Trong vài thập kỷ qua, một số nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy các chủng vi khuẩn để tăng cường khả năng tổng hợp levan đã được thực hiện.. Hiện nay, levan đang được rất nhiều nhà kh
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Tổng quan về levan
Levan là một trong hai loại fructans, các carbohydrate thường gặp trong thực vật, tảo và vi khuẩn Fructans gồm hai dạng chính là levan và inulin, được phân biệt bởi loại liên kết glycosid Các đơn phân trong phân tử levan liên kết với nhau bằng liên kết β-(2→6), còn trong phân tử inulin là liên kết β-(2→1) (Han và cs, 1990) Theo phân loại, levan thuộc nhóm thứ hai của fructans.
Levan is a polymer of fructose formed by β-(2-6) fructofuranosidic linkages, as reported by Ki-Hyo et al (2001) and Mardo et al (2014) Microorganisms capable of synthesizing levan include Lactobacillus gasseri, Bacillus circulans, Erwinia amylovora, and Serratia sp.
Acetobacter xylinum NCI 1005, Z mobilis, and B subtilis (Anwar et al., 2010; Devi and Alamu, 2013; Oliveira et al., 2007) are bacteria linked to levan production Levan is an extracellular polysaccharide synthesized by these bacteria when grown in media whose main component is sucrose These microbes are capable of synthesizing levansucrase to convert sucrose into levan (Mardo et al., 2014).
Vào năm 2012, một nghiên cứu của Esawy và cộng sự cho thấy vi khuẩn Bacillus spp được tách chiết từ mật ong có khả năng sinh tổng hợp levan Kết quả này cho thấy tiềm năng của các vi khuẩn này trong sản xuất levan từ nguồn mật ong, mở đường cho các ứng dụng của levan trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.
Levan có đặc trưng cấu trúc chủ yếu là mạch thẳng liên kết β-(2→6) Tuy nhiên, levan do vi khuẩn tổng hợp có thể có cấu trúc nhánh với liên kết β-(2→1), tạo ra các nhánh phân nhánh trong chuỗi polymer Các mạch nhánh thường ngắn và xuất hiện khi có sự tham gia của liên kết β-(2→1) giữa các đơn vị fructose, cho thấy sự đa dạng về cấu trúc và tính chất của levan tùy nguồn gốc sinh tổng hợp.
The shortest fructans are 6-ketose units, making them the shortest fructans among levan varieties Levan is one of the few natural carbohydrate polymers that exist in the furanose form.
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của levan
Levan được sản xuất từ các sinh vật khác nhau và có sự khác biệt về lượng phân tử và mức độ phân nhánh Levan từ vi khuẩn có khối lượng phân tử lớn hơn levan thu được từ thực vật khoảng 2–100 kDa (Pontis và Campillo, 1985; Keith và cs, 1991) Levan từ thực vật có khối lượng phân tử khoảng 2–33 kDa (Rhee và cs, 2002) Levan được sản xuất từ quá trình lên men bởi vi khuẩn Zymomonas mobilis có khối lượng phân tử khoảng 10^7 Da, tương ứng với 60.000 đơn phân fructose (Viikari và cs, 1986) Bên cạnh đó, levan từ vi khuẩn B subtilis Natto có hai loại trọng lượng phân tử khác nhau, levan có khối lượng phân tử cao 1794 kDa và levan có khối lượng phân tử thấp 11 kDa Trọng lượng phân tử khác nhau của levan mang lại các ứng dụng khác nhau cho từng mục đích cụ thể (Shin và cs, 2005).
Trong đó chủng B subtilis có khả năng sinh tổng hợp levan cao hơn cả với
40 g/l trên môi trường có chứa 200 g/l sucrose (Shih và cs 2005)
Trong nghiên cứu của Jothi và cs (2019), levan được tổng hợp bởi Bacillus subtilis MTCC 441 khi sucrose được dùng làm nguồn carbon Chiết xuất nấm men (YE) là nguồn nitơ tốt nhất cho quá trình sản xuất levan Điều kiện tối ưu được báo cáo là nồng độ sucrose 100 g/L, pH 7 và YE 2 g/L, với tốc độ lắc được xác định trong nghiên cứu.
150 vòng/phút là giá trị tối ưu cho sản xuất levan Kết quả cho thấy năng suất levan thu được tương ứng là 0,395 g/g sucrose
Các nghiên cứu chỉ ra levan có khả năng chống ung thư (Calazans cs, 2000;
Levan được sản xuất bởi Microbacterium laevaniformans, Rahnella aquatilis và Zymomonas mobilis và có khả năng chống lại tám dòng tế bào ung thư khác nhau Nhiều nghiên cứu cho thấy levan có vai trò trong điều trị sâu răng, giảm cholesterol và điều hòa hoạt động miễn dịch trong cơ thể Levan còn có thể được dùng để sản xuất DFA IV (di-D-fructose-2,6:2,6-dianhydride), một chất làm ngọt có độ ngọt bằng một nửa so với sucrose và độ ổn định cao, nên được ứng dụng như một chất làm ngọt cho các sản phẩm dành cho người tiểu đường.
Trong vài thập kỷ gần đây, nhiều nghiên cứu đã tối ưu điều kiện nuôi cấy các chủng vi khuẩn nhằm tăng khả năng tổng hợp levan Oliveira và cộng sự (2007) tiến hành tối ưu điều kiện nuôi cấy Zymomonas mobilis bằng phương pháp đáp ứng bề mặt với hai nhân tố thay đổi, thu được hàm lượng levan cao nhất là 21,68 g/L Santos và cộng sự (2013) cũng tối ưu điều kiện nuôi cấy Bacillus subtilis Natto bằng cùng phương pháp, cho hàm lượng levan đạt 111,6 g/L với nồng độ sucrose 400 g/L và thời gian nuôi 16 giờ.
Levan đang được nhiều nhà khoa học và nhà sản xuất quan tâm nhờ các đặc tính vượt trội như khả năng hòa tan tốt trong dầu và nước, độ kết dính mạnh, khả năng tương thích sinh học cao, khả năng chống ung thư và khả năng tạo màng (Santos và cộng sự, 2013) Nhờ những đặc tính này, levan được ứng dụng rộng rãi trong mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm, như được nêu trong các công trình của Jaecho và cộng sự (2001) và Santos và cộng sự (2013).
Levan được sử dụng trong chăm sóc cá nhân, y tế, công nghệ nanno (Gupta và cs, 2010), nuôi trồng thủy sản và các ứng dụng thực phẩm (Oner và cs, 2016)
Natural Polymers Inc (Hoa Kỳ); Real Biotech Co., Ltd., (Hàn Quốc) và Advance Co., Ltd., (Nhật Bản) là những nhà sản xuất chính của levan ở quy mô thương mại
Hai ví dụ phổ biến của các sản phẩm thương mại dựa trên levan có sẵn trên thị trường là Proteolea® và Slimexir® (Oner và cs, 2016)
Hình 1.2 Sản phẩm dưỡng da mặt với Proteolea®
Hình 1.3 Sản phẩm dưỡng thể với Slimexir®
Ngoài ra, RealBiotech đã đưa một số sản phẩm thực phẩm chức năng lên kệ tại hệ thống siêu thị ở Hàn Quốc và Nhật Bản, cho thấy sự mở rộng thị trường và sự tin tưởng của người tiêu dùng đối với thương hiệu Các sản phẩm này được giới thiệu và bán ra thông qua website www.realbio.com, giúp khách hàng dễ dàng tham khảo thông tin và nguồn gốc sản phẩm Sự hiện diện tại hai thị trường châu Á này phản ánh tiềm năng tăng trưởng của RealBiotech và xu hướng ngày càng tăng của nhu cầu đối với thực phẩm chức năng trên toàn cầu.
Hình 1.4 Các sản phẩm levan trên thị trường (www.realbio.com)
Levan là một loại bột tinh thể màu trắng có tính chất như một chất kết dính mạnh Các hạt của Levan có dạng hình cầu, đường kính từ 75 đến 200 nm Thành phần và tính chất của Levan phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Levan, nên điều kiện lên men và chủng vi sinh vật ảnh hưởng đến chất lượng và ứng dụng của sản phẩm (Khadiga và cộng sự, 2015).
Không giống như polysaccharides được sử dụng làm chất nhũ hóa và chất làm đặc, levan không trương lên trong nước và có độ nhớt thấp, chỉ khoảng 0,38 dL/g ở 25°C (In Young Bae và cộng sự, 2007).
Levan dễ tan trong nước nóng nhưng hầu như không hòa tan trong nước ở nhiệt độ phòng (< 0,5%) Khả năng hòa tan của levan trong nước nóng cao hơn của inulin được đặc trưng bởi liên kết hydro (2–6) so với liên kết hydro (2–1), và cấu trúc mạch nhánh có thể chỉ là một yếu tố hỗ trợ.
Levan là một homopolymer của fructose không hòa tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ như (Ashton và cs, 2012):
- Methyl caprylate/caprate, methylpalmitate/ oleate;
- Propylene carbonate, methoxypolyethylene glycol, polyethylene glycol;
Thức ăn chăn nuôi gà cảnh
1.2.1 Giới thiệu về một số giống gà cảnh
Có hai giống gà nổi bật là gà lôi và gà đỏ, trong khi gà rừng đang được nuôi và săn đón tại nhiều hội sinh vật cảnh ở Việt Nam Đây là những giống gà khó nuôi và khó tìm được cá thể thuần chủng, khiến người nuôi sẵn sàng chi một khoản tiền lớn để sở hữu chúng.
Hình 1.5 Gà rừng đỏ tại miền Trung và Tây Nguyên
Giống gà quý phi là một giống gà cao quý và mạnh mẽ, mang vẻ ngoài kiêu sa Điểm đặc biệt của nó nằm ở chiếc mào được ví như quả Phật thủ và không một giống gà nào khác có được sự tương đồng này, tạo nên sự độc đáo và cuốn hút cho giống gà quý phi.
Gà Quý phi có bộ lông độc đáo với hai màu đen và trắng, luôn bồng lên như một chiếc nón Đôi mắt đỏ đặc trưng khiến giống gà này càng thêm nổi bật và cuốn hút.
Hình 1.6 Giống gà Quý phi
Gà vảy cá, hay còn gọi là gà lai cá, tên quốc tế là gà Sebright, đang nổi lên như một vật nuôi độc đáo dành cho cộng đồng mê sinh vật cảnh ở Việt Nam Với kích thước nhỏ nhắn và bộ lông vảy cá đặc trưng, giống gà này thu hút sự chú ý của những người yêu thú cảnh nhờ vẻ đẹp tinh tế và dáng đi thanh lịch Người nuôi gà Sebright tại Việt Nam ngày càng quan tâm đến các yếu tố chăm sóc như chuồng nuôi sạch, dinh dưỡng cân đối và môi trường thoáng đãng để đảm bảo sức khỏe và sự phát triển tối ưu Bên cạnh yếu tố thẩm mỹ, gà Sebright còn được đánh giá cao về tính hiền lành, ít kêu và dễ chăm sóc, phù hợp với người mới bắt đầu nuôi gà cảnh Trong xu hướng thú cưng ở Việt Nam, gà vảy cá được xem là lựa chọn độc đáo cho những ai muốn sở hữu một sinh vật cảnh có nguồn gốc quốc tế nhưng phù hợp với điều kiện nuôi nhốt tại gia.
Hình 1.7 Giống gà lai cá
Đặc điểm nổi bật của gà lai cá là những chiếc lông vũ hình tròn trịa được viền đen bao quanh, trông rất giống vảy cá và tạo nên vẻ quyến rũ đặc trưng cho giống gà này Theo nguồn Hoisvcvn.org.vn, sự kết hợp giữa hình dạng lông và viền đen giúp nhận diện dễ dàng và tăng sức hút của loài gà lai cá.
Không những vậy, gà vảy cá còn có một lịch sử rất đáng tự hào Giống gà này được tạo ra từ thế kỷ 19, trong một chương trình nhân giống chọn lọc do nhà nghiên cứu người Anh John Saunders Sebright (1767 - 1846) tiến hành
Gà lông xù hay còn gọi là gà Silkie là giống gà rất đặc biệt bởi chúng sở hữu một bộ lông xù cực kỳ lạ mắt và đáng yêu Gà lông xù có đủ các loại màu sắc từ như màu vàng, trắng, đen Mỗi con gà trưởng thành nặng từ 1,5 - 2 kg, vòng đời có thể kéo dài tới 7 - 8 năm, nếu chăm sóc tốt có thể sống được 9 năm
Hình 1.8 Giống gà lông xù
Do sở hữu bộ lông tơ mịn và nhỏ, gà lông xù này không bay nhảy được như các loại gà bình thường Với đặc điểm lông như vậy, nó đẻ rất ít trứng, chỉ từ 7–10 quả trong một chu kỳ, nên số lượng trở nên hiếm hoi trên thị trường gà cảnh Việt Nam.
Được xem là giống gà nhẹ nhất thế giới, gà Serama có trọng lượng trưởng thành chỉ từ 300–500 g Dù nhỏ bé, giống gà này khó nuôi và đòi hỏi nhiều công tập luyện để đạt dáng đứng chuẩn, và nhờ đặc điểm đặc biệt này nên gà Serama đã thu hút sự chú ý của nhiều hội sinh vật cảnh trên thế giới.
1.2.2 Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi
Do nhu cầu dinh dưỡng khác nhau giữa các loại gà, mỗi loại gà thường được cho ăn bằng cám riêng nhằm tối ưu hiệu quả nuôi Tuy nhiên, với gà con ở giai đoạn từ 1–14 ngày tuổi, do còn rất nhỏ nên nhu cầu dinh dưỡng giữa các loại gà ở giai đoạn này là tương tự nhau Vì vậy, cám dành cho gà con trong giai đoạn này thường có thành phần chung, được thiết kế để cung cấp đầy đủ đạm, vitamin và khoáng chất thiết yếu, hỗ trợ quá trình tăng trưởng và phát triển của gà con những ngày đầu đời.
Dưới đây là quy trình công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi gà
Hình 1.10 Quy trình công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi gà
Thuyết minh quy tình công nghệ
- Nguyên liệu nhà máy sử sựng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi bao gồm:
+ Nguyên liệu thô: Ngô, khô đậu tương, sắn lát, bã bia, bã cải;
+ Nguyên liệu mịn: Cám gạo, bột cá, bột thịt, bột lông vũ, nguyên liệu khóang;
+ Nguyên liệu lỏng: Rỉ mật, dầu cá, dầu cám gạo
Dây chuyền tiếp nhận và xử lý nguyên liệu là công đoạn đầu tiên của quá trình sản xuất, có chức năng tiếp nhận, dự trữ và bảo quản nguyên liệu cho nhà máy nhằm đảm bảo nguồn cung ổn định và chất lượng từ đầu Sau khi tiếp nhận, nguyên liệu được lưu trữ và kiểm soát các thông số như nhiệt độ, độ ẩm và tình trạng tồn kho để tối ưu hóa chu trình sản xuất và giảm thiểu rủi ro biến động Tiến hành xử lý sơ bộ và làm sạch nguyên liệu trước khi đưa vào các công đoạn tiếp theo, nhằm loại bỏ tạp chất, chuẩn hóa kích thước và đặc tính vật lý, từ đó đảm bảo hiệu suất và năng suất của toàn bộ dây chuyền.
+ Làm sạch: Nguyên liệu được loại bỏ các tạp chất bằng kích thước lưới sàng 5mm, sử dụng hệ thống nam châm để loại bỏ kim loại
Nghiền nguyên liệu nhằm đạt kích thước hạt theo yêu cầu, tăng độ đồng đều giữa các thành phần và phân bố dinh dưỡng, đồng thời nâng cao khả năng tiêu hóa của sản phẩm Nguyên liệu được nghiền mịn sẽ thuận lợi cho quá trình tạo viên, giúp viên thức ăn có bề mặt bóng và liên kết tốt hơn với các cấu tử thành phần.
Máy trộn có nhiệm vụ đảo trộn các loại nguyên liệu để tăng tính đồng đều của hỗn hợp Thời gian trộn được chia thành hai giai đoạn: trộn khô (15 giây) và trộn ướt (15 giây), giúp đảm bảo sự đồng nhất và tối ưu hóa hiệu quả sản xuất.
Máy trộn không chỉ đồng đều trộn các thành phần mà còn kích hoạt các phản ứng hóa học và sinh học trong chế biến thực phẩm, đồng thời tăng cường quá trình trao đổi nhiệt khi đun nóng hoặc làm lạnh Quá trình trộn cho phép bổ sung các phụ gia, chất lỏng và khoáng chất, từ đó cải thiện đặc tính của viên cám Rỉ mật được bổ sung nhằm tăng độ kết dính của viên cám và nâng cao sự ngon miệng cho vật nuôi; rỉ mật được đưa qua máy phun mật trước khi phun trực tiếp lên cám để phân phối đồng đều.
Máy ép viên là bước tiếp theo sau khi nguyên liệu được phối trộn Tại đây, nguyên liệu được đưa vào máy và ép thành viên, đồng thời máy cấp nhiệt ở mức khoảng 70-80°C (tùy theo loại cám) trong suốt quá trình ép để hình thành các viên có kích thước và độ chắc mong muốn.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được các điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng B subtilis sinh tổng hợp levan cao
Nghiên cứu được điều kiện thu nhận và tinh sạch levan để ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất thức ăn chăn nuôi gà cảnh giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi.
Nội dung nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp và thu nhận levan từ Bacillus subtilis, tập trung vào nguồn carbon, nhiệt độ, pH, tốc độ lắc và thời gian nuôi cấy Mục tiêu là xác định mức độ tác động của từng biến số lên hiệu suất sản xuất levan và chất lượng thu được, từ đó đề xuất điều kiện tối ưu cho quá trình lên men Các yếu tố được khảo sát nhằm tối ưu hàm lượng và độ đồng nhất của levan, đồng thời cải thiện quy trình thu nhận và tinh sạch Kết quả có thể định hướng ứng dụng công nghiệp để sản xuất levan từ Bacillus subtilis một cách hiệu quả và ổn định.
- Tối ưu hóa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy cho chủng B subtilis sinh tổng hợp levan cao
- Nghiên cứu điều kiện thu nhận levan
- Bước đầu ứng dụng levan trong sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi.
Vật liệu nghiên cứu
Chủng B subtilis do Viện Công nghệ sinh học lâm nghiệp - Đại học Lâm nghiệp cung cấp
- Môi trường hoạt hóa B subtilis (môi trường L1): Nước chiết thịt bò 3 g/l, peptone 5 g/l, pH 7
- Môi trường nhân giống B subtilis (môi trường L2): Nước chiết thịt bò 3 g/l, peptone 1,5 g/l, NaCl 5 g/l, nước cất, pH 7
- Môi trường sinh tổng hơp levan (môi trường L3): Sucrose 100 g/l, cao nấm men 2 g/l, (NH4)2SO4 3 g/l, KH2PO4 1 g/l, MgSO4 0,6 g/l, MnSO4 0,2 g/l; pH 7
- Môi trường xác định mật độ vi sinh vật (TGA): Trypton 5 g/l, glucose 4 g/l, cao nấm men 2,5 g/l, agar 18 g/l, pH 7
- NaOH 1N, ethanol 96 o (ethanol thực phẩm nhà máy đường Tuy Hòa), HCl 1%
- Các loại thuốc nhuộm như: thuốc tím kết tinh, lugon và fuchsin
- Các hợp chất tinh khiết được sử dụng trong nghiên cứu
2.3.4 Thiết bị và dụng cụ
Phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh, Viện CNSH Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp được trang bị đầy đủ các thiết bị và dụng cụ như bình tam giác có thể tích 50 ml và 250 ml, đĩa petri, ống nghiệm, ống đong và cốc đong; Pipetman 100 µL, 200 µL và 1000 µL; que cấy và que tráng để thao tác vi sinh; nồi hấp tiệt trùng, máy đo pH và cân điện tử; tủ cấy, tủ lạnh, lò vi sóng, máy ly vi sinh, tủ ấm nuôi vi sinh vật và tủ lắc.
Thiết bị và quy trình kiểm tra tại Phòng Quản lý chất lượng, Công ty Cổ phần chăn nuôi C.P Việt Nam, chi nhánh Xuân Mai, Hà Nội, gồm máy quang phổ cận hồng ngoại DS 2500F, máy Kjeltec 8000 và các chuẩn mực AOCS Official Procedure Am5-04, AOAC Ba-6a 05; đồng thời, máy đo độ cứng Kahl được dùng để đánh giá độ bền và độ bụi của sản phẩm, nhằm đảm bảo tuân thủ các tiêu chuẩn chất lượng trong ngành chăn nuôi tại Việt Nam.
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp levan (Jothi và cs, 2019)
Phương pháp nghiên cứu được thực hiện theo Jothi và cs (2019) nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp levan Chủng Bacillus subtilis được kích hoạt trên môi trường L1 qua đêm, sau đó được nuôi trên môi trường L2 ở 37°C trong 48 giờ và lắc ở tốc độ 120 vòng/phút Sau khi hoạt hóa, vi khuẩn được đưa vào bình 250 ml chứa 50 ml môi trường sinh tổng hợp levan, với các thông số nghiên cứu được mô tả trong bài.
2.4.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ sucrose
Vi khuẩn được cấp vào môi trường chứa các nồng độ đường sucrose lần lượt là 20, 40, 60, 80 và 100 g/L Chủng được nuôi lắc ở 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 37°C, pH 7 trong 24 giờ, với nồng độ nitơ 1,5 g/L Hàm lượng levan được tính cho từng nồng độ sucrose đã cho.
Tiến hành nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trường sinh tổng hợp levan chứa nguồn sucrose ở nồng độ phù hợp đã được xác định từ pH ban đầu Quá trình nuôi cấy cho thấy sự biến đổi của nồng độ sucrose và điều kiện pH ban đầu ảnh hưởng đến sự phát triển và hiệu quả sản xuất của B subtilis, từ đó các tham số nuôi cấy được điều chỉnh tương ứng và ghi nhận dựa trên các biến đổi này.
4, 5, 6, 7 và 8 trên máy lắc 150 vòng/phút ở 37 o C trong 24 giờ, nồng độ cấp nito 1,5g/l; môi trường YE Xác định hàm lượng levan ở các nồng độ pH trong thí nghiệm
2.4.1.3 Ảnh hưởng của nguồn nito
Nuôi vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp levan có bổ sung nguồn sucrose và điều chỉnh pH phù hợp Các môi trường được thử nghiệm chứa YE (cao nấm men), BE (cao thịt bò) và ME (cao thịt lợn) Các tham số vận hành được giữ cố định ở tốc độ lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 37°C và thời gian 24 giờ, với nồng độ nitơ 1,5 g/L; sau đó hàm lượng levan được xác định ở các nguồn nitơ khác nhau nhằm đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sản lượng levan.
2.4.1.4 Ảnh hưởng của nồng độ cấp nito
Để xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự sinh trưởng và tổng hợp levan của chủng vi khuẩn, nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sucrose, pH và nguồn nitơ ở các mức nitơ khác nhau Các nồng độ nitơ được chọn là 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 g/L, trong khi các tham số khác được giữ cố định ở mức tốc độ lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 37 °C và thời gian 24 giờ Tiến hành xác định hàm lượng levan thu được tại từng mức nitơ nhằm đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ lên tổng hợp levan.
2.4.1.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp
Sau khi xác định các điều kiện thích hợp cho sự phát triển vi khuẩn, bao gồm nồng độ sucrose, pH, nguồn nitơ và nồng độ nitơ, chủng vi khuẩn được cấp ở các tỷ lệ giống cấp khác nhau Các tỷ lệ giống cấp được chọn nghiên cứu gồm 2,5; 5,0; 7,5 và 10,0.
12,5% Các thông số khác được giữ ở: tốc độ lắc 150 vòng/phút ở 37 0 C trong 24 giờ Bố trí thí nghiệm và tính hàm lượng levan thu được
2.4.1.6 Ảnh hưởng của tốc độ lắc
Sau khi xác định được các khoảng điều kiện thích hợp như trên, tiến hành nuôi cấy chủng B subtilis và lắc với các tốc độ: 100, 125, 150 và 175 vòng/phút
Các thông số khác được giữ ở nhiệt độ 37 0 C trong 24 giờ và thí nghiệm được xác định hàm lượng levan theo các tốc độ lắc khác nhau
2.4.2 Phương pháp tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp levan theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken (Bruna và cs, 2013)
Quá trình tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp levan được tiến hành theo quy hoạch Box-Behnken nhằm xác định ảnh hưởng của các biến đầu vào lên năng suất và chất lượng của sản phẩm levan Việc phân tích và tối ưu hóa được thực hiện trên phần mềm Design-Expert của State-Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ để xây dựng mô hình, đánh giá sự tương tác giữa các biến và xác định điều kiện tối ưu cho từng tham số Nhờ đó, có thể tối ưu hóa điều kiện vận hành, nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp levan và đảm bảo tính khả thi của quy trình ở quy mô phòng thí nghiệm và công nghiệp.
Bước 1 Xây dựng mô hình toán học dạng y = y0 + b1X1 + b11X1 2 + b2X2 + b22X2 2 + b3X3 + b33X3 2 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3
Xác định các biến ảnh hưởng, các mức của từng biến và khoảng biến đổi của chúng dựa trên khảo sát thực nghiệm và tham khảo các tài liệu đã công bố Các biến số và khoảng biến đổi của chúng được thể hiện trong Bảng 2.1, nhằm làm rõ phạm vi biến đổi và tác động của từng yếu tố đối với kết quả nghiên cứu.
Bảng 2.1 Bảng xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi từng biến số
Biến số Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1
X3 Tốc độ lắc vòng/phút 100 150
Thiết kế thực nghiệm Box-Behnken cho 3 yếu tố được thực hiện với 17 thí nghiệm kết hợp các mức -1 (mức thấp nhất), 0 (mức trung bình) và +1 (mức cao nhất) Trong thiết kế này có 5 thí nghiệm lặp lại tại tâm, tức là các yếu tố đều ở mức 0, nhằm ước lượng tác động phi tuyến và sự tương tác giữa các yếu tố một cách hiệu quả.
Quá trình tổng hợp levan được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy lỏng Trong quy trình này, bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường nuôi và được ủ trong 24 giờ, sau đó levan kết tủa và được thu nhận.
Bước 2 Cực đại hóa hàm mục tiêu theo phương pháp hàm kì vọng
Tìm cực trị của phương trình hồi quy y = b0 + b1X1 +b11X1 2 + b2X2 + b22X2 2
+ b3X3 + b33X3 2 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 bằng phần mềm Design-Expert cho kết quả giá trị cực trị tại X1, X2, X3 tương ứng với pH, nồng độ nito và tốc độ lắc
Do vậy, hàm lượng levan đạt cao nhất tại các giá trị cực trị X1, X2, X3 đó
2.4.3 Phương pháp nghiên cứu điều kiện thu nhận levan
Bài viết mô tả phương pháp thu nhận levan từ canh trường nuôi cấy B subtilis bằng phương pháp kết tủa các dung môi ethanol 96%, isopropanol và aceton Quá trình được tiến hành theo tỉ lệ thể tích dịch chiết levan với dung môi ở các mức 1:1, 1:2, 1:3 và 1:4, thực hiện ở ba mức nhiệt độ -50°C, 0°C và 32°C trong các thời gian 1 giờ, 3 giờ và 5 giờ, sau đó lọc và thu cặn để xác định hàm lượng levan thu được trong các thí nghiệm.
* Phương pháp xác định hàm lượng levan
Levan được thu được sau quá trình kết tủa cồn và thuỷ phân bằng HCl 1 M ở 100°C trong 1 giờ Dịch thuỷ phân được trung hoà bằng NaOH 2 M và hàm lượng fructose được xác định bằng phản ứng màu DNS và đo ở bước sóng 540 nm (Berte và cs, 2013).
Do levan là polymer của fructose nên hàm lượng levan được tính theo công thức: L = F × 0,9 (Szwengiel và cs, 2004)
0,9: Là hệ số chuyển đổi
2.4.4 Phương pháp xây dựng quy trình sản xuất cám gà cảnh bổ sung levan (giai đoạn 1-14 ngày tuổi)
2.4.4.1 Tỷ lệ levan phối trộn
Để nuôi gà con giai đoạn 1–14 ngày tuổi đạt hiệu quả, áp dụng công thức cám được trình bày trong bảng 2.2 của Công ty Cổ phần chăn nuôi CP Việt Nam, sau đó bổ sung levan vào công thức để tối ưu tiêu hóa và tăng trưởng cho gà.
0,1; 0,2 và 0,3% vào thức ăn phối trộn theo công thức trên từ đó lựa chọn chế độ dinh dưỡng phù hợp Thí nghiệm được bố trí theo bảng 2.3
Bảng 2.2 Thành phần nguyên liệu trong công thức cám gà con giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi
Loại nguyên liệu Tỷ lệ (%)
Bảng 2.3 Thành phần dinh dưỡng sau khi bổ sung levan theo các tỷ lệ
Bổ sung 0,1% levan (Công thức 1)
Bổ sung 0,2% levan (Công thức 2)
Bổ sung 0,3% levan (Công thức 3)
CP (AOAC 2001.11) Fat (Ankom method 201- 30-09)
Năng lượng (kcal/kg) (Caculation)
P (AOAC 927.02, 2016) Lysin (European diretive 98/64 EC, 2257/16)
2.4.4.2 Phương pháp xác định nhiệt độ ép viên
Sau khi lựa chọn công thức cám tối ưu, tiến hành phối trộn và ép viên Nhiệt độ ép viên được thử ở ba mức 70°C, 80°C và 90°C nhằm xác định hàm lượng levan còn lại ở từng mức nhiệt, thông qua đo hàm lượng đường tổng cộng và các chỉ tiêu ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của cám thành phẩm.
Các máy đo độ bền, máy đo độ cứng và máy đo độ bụi được vận hành tại phòng kiểm tra chất lượng nhằm đảm bảo tuân thủ các tiêu chuẩn sản phẩm Hàm lượng đường tổng số trong mẫu được xác định theo một phương pháp chuẩn, được mô tả chi tiết trong quy trình phân tích để đảm bảo độ chính xác và tính lặp lại của kết quả.
2.4.4.3 Bố trí thí nghiệm và thể hiện kết quả được thực hiện trong bảng 2.4
Bảng 2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ép viên đến chất lượng cám viên
Chỉ tiêu Công thức đối chứng Công thức 1
Hàm lượng đường tổng số (%) Độ ẩm (%)
CP (%) Fat (%) Fib (%) Năng lượng (Kcal/kg)
Chỉ tiêu Công thức đối chứng Công thức 1
P (%) Lysin (%) Độ ẩm (%) Độ bền (%) Độ cứng (kg) Độ bụi (%)
Bảng 2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ ép viên đến các chỉ tiêu vi sinh
Chỉ tiêu Công thức đối chứng Công thức 1