các trình tự ITS1, cho thấy vùng này có tiềm năng lớn trong nghiên cứu phả hệ và di truyền học các loài thực vật.
ITS2 có nhiều nguyên nhân gây ra biến đổi như lai gần, phân ly, tái tổ hợp và tỷ lệ đột biến cao, cùng với hình thành gen giả của các gen chức năng Nhờ những đặc điểm này, vùng nrDNA có thể được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả các loài thực vật cùng loài nhưng có đặc điểm lịch sử sinh thái khác nhau như sống lâu năm, trên cạn hoặc dưới nước, cũng như có nguồn gốc tiến hóa khác nhau.
1.2.2.3 Trình tự gen lục lạp
Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử ADN mạch vòng có kích thước từ 120 đến 160 kb, chia thành hai bản sao đơn lớn (LSC) và bản sao đơn nhỏ (SSC) Hai bản sao này được phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb), có độ dài trung bình khoảng 20 kb, tạo thành cấu trúc đặc trưng của hệ gen lục lạp thực vật.
Hệ gen lục lạp gồm các gen rRNA, tRNA và các gen mã hóa protein thiết yếu cho chức năng của lục lạp Cụ thể, hệ gen này chứa 4 gen rRNA trong thực vật bậc cao, 35 gen tRNA và khoảng 100 gen khác mã hóa các protein cần thiết cho hoạt động và sự tồn tại của lục lạp Tổng dung lượng của hệ gen lục lạp khoảng 30 kb, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp protein và duy trì chức năng của các b organelle quang hợp này.
Việc sử dụng kết quả phân tích hệ gen lục lạp trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật ngày càng được các nhà khoa học quan tâm nhờ đặc tính bảo thủ cao và tính đặc thù của hệ gen này đối với từng loài Các nghiên cứu gần đây đã xác định một số locus và gen trong hệ gen lục lạp có tiềm năng trở thành các chỉ thị barcode giúp phân loại chính xác các loài thực vật trên thế giới Khoảng 20 gen lục lạp có độ dài phù hợp khoảng 1 kb được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu phát sinh loài, do chứa đựng nhiều mức độ tiến hóa khác nhau, phù hợp cho các mức độ phân loại đa dạng.
Tổng quan về nuôi cấy mô - tế bào
Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô hoặc vi nhân giống là các kỹ thuật nuôi cấy in vitro giúp nhân lên cây trồng hiệu quả Đây là các phương pháp phổ biến hiện nay để nhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận nhỏ đã được tách ra từ cây mẹ Các kỹ thuật này mang lại hiệu quả cao trong việc nhân giống và duy trì đặc tính của giống cây trồng.
1.3.1 Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực chuyên về biệt lập và phát triển các nguyên liệu thực vật sạch sẽ, hoàn toàn không chứa vi sinh vật gây hại, trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng Phương pháp này giúp duy trì và nhân giống cácPlant material một cách hiệu quả, đồng thời đảm bảo tính sạch sẽ và an toàn của sản phẩm cuối cùng.
Phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên cơ sở lý luận về tính toàn năng của tế bào, được phát triển từ học thuyết của nhà sinh lý thực vật người Đức Học thuyết này khẳng định rằng mỗi tế bào thực vật đều có khả năng phát triển thành toàn bộ cây mới khi được cung cấp môi trường phù hợp Chính nhờ nguyên tắc này, kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu và nhân giống cây trồng hiện đại Các nguyên tắc của phương pháp này giúp thúc đẩy ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp và phát triển giống cây mới hiệu quả.
Vào cuối thế kỷ 19 và đầu thế kỷ 20, Haberl đã lập luận rằng mỗi tế bào của sinh vật đều chứa đựng toàn bộ thông tin di truyền (DNA) cần thiết để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh, khi gặp điều kiện thích hợp Ngày nay, các nhà khoa học đã chứng minh khả năng tái sinh toàn bộ cơ thể thực vật từ một tế bào riêng lẻ, xác nhận thông điệp này một cách rõ ràng.
Trong nuôi cấy in vitro, quá trình phát sinh hình thái của mô thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào, cho phép điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật trong điều kiện nhân tạo và vô trùng Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào dựa trên việc sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng như auxin và cytokinin để hướng dẫn sự phát triển của tế bào, với tỷ lệ hàm lượng giữa chúng quyết định hướng phát sinh hình thái Khi nồng độ auxin (ví dụ: IAA) thấp hơn so với cytokinin (ví dụ: kinetin), mô phát sinh theo hướng tạo chồi, còn khi tỷ lệ này cao hơn sẽ thúc đẩy sự hình thành rễ, và ở tỷ lệ cân đối sẽ dẫn đến hình thành mô sẹo (callus).
1.3.2 Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật
Bước đầu tiên của quy trình nhân giống là chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu và xác định cơ quan phù hợp để lấy mẫu, đảm bảo mô chọn có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy, sạch bệnh và giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Sau đó, cần lựa chọn chế độ khử trùng phù hợp nhằm giảm thiểu nhiễm trùng đồng thời duy trì khả năng sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là sử dụng các tác nhân hoá học mạnh như cồn 70% và HgCl2 để đảm bảo hiệu quả sát trùng cao.
Các chất khử trùng như NaOCl, Ca(ClO3)2, H2O2 được sử dụng để khử trùng mẫu, với nồng độ phù hợp dựa trên thực nghiệm và nguyên tắc mô non nồng độ thấp, mô già nồng độ cao Trong nhiều trường hợp, cần phối hợp nhiều loại chất khử trùng để nâng cao hiệu quả Có thể bổ sung các chất kháng nấm và vi khuẩn vào môi trường để tăng khả năng khử trùng Thời gian khử trùng được xác định dựa trên thực nghiệm cho từng loại cây hoặc mô nuôi cấy, trong đó mô non thường khử trùng trong thời gian ngắn hơn so với mô già.
Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Giai đoạn này gồm đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro trên môi trường dinh dưỡng phù hợp để tái sinh mô Môi trường nuôi cấy được thiết lập riêng cho từng loại cây và mô nuôi cấy, đảm bảo không nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus Các mẫu nuôi cấy được lưu giữ trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ và ánh sáng thích hợp Sau một thời gian, từ mẫu ban đầu sẽ xuất hiện các cụm tế bào, chồi, rễ hoặc phôi vô tính gần như phôi hữu tính, là những vật liệu khởi đầu để tiến hành nhân giống nhanh chóng tiếp theo.
Sau khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra và nhận được các cụm chồi cũng như phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nhân nhanh sẽ bắt đầu Để đạt tốc độ nhân nhanh cao nhất, cần tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường Quy trình cấy chuyển nhằm nhân nhanh chồi thường kéo dài từ 1-2 tháng tùy từng loại cây, và tổng thời gian của giai đoạn nhân nhanh có thể kéo dài từ 10 đến 36 tháng.
Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Trong quá trình nuôi cấy, các chồi hình thành có thể tự phát rễ, tuy nhiên, thường cần chuyển chúng sang môi trường mới để kích thích quá trình tạo rễ hiệu quả Ở giai đoạn này, việc phát triển cân đối giữa thân, lá và rễ trong cây trong ống nghiệm là rất quan trọng để đạt tiêu chuẩn của một cây giống chất lượng cao.
Giai đoạn vườn ươm là bước đánh giá tính khả thi của quá trình nhân giống in vitro khi chuyển cây từ môi trường vô trùng trong phòng thí nghiệm ra bên ngoài tự nhiên Trong giai đoạn này, việc đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm giúp giảm thiểu hiện tượng "sốc" do sự thay đổi điều kiện môi trường Để đảm bảo cây phát triển tốt sau khi chuyển đổi, cần có bước thích nghi nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho cây thích nghi với môi trường tự nhiên.
Quá trình thích nghi của cây với điều kiện bên ngoài đòi hỏi sự chăm sóc đặc biệt, bao gồm kiểm soát cường độ ánh sáng, dinh dưỡng và giữ nước để đảm bảo sự phát triển tối ưu Việc chọn lựa các loại giá thể phù hợp và duy trì điều kiện cách ly bệnh là yếu tố cần thiết để tăng tỷ lệ sống của cây con Chủ động trong việc điều chỉnh các yếu tố môi trường giúp cây con thích nghi tốt hơn và phát triển khỏe mạnh.
1.3.3 Thành tựu trong nuôi cây mô đối với chi Dendrobium
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là phương pháp quan trọng giúp nhân giống cây trồng nhanh chóng, đặc biệt đối với các loại cây khó nhân bằng phương pháp truyền thống Phương pháp này đã được nhiều nghiên cứu chứng minh hiệu quả trong việc nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen thực vật Nhờ đó, nuôi cấy mô tế bào thực vật góp phần thúc đẩy phát triển nông nghiệp bền vững và bảo vệ đa dạng sinh học.
Nguyễn Thị Lài và cộng sự (2018) nghiên cứu thành công phương pháp nhân giống Lan Hoàng Thảo Nghệ Tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe), bắt đầu bằng lát cắt mỏng chồi invitro được nuôi trên môi trường tối ưu để sản sinh protocorm-like bodies, gồm VW + 20 g/L sucrose + 10% nước dừa + 7 g/L aga + 1,5 mg/L BAP Kết quả cho thấy, sau sáu tuần nuôi cấy, môi trường này tạo ra trung bình 30,1 protocorm-like bodies/lát mỏng Cụm protocorm-like bodies sau đó được cấy lên môi trường chứa các thành phần như VW + 20 g/L sucrose + 10% nước dừa + 7 g/L agar + 1,0 g/L than hoạt tính + 2 g/L peptone + 1,5 mg/L BAP + 0,5 mg/L BAP + 30 g/L dịch nghiền bí ngô + 1 g/L tảo spirulina, đạt tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất với 16,82 chồi/mẫu sau 8 tuần nuôi cấy Môi trường cấy chồi in vitro để tạo cây con hoàn chỉnh bao gồm VW + 20 g/L sucrose + 10% nước dừa + 7 g/L agar.
1,0 g/L than hoạt tính + 1,0 mg/L BAP là thích hợp nhất với số rễ được hình thành là 7,3 rễ/cây sau 6 tuần nuôi cấy [8]
Nguyễn Văn Việt (2017) đã thành công trong kỹ thuật nuôi cấy in vitro và đạt tỷ lệ mẫu sạch lên đến 86,7% sau khi sát trùng quả lan bằng ethanol 70% trong 1 phút và dung dịch HgCl2 0,1% trong 12 phút Quá trình nuôi cấy trên môi trường Knops cho thấy tỷ lệ phát sinh thể chồi (protocom) đạt 76,7% sau 5 tuần Cảm ứng tạo đa chồi hiệu quả được thực hiện trên môi trường chứa BAP 0,8 mg/mL, Kinetin 0,3 mg/mL, NAA 0,1 mg/mL, kèm dịch chiết khoai tây 100 mg/L và nước dừa, góp phần thúc đẩy sự phát triển của cây lan Hoàng Thảo kèn (Dendrobium lituiflorum Lindley) trong quá trình nhân giống in vitro.
100mg/L, sucrose 30mg/L, aga 5g/L cho hệ số nhân chồi cao nhất 10,3 sau
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được một số đoạn ADN mã vạch và nhân giống cây Phi điệp tím Hòa Bình bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào
- Xác định được một số trình tự ADN mã vạch cho cây Phi điệp tím Hòa Bình
- Xây dựng được kỹ thuật nhân giống cây Phi điệp tím Hòa Bình bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.
Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết ADN tổng số của Phi điệp tím Hòa Bình
- Nhân bản các đoạn gen ycf, ITS2, rbcL, trnH-psbA
- Đọc trình tự của các đoạn gen đặc hiệu
- Xử lý và phân tích dữ liệu, xác định các trình tự ADN mã vạch
2.2.2 Nhân giống Phi điệp tím Hòa Bình bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
- Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch và nuôi cấy khởi động
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến nhân nhanh, ra rễ
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng cây giống
2.3 Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu
- Vật liệu nghiên cứu cho giám định loài: Lá cây Phi điệp tím Hòa Bình
Vật liệu nghiên cứu cho nhân giống được lấy từ quả lan Phi điệp tím Hòa Bình đã đạt tuổi chín sinh lý đạt 90% Quả được thu thập trực tiếp tại gia đình ông Bùi Huy Toàn, xã Tử Nê, huyện Tân Lạc, tỉnh Hòa Bình, đảm bảo chất lượng và đặc điểm phù hợp cho quá trình nhân giống lan hiệu quả.
- Đệm tách A (EBA- Extraction Buffer A): pha 100 ml
Bảng 2.1 Thành phần đệm tách A (100ml)
2 100mM Tris (pH 8,0) (use 1M stock) 10ml
3 20mM EDTA (use 0,5M stock) 1ml
7 10mM β-mereaptoethanol (BME)* (use 14,3M stock) 70àl
- Đệm tách B (EBB- Extraction Buffer B): pha 100ml
Bảng 2.2 Thành phần đệm tách B (100ml)
1 100mM Tris HCl (pH 8,0) (use 1M stock) 10ml
2 50mM EDTA (use 0,5M stock) 2,5ml
4 10mM β-mereaptoethanol (BME)* (use 14,3M stock) 70àl
Bảng 2.3 Thành phần đệm TE (100ml) STT Thành phần
1 10mM Tris (pH 8,0) (use 1M stock) 1,0ml
2 1mM EDTA (use 0,5M stock) 50ml
Hoá chất chạy điện di:
Điện di gel agarose gồm các hoá chất: TAE, Chất nhuộm Bromophenol blue, Ethidium bromide, agarose
Điện di gel polyacrylamide gồm các hóa chất: Dung dịch acrylamide, APS, Temed
2.3.2.2 Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Một số dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu:
Pipet 0,5-10àl, 2-20àl, 10-100àl, 20-200àl, 100-1000àl
Đầu tipe (10àl, 200àl, 1000àl)
Một số thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu này gồm :
Cân kỹ thuật điện tử
Thiết bị chạy điện di
Máy nhân gen PCR ( 9700; 9800 Fast PCR)
Phương pháp nghiên cứu xác đinh ADN mã vạch
Bước 1: Cõn 0,2 g mẫu lỏ cho vào cối chày sứ, bổ sung 600 àl EBA,
1800 àl EBB và 200 àl SDS, nghiền mẫu bằng cối chày sứ để phỏ vỡ tế bào
Bước 2: Hỳt 1,5 àl mẫu cho vào ống eppendorf 1,5 àl sạch
Bước 3: Ủ mẫu ở 65 o C trong bể ổn nhiệt, thời gian 10 phút
Bước 4: Ly tâm 12.000 v/ p trong 10 phút ở 4 o C
Bước 5: Hỳt 1,0 àl dung dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5 àl
Bước 6: Bổ sung 410 àl CH3COOK Trộn đều, đặt ống trong đỏ 5 phỳt
Bước 7: Ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4 o C để thu dịch nổi
Bước 8: Thu dịch nổi và bổ sung isopropanol lạnh theo tỷ lệ là Vmẫu :
Visopropanol = 1:1, đảo nhẹ và ủ ở -20 o C trong 20 phút
Bước 9: Ly tâm thu tủa 12.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 o C Loại bỏ dịch nổi, thu tủa
Bước 10: Rửa tủa bằng 500 àl ethanol 70% (cồn 70% để rửa cỏc cặn bẩn kết tủa cùng DNA)
Bước 11: Ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 phút ở 4 o C, loại bỏ dịch nổi rồi làm khô tủa (ít nhất 30 phút)
Bước 12: Hũa tan tủa trong 100 àl đệm Elution
Bước 13: Tiến hành kiểm tra DNA thu được bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, chứa RedSafe và đệm TAE 1X, với hiệu điện thế 90V để xác định chất lượng DNA Hình ảnh gel sau điện di sẽ được so sánh với thang chuẩn maker 1kb để đảm bảo độ chính xác và độ tinh khiết của mẫu DNA Quá trình này giúp đánh giá thành công của bước amplificação và chuẩn bị mẫu cho các bước phân tích tiếp theo.
2.4.1.2 Kiểm tra kết quả tách chiết ADN tổng số
Sản phẩm ADN sau khi tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, trong đệm TAE ở hiệu điện thế 90V
Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 1g agarose cho vào 100ml dung dịch TAE 1X Đun sôi bằng lò vi sóng cho agarose tan thật đều
Để hỗn hợp giảm nhiệt độ xuống còn 50 - 60 0 C bổ sung Redsafe với tỷ lệ 5 àL Redsafe/100 mL gel agarose 1% Trộn đều và đổ vào khay điện di
Trước khi đổ gel, cần lau sạch giá đổ bằng giấy thấm mềm dễ hút nước để đảm bảo bề mặt khô ráo Lược tạo giếng được đặt ở phía cực âm của bể điện di, giúp định hình dòng điện và ổn định quá trình chạy gel Tiếp theo, tiến hành cân bằng mặt phẳng của giá bể bằng cách đặt giọt nước trên giá, đảm bảo độ phẳng lý tưởng cho quá trình chạy điện di Sau đó, đổ gel agarose vào khay, chờ gel đông hoàn toàn rồi tháo lược để hoàn tất quá trình chuẩn bị cho điện di phân tử.
Đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di, dung tích TAE có thể linh động thay đổi để phù hợp khi đặt bản gel trong bể
Đặt bản gel vào bể điện di, đảm bảo bằng cách điều chỉnh lượng dung dịch TAE 1X để bản gel được ngập khoảng 1mm so với bề mặt dung dịch Việc này giúp tối ưu quá trình điện di và đảm bảo hiệu quả phân tách DNA hoặc mẫu phân tử.
Lấy 5 µL mẫu DNA và trộn với 2 µL dung dịch Dye, sau đó đặt lên bề mặt giấy parafilm để chuẩn bị cho quá trình điện di Dùng micropipet chính xác để lấy 7 µL hỗn hợp này rồi đưa vào các giếng trong gel điện di theo thứ tự mẫu Chạy điện di ở điện áp 90V, dòng điện 400mA trong khoảng thời gian 30 phút để phân tách các phân tử DNA Trong quá trình này, quan sát bằng mắt thường thấy hỗn hợp mẫu di chuyển chậm từ cực âm sang cực dương, giúp xác định kích thước của các đoạn DNA dựa trên vận chuyển trong gel.
Lấy bản gel từ bể điện di soi trực tiếp dưới đèn tia UV
2.4.2 Phương pháp nhân bản gen đích của kỹ thuật PCR a Các bước tiến hành phản ứng PCR
Thể tớch mỗi phản ứng PCR mỗi mẫu là 50 àL
Bảng 2.4 Trình tự và thông tin của các cặp mồi được sử dụng
Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ gắn mồi (Ta) ycf mP3 F 5’- TTCCATGGCCTTCTTTGCATTTGTTGC-3’ 50 0 C mP3R 5’- TTCCATGGTTTTTTGAGGATCCGCTGT-
3’ rbcL rP2F 5’- TGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’ 50 0 C rP2R 5’- GTAAAATCAAGTCCACCTCG -3’ trnH- psbA trnPF1 5’- GTTATGCATGAACGTAATGCTC -3’ 51 0 C psbPR1 5’- CGCGCATGGTGGATTCACAATCC -3’
- Bước 1: Cho các thành phần phản ứng PCR vào ống PCR Thực hiện ở nhiệt độ thấp (trong đá)
Bảng 2.5 Thành phần của một phản ứng PCR
STT Thành phần Nồng độ Thờ̉ tớch (àL)
- Bước 2: Trộn (mix) đều hỗn hợp bằng pipet hoặc máy Vortex, sau đó làm lắng (spin) bằng máy ly tâm (8000 vòng/phút, 1 phút)
- Bước 3: Lập chương trình và chạy PCR trên máy
Chu trình nhiệt, đặc biệt là quá trình thay đổi nhiệt độ gắn mồi, đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR để đảm bảo sự chính xác và hiệu quả của quá trình khuếch đại DNA Sau khi hoàn thành phản ứng PCR, tiến hành chạy điện di để kiểm tra mẫu, so sánh kết quả với thang chuẩn marker 1kb nhằm xác định kích thước và sự thành công của quá trình khuếch đại DNA Việc phân tích dữ liệu qua điện di giúp đánh giá chính xác sản phẩm PCR và đảm bảo đáp ứng tiêu chuẩn kỹ thuật trong các nghiên cứu gene và sinh học phân tử.
Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 1%
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, chạy điện di để kiểm tra, so sánh với thang chuẩn marker 1kb
Cân 1g agarose cho vào 100ml TAE 1X
Đun nóng bằng lò vi sóng
Bổ sung 4àl RedSafe/100ml gel, mix đều
Lắp lược vào bản gel, đổ gel, chờ 20 - 30 phút cho gel đông lại
Tra vào mỗi giếng 2àl sản phẩm PCR
Chạy điện di trong dung dịch TAE 1X, 90V trong 30 phút
Soi gel bằng tia UV
2.4.3.Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR purification kit của Norgen Các bước tinh sạch tiến hành như sau:
- Thêm 5V binding solution vào sản phẩm PCR, mix và ly tâm nhẹ
- Lắp cột, chuyển dịch sang cột
- Ly tâm 8000vòng/phút trong 1 phút
- Thờm 500àl wash solution A Ly tõm 10000 vũng/phỳt trong 1 phỳt
- Loại bỏ dịch, lắp lại cột
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút để làm khô
- Lắp cột vào ống eppendorf
- Bổ sung 50àl elution buffer
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đưa đi giải trình tự
2.4.4 Phương pháp đọc trình tự
Phương pháp xác định trình tự DNA tự động dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger, nhưng sử dụng kỹ thuật PCR để tổng hợp DNA Mỗi ddNTP được đánh dấu bằng một loại fluorochrom màu khác nhau, giúp thực hiện đồng thời cả bốn phản ứng tổng hợp trong một ống nghiệm Kết quả được đọc tự động qua quá trình điện di sử dụng tia laser và phần mềm phân tích dữ liệu, đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong việc xác định trình tự gen.
Phương pháp này được tiến hành tại Malaysia
Phân tích bằng Bioedit, BLAST trong NCBI
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) là phần mềm so sánh cấu trúc chuỗi DNA hoặc chuỗi amino acid nhằm tìm kiếm các chuỗi tương đồng trong ngân hàng dữ liệu Chương trình giúp xác định các vùng tương đồng và mức độ phân ly về cấu trúc giữa chuỗi kiểm tra và các chuỗi đã lưu trữ, hỗ trợ nghiên cứu về gen và sinh học phân tử một cách hiệu quả.
Phân tích đặc điểm bằng phần mềm Mega 10 giúp xác định mối liên hệ giữa loài Phi điệp tím Hòa Bình và các loài Phi điệp tím khác Việc xây dựng cây phân loại dựa trên dữ liệu này thể hiện rõ sự tương quan sinh học và phân bổ địa lý của các loài, hỗ trợ nghiên cứu và bảo tồn loài hoa đặc sắc này Sử dụng phần mềm Mega 10 là bước quan trọng trong việc phân tích đa dạng sinh học, giúp hiểu rõ hơn về mối quan hệ di truyền và sự phân chia của các loài Phi điệp tím.
Phương pháp nhân giống Phi điệp tím Hòa Bình bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
2.5.1 Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch và nuôi cấy khởi động
Quả lan được làm sạch và sát khuẩn bằng ethanol 70% trong 2 phút nhằm tiêu diệt vi khuẩn và nấm ký sinh Sau đó, mẫu quả được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong vòng 5-15 phút hoặc NaClO 6% trong 15-25 phút để đảm bảo an toàn và loại bỏ các tác nhân gây nhiễm Tiếp theo, tách vỏ quả và trải hạt lên môi trường nuôi cấy khởi động gồm môi trường dinh dưỡng cơ bản MS bổ sung 30 g/l sucrose và 6,5 g/l agar để kích thích phát triển mô nuôi cấy hiệu quả.
Kết quả thu thập sau 6 tuần nuôi cấy
Bảng 2.6 Ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến tạo mẫu sạch và khả năng nảy mầm Loại hóa chất
Thời gian nảy mầm (ngày)
2.5.2 Phương pháp nhân nhanh thể chồi
Trong quá trình nghiên cứu, thể chồi được tái sinh từ hạt Lan trong môi trường nuôi cấy khởi đầu, sau đó chuyển sang môi trường nhân nhanh thể chồi nhằm thúc đẩy quá trình phát triển Thí nghiệm được thiết kế gồm 8 công thức sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với các nồng độ khác nhau, cùng với 1 công thức đối chứng không bổ sung chất điều hòa Sau 5 tuần theo dõi, dữ liệu về hệ số tạo thể chồi và đặc điểm của thể chồi được thu thập nhằm đánh giá hiệu quả của các công thức khác nhau.
Dùng môi trường dinh dưỡng cơ bản MS bổ sung (0,2 - 1mg/L) BAP, (0,3-0,4mg/L) Kinetin và 0,2 mg/L NAA: 30 g/L sucrozo, 6,5 g/L aga, 100 g/L khoai tây nghiền, 100 ml/L nước dừa
Bảng 2.7 Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh thể chồi
CTTN Chất ĐHST (mg/L) Hệ số nhân thể chồi (lần) Đặc điểm thể chồi BAP Kinetin NAA ĐC - - -
2.5.3 Phương pháp nhân nhanh chồi
Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi
Thí nghiệm này sử dụng các môi trường dinh dưỡng cơ bản: Knops, MS, WPM bổ sung 0,1 mg/L BAP, 30 g/L sucrose, 6,5 g/L agar, 100 g/L khoai tây nghiền, 100 ml/L nước dừa
Trong thí nghiệm này, sử dụng 3 loại môi trường nuôi cấy với các môi trường khoáng cơ bản khác nhau (MS, WPM, Knops)
Bảng 2.8 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi
CTCN Môi trường dinh dưỡng
Tỷ lệ tạo cụm chồi(%)
Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến nhân nhanh chồi
Dùng môi trường dinh dưỡng phù hợp nhất ở thí nghiệm 3, bổ sung (0,2
- 2 mg/L) BAP, (0,1 - 1,5 mg/L) Kinetin và 0,2 mg/L NAA; 30 g/L sucrose, 6,5 g/L agar, 100 g/L khoai tây nghiền, 100 ml/L nước dừa
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng BAP và NAA ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ tái sinh chồi của chi lan Dendrobium Cụ thể, trong các thử nghiệm sử dụng môi trường MS bổ sung từ 0,2 đến 2 mg/L BAP cùng 0,2 mg/L NAA, tỷ lệ nhân nhanh chồi đã được nâng cao rõ rệt, cho thấy vai trò quan trọng của các chất kích thích này trong quá trình nhân giống lan.
Bảng 2.9 Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến nhân nhanh chồi
Chất ĐHST(mg/L) Tỷ lệ tạo cụm chồi (%)
Số chồi TB/mẫu (chồi)
*Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi
Việc bổ sung Kinetin, BAP và NAA giúp tăng rõ rệt hệ số nhân của chồi, đồng thời thúc đẩy quá trình phân hóa, sinh trưởng và phát triển chồi trong kỹ thuật cấy mô in vitro Các chất này chủ yếu kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào, góp phần quan trọng vào quá trình hình thành và phân hóa chồi hiệu quả.
Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng đối với khả năng nhân nhanh chồi của cây trồng Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường khoáng cơ bản để đánh giá hiệu quả của các loại chất điều hòa sinh trưởng Kết quả cho thấy, việc sử dụng tổ hợp các chất này giúp thúc đẩy quá trình ra chồi nhanh chóng và tăng số lượng chồi trên cây trồng Hiểu rõ tác động của các chất điều hòa sinh trưởng sẽ giúp tối ưu hóa phương pháp nhân giống và nâng cao năng suất cây trồng SEO từ khóa: ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng, nhân nhanh chồi, môi trường khoáng cơ bản, tăng năng suất cây trồng.
MS bổ sung BAP, Kinetin và NAA có nồng độ khác nhau, quan sát sau 5 tuần nuôi cấy
Bảng 2.10 Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi
Chất ĐHST( mg/L) Tỷ lệ tạo cụm chồi(%)
Chất lượng chồi BAP Kinetin NAA ĐC 0 0 0
2.5.4 Phương pháp nghiên cứu ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh
Thí nghiệm cấy chuyển chồi lan đạt tiêu chuẩn với chồi có kích thước 3-4 cm, săn chắc, lá xanh tươi Chồi được cấy vào môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung dung dịch IBA ở liều lượng 0,1-0,4 mg/L và NAA từ 0,2-0,4 mg/L, cùng với 20 g/L sucrose và 6,5 g/L agar để thúc đẩy quá trình phát triển rễ và sinh trưởng Việc tối ưu các yếu tố này giúp tăng tỷ lệ thành công của kỹ thuật cấy mô lan.
100 g/L khoai tây nghiền, 100 ml/L nước dừa
Bảng 2.11 Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA tới khả năng ra rễ
Tỷ lệ chồi ra rễ(%)
Chiều dài TB/rễ (cm)
2.5.5 Phương pháp huấn luyện và ra ngôi
Khi cây cao hơn 4,5 cm và có khoảng 4 rễ đủ tiêu chuẩn, cây trở nên cứng cáp và chuẩn bị cho quá trình huấn luyện ở điều kiện tự nhiên Quá trình huấn luyện được thực hiện theo 4 công thức khác nhau về thời gian, giúp cây con thích nghi tốt hơn Sau khi huấn luyện, cây con được trồng trên giá thể hỗn hợp gồm dương xỉ và xơ dừa đã qua xử lý Sau 8 tuần quan sát, kết quả cho thấy sự phát triển rõ rệt của cây sau quá trình huấn luyện, tăng khả năng thích nghi và sinh trưởng mạnh mẽ hơn.
Bảng 2.12 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng cây khi ra ngôi
CTTN Số mẫu TG huấn luyện
(ngày) Tỷ lệ sống (%) Đặc điểm cây ĐC 91 0
+ Điều kiện phòng nuôi: Nhiệt độ phòng từ 24 ± 2 0 C, cường độ chiếu sáng 2000 - 3000 lux, 14h/ngày
+ Môi trường nuôi cấy được chuẩn độ pH = 5,8, khử trùng môi trường ở 118 0 C, áp suất 1atm trong 18 phút
+ Bình nuôi cấy: Bình thủy tinh trong suốt, thể tích 250 ml + Mỗi thí nghiệm dùng 30 mẫu, lặp lại 3 lần
2.5.7.Chỉ tiêu theo dõi, đánhgiá
- Tỷ lệ mẫu sạch (%) - Tỷ lệ mẫu mảy chồi (%) - Hệ số nhân (lần) - Tỷ lệ chồi ra rễ (%)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Kết quả xác định một số đoạn ADN mã vạch
3.1.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số Các mẫu Phi điệp tím Hòa Bình sau khi thu thập được tiến hành tách chiết
ADN tổng số Kết quả tách chiết được điện di trên gel agarose 1% được thể hiện trên hình 3.1
Hình 3.1 Ảnh điện di ADN tổng số của 3 mẫu Phi điệp tím
Các mẫu ADN sau khi tách chiết từ phi điệp 1, phi điệp 2 và phi điệp 3 cho thấy các băng vạch sáng rõ trên ảnh điện di, chứng tỏ lượng ADN thu được ít bị đứt gãy và chất lượng cao Điều này cho thấy phương pháp tách chiết ADN đã phù hợp và hiệu quả để phục vụ nghiên cứu về mẫu Phi điệp tím Hòa Bình.
Chất lượng ADN của 3 mẫu Phi điệp tím Hòa Bình đều cao, có thể thực hiện tiếp các phản ứng PCR
3.1.2 Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR được sử dụng để nhân bản các đoạn gen ycf, ITS2, rbcL, trnH-psbA dựa trên ADN tổng số đã được tách chiết ở bước trước, tạo ra các sản phẩm PCR minh họa trong hình 3.2.
Hình 3.2 Kết quả PCR các đoạn gen rbcL, ITS2, trnH-psbA, ycf của 3 mẫu Phi điệp tím Hòa Bình
Kết quả điện di cho thấy các băng sáng rõ nét, không xuất hiện băng phụ, và các băng có kích thước khá đồng đều, đảm bảo độ chính xác của phân tích Đoạn gen rbcL có chiều dài gần 700bp, giúp xác định chính xác đặc điểm di truyền của mẫu Đoạn gen ITS2 dài khoảng 300bp, phù hợp cho các nghiên cứu phân loại và xác định loài Ngoài ra, đoạn gen trnH-psbA có chiều dài gần 500bp, góp phần nâng cao độ tin cậy trong phân tích phả hệ và mối quan hệ giữa các loài thực vật.
850bp, đoạn gen ycf là gần 850bp Điều này cho thấy mồi được sử dụng khá đặc hiệu và nhiệt độ bắt mồi là tối ưu
Các mẫu đều được tinh sạch và đem đi giải trình tự
3.1.3.1 Xác định và phân tích trình tự ADN trên các vùng gen nghiên cứu a Trình tự đoạn gen trnH-psbA
Kết quả xác định trình tự nucleotide cho thấy đoạn gen trnH-psbA dài 844 bp đã được nhân bản thành công, không có sự sai khác nào giữa 3 mẫu nghiên cứu, đạt mức độ đồng nhất 100%, đảm bảo độ chính xác trong phân tích trình tự DNA.
Kết quả giải trình tự đoạn gen trnH-psbA của mẫu Phi điệp tím Hòa Bình như sau:
ATCCGCCCCTTCCCTTATCTAGCTAAAGGGTTTTCTCTTTTTTCCAT TCATCATTATACTTCAGATTAAGATCGAGATATTGGACATAGAATG CCAATTTAAAAAATGGAAAAAAAGGAGTAATCAGCCGTGACACGT TCACTAAAAAAAAATCCTTTTGTAGCTAATCATTTAGCGGGAAGA ATTGAAAAACTCAACAGGAGGGAGGAGAAAGAAATCATAGTGAC TTGGTCTCGGGCATCTACCATTATACCCACAATGATTGGCCATACA ATCGCTATTCATAATGGAAAGGAACATTTACCTATTTATATCACAG ATCGTATGGTCGGTCACAAATTGGGAGAATTTGCACCTACTCTAAC TTTCGTGAGACACGCGAGAAACGATAATAAATCTCGTCGTTAGTC GTTCTACTAAGTATTCATGTGAAAAGCCTTATCTTAATAGTATTTCT AATAGTATTTAGACTTAAGAGTCTTTATCTTATAGTAAGAGTATAG GTATATTTCTTTTTCTAGTATACTAATATACTCACTTTTCTGACTTA TCTTATACTATACTTCACCTAGGCACTTATCATTCATTGGCGGGGG AGAACTTTTATGATAAAGAACGAAAATTCGGATAGAGAAGCAAAA GACCCCTGAATCCGAATCCAAGAATGCAAATCCAACAAGATAGCA ATCCCCCAATATCTTGTTCTTAGAACAAGATATTGGGGGATTGCTA TCTTGAAAGATTCGTATACATGGATAAGTATTATCCATTTATAGAT GGAGCTTCCACAGAAGCTAGATCTAGAGGGAAGTTGTGAGCATTA CGTTCATGCATAAC
Chúng tôi đã sử dụng đoạn gen trnH-psbA để so sánh loài Phi điệp tím Hòa Bình (Dendrobium anosumun) với các loài Lan khác trong ngân hàng dữ liệu quốc tế NCBI Các loài có trình tự gen tương đồng với Phi điệp tím Hòa Bình gồm Dendrobium anosumun, Dendrobium loddigesii (EU887940), Dendrobium salaccense (KF177545), Dendrobium pendulum (EU887933), và Dendrobium tosaense (EU672794) Kết quả phân tích bằng phần mềm Mega 10 đã xác định cây phát sinh chủng loại và khoảng cách di truyền giữa các loài này, cung cấp thông tin quan trọng cho nghiên cứu phân loại và đặc điểm di truyền của các loài lan trong họ Dendrobium.
Hình 3.3 Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn trnH-psbA
Bằng phần mềm mega 10 chúng tôi nhận được khoảng cách di truyền của loài Phi điệp tím Hòa Bình với các loài Lan khác như sau
Bảng 3.1 trình bày so sánh khoảng cách di truyền của cây Phi điệp tím Hòa Bình với các loài lan khác dựa trên đoạn trình tự trnH-psbA tại ngân hàng gen quốc tế NCBI Kết quả cho thấy mức độ đa dạng di truyền giữa các loài lan, trong đó cây Phi điệp tím Hòa Bình có khoảng cách di truyền đáng kể so với các loài khác, phản ánh sự khác biệt về mặt di truyền Phân tích này giúp xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài lan, hỗ trợ trong việc xác định đặc điểm di truyền và bảo tồn gen của loài Phi điệp tím Hòa Bình Các dữ liệu này góp phần nâng cao hiểu biết về nguồn gốc và phân bổ di truyền của loài lan trong khu vực, thúc đẩy các chiến lược bảo tồn hiệu quả hơn.
502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared
502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared
Score Expect Identities Gaps Strand
502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared
Hình 3.4 cho thấy tỷ lệ tương đồng giữa hai loài đạt 98%, với 18 điểm sai khác được đánh dấu đỏ trong trình tự đoạn gen rbcL Điều này thể hiện mức độ giống nhau cao nhưng vẫn có các biến thể quan trọng giúp phân biệt hai loài khác nhau Phân tích trình tự gen rbcL đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu phân loại và xác định loài trong sinh học, góp phần nâng cao hiểu biết về đa dạng sinh học.
Kết quả xác định trình tự nucleotide cho thấy đoạn gen rbcL có kích thước 740bp đã được nhân bản thành công Không có sự sai khác nào giữa ba mẫu nghiên cứu, cho thấy kết quả đồng nhất và đạt tỷ lệ 100% tương đồng.
Kết quả giải trình tự đoạn gen rbcL của mẫu Phi điệp tím Hòa Bình như sau:
ATGTCACCACAAACAGAAACTAAAGCAAGCGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAA GATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAGATACTGATATCT TGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGGGG CTGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGG ACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGTCGTTGTT GGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAG AAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGTTTCAAA GCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCTACTTCTTATTCCAAAA CTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGT ATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAA AAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAG GATGATGAAAACGTAAATTCACAACCATTTATGCGTTGGAGAGATCGTTTCTTAT TTTGTGCCGAAGCAATCTTTAAAGCGCAAGCCGAAACGGGTGAAATTAAAGGAC ATTACTTGAATGCTACTGCAGGAACATGCGA
Chúng tôi đã sử dụng đoạn gen rbcL để so sánh loài Phi điệp tím Hòa Bình (Dendrobium anosumun) với các loài lan khác trên ngân hàng gene NCBI, bao gồm Liparis vivipara (MK862100), Dendrobium tosaense (LC348532), Dendrobium scoriarum (KF177649), và Dendrobium aphyllum (MG324297) Phân tích dữ liệu bằng phần mềm Mega 10 giúp xác định mối quan hệ phát sinh chủng loại và mức độ cách ly di truyền giữa các loài Phi điệp, từ đó cung cấp cái nhìn rõ hơn về sự liên quan và đa dạng di truyền của các loài lan này.
Hình 3.5 Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn rbcL tạo bởi phần mềm mega 10 của cây Phi điệp tím Hòa Bình
Bằng phần mềm mega 10 chúng tôi nhận được khoảng cách di truyền của loài Phi điệp tím Hòa Bình với các loài Lan khác như sau:
Bảng 3.2 Bảng so sánh khoảng cách di truyền của cây Phi điệp tím Hòa
Bình với các loài Lan khác của đoạn trình tự rbcL phi diep 1
Phân tích dựa trên dữ liệu trình tự gen rbcL cho thấy, loài Phi Điệp Tím Hòa Bình có trình tự gen hoàn toàn giống với loài Phi Điệp Tím khác trong ngân hàng NCBI, với khoảng cách di truyền là 0.00, cho thấy chúng là cùng loài hoặc rất gần nhau về mặt di truyền Ngoài ra, loài Phi Điệp Tím Hòa Bình có quan hệ họ hàng xa với các loài Liparis vivipara và Dendrobium scoriarum, với khoảng cách di truyền lần lượt là 4.3680 và 4.4113, phù hợp với đặc điểm hình thái hoa của Phi Điệp Tím, Lan Hoàng Thảo và Liparis vivipara Kết quả này củng cố mối liên hệ về mặt sinh học và hình thái giữa các loài này, góp phần vào công tác phân loại và nghiên cứu đa dạng sinh học của họ lan.
Chúng tôi đã tiến hành so sánh đoạn gen rbcL ở cấp độ loài giữa loài Phi Điệp Tím Hòa Bình và Dendrobium tosaense, dựa trên dữ liệu công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI Kết quả cho thấy sự sai khác rõ rệt giữa hai đoạn gen, được thể hiện rõ ràng qua hình 3.6, cho thấy sự đa dạng di truyền giữa các loài này.
Score Expect Identities Gaps Strand
Hình 3.6 trình bày sự khác biệt trong trình tự đoạn gen rbcL của loài Phi điệp tím Hòa Bình so với loài Dendrobium tosaense, trong đó các vị trí sai khác được làm nổi bật bằng màu đỏ, giúp nhận biết các điểm biến đổi chính giữa hai loài để phục vụ nghiên cứu phân loại và đặc điểm di truyền.
Từ hình 3.6 nhận thấy tỷ lệ tương đồng là 99%, có 4 điểm sai khác giữa
2 loài và được bôi đỏ như trên hình 3.6 c Trình tự ADN của đoạn gen ycf
Kết quả nhân giống cây Phi điệp tím Hòa Bình bằng nuôi cấy mô tế bào
3.2.1 Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch và nuôi cấy khởi động
Trong quy trình kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, tỷ lệ mẫu sạch có khả năng tái sinh chồi đóng vai trò then chốt trong việc đảm bảo thành công các bước tiếp theo Việc xác định công thức khử trùng tối ưu giúp nâng cao hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro và tăng khả năng nẩy mầm của mẫu sạch Môi trường nuôi cấy sử dụng môi trường khoáng cơ bản MS, bổ sung 30 g/L sucrose và 6,5 g/L agar, góp phần thúc đẩy quá trình sinh trưởng của cây in vitro, như đã được trình bày trong kết quả nghiên cứu tại bảng 3.5.
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến tạo mẫu sạch và nảy mầm
Thời gian nảy mầm (ngày) CT1 HgCl2
Hình 3.9 Ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến tạo mẫu sạch và nảy mầm
Từ kết quả thu được (Bảng 3.5 và biểu đồ 3.1) cho biết, khi dùng dung dịch HgCl2 0,1% với thời gian khử trùng 5 đến 15 phút hoặc dung dịch
Sử dụng NaClO 6% trong khoảng thời gian từ 15 đến 25 phút cho phép làm sạch tỷ lệ mẫu đạt từ 73,3% đến 100%, tuy nhiên, thời gian khử trùng kéo dài có thể giảm tỷ lệ nảy mầm do hóa chất độc hại ngấm vào mô thực vật Tăng thời gian khử trùng thường làm tăng tỷ lệ mẫu sạch nhưng đồng thời giảm khả năng nảy mầm của hạt, với tỷ lệ nảy mầm dao động từ 70% đến 93,3%, cho thấy sự ảnh hưởng tiêu cực của hóa chất độc đối với hạt giống Nghiên cứu của Lita S et al (2012) xác nhận rằng hóa chất khử trùng có thể làm sạch mẫu nhưng gây độc hại nếu khử trùng lâu, làm hỏng hoặc gây độc cho mô thực vật và làm giảm khả năng nảy mầm Tương tự, Nguyễn Văn Việt và cộng sự (2016) đã sử dụng HgCl2 0,1% trong 15 phút để khử trùng quả Quế lan hương, đạt tỷ lệ sạch lên tới 94,33% và tỷ lệ nảy mầm sau 40 ngày nuôi cấy là 88,67%, chứng minh hiệu quả của phương pháp khử trùng này trong việc đảm bảo sạch và duy trì khả năng nảy mầm của mẫu.
Nghiên cứu năm 2016 cho thấy hiệu quả khử trùng quả lan Hoàng thảo ý thảo ba mầu cao hơn khi sử dụng dung dịch HgCl₂ 0,1% trong 10 phút, gồm lần 1 7 phút và lần 2 3 phút, đạt tỷ lệ mẫu sạch lên tới 96,67% và tỷ lệ nảy mầm 90% Kết quả này dựa trên bảng 3.5 cho thấy dung dịch HgCl₂ 0,1% là lựa chọn tối ưu để khử trùng mẫu lan trong điều kiện thời gian phù hợp.
10 phút hoặc NaClO 6% khử trùng mẫu trong 20 phút là phù hợp là phù hợp
Kết quả phân tích thống kê cho thấy tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ nảy mầm tại các công thức thí nghiệm có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05), cho thấy các yếu tố trong nghiệm thức ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình mọc và sạch mẫu.
Hình 3.10 Hình ảnh Lan Phi điệp tím Hòa Bình ở giai đoạn tạo mẫu sạch và tái sinh thể chồi
3.2.2 Phương pháp nhân nhanh thể chồi
Thể chồi tái sinh từ hạt Lan trong môi trường nuôi cấy khởi động được chuyển sang môi trường nhân nhanh thể chồi để thúc đẩy sự phát triển nhanh chóng Thí nghiệm gồm 8 công thức sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với nồng độ khác nhau và 1 công thức đối chứng không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Sau 6 tuần theo dõi, dữ liệu về hệ số tạo thể chồi và đặc điểm thể chồi được thu thập để đánh giá hiệu quả của các công thức khác nhau Kết quả thể hiện rõ sự ảnh hưởng của các nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đối với quá trình sinh trưởng của thể chồi, giúp lựa chọn công thức tối ưu cho quá trình phục tráng Lan.
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh thể chồi (sau 6 tuần nuôi cấy)
Chất ĐHST (mg/L) Hệ số nhân thể chồi
(lần) Đặc điểm thể chồi BAP Kinetin NAA ĐC - - - 4,0 +
Ghi chú: +: chồi nhỏ, ngắn, màu xanh nhạt; ++: chồi trung bình, kích thước không đồng đều; +++: chồi mập, màu xanh đậm, đồng đều
Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi
Kết quả nghiên cứu (Bảng 3.6 và Biểu đồ 3.2) cho thấy, việc nuôi cấy thể chồi trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình hình thành thể chồi in vitro Công thức đối chứng không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng có hệ số nhân thể chồi thấp chỉ đạt 4,0 lần, thể chồi kém chất lượng, kích thước nhỏ Trong khi đó, công thức TC6 đạt hệ số tạo thể chồi cao nhất lên tới 13,8 lần cùng với thể chồi mập, màu xanh đẹp (Hình 3.10) Thể chồi lan Phi điệp tím trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BAP, 0,3 mg/L Kinetin, 0,1 mg/L NAA cho hệ số nhân vượt xa kết quả của Nguyễn Thị Sơn và cộng sự (2012), khi nhân nhanh thể chồi lan Hoàng thảo long nhãn trong 8 tuần chỉ đạt 4,63 lần Phân tích thống kê xác nhận có sự khác biệt ý nghĩa (Sig < 0,05) về hệ số nhân thể chồi giữa các công thức thí nghiệm (a) Nhân nhanh ở môi trường TC1, (b) Nhân nhanh ở môi trường TC6.
Hình 3.12 Hình ảnh Lan Phi điệp tím Hòa Bình ở giai đoạn nhân nhanh thể chồi 3.2.3 Phương pháp nhân nhanh chồi
Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi
Môi trường khoáng cơ bản đóng vai trò quan trọng trong cung cấp dinh dưỡng cho cây và ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Tuy nhiên, mỗi loài cây sẽ phù hợp với từng loại môi trường khoáng nhất định, giúp tối ưu hóa quá trình sinh trưởng Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng ba loại môi trường nuôi cấy khác nhau là MS, WPM và Knops để đánh giá ảnh hưởng của từng loại môi trường khoáng cơ bản đến sự phát triển của cây Kết quả nghiên cứu được trình bày rõ ràng trong bảng 3.7, cho thấy sự khác biệt giữa các loại môi trường khoáng đối với quá trình sinh trưởng của cây.
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi (sau 6 tuần nuôi cấy)
CTCN Môi trường dinh dưỡng
Tỷ lệ tạo cụm chồi(%)
Số chồi TB/mẫu Chất lượng chồi
D1 MS 77,1 7,6 Chồi mập, xanh lá
D2 Knops 71,4 7,1 Chồi mập, ít, xanh lá
D3 WPM 72,2 6,9 Chồi mập, xanh đậm
Kết quả cho thấy (Bảng 3.7 và Biểu đồ 3.3), tỷ lệ tạo cụm chồi tương đối cao (71,4 đến 77,1%), số chồi trung bình/mẫu đạt giá trị 6,9 đến 7,6 chồi/mẫu
Môi trường khoáng cơ bản MS có khả năng tái sinh chồi cao nhất, đạt tỷ lệ tạo cụm chồi lên tới 77,1%, cho thấy đây là môi trường lý tưởng để thúc đẩy quá trình tái sinh chồi hiệu quả.
Hình 3.13 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi
Chất lượng chồi nuôi cấy trên môi trường MS khá tốt, phát triển nhanh, chồi mập, màu xanh đậm và số chồi trung bình đạt 7,6 chồi/cụm Tuy nhiên, kết quả này vẫn còn khiêm tốn so với các công bố trước đó như của Vũ Kim Dung và cộng sự (2016), đạt tỷ lệ 100% mẫu tạo cụm chồi nhưng hệ số nhân chỉ 5,61 chồi/cụm Theo Nguyễn Văn Việt (2016), khi nhân nhanh Hoàng thảo vôi trên môi trường MS, tỷ lệ tạo cụm chồi đạt 87,6% với trung bình 5,6 chồi/cụm Phân tích thống kê cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về tỷ lệ tái sinh chồi giữa các môi trường cơ bản khác nhau, điều này có ý nghĩa thống kê (Sig < 0,05).
Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến nhân nhanh chồi
Việc bổ sung phối hợp Kinetin, BAP và NAA làm tăng rõ rệt hệ số nhân của chồi, giúp kích thích sự phân hóa, sinh trưởng và phát triển của chồi trong quá trình cấy in vitro Các chất này chủ yếu thúc đẩy sự phân chia tế bào mạnh mẽ, tác động lớn đến quá trình hình thành và phân hóa chồi, góp phần nâng cao hiệu quả nhân giống.|
* Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến nhân nhanh chồi Một số công trình nghiên cứu đã công bố về nhân giống chi lan
Nghiên cứu của Sana và cộng sự (2011) cho thấy rằng chất điều hòa sinh trưởng BAP và NAA ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi của Dendrobium Trong thí nghiệm này, môi trường khoáng cơ bản MS được bổ sung từ 0,2 đến 2,0 mg/L BAP cùng với 0,2 mg/L NAA để thúc đẩy quá trình nhân giống Kết quả thực nghiệm được trình bày rõ ràng trong bảng 3.8, chứng minh tác động của các hoạt chất này đối với tỷ lệ tái sinh chồi.
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi (sau 6 tuần nuôi cấy)
Chất ĐHST(mg/L) Tỷ lệ tạo cụm chồi (%)
Số chồi TB/mẫu (chồi)
Ghi chú: +: Chồi mảnh, yếu, lá xanh; ++: Chồi thấp, gầy, yếu, lá xanh;
+++: Chồi cao, mập, lá xanh đậm
Hình 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
Các công thức thí nghiệm có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng đều đạt tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi cao, từ 66,8% đến 86,7% Trong đó, công thức NC4 (bổ sung 0,8 mg/L BAP và 0,2 mg/L NAA) cho kết quả nổi bật với tỷ lệ tạo cụm chồi đạt 86,7%, trung bình 9,4 chồi mỗi mẫu, chồi phát triển tốt, mập, đều và có màu xanh đậm Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Nguyễn Văn Việt về hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng trong tăng sinh cây trồng.
Trong nghiên cứu năm 2016, phương pháp nhân nhanh Hoàng thảo vôi trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BAP và 0,3 mg/L NAA đạt hiệu quả cao, với 90% mẫu tạo cụm chồi và trung bình 9,6 chồi mỗi mẫu Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt rõ rệt về khả năng nhân nhanh chồi giữa các công thức thí nghiệm (Sig < 0,05), khẳng định tính hiệu quả của công thức sử dụng.
*Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi
Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi của thực vật Thí nghiệm được bố trí với môi trường khoáng cơ bản để đánh giá hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng trong việc thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của chồi cây Kết quả cho thấy sự phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng có thể tăng khả năng nhân nhanh chồi, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng Điều này giúp mở ra triển vọng ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp để tối ưu hoá quá trình nhân giống cây trồng.
MS bổ sung BAP, Kinetin và NAA có nồng độ khác nhau Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.9
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi (sau 6 tuần nuôi cấy)
Chất ĐHST( mg/L) Tỷ lệ tạo cụm chồi (%)
Chất lượng chồi BAP Kinetin NAA ĐC 0 0 0 40,3 3,0 +
Ghi chú: +: Chồi mảnh, yếu, lá xanh; ++: Chồi thấp, gầy, yếu, lá xanh
+++:Chồi cao, mập, lá xanh đậm
Hình 3.15 Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi
Kết quả ở bảng 3.9 và biểu đồ 3.5 cho thấy, khi bổ sung đồng thời BAP,
NAA và Kinetin trong môi trường nuôi cấy giúp đạt tỷ lệ tạo cụm chồi cao, từ 81,7% đến 96,8%, với trung bình từ 8,2 đến 13,3 chồi/mẫu Công thức NN3 cho kết quả ấn tượng nhất, đạt tỷ lệ tạo cụm chồi 96,8% và trung bình 13,3 chồi/cụm, tương tự như kết quả của Nguyễn văn Việt (2017) về nhân giống lan Hoàng thảo vôi Theo Vũ Kim Dung et al (2016), lan Hoàng thảo ý thảo ba mầu cũng cho tỷ lệ tạo cụm chồi gần 97% với trung bình 9,53 chồi/cụm Do đó, môi trường nhân nhanh Phi Điệp tím Hòa Bình dùng bổ sung MS với 0,8 mg/L BAP, 0,5 mg/L Kinetin và 0,2 mg/L NAA là lựa chọn tối ưu Phân tích thống kê cho thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa các công thức thí nghiệm về hệ số nhân chồi (Sig < 0,05).
Hình 3.16 Hình ảnh cây lan Phi điệp tím Hòa Bình qua các giai đoạn nuôi cấy a) Cụm chồi ở NN2; b) Cụm chồi ở NN3; c) Cụm chồi ở NN4
3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh