LUẬN văn THẠC sĩ HAY nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập từ giống ngô địa phương việt nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng​

Theo nhóm nghiên cứu, sự biểu hiện toàn thể của gen ZmbZIP72 dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S ở các dòng cây Arabidopsis chuyển gen đã làm tăng đáng kể khả năng thích ứng với khô

VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI TÀI NGUYÊN VÀ SINH VẬT

PHẠM THỊ HẰNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM GEN ZmBZIP72 PHÂN LẬP TỪ GIỐNG NGÔ ĐỊA

PHƯƠNG VIỆT NAM VÀ THIẾT KẾ CẤU TRÚC MANG GEN PHỤC VỤ

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO CÂY TRỒNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TS HUỲNH THỊ THU HUỆ

Hà Nội - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, Ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Phạm Thị Hằng

LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Huỳnh Thị Thu Huệ - Phó trưởng phòng Đa dạng sinh học hệ gen – Viện Nghiên cứu hệ gen đã tận tình

hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Luận văn này được thực hiện tại phòng Đa dạng sinh học hệ gen – Viện Nghiên cứu

hệ gen với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài cấp nhà nước: “Phân lập thiết kế gen chịu hạn phục

vụ công tác tạo giống ngô biến đổi gen” giai đoạn 2014-2018 do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn quản lý

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và cho tôi những lời khuyên cũng như những góp ý quý báu trong quá trình tôi thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, Ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Phạm Thị Hằng

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ABA Abscisic acid ABF ABRE binding factor ABRE AB -responsive element AP2/EREBP APETALA2/ethylene responsive element binding protein AREB ABA responsive element binding protein

bZIP basic leucine zipper CaMV Cauliflower mosaic virus CBF CRT binding factor CBU Crop Biotech Update

CDPK Calcium-dependent protein kinase CDS Coding DNA sequence

DST Drought and Salt Tolerance EAR ERF-associated amphiphilic repression EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

ERD1 Early responsive to dehydration ERF Ethylene responsive e blement EtBr Ethidium bromide

FAO Food and Agriculture Organization

FAS-USDA Foreign Agricultural Service-United States Department of Agriculture HSP Heat Shock Protein

LEA Late embryogenesis abundant MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight MCS Multiple cloning site

NACRS NAC recognition sequence NAM No apical meristem

NF-Y Nuclear factor Y PCR Polymerase Chain Reaction PIS Phosphatidylinositol synthase PKC Protein kinase C

PTMs Post translation modifications

RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction sHSP Small heat shock protein

TF Transcription factor WFP World Food Programme

WMO World Meteorological Organization

ZAT Zinc transporter ZFP Zinc finger protein

Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 21 - 22

Bảng 2.2 Thành phần các môi trường sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 22 - 23

Bảng 3.2 Danh sách mẫu cây chuyển gen ZmbIP72 thu được 58

Hình 3.2 Sản phẩm PCR nhân gen Actin từ các mẫu cDNA 39

Hình 3.4 Tách chiết và chọn lọc plasmid mang gen ZmbZIP72 41 Hình 3.5 Kiểm tra plasmid pJET 1.2 mang đoạn gen ZmbZIP72 42 Hình 3.6 So sánh trình tự nucleotide giữa đoạn gen ZmbZIP72 từ giống Tẻ

vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham chiếu

43

Hình 3.7 So sánh trình tự acid amin suy diễn của đoạn CDS trên đoạn gen

ZmbZIP72 giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham

chiếu

44

Hình 3.8 Kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ZmbZIP72SacI F/R 45 Hình 3.9 Kết quả cắt enzyme giới hạn BglII trên các plasmid pJET 1.2 46

Hình 3.10 Tách chiết và chọn lọc plasmid pRTL2 mang gen ZmbZIP72 47

Hình 3.11 Sản cắt plasmid pRTL2_ZmbZIP72 bằng enzyme HindIII 47

Hình 3.12 Sản phẩm cắt plamsid pRTL2_ZmbZIP72 với enzyme BamHI

Hình 3.15 Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp 01 bằng enzyme SacI, HindIII 51

Hình 3.16 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen ZmbZIP72 từ 4 dòng plasmid 53 Hình 3.17 Minh hoạ quá trình biến nạp và tái sinh cây ngô chuyển gen 56

Hình 3.18 DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá cây chuyển gen ZmbZIP72

thế hệ T0

60

Hình 3.19 Sản phẩm PCR nhân gen chỉ thị hygromycin ở các cây chuyển

gen T0

61

Hình 3.20 Sản phẩm PCR nhân gen đích ZmbZIP72 ở cây chuyển gen T0 62

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán , 3

1.1.1 Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật 3

1.1.3.1 Các gen mã hoá protein chức năng 5

1.1.3.2 Các gen mã hoá protein truyền tín hiện 6

1.1.3.3 Các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã 7

1.2 Họ bZIP là yếu tố điều khiển phiên mã trong cảm ứng chống chịu hạn ở thực vật 10

1.3. Cấu trúc và chức năng của gen ZmbZIP72 12

1.4 Cây ngô và vấn đề chịu hạn 14

1.5 Nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen 17

1.6. Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu và hoá chất nghiên cứu 21

2.1.1 Mẫu thực vật 21

2.1.2 Các vật liệu khác 21

2.1.3 Hoá chất 21

2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số từ thực vật 24

2.2.2 Tách chiết RNA tổng số từ thực vật 25

2.2.3 Sinh tổng hợp cDNA sợi thứ nhất 26

2.2.4 Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR 26

2.2.5 Tinh sạch các đoạn DNA trên gel agarose 27

2.2.6. Tạo dòng gen và thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 28 2.2.7. Biến nạp các vector tái hợp vào tế bào vi khuẩn E coli DH10β và A tumefaciens 30

2.2.8 Tách chiết và tinh sạch plasmid 32

2.2.9 Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn 33

2.2.10 Điện di trên gel agarose 33

2.2.11. Chuyển gen vào thực vật thông qua A tumefaciens 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1. PHÂN LẬP GEN ZmBZIP72 TỪ CÂY NGÔ 37

3.1.1 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô 37

3.1.2 Tổng hợp cDNA sợi thứ nhất 38

3.1.3. RT-PCR nhân gen ZmbZIP72 39

3.1.4. Tạo dòng gen ZmbZIP72 trong vector pJET1.2 40

3.1.5. Xác định và phân tích trình tự gen ZmbZIP72 42

3.2. Thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 44

3.2.1. PCR nhân gen ZmbZIP72 với cặp mồi treo vị trí enzyme SacI 44

3.2.2. Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72 46

3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72 49

3.3. Tạo chủng A tumefaciens mang cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 52

3.4. Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô 54

3.5. Đánh giá cây ngô T0 chuyển gen ZmbZIP72 58

3.5.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số cây ngô chuyển gen 59

3.5.2 Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chỉ thị hygromycin 60

3.5.3. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

1 Kết luận 64

2 Kiến nghị 64

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

Những khu vực khác bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi hạn hán trong những tháng đầu năm

2016 bao gồm phần lớn các khu vực ở phía Bắc Nam Mỹ, các vùng phía đông của Australia, các hòn đảo thuộc phía Tây Thái Bình Dương và các nước Đông Nam Á thuộc lưu vực sông Mekong đặc biệt là Việt Nam Chương trình Lương thực thế giới (WFP) ước tính sẽ

có khoảng 17 triệu người cần được hỗ trợ vào đầu năm 2017 (WMO, 2016)

Cây ngô là một trong các loại cây ngũ cốc quan trọng đối với con người Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa và được trồng ở nhiều vùng khác nhau Theo số liệu của Tổng cục thống kê, diện tích trồng ngô ở nước ta năm 2015 ước đạt 1164,8 nghìn ha, sản lượng ước đạt 5287,2 nghìn tấn và năng suất bình quân đạt 4,54 tấn/ha (https://www.gso.gov.vn) Tuy nhiên, sản xuất ngô ở Việt Nam hiện vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước, năm 2015 nước ta vẫn phải nhập khẩu khoảng 7,55 triệu tấn ngô (https://www.gso.gov.vn ) Một trong những nguyên nhân chính là do việc canh tác ngô ở Việt Nam chủ yếu dựa vào nguồn nước mưa tự nhiên Điều này ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tăng năng suất và sản lượng ngô hàng năm và đặc biệt là trong điều kiện nắng hạn kéo dài Do đó, việc nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn đang là chủ đề nghiên cứu của nhiều tổ chức và các nhà khoa học Trong nhiều năm gần đây, việc ứng dụng công nghệ sinh học đặc biệt là công nghệ gen để cải thiện khả năng chịu hạn của cây

trồng đang được quan tâm Tuy nhiên, ở nước ta, những thành tựu trong nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn vẫn còn hạn chế Nguyên nhân gồm cả khách quan và chủ quan như nguồn gen chưa được tập trung khai thác/nghiên cứu nhiều, công nghệ chuyển gen chưa được tiếp cận sớm, đồng thời cây ngô cũng là đối tượng khó để chuyển gen vào hệ gen

Ở thực vật, trong quá trình thích nghi với điều kiện hạn, sự biểu hiện và các cơ chế điều hòa mức độ biểu hiện của các gen có vai trò quan trọng Sự biểu hiện của gen liên

quan chặt chẽ với các yếu tố điều khiển phiên mã Gen ZmbZIP72 là một trong những gen

mã hóa cho yếu tố điều khiển phiên mã của cây ngô đã được phân lập và mô tả bởi Sheng

và cộng sự (2012) Theo nhóm nghiên cứu, sự biểu hiện toàn thể của gen ZmbZIP72 dưới

sự điều khiển của promoter CaMV35S ở các dòng cây Arabidopsis chuyển gen đã làm tăng đáng kể khả năng thích ứng với khô hạn, cho thấy vai trò tiềm năng của gen ZmbZIP72

trong việc tăng cường khả năng chịu hạn đối với cây chuyển gen Trên cơ sở đó, chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập từ giống ngô

địa phương Việt Nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên cứu chuyển gen

vào cây trồng” mục tiêu là phân lập gen và chuyển gen ZmbZIP72 vào cây dòng ngô K7

để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn Các nội dung nghiên cứu

cụ thể như sau:

- Phân lập, tách dòng gen ZmbZIP72 từ giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) của

Việt Nam

- Xác định và phân tích trình tự của gen ZmbZIP72

- Thiết kế các vector mang gen ZmbZIP72

- Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô thông qua vi khuẩn A tumefaciens

- Kiểm tra sự có mặt của gen ZmbZIP72 trong cây chuyển gen T0 bằng kỹ thuật PCR

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán 1.1.1 Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật

Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm của cây trồng Khi môi trường hạn hán, cây bị mất nước dẫn đến nhiều hậu quả nghiêm trọng: (i) Gây nên hiện tượng co nguyên sinh và làm cho cây bị héo Sự co nguyên sinh chất xảy ra khi tế bào bị stress nước làm cho nước trong tế bào bị thất thoát ra ngoài nên khối nguyên sinh chất của tế bào co lại, thể tích không bào bị thu hẹp Khi cây sống trong môi trường thiếu nước kéo dài, tế bào mất nước dẫn đến các mô trở nên mềm yếu và sự héo xảy ra Mô thực vật bị héo tạm thời nhưng cũng có thể vĩnh viễn nếu sự thiếu nước xảy

ra nghiêm trọng và trong thời gian dài (ii) Môi trường sống bị khô hạn cản trở sự vận chuyển nước trong mạch gỗ Trong điều kiện thiếu nước, sự cung cấp nước cho rễ không

đủ trong đêm để thủy hóa các mô đã bị thiếu nước ban ngày, dẫn đến các lông hút bị tổn thương lớp ngoài, vùng vỏ bị phủ chất sáp (suberin) làm giảm áp suất rễ nên ảnh hưởng đến đẩy cột nước lên cao trong mạch gỗ Đặc biệt khi thiếu nước sẽ hình thành nhiều bọt khí trong mạch gỗ dẫn đến phá vỡ tính liên tục của cột nước làm cho cột nước trong mạch

gỗ không được đẩy lên liên tục (iii) Hạn hán làm dày lớp cutin trên bề mặt lá làm giảm sự thoát hơi nước qua biểu bì (iv) Sự thiếu nước làm giảm cường độ quang hợp Khi hàm lượng nước trong lá còn khoảng 40 -50%, quang hợp của lá bị đình trệ (v) Đặc biệt, hạn hán cản trở sự sinh trưởng của cây trồng Thiếu nước ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý,

nhất là quang hợp nên làm giảm sinh trưởng và năng suất cây trồng nghiêm trọng (Abdullah

et al., 2011; Belkheiri & Mulas, 2013)

Việc giảm năng suất do hạn hán đã được báo cáo ở nhiều loại cây trồng, mức độ

nghiêm trọng phụ thuộc vào thời gian xảy ra hạn Ở lúa mạch (Hordeum vulgare), hạn hán

làm giảm năng suất do số lượng của chồi, cụm hoa, hạt trên mỗi cây và trọng lượng của mỗi hạt bị giảm Ở ngô, stress hạn làm giảm năng suất do trì hoãn việc phun râu, do đó làm tăng thời gian chênh lệch trỗ cờ - phun râu Đặc tính này liên quan chặt chẽ với năng suất

hạt, cụ thể là số bắp và số hạt trên mỗi cây bị ảnh hưởng (Cattivelli et al., 2008) Thâm hụt

nước trong suốt quá trình thụ phấn làm tăng tần số hạt không phát triển ở ngô Ở cây đậu

triều (Cajanus cajan), hạn hán diễn ra trong giai đoạn nảy mầm làm sản lượng hạt bị giảm

đi 40 – 55% (Nam et al., 2001) Trong giai đoạn sinh sản, thiếu hụt nước làm giảm sản lượng ở bông (Gossypium hirsutum) do việc giảm hình thành và sự phát triển không đầy

đủ của các quả nang Hạn hán ở đậu tương cũng làm giảm tổng sản lượng hạt (Frederick et al., 2001) Hạn hán ít có ảnh hưởng đến tỷ lệ hạt mẩy trên lúa mỳ nhưng thời gian hình

thành hạt ngắn hơn và trọng lượng khô bị giảm khi trưởng thành (Wardlaw and Willenbrink, 2000)

1.1.2 Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật

Để chống lại khô hạn, thực vật có những biến đổi sinh lý, hóa sinh phù hợp Có hai

cơ chế bảo vệ thực vật tồn tại trong môi trường thiếu nước: cơ chế tránh mất nước và cơ chế chịu mất nước Cơ chế tránh mất nước liên quan đến đặc điểm cấu trúc và hình thái của bộ rễ (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998) Những cây chịu hạn có bộ rễ khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những nơi sâu, xa trong đất, hoặc lan rộng với

số lượng lớn để tăng diện tích tìm kiếm nước (Nguyễn Lan Điền, 2003) Cơ chế này phụ thuộc vào khả năng thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi nhằm giảm mất nước một cách tối đa (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998) (Đinh Thị Phòng, 2001) Trong khi đó, cơ chế chịu mất nước liên quan đến những thay đổi hóa sinh diễn ra trong tế bào nhằm sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước Trong điều kiện khô hạn, áp suất thẩm thấu của dịch bào được điều chỉnh tăng lên, giúp cho tế bào thu nhận được những phân tử nước ít ỏi còn lại trong đất Nhờ vậy, thực vật có thể vượt qua

được tình trạng hạn cục bộ (Steponkus P.L et al, 2003) Tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu

nội bào còn thông qua tích lũy các chất hòa tan, các protein, các axit amin ví dụ như: axit amin prolin, mannitol, fructose, K+, các enzyme phân hủy gốc tự do… Sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu có hai chức năng: Giữ và lấy nước vào trong tế bào và ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+; thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hóa, tương tác với lipid hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng và các phức protein (Lê Trần Bình,

Lê Thị Muội, 1998)

1.1.3 Cơ chế phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật

Việc nắm được các cơ chế phân tử của phản ứng chịu hạn ở thực vật là vô cùng quan trọng đối với việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây trồng Các nghiên cứu gần đây

đã phân lập được hàng trăm gen được cảm ứng hoặc ức chế khi cây gặp điều kiện khô hạn

Tuy nhiên, chỉ một phần rất nhỏ các gen được kiểm chứng về vai trò của nó trong việc tăng tính chịu hạn của cây Những gen này có thể phân vào các nhóm dựa vào chức năng nội bào như: các gen mã hoá protein chức năng, các gen mã hoá yếu tố truyền tín hiệu và các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã…

1.1.3.1 Các gen mã hoá protein chức năng

Các gen liên quan đến chức năng bảo vệ trực tiếp lên màng tế bào và protein như LEA protein, heat shock protein (HSP), cold shock protein (CSP) LEA là một nhóm các protein tự nhiên tích tụ trong hạt phấn hoa, hạt và các mô thực vật trong quá trình đáp ứng lại các stress phi sinh học Việc tích luỹ các protein LEA liên quan trực tiếp với khả năng

chịu khô hạn ở thực vật (Amara et al 2012) Bên cạnh dữ liệu phong phú về cấu trúc và sự

biểu hiện của protein này, ngày càng có nhiều các công trình đề cập đến việc sử dụng các

gen LEA nhằm cải thiện tính chống chịu khô hạn ở thực vật (Grelet et al., 2005) Ví dụ, gen HVA1 mã hoá nhóm protein LEA3 của cây lúa mạch (Hordeum vulgare L.) Người ta

đã chuyển nạp gen này thành công vào cây ngô để tăng cường khả năng chịu hạn và mặn

trong điều kiện nhà lưới (Nguyen et al., 2013) Gen OsLEA3-1 nhạy cảm với mặn đã thể

hiện tính chống chịu khô hạn trong điều kiện đồng ruộng nhờ sự điều khiển của promoter

CaMV35S và promoter HVA1-like (Xiao et al 2007)

Các protein sốc nhiệt (HSP) và sốc lạnh (CSP) là các chaperone ngăn ngừa sự biến

đổi và gấp nếp của các thành phần tế bào trong điều kiện stress Các gen CspA và CspB từ

vi khuẩn đã được chuyển vào ngô để tăng cường khả năng chịu hạn, nóng, và lạnh bằng cách bảo vệ quá trình quang hợp, sinh dưỡng và các giai đoạn sinh trưởng, sinh sản Năng

suất tăng lên khoảng 11 – 12% đối với cây ngô chuyển gen CspA và CspB thông qua việc đánh giá các thử nghiệm về năng suất trong nhiều năm, ở nhiều địa điểm (Yang et al.,

2010) sHSP17.2, sHSP17.4 và sHSP26 là 3 protein sốc nhiệt nhỏ đã được xác định bằng

cách sử dụng quang khối phổ MALDI-TOF ở lá ngô khi đáp ứng với stress hạn Các phân tích hệ phiên mã cho thấy mức biểu hiện của các sHSP này được điều chỉnh tăng lên khi đáp ứng với stress nhiệt và hạn ở lá ngô ABA chịu trách nhiệm điều hoà biểu hiện sau

phiên mã các sHSP này (Hu et al 2010)

Protein Cyclophilin (CYP) liên quan đến nhiều chức năng như phân chia tế bào, truyền tín hiệu tế bào, vận chuyển protein, điều hoà phiên mã, cắt nối tiền mRNA và khả

năng chịu stress (Trivedi et al 2012) Các phân tích silico cho thấy rằng việc đáp ứng stress

của thực vật có liên quan với các protein cyclophilin Các protein CYP ở lúa, ngô,

Arabidopsis, lúa mạch và brachypodium giống nhau đến trên 80% cho thấy tần số cao các trình tự bảo thủ CYP thường gặp ở lục lạp, cytosol, và ty thể (Trivedi et al 2013) Đánh

giá so sánh chỉ ra rằng mRNA chịu trách nhiệm tổng hợp CYP được phát hiện với tần số cao ở ngô sau 6 – 7 giờ xử lý stress hạn, ở đậu mất khoảng 48 giờ

1.1.3.2 Các gen mã hoá protein truyền tín hiện

Nhiều hệ thống truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng với điều kiện bất lợi phi sinh học, bao gồm kinase, enzyme chuyển hoá phospholipid, calcium sensing… Mặc dù các quá trình truyền tín hiệu này khá phức tạp và chưa được hiểu rõ, một vài gen mã hoá cho các yếu tố truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng chịu hạn đã được phân lập Một vào yếu tố gần đây đã được sử dụng trong tạo tính chịu hạn ở cây chuyển gen như: NPK

(Kovtun et al, 2000), SnRK2 (Umezawa et al., 2004), CBL (Cheong et al., 2003) Cũng

giống như các yếu tố điều khiển phiên mã, việc biến đổi một yếu tố truyền tín hiệu có thẻ làm thay đổi một loạt các sự kiện sau đó, kết quả là tạo khả năng chống chịu ở nhiều mặt

Ví dụ, NPK1 là một kinase của Nicotinana NPK1 nằm ở giai đoạn đầu của con đường

truyền tín hiệu oxi hoá và dẫn đến khả năng chịu hạn, lạnh, nóng và muối ở cây ngô chuyển

gen (Shou et al., 2014) PIS (Phosphatidylinositol synthase) là một enzyme quan trọng

trong con đường tổng hợp phosphatidylinositol không những là một thành phần cấu trúc màng tế bào mà còn là tiền chất của phần tử tín hiệu điều hoà đáp ứng của cây trước điều

kiện bất lợi Khi biểu hiện quá mức gen ZmPIS trong cây ngô, cây tăng cường khả năng chịu hạn đặc biệt là giai đoạn trước khi nở hoa (Liu et al., 2013)

1.1.3.3 Các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã

Yếu tố điều kiển phiên mã (TF) là các protein có vai trò kiểm soát quá trình phiên

mã bằng cách bám vào các vùng trình tự đặc hiệu trên promoter của gen Các yếu tố điều khiển phiên mã hiện nay được các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu và khai thác do

tiềm năng sử dụng lớn trong công nghệ sinh học (Saibo et al., 2009; Century et al., 2008)

Hiện nay, những nghiên cứu sinh học phân tử đã chỉ ra rằng abscisic acid (ABA) đóng vai trò quan trọng trong việc đáp ứng và thích nghi với các stress phi sinh học Người ta nhận thấy rằng, bên cạnh phần lớn các gen đáp ứng với stress được điều hòa bằng ABA, vẫn còn một lượng các gen không chịu ảnh hưởng bởi ABA Do đó, các yếu tố phiên mã cũng được chia thành nhóm phụ thuộc hay độc lập với ABA Các TF của hơn 50 họ khác nhau mã hoá

cho 1700 gen khác nhau đã được tìm thấy trong Arabidopsis (Yang et al., 2010) Các TF

được trình bày dưới đây đều là các TF đáp ứng với hạn và chịu hạn

TF bZIP là một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã phụ thuộc ABA ABA responsive element binding factors (AREB/ABF) là một thành viên của nhóm TF bZIP liên quan đến tín hiệu ABA trong điều kiện hạn hán và trưởng thành của hạt AREB/ABF nhận biết và bám vào ABA responsive element (ABRE) yếu tố hoạt động cis để điều khiển sự

hoạt động của các gen phía sau (Mundy et al., 1990) ABRE nằm trong vùng promoter của

các gen đáp ứng ABA (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 2006) Việc đóng khí khổng

và giảm sự thoát hơi nước là kết quả của việc tăng hàm lượng ABA do sự biểu hiện quá

mức của AREB1/ABF2, ABF3 hoặc AREB2/ABF4 (Kang et al., 2002) Sự biểu hiện quá mức của gen ABF3 ở cây lúa chuyển gen cho thấy khả năng chịu hạn thông qua việc tăng cường độ phát huỳnh quang của diệp lục (Fv/Fm) và giảm sự héo và cuộn xoắn ở lá (Oh et al., 2005) Các cây chuyển gen AREB1 được điều khiển bởi 35S promoter cho thấy khả

năng sống sót vượt trội (100%) so với cây đối chứng (40%) trong điều kiện hạn, không những vậy cây chuyển gen còn có hiệu năng sử dụng nước cao hơn và có nhiều lá hơn so

với dòng đối chứng (Leite et al., 2014)

Một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã lớn khác là WRKY, TF này được tìm thấy ở nhiều loài, đặc biệt là ở các loài thực vật bậc cao (Ulker and Somssich, 2004)

Gần đây, các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu vai trò của nhóm TF này trong đáp

ứng của cây với các điều kiện bất lợi phi sinh học, đặc biệt là hạn hán ở Arabidopsis, lúa mạch (Luo et al., 2013; Xiong et al., 2010) Mới đây, các nhà khoa học đã phân lập được gen ZmWRKY58 từ ngô và sự biểu hiện của gen này ở các dòng lúa chuyển gen làm tăng khả năng chống chịu hạn và muối (Cai et al., 2014)

NAC (NAM, ATAF1-2, CUC2) là một họ TF đặc trưng cho thực vật, bao gồm các

vùng NAC bám DNA có tính bảo thủ cao (Guo et al., 2008) Có hơn 100 gen mã hóa cho các protein NAC đã được xác định trên đối tượng Arabidopsis Các protein NAC có nhiều

chức năng, không chỉ tham gia vào sự phát triển của cây mà còn tham gia vào phản ứng

chống chịu stress của thực vật (Nakashima et al., 2012) Có khoảng 40 TF NAC trong số

140 được tìm thấy chịu trách nhiệm đối khả năng chịu hạn và mặn ở lúa NAC019, NAC055

và NAC072 là các thành viên của họ các yếu tố phiên mã NAC, chúng nhận biết và bám vào yếu tố NACRS (CATGTG) nằm trong vùng promoter của các gen đáp ứng nhanh với

mất nước (ERD1) và tăng cường khả năng chống mất nước (Tran et al., 2004) Sự biểu hiện của gen SNAC1 trong cây lúa biến đổi gen làm tăng độ thụ phấn của hoa lên 17 -22%

và khả năng hình thành hạt lên 22 -34% so với các cây đối chứng trong điều kiện hạn hán

vừa và nặng (Hu et al., 2006) Các cây lúa chuyển gen OsNAC6 tăng cường tính chịu hạn

và mặn, ngoài ra còn tăng cường tính kháng bệnh bạc lá so với cây đối chứng (Nakashima

et al., 2007) Cũng nằm trong nhóm NAC, các cây lúa chuyển gen OsNAC9 có tính chịu

hạn rất cao đồng thời, năng suất tốt hơn 13 – 32% so với các cây đối chứng trong điều kiện

bình thường và khô hạn (Redillas et al., 2012)

Một số TF đáp ứng mất nước nhưng không liên quan đến ABA, chúng được gọi là các TF đáp ứng mất nước không phụ thuộc ABA Phân tích vùng promoter của các gen biểu hiện không phụ thuộc ABA trong phản ứng stress của thực vật cho thấy một yếu tố

hoạt động cis với trình tự A/GCCGAC là vị trí liên kết của các TF này, được biết đến như

yếu tố đáp ứng mất nước (DRE- dehydration responsive element) Họ TF đáp ứng mất nước độc lập ABA điển hình là họ DREB Các TF này đóng vai trò điều tiết trong điều

kiện stress hạn, lạnh và sự phát triển của lá, hoa, và hạt (Yang et al., 2010) Có 2 loại DREB

(DREB1 và DREB2) được tìm thấy đáp ứng cho những stress khác nhau DREB1 đáp ứng với stress lạnh trong khi DREB2 đáp ứng với stress hạn, nhiệt và mặn Sự biểu hiện quá

mức của ZmDREB1A (DREB1A của Zea mays L.) và OsDREB1A (DREB1A của Oryza sativa L.) ở Arabidopsis làm tăng cường sự hoạt động của các gen phía sau và tăng cường khả năng chống chịu stress hạn hán, nhiệt và mặn (Qin et al 2004; Yang et al., 2010)

Promoter ZmUbi (Zea mays L Ubiquitin) có hiệu quả trong điều khiển các gen DREB1A, DREB1B và DREB1C ở Arabidopsis để cải thiện khả năng chống chịu hạn hán (Yang et al., 2010) Sự biểu hiện của DREB2A-CA đã cảm ứng biểu hiện một loạt các gen sốc nhiệt

và tăng cường khả năng chịu hạn của các cây chuyển gen (Sakamura et al., 2006) Rất

nhiều cây trồng đã được chuyển gen thử nghiệm nhằm biểu hiện yếu tố phiên mã

DREB/CBF như đậu phộng (Arachis hypogaea) (Bhatnagar-Mathur et al., 2014), khoai tây (Iwaki et al., 2013), đậu nành (de Paiva Rolla et al., 2014), lúa (Datta et al., 2012; Ito et al., 2006), lúa mỳ (Saint Piere et al., 2012) đều cho kết quả cải thiện khả năng chịu hạn

một cách đáng kế ở các cây chuyển gen HARDY là một thành viên khác của họ TF DREB được biểu hiện trong mô sẹo Sự biểu hiện quá mức của thành viên này có ảnh hưởng đa tính trạng lên sự tăng trưởng của thực vật và hình thành rễ dày đặc và lá xanh dày HARDY cải thiện hiệu quả sử dụng nước thông qua cải thiện quang hợp và giảm sự thoát hơi nước

(Karaba et al., 2007)

Protein zinc finger (ZFP) là protein phổ biến nhất ở tế bào nhân thực, chức năng của các protein này khá đa dạng, bao gồm bám DNA và RNA, hoạt hoá phiên mã, điều hoà quá tình tự chết, điều hoà sự cuộn gấp và kết hợp protein Nhiều protein ZFP được chứng minh

là có khả năng làm tăng khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi Các TF này tham gia tự động vào phản ứng stress thông qua hoạt động như chất hoạt hoá hoặc ức chế phiên mã (Sakamoto et al 2000, 2004) Các thành viên của họ ZFP như: OsZFP252 (Xu et al 2008)

và ZAT10 (Xiao et al., 2009) tích cực tham gia vào việc điều hoà phản ứng mất nước DST

là một chất điều hoà âm tính, cải thiện khả năng chịu hạn và mặn thông qua việc giảm biểu

hiện của gen (Huang et al., 2009) C2H2 ZFP, EAR và ZAT10 là thành viên của TF ZFP

cải thiện khả năng chịu hạn ở lúa (Yang et al., 2010)

Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu tập trung vào các yếu tồ điều khiển phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật cũng đang được các nhóm nghiên cứu quan tâm Nhóm

nghiên cứu của Phạm Xuân Hội đã phân lập một số gen TF (OsNAC1, OsNAC6, OsDREB1A, OsDREB2A, OsAREB1A và ZmDREB2A) từ các giống lúa, ngô Việt Nam và chuyển gen vào cây mô hình lúa và Arabidopsis (Phạm Thu Hằng et al., 2014; Nguyễn Duy Phương et al., 2014; Nguyễn Thị Phương Dung và Phạm Xuân Hội, 2010; Cao Lệ Quyên et al., 2012; Phạm Thu Hằng và Phạm Xuân Hội, 2012 ) Một nhóm tác giả khác cũng đã chuyển thành công các gen TF OsRAP2.4A, OsNLI-IF1 và cây lúa nhằm nghiên

cứu đặc tính của các yếu tố phiên mã này để tăng cường mức độ chịu hạn và mặn của cây

trồng (Nguyen Duy Phuong and Pham Xuan Hoi 2015, Nguyen Duy Phuong et al., 2014)

Cao Lệ Quyên và đồng tác giả (2009) đã phân lập được gen MtOsDREB2A từ thư viện

cDNA xử lý hạn của giống lúa Mộc tuyền Đây là nguồn gen điều khiển chịu hạn từ chính

nguồn thực vật của Việt Nam, là cơ sở cho các nghiên cứu tính chịu hạn trên cây lúa Nhóm

nghiên cứu của Nguyễn Văn Đồng cũng đã áp dụng thành công các gen yếu tố điều khiển

phiên mã NF-YB2, MYB trong việc chọn tạo giống ngô và đậu tương có khả năng chống

chịu với điều kiện khô hạn (Nguyễn Văn Đồng và Nguyễn Hữu Kiên, 2013; Nguyễn Văn

Đồng et al., 2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2015) Gen DREB1A cũng được áp dụn g ở đậu tương (Trần Thị Cúc Hoà, 2009; Trần Thị Cúc Hoà et al., 2015) để chọn tạo giống đậu

tương có khả năng chống chịu hạn

1.2 Họ bZIP là yếu tố điều khiển phiên mã trong cảm ứng chống chịu hạn ở thực

vật

Basic leucine zipper (bZIP) là một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã lớn nhất ở thực vật, chúng tham gia điều hòa nhiều chức năng tế bào, đặc biệt là quá trình điều hòa trong đáp ứng stress và cảm ứng tín hiệu hormone (Kim, 2006) Tên của họ bZIP được bắt nguồn từ việc protein này chứa một vùng cơ sở (basic region) và một motif leucine zipper Vùng cơ sở chứa 16 chuỗi bên amino acid được nhận biết bởi sự có mặt của một motif bất biến N-x7-R/K-x9, trong khi đó Leu zipper bao gồm sự lặp lại 7 lần của amino acid Leu hay các amino acid kị nước khác như Ile, Val, Phe, hay Met nằm chính xác ở vị

trí amino acid thứ 9 từ đầu C Vùng cơ sở và vùng Leu zipper có chức năng riêng biệt

Vùng cơ sở có nhiệm vụ là tín hiệu di chuyển vào nhân và bám đặc hiệu lên trình tự DNA, vùng này vô cùng bảo thủ Vùng Leu zipper là trình tự lưỡng cực ở dạng cuộn xoắn, đặc trưng cho chức năng dimer hóa và kém bảo thủ hơn Vùng trình tự Leu zipper này thực hiện quá trình dimer hóa tương đồng (homo-) hoặc không tương đồng (hetero-) của các protein bZIP Các đơn phân bZIP ở dạng một chuỗi xoắn alpha dài, và khi bám với DNA chứa trình tự lõi ACGT, thường là G-box (CACGTG), C-box (GACGTC) và A-box (TACGTA), đầu N bám vào rãnh chính của sợi kép DNA, còn đầu C thì làm chức năng

dimer hóa để hình thành nên cấu trúc cuộn xoắn chồng gọi là Leu zipper (Nijhawan et al.,

2008)

Họ gen bZIP đã được phân lập và mô tả ở Arabidopsis (có 75 gen), lúa (89), đậu tương (131), ngô (125) (Wei et al 2012) Ở Arabidopsis, 75 gen khác nhau đã được xác định và phân vào 10 nhóm dựa vào vùng bảo thủ của nó (Jakoby et al., 2002) Trong khi ở lúa, 89 gen bZIP cũng được chia thành 11 nhóm (Nijhawa et al., 2008) Phần lớn các gen bZIP liên kết với ABRE thuộc nhóm A, các gen trong nhóm này được cảm ứng mạnh mẽ bởi ABA và stress phi sinh học khác (Jakoby et al., 2002, Lu et al., 2009)

Ở Arabidopsis, 75 gen mã hóa cho yếu tố phiên mã bZIP đã được phân lập nhưng

còn khoảng 50 gen chưa được miêu tả trong các dữ liệu Trong số 7 gen thuộc nhóm A, nhóm tham gia quá trình chống chịu stress và đáp ứng ABA thì chỉ có 3 gen tham gia vào

sự chịu hạn của cây Đó là ABRE-binding protein 1 và 2 (AREB1 và AREB2) và ABRE

binding factor 3 (ABF3) (Jakoby et al., 2002) Một số nghiên cứu cho thấy ABA và stress phi sinh học cảm ứng sự biểu hiện của ABF/AREB và ABA gây sự phosphoryl hóa của

AREB1/2 Sự photphoryl hóa này là cần thiết cho AREB1/2 cảm ứng gen sau nó và có thể xảy ra ở vị trí phosphoryl hóa bằng casein kinase II nằm ở các domain bảo thủ ABA và stress hạn do đó có thể cảm ứng cả sự phiên mã và điều hòa sau dịch mã của nhiều gen bZIP thuộc nhóm A

Ở lúa, có gần 100 gen thuộc họ bZIP, trong đó 33 gen tham gia phản ứng với hạn

(Nijihawan et al., 2008) Trong số đó, 5 gen ABF3, OsbZIP23, OsbZIP46, OsbZIP 52 và

OsbZIP72 được cho là tạo nên khả năng thích ứng với hạn khi biểu hiện quá mức ở lúa

Gen OsbZIP23 biểu hiện mạnh bởi stress phi sinh học, bao gồm muối, hạn, xử lí với ABA

và PEG Gen OsbZIP23 khi biểu hiện quá mức ở thực vật cho thấy một sự điều hòa tăng

lên ở trên 800 gen tham gia trong các con đường chống chịu khác nhau OsbZIP46 có thể

là yếu tố điều hòa dương tính của con đường tín hiệu ABA và chịu hạn ở lúa (Tang et al.,

2012) Một protein bZIP khác OsbZIP52 gần đây được cho là có khả năng tăng tính nhạy

cảm với hạn và lạnh (Liu et al., 2012) OsbZIP72 được công bố là có chức năng như một

chất điều hòa dương tính trong con đường truyền tín hiệu của ABA và hạt nảy mầm biểu

hiện quá mức OsbZIP72 cho thấy tăng khả năng chịu hạn

1.3 Cấu trúc và chức năng của gen ZmbZIP72

Gen mã hóa ZmbZIP72 dài 2164bp, gồm 3 intron, giống với sự phân bố introns ở hầu hết các gen bZIP nhóm A ở Arabidopsis và lúa Vùng promoter của gen ZmbZIP72 (1670bp upstream) có nhiều các yếu tố hoạt động cis đáp ứng với stress và một vài đáp ứng

với ánh sáng cũng được tìm thấy Điều đó gợi ý rằng ZmbZIP72 có thể tham gia nhiều đáp ứng stress và điều khiển bởi một cơ chế điều hòa phức tạp Tuy nhiên chưa có bằng chứng cho thấy ZmbZIP72 tham gia đáp ứng lạnh

Gen ZmbZIP72 chứa một khung đọc mở dài 894bp mã hóa cho một chuỗi

polypeptide dài 297 aa, 180bp ở vùng 5’ không dịch mã và 226bp ở vùng 3’ không dịch

mã Trình tự amino acid suy diễn của ZmbZIP72 được tính toán tương ứng với protein có khối lượng 32,4 kDa và chỉ số pI là 9,39 Protein suy diễn có trình tự amino acid tương

đồng cao với protein của lúa là OsbZIP72 (Sheng et al., 2012)

Protein ZmbZIP72 chứa một domain bám DNA bZIP điển hình ở đầu C và 4 trình

tự bảo thủ phân bố ở đầu N hoặc C Một vài vị trí hoạt động đích của kinase, ví dụ R/KXXS/T cho CDPK, S/TXK/R cho PKC, nằm trong các vùng bảo thủ Amino acid vị trí

từ 23 đến 63 là cần thiết cho hoạt động hoạt hóa phiên mã của gen ZmbZIP72

Sản phẩm phiên mã của gen ZmbZIP72 được tìm thấy ở tất cả các cơ quan, nhưng

nồng độ cao nhất là ở rễ của cây mới nảy mầm và trưởng thành và thấp nhất ở thân Protein

ZmbZIP72 hoạt động ở nhân Tín hiệu chuyển vào nhân được tìm thấy ở domain bảo thủ

bZIP của ZmbZIP72 giống với các nghiên cứu trước (Fujita et al., 2005, Xiang et al., 2008, Zou et al., 2008, Lu et al., 2009) Để hoạt động thì bZIP cần được phosphoryl hóa phụ

thuộc ABA nhờ protein kinase Một vài gốc serin ở vùng bảo thủ có thể là vị trí được phosphoryl hóa Đồng thời, chúng có thể cần được dimer hóa tương đồng (homo) hoặc

không tương đồng (hetero-) như ở Arabidopsis và lúa

Khi chuyển cDNA ZmbZIP72 vào Arabidopsis dưới sự điều khiển của promoter

CaMV 35S, dòng chuyển gen thể hiện một số đặc điểm của sự thích ứng với hạn như: sự nảy mầm của hạt bị ức chế mạnh hơn so với hạt đối chứng trong điều kiện xử lí với ABA

và stress thẩm thấu Cây trồng trong đất không được tưới nước trong 2 tuần cho thấy lá tươi và xanh hơn so với cây đối chứng, đồng thời nhanh phục hồi khi được tưới lại với tỉ

lệ sống sót cao hơn đối chứng Những kết quả kiểu hình và thay đổi sinh lý này cho thấy

sự biểu hiện quá mức ZmbZIP72 ở Arabidopsis chuyển gen có thể làm tăng đáng kể khả

năng thích ứng với khô hạn Không những thế, ZmbZIP72 có thể hoạt hóa sự biểu hiện của

một vài gen cảm ứng bởi ABA ZmbZIP72 làm tăng sự biểu hiện của các gen như RD29B, RAB18, HIS1-3, các gen được cảm ứng bởi các stress khác nhau qua con đường phụ thuộc

ABA, và các gen này biểu hiện càng cao thì tính chống chịu càng cao Điều này chứng tỏ ZmbZIP72 hoạt động như là yếu tố hoạt hóa phiên mã dương tính trung gian ABA (ABA-mediating) Một vài nghiên cứu chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức liên tục của gen mã hóa yếu tố phiên mã thường gây ra các kiểu hình không mong muốn, như là sự sinh trưởng

chậm của cây (Kasuga et al., 1999; Kim et al., 2004) Tuy nhiên, các dòng Arabidopsis chuyển gen biểu hiện quá mức ZmbZIP72 không gây ra hậu quả bất lợi nào đến sự sinh

trưởng và phát triển của cây như chiều cao hay kiểu hình so với kiểu dại Do đó protein ZmbZIP72 có tiềm năng ứng dụng vào trồng trọt để tăng khả năng chống chịu stress, đặc

biệt là điều kiện khô hạn (Sheng et al., 2012)

1.4 Cây ngô và vấn đề chịu hạn

Ngô là cây lương thực quan trọng đối với nền kinh tế toàn cầu, có tiềm năng năng suất cao và được trồng phổ biến ở nhiều nước Trên thế giới, ngô chỉ đứng thứ ba về diện tích sau lúa mì và lúa nước nhưng ngô lại dẫn đầu về năng suất và sản lượng Bên cạnh đó, ngô còn là cây điển hình được ứng dụng nhiều thành tựu khoa học về các lĩnh vực di truyền học, chọn giống, công nghệ sinh học,… vào công tác nghiên cứu và sản xuất (Ngô Hữu Tình, 2009) Theo USDA dự đoán, sản lượng ngô ước tính sẽ đạt 1,011 tỷ tấn trong niên

vụ 2016/2017, tăng 9,58% so với niên vụ 2015/2016 (968,85 triệu tấn) (USDA-FAS, 2017)

Bảng 1.1: Sản lượng ngô trên toàn thế giới qua các niên vụ 2011/2012 – 2016/2017

Niên vụ Sản lượng (tấn) 2016/2017 1,011,068,000 2015/2016 968,855,000 2014/2015 1,013,462,000 2013/2014 990,790,000 2012/2013 869,735,000 2011/2012 889,782,000

(Nguồn: FAS/USDA, 2017) Quan sát sản lượng ngô trên thế giới qua các niên vụ (bảng 1.1), chúng ta có thể nhận thấy rằng sản lượng ngô trên thế giới tăng qua các niên vụ từ 2011/2012 đến 2014/2015 và đến niên vụ 2014/2015 đã đạt hơn 1 tỷ tấn Có được kết quả trên, trước hết là nhờ ứng dụng rộng rãi giống ngô biến đổi gen và giống ngô lai, đồng thời không ngừng cải thiện các biện pháp kỹ thuật canh tác. Tuy nhiên, trong năm 2015/2016, sản lượng ngô đã bị giảm đi 9.55% Nguyên nhân chính được cho là do tình trạng hạn hán diễn ra tại các nước sản xuất ngô

Ở ngô, hạn hán gây ảnh hưởng đến toàn bộ chu trình sống Tỷ lệ nảy mầm, tốc độ nảy mầm, hình thành cây con và sức sống của cây con bị hạn chế do hạn hán ở giai đoạn phát triển sớm Khi bị thiếu nước, cây ngô biểu hiện một loạt các đặc điểm như toàn bộ thân và lá sẽ chuyển từ màu xanh sang màu xanh xám, các lá có hiện tượng cuộn lại, khí khổng đóng, quang hợp giảm, giảm cố định carbon qua đó sinh trưởng bị chậm lại Giai đoạn sinh sản của ngô cũng bị hạn chế do hạn hán Sự phát triển của cờ và bắp, quá trình thụ phấn, sự phát triển của phôi, sự phát triển của nội nhũ và hạt bị ảnh hưởng nặng nề bởi stress hạn Nếu cây gặp hạn trước khi ra hoa 7 – 10 ngày, sự phát triển của bắp sẽ chậm hơn cờ, do đó quá trình phu râu sẽ chậm hơn sự tung phấn, điều này dẫn đến khả năng thụ phấn thấp Nếu hạn nặng ở giai đoạn ra hoa có thể dẫn đến việc mất hoàn toàn bắp và làm mất năng suất (Chapman, Edmeades, 1999) Nếu hạn xảy ra trong thời gian tạo hạt, bắp

ngô sẽ ít hàng hạt, và các hàng không có nhiều hạt (Edmeades et al., 2000) Như vậy, hạn

hán dù ngắn hay dài, dù nặng hay nhẹ cũng đều ảnh hưởng không nhỏ đến sản lượng và năng suất của ngô

Các cơ chế chống chịu khác nhau đã được phát triển ở ngô giống như các cây trồng khác, cho phép chúng tồn tại một cách hiệu quả trong điều kiện hạn hán Thoát hạn, tránh hạn và chịu hạn là các cơ chế khác nhau của thực vật làm việc trong điều kiện hạn hán Các giống ngô thoát hạn điều chỉnh đời sống của chúng hoàn thành trước khi bắt đầu hạn hán

và các giống ngô tránh hạn tránh không bị hạn bằng cách giảm tổn thất nước hoặc tăng lượng nước hấp thụ Các giống ngô chịu hạn duy trì sự tăng trưởng và phát triển của chúng cùng với năng suất hạt trong điều kiện hán hán

Do nhu cầu về ngô ngày càng tăng và tình trạng khan hiếm nước ngày càng trầm trọng, cần phải nâng cao mức độ chịu hạn đối với cây ngô Các nhà khoa học và người nông dân có thể sử dụng nhiều phương thức khác nhau để làm tăng khả năng sống sót của trồng trong điều kiện hạn hán Các chiến lược khác nhau đã được sử dụng để cải thiện khả năng chống lại stress hạn hán của ngô như: chiến lược quản lý và chiến lược sinh học Các chiến lược quản lý bao gồm việc sử dụng nguồn tài nguyên nước hợp lý và áp dụng các biện pháp nông học tiết kiệm nước Các chiến lược sinh học được ưa thích hơn các chiến

lược quản lý do hiệu quả kinh tế lâu dài Cách tiếp cận sinh học được thực hiện dưới nhiều hình thức khác nhau như phương pháp lai tạo giống truyền thống và phương pháp sử dụng công nghệ gen Các giống ngô lai chịu hạn được trồng thực tế ở nhiều nước châu Phi Với nghiên cứu chuyển gen chịu hạn cho ngô thì năm 2013, Monsanto đã công bố giống ngô

chuyển gen chịu hạn đầu tiên DroughtGard MON 87460, chứa gen shock lạnh (CspB) được phân lập từ Bacillus subtillis Ngoài ra, gen HVA1 và mtlD dưới sự điều khiển của promoter Act1 ở cây ngô chuyển gen đã cho thấy sự cải thiện khả năng chịu hạn và chịu mặn (Nguyen

et al., 2013) Một số gen mã hóa cho các protein tham gia vào chuyển hóa đường và tổng

hợp các hợp chất phản ứng cũng đã được phân lập từ vi khuẩn như glutamate

dehydrogenase (gdhA); choline dehydrogenase (betA) từ E.coli, trehalose synthase (TPS)

của vi sinh vật cũng đã được chuyển vào hệ gen ngô nhằm nâng cao tính chịu hạn của cây

và đã thu được những kết quả khả quan (Chun-lin et al., 2011; Lightfoot et al., 2007; Quan

et al., 2004) Gần đây, nhóm nghiên cứu của Zou đã công bố một nghiên cứu chuyển gen AtCBF4 – một yếu tố phiên mã không phụ thuộc ABA- nhằm nâng cao tính chịu hạn của cây ngô và đã đạt được hiệu quả tích cực khi biểu hiện bằng promoter cảm ứng hạn RD29A (Zou et al., 2014) Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dòng ngô chịu hạn đang được đầu tư

và tập trung nghiên cứu Nhóm nghiên cứu của Bùi Mạnh Cường đã xác định được một số chỉ thị SSR liên kết với các gen chịu hạn và một số chỉ thị liên quan đặc tính chịu hạn ở ngô (Bùi Mạnh Cường, 2007) Theo báo cáo của Lương Văn Vàng (2012), đã lựa chọn được một số dòng ngô chịu hạn tốt, thích ứng rộng, năng suất khá và ổn định: VS36, H119, VS71 và CN11-2 Các giống ngô lai LVN61, LVN14 và VN8960 phát triển tốt trong điều

kiện hạn và có năng suất cao (Nguyễn Đức Thuận et al., 2008) Dựa trên đánh giá kiểu

hình và maker phân tử, nhóm nghiên cứu Phan Đức Thịnh đã chọn ra được 5 dòng TP17, TP12, TP2, TP5 và TP4 ưu tú là những dòng phát triển từ giống ngô địa phương Việt Nam

có thể sử dụng để lai thử khả năng kết hợp chọn tạo giống ngô lai chịu hạn (Phan Đức

Thịnh et al., 2013)

1.5 Nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen

Nhu cầu ngô nguyên liệu luôn gia tăng là động lực thúc đẩy các nhà khoa học nghiên cứu lai tạo ra nhiều giống ngô đáp ứng với các điều kiện sống khác nhau Những tiến bộ vượt bậc trong công nghệ gen đã cho ra đời nhiều giống ngô biến đổi gen có khả năng chống chịu thuốc diệt cỏ, kháng côn trùng, chịu hạn, đạt năng suất cao hoặc có các tính chất theo ý muốn

Diện tích trồng ngô biến đổi gen phát triển mạnh trên thế giới bắt đầu từ năm 1996, tính đến năm 2016 đã đạt 60,6 triệu hecta, tăng 13% so với năm 2015 Diện tích tăng lên

là do giá cả thị trường thuận lợi, nhu cầu về năng lượng sinh học và thức ăn gia súc cũng như sự gia tăng của sâu đục thân ngô ở châu Âu Bên cạnh đó, việc chấp nhận các mặt tích cực của ngô chịu hạn ở Mỹ và Châu Phi năm 2017 sẽ khiến cho việc chấp nhận ngô chuyển gen tăng lên ở nhiều nước phải đối mặt với stress hạn hán do biến đổi khí hậu Đồng thời, ngô biến đổi gen cũng đã mang lại lợi ích về thu nhập cho nông dân trong suốt 20 năm từ

1996 đến 2015 là 57,1 tỷ đô la Mỹ (USD) và chỉ riêng trong năm 2015 là 6,25 tỷ USD (Brookes and Barfoot, 2017) Trong 60,6 triệu hecta cây chuyển gen ngô thì có 6 triệu hecta trồng cây chuyển gen kháng sâu, 7 triệu hecta trồng cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ

và 47.7% hecta trồng cây chuyển gen có cả hai đặc tính trên Cây ngô chuyển gen được trồng ở 16 quốc gia, năm quốc gia đứng đầu bao gồm: Mỹ (30 triệu hecta), tiếp sau đó là Brazil (15.6 triệu hecta), Argentina (4.7 triệu hecta), Nam Phi (2.2 triệu hecta), và Canada (1.5 triệu hecta) Các quốc gia trồng dưới 1 triệu hecta bao gồm Phillipines, Paraguay, Spain, Colombia, Uruguay, Việt Nam, Honduras, Bồ Đào Nha, Chile, Slovakia và Cộng hoà Séc Trong số 185 triệu hecta trồng ngô trên toàn cầu (FAOSTAT, 2016), thì diện tích trồng cây ngô chuyển gen chiếm 33%

Ở Việt Nam, ngô biến đổi gen là cây trồng chuyển gen đầu tiên được thương mại hoá với diện tích tối thiểu là 3500 heta vào năm 2015 Năm 2016, nông dân Việt Nam đã chấp nhận công nghệ này khá nhanh với ước tính diện tích trồng ngô biến đổi gen tăng lên

10 lần khoảng 35000 hecta với các giống mang đồng thời hai đặc tính kháng sâu bệnh và khác thuốc diệt cỏ Vào năm 2015, có 14 sự kiện ngô chuyển gen được phê duyệt, đến năm

2016, có 3 sự kiện được phê duyệt làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bao gồm sự kiện

5370 và MIR604 kháng côn trùng và TC1507 kháng côn trùng và thuốc diệt cỏ Có 4 sự kiện được chấp nhận được trồng vào năm 2015 bao gồm: Bt11 x GA21, GA21, MON8904

và NK603 Các thử nghiệm trên đồng ruộng về các sự kiện ngô chuyển gen được tiến hành tại các địa điểm khác nhau trong nước như là một điều kiện tiên quyết để các sự kiện này được thương mại hoá Một thử nghiệm trên đồng ruộng cho MON810 bắt đầu vào 17/03/2017 do Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam và Pioneer Hi-bred Vietnam thực hiện ở huyện Văn Giang, tỉnh Hưng Yên Một thử nghiệm khác được thực hiện bởi Viện Bảo vệ thực vật kết hợp với Công ty TNHH Syngenta Việt Nam về ngô biến đổi gen kháng côn trùng MIR162 cũng như đặc tính kháng côn trùng và thuốc diệt cỏ Bt11 x IR162 x GA21 ở Sơn La bắt đầu từ ngày 2/6/2016 (CBU, 2016)

Các nghiên cứu phân lập gen và tạo cây chuyển gen chịu hạn ở Việt Nam có thể nói là đang khá mới mẻ và đang ở giai đoạn ban đầu nên các thành tựu đạt được chưa nhiều Nhóm nghiên cứu của Phạm Xuân Hội và cộng sự đã phân lập một số gen TF

(OsNAC1, OsNAC5, OsNAC6, OsNAC10, OsDREB1A , OsAREB1A và ZmDREB2A) từ các giống lúa, ngô Việt Nam và chuyển gen vào cây mô hình lúa và Arabidopsis (Phạm Thu Hằng et al., 2014; Nguyễn Duy Phương et al., 2014; Nguyễn Thị Phương Dung và Phạm Xuân Hội, 2010; Cao Lệ Quyên et al., 2012; Phạm Thu Hằng và Phạm Xuân Hội,

2012 ) Các gen chịu hạn ZmNF-YB2 và IPT đã được chuyển thành công vào các giống ngô

chọn lọc cho kết quả chuyển nạp ổn định và đồng đều trên hai dòng ngô VH1 và C8H9

(Nguyễn Văn Đồng và Nguyễn Hữu Kiên, 2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2015) Huỳnh Thị Thu Huệ và cộng sự cũng đã chuyển thành công gen modiCspB vào ba dòng ngô Việt Nam V152N, C436 và C7N (Huỳnh Thị Thu Huệ et al.,

2014)

1.6 Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Hiện nay, có nhiều phương pháp được các nhà khoa học sử dụng để chuyển gen vào

thực vật như: phương pháp gián tiếp sử dụng A tumefaciens, phương pháp trực tiếp sử

dụng xung điện, vi tiêm, xử lý polyethylene glycol (PEG) và dùng súng bắn gen Mỗi phương pháp chuyển gen đều có những ưu, nhược điểm riêng tùy vào từng đối tượng

nghiên cứu khác nhau Trong đó, phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens

đem lại hiệu quả cao và ít tốn kém nhất Ưu điểm lớn của phương pháp chuyển gen thực

vật thông qua A tumefaciens là một lượng nhỏ bản sao (thường là 1 hoặc 2) kích thước

tương đối lớn (có thể lớn hơn 10kb) của T-DNA với các đầu xác định được ghép vào hệ

gen thực vật với sự tái sắp xếp tối thiểu, tạo ra cây chuyển gen chất lượng cao (Ishida et al., 2007) Việc chuyển gen vào thực vật hai lá mầm thông qua vi khuẩn A tumefaciens đã

được biết đến như là một cơ chế đưa DNA mong muốn vào thực vật với hiệu quả cao Tuy

nhiên, trước đây, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefacines không được xem là hiệu quả với cây một lá mầm (Raineri et al., 1990) Một trong những nguyên nhân dẫn đến sự chậm trễ trong các nghiên cứu biến nạp gen vào cây một lá mầm thông qua A

tumefaciens là do thiếu phản ứng gây tổn thương hoặc phản ứng gây tổn thương kém ở mô

tế bào của cây một lá mầm (Repellin et al., 2001) Phản ứng này là một trong các yếu tố

quan trọng trong quá trình chuyển gen Khi tế bào bị tổn thương, chúng tiết ra các hợp chất phenol: acetosyringone(AS), chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và gắn kết vi

khuẩn với tế bào thực vật Cơ chế nhận biết này được giải thích là nhờ tính đặc hiệu của A

tumefaciens với cây hai lá mầm, ở cây một lá mầm chỉ có ở 1 ít loài Vì vậy, khi tiến hành chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua A tumefaciens, người ta thường bổ sung AS

Năm 1993, cây lúa là cây một lá mầm chuyển gen đầu tiên được thu nhận nhờ lây nhiễm

phôi non với A tumefaciens (Chan et al., 1993); tiếp đó là nhiều thành công chuyển gen

vào các loại ngũ cốc quan trọng khác như ngô, lúa mì, lúa mạch và cao lương Các yếu tố quan trọng cho những thành công này gồm tối ưu hóa loại mô thực vật chuyển gen, lựa

chọn vector, lựa chọn chủng A tumefaciens và tối ưu kĩ thuật nuôi cấy mô Ngày nay,

chuyển gen thông qua A tumefacien khuyến khích được sử dụng trên các giống ngô do đáp

ứng nuôi cấy mô tốt

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và hoá chất nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) là giống ngô địa phương của Việt Nam có khả năng chịu hạn tốt do Viện Nghiên cứu Ngô sàng lọc và cung cấp Hạt ngô được gieo mầm và phát triển đến giai đoạn ba lá thì xử lý hạn nhân tạo theo phương pháp của Sheng

và cộng sự (2012) Mẫu tại các thời điểm: 3 giờ và 6 giờ được thu giữ trong Nitơ lỏng và bảo quản ở -70oC

Bảng 2.1: Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu

ZmbZIP72 F 5’ AAGGGTTTCGGCTCCGTGAAC 3’

ZmbZIP72 R 5’ TAGCAAGTGCAAGTCATGTGC 3’

ZmbZIP72 SacI F 5’ ATGAGAGCTCATGGACGAGCTG 3’

ZmbZIP72 SacI R 5’ TAATGAGCTCTCACCAGGGGGC 3’

HptR 5’ GCTTTCCACTATCGGCGA 3’

TestRD29AR 5’ TGTCCCTTTATCTCTCTCAGTCTC 3’

ZmbZIP72SacIR 5’ TAATGAGCTCTCACCAGGGGGC 3’

Plant actinF 5’ AGCTAGCATACTCGAGGTCAT 3’

Plant actin R 5’ TATCCTCGGCGTCAGCCATC 3’

- Kit tổng hợp cDNA: First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real – Time PCR của

- Hóa chất sử dụng trong việc chọn dòng: Clone JET for cloning PCR Kit; LB; agar;

các dung dịch tách chiết plasmid: Sol I (50 mM glucose, 25 mM Tris-base, 10mM EDTA pH 8,0), Sol II (0,2M NaOH, 1% SDS), Sol III (3M CH3COOK, 11,5%

Ch3COOH); Ampicillin; các enzyme giới hạn: BamHI, BglII, HindIII, SacI

- Các hóa chất chloroform, isoamyl alcohol, Tris, acetic acid, EDTA, cồn tuyệt đối

và các hóa chất chuyên dụng khác: Hãng Merck (CHLB Đức)

- Các hoá chất sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Thành phần môi trường sử

dụng nuôi cấy mô thực vật được thể hiện ở bảng 2.2

Bảng 2.2: Thành phần các môi trường sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

(Frame et al 2015)

Lây nhiễm lỏng

MS + 2,4D 1,5mg/l + L-proline 0,7g/l + sucrose 68,4 g/l + glucose 36 g/l + AS (100uM)

pH 5,5

Nuôi ủ - đồng nuôi cấy

MS + 2,4D 2mg/l + L-proline 0,7 g/l + sucrose 30 g/l + phytagel 2,4 g/l + AgNO3 0,85 mg/l + AS (100uM)

pH 5,8 Nuôi phục

phytagel 2,4 g/l + cefotaxim 100mg/l + vancomycin 100mg/l + AgNO3

0,85 mg/l + hygromycin 1,5 mg/l

pH 5,8 Chọn lọc 2 MS + 2,4D 1,5mg/l + L-proline 0,7 g/l + MES 0,5 g/l + sucrose 30 g/l +

phytagel 2,4 g/l + cefotaxim 100mg/l + vancomycin 100mg/l + AgNO3

0,85 mg/l + hygromycin 3 mg/l

pH 5,8 Tái Sinh 1 MS + myo-inositol 100mg/l + sucrose 60 g/l + phytagel 2,4 g/l +

cefotaxim 100mg/l + vancomycin 100mg/l + hygromycin 3 mg/l

pH 5,8 Tái Sinh 2 MS + myo-inositol 100mg/l + sucrose 30 g/l + casein 400mg/l + kinetin

1mg/l + nước dừa 150 ml/l + phytagel 2,4 g/l

pH 5,8 Môi trường

Các thiết bị được sử dụng thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam Bao gồm: Tủ lạnh 20C (Sanyo, Nhật Bản), Cân phân tích (Mettler Toledo, Thụy Sỹ), bể ổn nhiệt (Memmert, Đức), máy làm khô chân không (Concentrator Plus) (Eppendorf, Đức), máy li tâm lạnh Eppendorf 5424R (Eppendorf, CHLB Đức), máy li tâm lạnh đa năng 5810R (Eppendorf, Đức), máy chạy điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy PCR Master Cycler Pro S (Eppendorf, Đức), máy soi gel M-26 UVP (Mỹ), máy chụp ảnh gel (GelDoc) UVP (Mỹ), máy ủ nhiệt Thermomixer C (Eppendorf, Đức), máy giải trình tự ABI 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies, Nhật),

máy biến nạp xung điện Gene Pulser (Bio-Rad, Mỹ), box cấy vi sinh vật The Esco

Airstream® Class II Biological Safety Cabinet (Esco, Singapore) Phòng nuôi cấy mô vô trùng, box cấy thực vật Esco laminar flow cabinets ( Esco, Singapore)

2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số từ thực vật

DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Roger và đồng tác giả nhưng

có cải tiến cho phù hợp với mô lá ngô, bao gồm các bước sau:

1 Nghiền lá tươi thành bột mịn bằng cối chày sứ đã khử trùng trong nitơ lỏng Cho toàn bộ bột lá vào ống eppendorf 1.5ml

2 Bổ sung đệm chiết (1ml cho 100g lá) vào ống Đảo ống vài lần hoặc vortex nhẹ

để đệm chiết và bột lá trộn đều với nhau Ủ hỗn hợp ở 65°C trong 60 phút

4 Để hỗn hợp 15 phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm mẫu ở 12.000 vòng/phút trong

10 phút ở 4˚C, thu dịch ở pha trên chuyển sang ống mới

5 Loại protein và tạp chất bằng hỗn hợp phenol/choloroform/isoamyl alcohol (v:v:v

= 25:24:1) Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4˚C, thu dịch ở pha trên

6 Bổ sung RNase, ủ dịch thu được ở 4˚C, 1 giờ Dịch thu tiếp tục được tinh sạch bằng hỗn hợp choloroform/isoamyl alcohol (v:v =24:1) Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4˚C, thu dịch ở pha trên

7 Tủa DNA trong dịch thu được bằng 2 lần thể tích EtOH 100% , 0.3M CH3COONa trong ít nhất 3 giờ ở -20˚C

8 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4˚C, loại bỏ dịch, thu kết tủa

9 Rửa kết tủa bằng cồn 70% Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4˚C, thu kết tủa

10 Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút Hòa lại tủa trong nước không chứa DNase Bảo quản DNA ở -20⁰C

2.2.2 Tách chiết RNA tổng số từ thực vật

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tách chiết RNA theo phương pháp sử dụng TRI Reagent có cải tiến phù hợp với mẫu ngô Quy trình thực hiện như sau:

1 Nghiền 2- 3 g mẫu thành bột mịn bằng cối chày sứ đã khử trùng trong nitơ lỏng

2 Bổ sung ngay 700 µl Trizol, trộn đều, sau đó chuyển sang ống eppendorf 1.5ml,

7 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC Loại bỏ dịch, thu tủa RNA

8 Rửa kết tủa bằn Ethanol 70% Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC và loại bỏ dịch

9 Làm khô tủa RNA tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút

10 Hòa tan RNA tổng số trong 50µl nước đã được xử lý DEPC

11 Kiểm tra RNA tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và đo quang phổ ở bước sóng 260nm RNA tổng số được bảo quản ở -80oC

2.2.3 Sinh tổng hợp cDNA sợi thứ nhất

Trong di truyền học, cDNA (complementary DNA) là đoạn DNA sợi đôi được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu mRNA xúc tác bởi enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Trong nghiên cứu này, chúng tôi tổng hợp sợi cDNA thứ nhất dựa trên khuôn mẫu mRNA bằng kit tổng hợp cDNA của hãng Affymetrix: First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real – Time PCR Thành phần phản ứng tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bao gồm: 2

µl primer mix 10pM, 1 µg RNA tổng số, 2 µl 10X RT Buffer, 2 µl dNTPs 10mM, 1 µl RNase Inhibitor, 1 µl M-MLV RT, và H2O Phản ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt PCR Master Cycler Pro S với chu trình nhiệt như sau: 44oC - 60 phút, 92oC - 10 phút Các

cDNA sau khi được tổng hợp được kiểm tra bằng phản ứng PCR nhân gen Actin từ cặp

mồi Plant Actin F/R và được lưu giữ ở tủ -20oC

2.2.4 Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR

PCR được tiến hành với thể tích là 25 µl Bao gồm các thành phần: 2,5 µl 10X DreamTaq Buffer, 1 µl dNTPs 10mM, 1 µl mồi xuôi 10pM, 1 µl mồi ngược 10pM, 1 µl DNA khuôn (20 ng – 100ng), 0.2 µl DreamTaq DNA polymerase (5U/µl) và nước Phản ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt PCR Master Cycler Pro S với chu trình nhiệt như sau:

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân gen Actin: 950C - 3 phút; 30 chu kỳ : 95oC

- 45 giây, 54oC - 45 giây, 72oC - 30 phút; 72oC - 10 phút; 4oC

- Chu trình nhiệt với phản ứng RT-PCR phân lập gen ZmbZIP72: 950C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95oC - 45 giây, 60oC - 45 giây, 72oC - 1 phút; 72oC -10 phút; 4oC

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng CDS gen ZmbZIP72: 950C - 3 phút;

30 chu kỳ: 95oC - 30 giây, 60oC - 30 giây, 72oC - 1 phút; 72oC - 10 phút; 4oC

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân gen hygromycin: 950C-3 phút; 30 chu kỳ:

95oC - 30 giây, 54oC- 30 giây, 72oC - 50 giây; 72oC - 8 phút; 4oC

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng từ cuối promoter RD29A đến cuối gen

ZmbZIP72: 950C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95oC - 30 giây, 54oC - 30 giây, 72oC - 1phút

15 giây; 72oC - 8 phút; 4oC

2.2.5 Tinh sạch các đoạn DNA trên gel agarose

Chúng tôi sử dụng GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific để tinh sạch sản phẩm PCR Quy trình thực hiện:

1 Điện di sản phẩm PCR cần tinh sạch trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế: 100V

2 Sau khi điện di, nhuộm bản gel trong EtBr trong 10 phút, sau đó cắt đoạn gel có chứa đoạn DNA cần tinh sạch chuyển sang ống eppendorf 1.5ml

3 Bổ sung Binding Buffer vào ống eppendorf chứa gel (V:W = 1:1)

4 Ủ hỗn hợp gel + Binding Buffer ở 55oC trong 10 phút, cho tới khi miếng gel tan hoàn toàn Trong lúc ủ, cách 2 – 3 phút dảo ống một lần để đảm bảo gel tan đều

Sau khi gel tan hoàn toàn, đem ống eppendorf đi vortex và spindown trước khi chuyển lên cột tinh sạch

5 Chuyển dung dịch gel đã tan ở bước 4 sang cột tinh sạch Ly tâm 1 phút, 12000 vòng/phút ở 24oC Bỏ dịch, đặt cột tinh sạch lại vào ống

6 Bổ sung 100 µl Binđing Buffer vào cột tinh sạch Ly tâm 1 phút, 12000 vòng/phút

ở 24oC Bỏ dịch, đặt cột tinh sạch lại vào ống

7 Bổ sung 700 µl Wash Buffer vào cột tinh sạch Ly tâm 1 phút, 12000 vòng/phút ở

24oC Bỏ dịch, đặt cột tinh sạch lại vào ống

8 Ly tâm cột tinh sạch không chứa gì trong 1 phút, 12000 vòng/phút ở 24oC để loại

bỏ hoàn toàn Wash Buffer

9 Bỏ dịch, chuyển cột tinh sạch sang ống eppendorf 1.5ml mới Bổ sung 30 µl H2O

10 Bỏ cột tinh sạch, DNA thu được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%và đo nồng

độ Sản phẩm sau tinh sạch được lưu giữ ở tủ lạnh – 20oC

2.2.6 Tạo dòng gen và thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72

2.2.6.1 Tạo dòng gen trong vector tách dòng pJET1.2

Chúng tôi sử dụng bộ kit: CloneJET PCR Cloning Kit để xử lý đầu bằng đoạn gen

và ghép nối đoạn gen với vector Quy trình thực hiện như sau:

1 Xử lý đầu bằng đoạn gen Thành phần phản ứng: 10 µl 2X reaction buffer, 1 µl sản phẩm PCR, 1 µl DNA blunting enzyme, 18 µl H2O

2 Ủ hỗn hợp ở 70oC trong 5 phút sau đó đặt ngay lên đá

3 Bổ sung thêm các thành phần sau vào trong hỗn hợp ban đầu: 1 µl pJET 1.2/blunt Cloning Vector, 1 µl T4 DNA Ligase

4 Ủ hỗn hợp phản ứng ở 22oC trong 5 phút Sản phẩm sau ghép nối được sử dụng để biến nạp ngay hoặc được giữ trong tủ lạnh – 20oC

2.2.6.2 Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72

Vector trung gian pRTL2 RD29A mang promoter RD29A và terminator 35S được

cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn SacI Đồng thời, plasmid tái tổ hợp pJET 1.2_ZmbZIP72 cũng được cắt bằng enzyme giới hạn SacI để thu đoạn gen ZmbZIP72 Phản

ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 16 giờ

Các đoạn DNA này sau đó được tinh sạch bằng kit thôi gel GeneJET Gel Extraction

Kit của hãng Thermo Scientific Đoạn ZmbZIP72 được ghép nối với vector pRTL2 đã mở

vòng nhờ sự xúc tác của enzyme T4 ligase ở 22oC trong 1 giờ Sản phẩm ghép nối sau đó

được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli DH10β