(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia jack) ở khu vực miền trung tây nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Nhiều công trình khoa học nghiên cứu về cây mật nhân trên thế giới đã được công bố và được ứng dụng rộng rãi với kết quả phân lập được nhiều hợp chất hữu cơ có giá trị, các chiết xuất từ

RỄ CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK)

Ở MIẾN TRUNG – TÂY NGUYÊN VÀ ỨNG DỤNG TRONG

CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

ĐÀ NẴNG, NĂM 2021

RỄ CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK)

Ở MIẾN TRUNG – TÂY NGUYÊN VÀ ỨNG DỤNG TRONG

CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Mã số: 9.54.01.01

ĐÀ NẴNG, NĂM 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Người cam đoan

Võ Khánh Hà

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN TRANG TÓM TẮT MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4

6 Bố cục của luận án 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 Tổng quan về cây mật nhân 6

1.1.1 Đặc điểm sinh thái, phân bố 6

1.1.2 Thành phần hóa học của cây mật nhân 7

1.1.3 Tác dụng dược lý của cây mật nhân và ứng dụng trong dân gian 9

1.2 Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu 12

1.2.1 Tổng quan về phương pháp chiết 12

1.2.2 Tổng quan về phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học 15

1.2.3 Tổng quan về phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học 16

1.2.4 Tổng quan về quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 23

1.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu mật nhân trong và ngoài nước 27

1.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học 27

1.3.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học 31

1.3.3 Nghiên cứu về phương pháp chiết 32

1.3.4 Nghiên cứu về ứng dụng mật nhân trong thực phẩm 33

1.4 Đánh giá tình hình nghiên cứu cây mật nhân 36

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 Nguyên liệu 39

2.1.1 Thu hái và định danh mẫu rễ cây mật nhân 39

2.1.2 Xử lý nguyên liệu 39

2.2 Hóa chất, vật tư, thiết bị, dụng cụ 39

2.2.1 Hóa chất, vật tư 40

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 40

2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 41

2.4 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 42

2.4.1 Khảo sát, lựa chọn nguyên liệu 42

2.4.2 Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ rễ cây mật nhân 43

2.4.3 Phương pháp xây dựng quy trình chiết rễ mật nhân 48

2.4.4 Khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân 54

2.4.5 Nghiên cứu ứng dụng bổ sung mật nhân trong sản xuất một số thực phẩm bảo vệ sức khỏe 55

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60

3.1 Định danh mẫu thực vật và lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu 60

3.1.1 Kết quả định danh mẫu thực vật 60

3.1.2 Đánh giá, lựa chọn vùng nguyên liệu nghiên cứu 60

3.2 Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học 65

3.2.1 Kết quả phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất nhóm alkaloid 65

3.2.2 Kết quả phân lập, định danh các hợp chất không thuộc nhóm alkaloid 71

3.3 Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân 77

3.3.1 Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong dung môi ethanol 80 % 77

3.3.2 Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong nước 79

3.4 Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân 85

3.4.1 Kết quả thử khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol 80 % từ rễ cây mật nhân 85

3.4.2 Kết quả thử khả năng kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền viêm và

cytokine gây viêm 88

3.4.3 Kết quả thử khả năng ức chế đại thực bào sản sinh NO 90

3.4.4 Khả năng ức chế enzyme -glucosidase 91

3.4.5 Kết quả thử khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết nước 91

3.4.6 Kết quả thử khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết nước 93

3.4.7 Kết quả thử độc tính bất thường của dịch chiết nước rễ cây mật nhân 94

3.4.8 Kết quả thử khả năng không gây độc đối với tế bào thận gốc phôi ở người HEK-293 94

3.5 Nghiên cứu ứng dụng sản xuất một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe 96

3.5.1 Sản phẩm cao chiết mật nhân 96

3.5.2 Sản phẩm trà thảo mộc mật nhân 100

3.5.3 Nghiên cứu sản xuất sản phẩm nước rau má mật nhân 105

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

QCVN Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia DĐVN Dược điển Việt Nam

TCVN Tiêu chuẩn kỹ thuật Việt Nam MKN7 Ung thư dạ dày ở người Human Gastric Carcinoma SW626 Ung thư buồng trứng ở người Human Ovarian Adenocarcinoma

HL Ung thư bạch cầu cấp tính

leukemic ở người

Human Acute Leukemia

SK-Mel-2 Ung thư da người Human Malignant Melanoma NIH/3T3 Nguyên bào sợi của gốc phôi chuột Mouse Embryo Fibroblast

MCF-7 Ung thư vú ở người Human Breast Carcinoma

IC50 Nồng độ ức chế tối đa 50 % Half Maximal Inhibitory

Concentration

IL Interleukine MBC Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu Minimum Bactericidal

Concentration MIC Nồng độ ức chế tối thiểu Minimal Inhibited Concentration NCI Viện Ung thư quốc gia Hoa Kỳ National Cancer Institute

LPS Lipopolysaccharide TNF Yếu tố hoại tử khối u alpha Tumor Necrosis Factor RNI Nhu cầu dinh dưỡng khuyến nghị Recommended Nutrition Intakes CODEX Cơ sở dữ liệu về an toàn thực phẩm Codex Alimentarius

DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl NMR Cộng hưởng từ hạt nhân Nuclear Magnetic Resonance

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High-performance liquid

chromatography

TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography NOESY Phổ hiệu ứng hạt nhân Overhauser Nuclear Overhauser Effect

Spectroscopy

Polarization Transfer COSY Phổ tương quan proton – Proton Correlation spectroscopy HSQC Phổ tương tác dị nhân đơn liên kết Heteronuclear single quantum

coherence spectroscopy HMBC Phổ tương tác dị nhân đa liên kết Heteronuclear Multiple Bond

Correlation QPA Phân tích chương trình chất lượng Quality Program Analysis ESI Ion hóa đầu phun điện tử Electrospray Ionization GMP Thực hành sản xuất tốt Good Manufacturing Practice HMP Pectin methoxyl hóa cao High Methoxyl Pectin

ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm SKC Sắc ký cột

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Danh mục các hợp chất được phân lập từ cây mật nhân 30 Bảng 1.2 Một số sản phẩm mật nhân được bán trên thị trường ở một số

nước trên thế giới

Bảng 3.1 Phân tích một số thành phần hóa học trong rễ mật nhân tại Gia

Lai và Quảng Nam

61

Bảng 3.2 Khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết ethanol 80 % rễ

cây mật nhân tại huyện Ia Grai, tỉnh Gia Lai

61

Bảng 3.3 Khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết ethanol 80 % rễ

cây mật nhân tại huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam

62

Bảng 3.4 Giá trị IC50 của dịch chiết rễ mật nhân và vitamin C 64 Bảng 3.5 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 1 65 Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 2 67 Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 3 68 Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 4 70 Bảng 3.9 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 5 71 Bảng 3.10 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 6 và chất 7 74 Bảng 3.11 Bảng tổng hợp kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các

Bảng 3.16 Giá trị IC50 khángvi sinh vật kiểm định của dịch chiết nước 92 Bảng 3.17 Kết quả đo ABS đối với dịch chiết rễ cây mật nhân và acid

Bảng 3.23 Kết quả kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm cao mật nhân 99

Bảng 3.25 Kết quả kiểm tra chất lượng mẫu trà thảo mộc mật nhân 104 Bảng 3.26 Chiều cao cột lắng qua mỗi ngày theo từng nồng độ pectin 105 Bảng 3.27 Điểm đánh giá cảm quan thị hiếu người tiêu dùng 109 Bảng 3.28 Kết quả kiểm tra chất lượng mẫu nước rau má mật nhân 110

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh cây mật nhân tại vùng núi Gia Lai 6

Hình 2.4 Sơ đồ phân lập các chất không thuộc nhóm alkaloid 47

Hình 3.2 Khả năng bắt gốc tự do DPPH của vitamin C, dịch chiết rễ mật

nhân Gia Lai và dịch chiết rễ mật nhân Quảng Nam

63

Hình 3.3 Đường xu hướng của khả năng bắt gốc tự do DPPH của vitamin

C, dịch chiết rễ mật nhân Gia Lai và dịch chiết rễ mật nhân Quảng Nam

63

Hình 3.4 Sự ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ chiết và thời gian chiết đến

hiệu suất chiết rễ cây mật nhân trong dung môi ethanol 80 %

79

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng EL4 80 Hình 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng EL4 81 Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng EL4 82 Hình 3.8 Sơ đồ quy trình chiết mật nhân trong ethanol 84 Hình 3.9 Sơ đồ quy trình chiết mật nhân trong nước 85 Hình 3.10 Khả năng ức chế sản sinh TNF-anpha của dịch chiết nước tại các

trà thảo mộc mật nhân

103

Hình 3.16 Sự biến đổi chiều cao cột lắng theo thời gian 106 Hình 3.17 Quy trình công nghệ sản xuất nước rau má mật nhân 108 Hình 3.18 Biểu đồ mạng nhện thể hiện mức độ ưa thích đối với sản phẩm

nước rau má mật nhân

109

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Mật nhân là một loại thực vật có hoa thuộc họ Simaroubaceae họ Thanh Thất

có nguồn gốc từ Đông Nam Á Mật nhân được sử dụng phổ biến, có tên khoa học là

eurycoma longifolia jack hay còn gọi là cây bách bệnh, mật nhơn hay hậu phác nam

Nhiều công trình khoa học nghiên cứu về cây mật nhân trên thế giới đã được công bố và được ứng dụng rộng rãi với kết quả phân lập được nhiều hợp chất hữu cơ

có giá trị, các chiết xuất từ mật nhân được sử dụng để bổ sung vào sản xuất các sản phẩm dược phẩm, thực phẩm có lợi cho sức khỏe Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh, rễ cây mật nhân là thành phần có giá trị nhất và được sử dụng để điều trị đau nhức, ăn uống không tiêu, no hơi, đầy bụng, sốt dai d ng, sốt r t, suy dương, kiết l , sưng tuyến và có thể d ng làm thuốc bổ tăng cường sức khỏe Các chiết xuất từ mật nhân đã được con người sử dụng để chống sốt r t, thuốc tăng trưởng hormone sinh dục

và thuốc hạ nhiệt Ngoài ra, chiết xuất từ rễ cây mật nhân còn được d ng để khôi phục năng lượng và sinh khí, tăng cường lưu thông máu và có vai trò tốt đối với phụ nữ sau khi sinh con Bên cạnh đó, chiết xuất này còn chứa các hợp chất có hoạt tính chống khối u và chống k sinh tr ng, chống lo t Trong đó, được biết đến nhiều nhất là tác dụng làm tăng cường lượng hormone nội sinh testosterol ở nam giới

Ở nước ta, hiện nay, mật nhân không những được sử dụng trong các bài thuốc

cổ truyền mà còn có một số công trình nghiên cứu khoa học được công bố, khá nhiều hợp chất có giá trị được tìm thấy và đã ứng dụng mật nhân vào sản xuất một số sản phẩm Tại khu vực miền Trung - Tây Nguyên, đặc biệt là vùng núi các tỉnh như Gia Lai, Quảng Nam, Huế, cây mật nhân phát triển rất nhiều, người dân khai thác và sử dụng chúng như một loại thuốc bổ rất phổ biến, đặc biệt là rễ Tuy nhiên, các nghiên cứu được công bố trên đối tượng tại những địa phương này không mang tính hệ thống, chưa có công trình nghiên cứu nào công bố chi tiết và đầy đủ về phân lập, ứng dụng những hoạt tính sinh học quý có trong rễ mật nhân để làm cơ sở ứng dụng trong công nghệ sản xuất sản phẩm thực phẩm

Ngoài ra, ứng dụng mật nhân chủ yếu trong lĩnh vực dược phẩm, trong khi đó, ứng dụng bổ sung mật nhân vào sản xuất thực phẩm chưa nhiều và đa dạng, đặc biệt, chưa có nhiều sản phẩm nghiên cứu làm giảm vị đắng khó chịu khi bổ sung mật nhân

để tạo thành sản phẩm có giá trị dược lý và có giá trị cảm quan

Với những tác dụng to lớn như trên của mật nhân, một loại dược liệu qu và tình hình thực trạng nghiên cứu về mật nhân tại miền Trung - Tây Nguyên hiện nay, đồng thời nhằm đa dạng hóa sản phẩm thực phẩm, nâng cao giá trị kinh tế và khuyến khích công tác bảo tồn nguồn nguyên liệu thiên nhiên này của địa phương, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần

hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung - Tây

Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm kiếm, phát hiện và xác định những hợp chất có hoạt tính sinh học đáng qu trong rễ cây mật nhân ở miền Trung – Tây Nguyên Từ đó, ứng dụng bổ sung vào quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Rễ cây mật nhân được thu nhận tại vùng nguyên liệu được lựa chọn ở khu vực vùng núi tỉnh Gia Lai và Quảng Nam

Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát, đánh giá lựa chọn nguyên liệu để phục vụ toàn

bộ quá trình nghiên cứu, sử dụng các phương pháp phân lập, định danh xác định thành phần các hợp chất chính Thăm dò một số hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân Ứng dụng sản xuất một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe với quy mô phòng thí nghiệm

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo, các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về đặc điểm, cấu trúc, thành phần, các phương pháp thu nhận cao chiết, khảo sát hoạt tính sinh học và ứng dụng của rễ cây mật nhân trong nước và trên thế giới

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

4.2.1 Phương pháp phân lập, định danh và xác định cấu trúc hóa học 4.2.1.1 Phương pháp phân lập

Chiết các hợp chất thuộc nhóm alkaloid bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu với dung môi là nước để chiết các hợp chất chủ yếu tan nhiều trong dung môi phân cực

Chiết các hợp chất khác bằng phương pháp chiết Soxhlet với dung môi hữu cơ

ít phân cực để chiết các hợp chất chủ yếu tan nhiều trong dung môi ít phân cực hoặc không phân cực

Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký, tinh chế bằng phương pháp kết tinh phân đoạn, trong đó, cao chiết trong các dung môi khác nhau được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp Sắc ký cột gồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagel Đối với các chất phân cực có thể sử dụng Sephadex LH–20 hoặc ngược pha RP–18 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp

4.2.1.2 Phương pháp định danh, xác định cấu trúc hóa học của các chất

Các phương pháp định danh, xác định cấu trúc hóa học phổ biến: Kết hợp giữa

các phương pháp vật lý (to

nc, []D) và các phương pháp phổ hiện đại: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối va chạm electron (EI-MS), phổ khối ion hóa bằng bụi electron (ESI-MS), phổ khối có độ phân giải cao (HR-ESI-MS , phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY)

4.2.1.3 Phương pháp tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng bằng phương pháp quy

hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1, 2 mức với k yếu tố ảnh hưởng

- Xây dựng quy trình tối ưu để chiết những hợp chất có lợi bổ sung vào quy trình

công nghệ sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

- Khảo sát các điều kiện thu nhận cao chiết bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu

- Tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng phương pháp chưng ninh hồi lưu Sử dụng

phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1, 2 mức với k yếu tố ảnh hưởng (TYT 2k)

- Các yếu tố khảo sát gồm: Thời gian chiết, nhiệt độ chiết và tỷ lệ dung môi/

nguyên liệu

4.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học của các dịch chiết

- Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào ung thư

- Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO

- Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase

- Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền

viêm và cytokine gây viêm

- Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

- Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa

- Phương pháp thử độc tính

- Phương pháp thử khả năng không gây độc đối với tế bào người

4.2.3 Phương pháp sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Nghiên cứu quy trình sản xuất của một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng quy trình công nghệ tạo ra sản phẩm đáp ứng quy định hiện hành của Nhà nước đối với thực phẩm bảo vệ sức khỏe

4.2.4 Phương pháp đánh giá mức độ an toàn thực phẩm

Xác định hàm lượng kim loại nặng, vi sinh vật gây bệnh trong nguyên liệu và sản phẩm bằng các thiết bị và phương pháp phân tích hiện đại

4.2.5 Phương pháp phân tích và đánh giá cảm quan sản phẩm thực phẩm

Sản phẩm thực phẩm mới, đặc biệt là trong sản phẩm có vị đắng của mật nhân đòi hỏi phải được người tiêu dùng chấp nhận, do đó, yêu cầu sản phẩm phải được đánh giá cảm quan là cần thiết và quan trọng Sử dụng phương pháp cho điểm thị hiếu để

đánh giá mức độ chấp nhận của người tiêu d ng đối với sản phẩm

- Cung cấp các thông tin khoa học của những sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức

khỏe được ứng dụng từ rễ mật nhân

* Ý nghĩa thực tiễn

- Đặt cơ sở cho việc xây dựng quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm bổ sung

cao chiết mật nhân có hiệu quả cao, thúc đẩy sự phát triển đa dạng của ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm có lợi cho sức khỏe người tiêu d ng

- Góp phần nâng cao giá trị kinh tế của rễ cây mật nhân tại v ng núi các tỉnh

miền Trung và Tây Nguyên

- Làm cơ sở để phát triển ngành công nghiệp khai thác và ứng dụng các loại thảo

dược qu tại địa phương

6 Bố cục của luận án

Luận án gồm 123 trang (không kể phần phụ lục), kết cấu bao gồm: Mở đầu có 5 trang trình bày tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung, nghĩa khoa học, nghĩa thực tiễn của luận án

Nội dung chính gồm 3 chương:

Chương 1: Tổng quan tài liệu gồm 32 trang;

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu, gồm có 18 trang;

Chương 3: Kết quả nghiên cứu gồm có 52 trang;

Phần kết luận và kiến nghị gồm 3 trang;

Các công trình nghiên cứu đã công bố 1 trang

Ngoài ra phần các công trình công bố và tài liệu tham khảo gồm 12 trang

Trong luận án tổng cộng có 37 bảng, 28 hình vẽ và đồ thị Có 114 tài liệu tham khảo tiếng Việt, tiếng Anh và trang web

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây mật nhân

1.1.1 Đặc điểm sinh thái, phân bố

Mật nhân, còn gọi là bá bệnh, hậu phác, tho nan Lào , antongsar Campuchia ,

danh pháp khoa học: Eurycoma longifolia Jack, là loại cây có hoa thuộc họ Thanh Thất Simaroubaceae, loài bản địa ở Malaysia, Indonesia, Việt Nam, mật nhân phân bố

ít hơn ở Thái Lan, Lào và Ấn Độ Ở Indonesia, cây mật nhân tự nhiên mọc duy nhất ở Sumatra và Kalimanta [1] [2]

Cây mật nhân (hình 1.1) là loại cây nhỏ có cành, bụi thân mảnh, sinh trưởng ở tầng rừng thấp, trên đất sỏi, ưa chua và dẫn lưu nước tốt Cây có kích thước trung bình,

có thể cao đến 10 m, thường không phân nhánh Lá kép lông chim chẵn có thể dài đến 1m, cuống lá màu nâu đỏ Mỗi lá k p gồm 30 – 40 lá ch t, hình mũi mác hoặc hình trứng ngược Mỗi lá ch t dài khoảng (5 – 20) cm, rộng (1,5 – 6) cm, mặt trên của lá màu xanh, mặt dưới màu trắng Hoa mọc thành cụm hình ch y ở nách lá, màu đỏ nâu,

có nhiều lông tơ mịn Hoa lưỡng tính, cánh hoa nhỏ, rất mềm Quả hạch cứng, hình trứng, nâu vàng khi còn non và trở thành nâu đỏ khi chín Vỏ và rễ của mật nhân thường có màu trắng hoặc vàng ngà [1] [2].

Hình 1.1 Hình ảnh cây mật nhân tại vùng núi Gia Lai

Mật nhân thường mọc ở v ng đồi núi có sườn dốc cao, v ng đất cát có tính acid, nghèo chất dinh dưỡng mọc dưới tán cây, thích hợp ở những nơi có nhiệt độ trung bình 25 0C và độ ẩm khoảng 80 – 90 % mọc trong các khu rừng ven bờ biển hoặc rừng nguyên sinh, rừng tái sinh và các khu rừng hỗn tạp, rừng thưa, cây ưa acid

và đất cát ở độ cao khoảng 700 m so với mực nước biển [1] [2]

Mật nhân được xem là loại thảo dược quý, các bộ phận của cây mật nhân gồm lá, quả, thân, đặc biệt là rễ có tác dụng điều trị nhiều bệnh Hiện nay, mật nhân được d ng rộng rãi ở rất nhiều nơi trên thế giới, trong đó, có ở cả ở châu Âu, Hoa

Kỳ, dưới dạng thực phẩm bổ sung và nước uống [1]

Cây mật nhân mọc nhiều nơi ở nước ta, nhưng phổ biến nhất là ở miền Trung

và một số v ng Tây Nguyên như: Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Gia Lai, trong đó, ở

v ng núi tỉnh Gia Lai như huyện Kbang, huyện Ia-Grai, cây mật nhân mọc tự nhiên rất nhiều và được khai thác với số lượng lớn [1] [2]

1.1.2 Thành phần hóa học chính của cây mật nhân

Thành phần hóa học của mật nhân rất đa dạng, mỗi bộ phận của cây thì có các thành phần khác nhau, bao gồm những hợp chất thuộc nhóm triterpen với ba khung sườn quassinoid, squallan và tirucallan Ngoài ra, còn có alkaloid (các dẫn chất có khung cơ bản canthin-6-one và β-carbolin), steroid, coumarin, acetic acid, benzoic acid, menthol… Trong đó, quassinoid và alkaloid đóng vai trò quan trọng và là hoạt

chất chủ yếu của các cây họ Thanh Thất (Simarubaceae) nói chung và cây mật nhân

nói riêng [3]

Quassinoid là thành phần chất đắng đặc trưng của những thực vật thuộc họ Thanh Thất Các hợp chất quassinoid đều là dẫn xuất của các hợp chất triterpenoid và hầu như đa phần đều có dẫn xuất từ tetracyclic triterpend Đa số các quassinoid đều có dược tính; xu hướng phổ biến của các quassinoid là được sử dụng trong điều trị viêm khớp, chống sốt, điều trị bệnh viêm đường ruột, [4] Nhiều hợp chất quassinoid được tìm thấy ở phần thân và rễ Trong đó, eurycomanone và eurycomanol là hai quassinoid điển hình trong rễ mật nhân Các hợp chất này làm tăng nội tiết tố testosterone và lượng tinh dịch ở chuột đực [5] Ba dạng quassinoid Eurycolactone D,

E và F cũng được phân lập từ phần rễ theo báo cáo vào năm 2002 của Ang và cộng sự [6] Vào năm 2009, nhóm nghiên cứu Miyake và cộng sự đã phân lập được 34 loại

quassinoid từ phần thân đồng thời đã khám phá ra 10 hợp chất mới và chứng minh hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất này [7]

Quassinoid có thể được phân loại thành năm loại chính dựa theo bộ khung carbon cấu tạo nên hợp chất đó, bao gồm nhóm quassinoid có 18 nguyên tử carbon C18 , 19 nguyên tử carbon C19 , loại có 20 nguyên tử carbon C20 , loại có 22 nguyên tử cacbon C22 và loại có 25 nguyên tử carbon C25 trong công thức phân

tử Cấu trúc của quassinoid phụ thuộc nhiều vào bộ khung carbon chính [4]

Alkaloid là một chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có dược tính mạnh, cho kết tủa và phản ứng màu với một số thuốc thử gọi là thuốc thử của alkaloid

Alkaloid là một hợp chất hữu cơ chứa nitơ đa số có nhân vòng Các alkaloid trong cây mật nhân là các dẫn xuất có khung cơ bản canthin-6-one và β-carboline Một

số alkaloid được tìm thấy trong rễ mật nhân như n -pentyl β-carboline-1-propionate,

5-hydroxymethyl-9-methoxycanthin-6-one và 1-hydroxy-9-methoxycanthin-6-one, các hợp chất này có hoạt tính gây độc tế bào và chống sốt r t Bên cạnh đó, nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào sợi nhân HT-1080 của các hợp chất trong mật nhân, nhóm tác giả Miyake và cộng sự vào năm 2010 đã nghiên cứu và công bố hợp chất 9,10-dimethoxy-canthin-6-one hiển thị hoạt động gây độc tế bào này mạnh nhất với nồng

Alkaloid thường chứa trong các bộ phận của cây như hoa, lá, rễ, hạt, vỏ Có trường hợp, trong c ng một cây, bộ phận này rất giàu alkaloid nhưng bộ phận khác lại không có Lượng alkaloid và tỷ lệ thành phần các alkaloid trong cây có thể thay đổi tuỳ theo m a thu hái, tuổi của cây, điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng Trong c ng một

cây thường chứa các alkaloid có cấu trúc hoá học gần giống nhau Đặc biệt, trong một

số cây có chứa đến vài chục alkaloid Các alkaloid trong cây tồn tại dưới dạng muối của các acid hữu cơ [8]

1.1.3 Tác dụng dược lý của cây mật nhân và ứng dụng trong dân gian

Mật nhân là một loại thảo dược có giá trị, theo Đông y, cây mật nhân có vị đắng, tính ấm, có thể chữa nhiều bệnh nên còn có tên là bá bệnh như: Ăn không tiêu, tiêu chảy, nôn mữa, kiết l … Nước sắc lá cây trị ghẻ lở, mụn nhọt Các quassinoid từ

rễ có tác dụng diệt kí sinh trùng sốt rét Plasmodium [9]

Theo nội dung trong sách Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của Đỗ Tất Lợi, trong vỏ cây mật nhân có chứa một chất đắng gọi là quassin Vỏ cây d ng để chữa những trường hợp ăn uống không tiêu, đau mỏi lưng Quả của cây này d ng để chữa l [2]

Theo từ điển cây thuốc Việt Nam của Võ Văn Chi, người ta dùng rễ cây mật nhân thái nhỏ, tẩm rượu sao để làm thuốc, có vị đắng, tính mát Thường dùng chữa khí

hư, huyết k m, ăn uống không tiêu, tức ngực, gân xương yếu, tay chân tê đau, tả l , nôn mửa Ngoài ra, rễ mật nhân còn d ng để chữa tứ thời cảm mạo [10]

Tại Việt Nam, rễ, vỏ và quả cây được dùng sắc thuốc, vị rất đắng Thuốc được dùng trị tẩy giun, sốt rét, kiết l , ngộ độc, đầy bụng, và cả say rượu Khi dùng ngoài da

có thể trị ghẻ lở Có lẽ vì đa dụng nên cây này còn được gọi là bách bệnh Ngoài ra mật nhân còn có khả năng tăng cường tetosterone bên trong nam giới, cây d ng như vị thuốc

bổ giúp năm giới tăng cường chức năng sinh l và sức khỏe tình dục, bổ sung năng lượng cho cơ thể, giúp giảm stress, mệt mỏi, tăng cường miễn dịch, ngăn ngừa khối u và phòng chống lão hóa, giúp tăng năng lượng hoạt động và sức bền cơ thể [11]

Các kết quả nghiên cứu đã được chứng minh rõ ràng trên phương diện khoa học

và đã được công bố rộng rãi cho thấy, mật nhân các tác dụng dược lý linh hoạt bao gồm hoạt tính chống ung thư, chống sốt rét, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kích thích tình dục, chống viêm, chống loét, chống đái tháo đường

Hoạt tính kháng sốt rét: Một nghiên cứu tiến hành với dịch chiết rễ mật nhân

trên Plasmodium falciparum với mô hình lactate dehydrogenase cho thấy bốn

quassinoid gồm eurycomalactone; 13,21-dihydroeurycomanone; epoxyeurycomanone; eurycomanone đều có tác dụng kháng sốt r t, trong đó,

13-α-(21)-eurycomanone cho tác dụng mạnh nhất [9]

Tác dụng trị tiểu đường: Bệnh đái đường (hay tiểu đường) là một bệnh mãn

tính, do rối loạn chuyển hoá hydrat cacbon vì thiếu insulin ở các mức độ khác nhau, do

đó, nó gây tăng đường huyết và nếu vượt quá ngưỡng thì có đường niệu nước tiểu có đường) Insulin là hormone do tụy tiết ra, khi dòng máu mang glucose đến các cơ quan, insulin sẽ giúp glucose đi vào trong tế bào và giúp tế bào sử dụng glucose để sinh ra năng lượng cho hoạt động của các tế bào Khi thiếu insulin, cơ thể sẽ không sử dụng được glucose, hậu quả là glucose trong máu sẽ tăng cao và xuất hiện trong nước tiểu Do đó, để điều trị bệnh này có thể bằng các cách làm chậm hấp thu đường glucose từ ruột vào máu, tăng hoạt tính của insulin, kích thích tế bào bêta của tụy tăng sản xuất insulin… Một trong những nguyên nhân làm tăng lượng glucose vào máu đó

là do sự có mặt của enzyme α-glucosidase Lá và rễ cây mật nhân đã được d ng để kiểm soát đường huyết Năm 2004, nhóm nghiên cứu của Husen và cộng sự đã thử dịch chiết nước của rễ mật nhân ở ba liều (50 mg/kg; 100 mg/kg và 150 mg/kg) theo

mô hình steptozotocin trên chuột bình thường và chuột có đường huyết cao, kết quả cho thấy ở nồng độ 150 mg/kg cao nước rễ mật nhân có khả năng làm hạ đường huyết

ở lô thử và không gây giảm có nghĩa ở lô đối chứng [12]

Tác dụng kháng khuẩn: Hoạt tính kháng khuẩn là hoạt tính sinh học cho thấy

khả năng tiêu diệt hoặc ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật Hầu hết các loại

vi sinh vật gây độc đối với sức khỏe con người thường được sử dụng trong việc nghiên

cứu về hoạt tính kháng khuẩn của thực vật như: Tụ cầu vàng (S.aureus), E.coli,

Samonella, P.aeruginosa … Năm 2007, nhóm nghiên cứu Farouk cùng cộng sự đã thử

nhiều dịch chiết khác nhau methanol, ethanol, acetone, nước) từ lá, thân và rễ mật nhân trên hoạt tính kháng khuẩn Gram (-) và (+) Kết quả cho thấy dịch chiết lá và thân có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram (-) và (+), ngoại trừ hai chủng Gram (-) là

Escherichia coli và Salmonella typhi Dịch chiết nước từ lá cũng có tác dụng kháng

khuẩn trên các chủng Staphylococcus aureus và Serratia marscesens [9]

Tác dụng kích thích sinh dục: Đây là tác dụng chính, vượt trội của cây mật

nhân, đã được chứng nhận và công bố rộng rãi với nhiều đề tài nghiên cứu khoa học trên thế giới Đó là khả năng tăng cường sức khoẻ tình dục cho nam giới, kích thích cơ thể tăng tiết hormone giới tính nam (testosterone) một cách tự nhiên, duy trì sự hưng

phấn và phong độ tình dục ở nam giới, ngăn chặn các dấu hiệu suy giảm khi bước vào tuổi trung niên Theo kết quả nghiên cứu vào năm 2010 của nhóm Mohd Ismail Bin và cộng sự cho thấy, 76 trong số 320 bệnh nhân mắc chứng suy sinh dục khởi phát muộn LOH đã được cung cấp 200 mg dịch chiết mật nhân tiêu chuẩn trong 1 tháng Các triệu chứng lão hóa nam giới AMS theo thang đánh giá tiêu chuẩn và nồng độ testosterone trong huyết thanh đã được theo dõi Kết quả cho thấy điều trị bệnh nhân LOH với chiết xuất mật nhân này P <0,0001 đã cải thiện điểm AMS cũng như nồng

độ testosterone trong huyết thanh [13]

Tác dụng kháng ung thư: Năm 2018, nhóm tác giả Thu Hnin E và cộng sự đã

công bố, eurycomanone là một trong những hợp chất dược liệu mạnh nhất của mật nhân, chúng thể hiện được hiệu quả cao trong việc chống ung thư biểu mô phổi (tế bào A-549 và ung thư vú tế bào MCF-7) và cho thấy hiệu quả trung bình chống lại ung thư dạ dày (tế bào MGC-803 và ung thư biểu mô đường ruột (tế bào HT-29) [14]

Bên cạnh đó, năm 2018, nhóm tác giả Chunxin Zou và cộng sự đã công bố, tám hợp chất trong mật nhân thuộc các dẫn xuất squalene, biphenyl, neolignans và alkaloids được dự đoán là có tiềm năng hoạt động ức chế ung thư gan [15]

Hoạt tính kháng viêm: Năm 2018, nhóm nghiên cứu Lê Thanh Liêm cùng cộng

sự đã công bố kết quả: Chiết xuất alkaloid từ rễ cây mật nhân tại Kỳ Sơn – Nghệ An

đã cho thấy tác dụng chống viêm đáng kể ở cả mẫu in vitro và in vivo Dịch chiết này

thể hiện hoạt động chống viêm thông qua việc ức chế các chất trung gian gây viêm như NO, iNOS và COX-2 và bảo vệ chuột khỏi tử vong do LPS gây ra trong mô hình sốc nhiễm trùng [16]

Hoạt tính kháng oxy hóa: Khả năng kháng oxy hóa của một chất là khả năng

làm ức chế quá trình oxy hóa của các phân tử khác Oxy hóa là một phản ứng hóa học

có thể tạo ra các gốc tự do, dẫn đến các phản ứng dây chuyền có thể làm hỏng các tế bào Các chất kháng oxy hóa như thiolis hay vitamin C có thể chấm dứt các phản ứng dây chuyền này để ngăn cản quá trình oxy hóa xảy ra Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Varghese và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa và kết luận rằng dịch chiết mật nhân trong cồn thể hiện hoạt động kháng oxy hóa ở tất cả các nồng độ (10, 25, 50, 100 và 250 μg/mL Khả năng kháng oxy hóa của chiết xuất này được so sánh với các giá trị của ascorbic acid [17]

Ngoài ra, theo phát hiện của nhóm nghiên cứu Hulol Saleh Alruhaimi và cộng

sự vào năm 2019 ở Malaysia cho thấy, mật nhân có tác dụng bảo vệ thần kinh đối với giảm máu đến não mãn tính (chronic cerebral hypoperfusion) bằng cách tăng cường khả năng chống oxy hóa và giảm peroxide hóa và viêm, có thể cải thiện chức năng nhận thức ở chuột [18]

1.2 Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Tổng quan về phương pháp chiết

Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật, sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là dịch chiết Trong phạm vi công nghệ thì có rất nhiều phương pháp chiết khác nhau từ phương pháp gián đoạn đến phương pháp liên tục, từ phương pháp đơn giản đến phức tạp, từ phương pháp truyền thống đến hiện đại với các loại dung môi khác nhau Các yếu tố ảnh hưởng quá trình chiết: Bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu, thời gian chiết [19]

Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau như chiết ở nhiệt độ thường ngâm lạnh, ngâm kiệt ở nhiệt độ thường hoặc chiết ở nhiệt độ cao chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng , chiết với các thiết bị khác nhau như: Soxhlet, Kumagawa tùy yêu cầu, điều kiện mà chọn kỹ thuật chiết thích hợp

Phương pháp chưng ninh hồi lưu: Nguyên liệu được ngâm cùng dung môi trong một bình cầu đáy tròn được nối với hệ thống ngưng tụ Đun nóng bình cầu chứa nguyên liệu và dung môi đến nhiệt độ sôi, dung môi bốc hơi sẽ ngưng tụ và quay trở lại Phương pháp chưng ninh hồi lưu có ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền

Tuy nhiên, có những nhược điểm chung của phương pháp chiết xuất gián đoạn: Năng suất thấp, thao tác thủ công giai đoạn tháo bã và nạp liệu), chiết nhiều lần nên tốn dung môi, thời gian [19]

Phương pháp chiết Soxhlet: Nguyên liệu được cho vào một ống giấy lọc rồi đặt vào ngăn chiết Dung môi mới được cho vào bình cầu và đun hồi lưu Dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi - phông xuống bình cầu bên dưới, mang theo chất hòa tan từ nguyên liệu Ở bình cất, chất tan được giữ lại, dung môi bốc hơi được ngưng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp nguyên liệu để hòa tan các chất còn lại Quá trình được tiếp tục đến khi nguyên liệu được chiết hoàn

toàn Phương pháp chiết Soxhlet thuộc loại phương pháp chiết bán liên tục, nguyên liệu cho vào bộ Soxhlet và đứng yên trong khi dung môi chuyển động liên tục Phương pháp chiết Soxhlet có ưu điểm: Chiết kiệt, tiết kiệm được dung môi thu hồi dung môi) Tuy nhiên, có những nhược điểm: Lượng nguyên liệu chiết phụ thuộc nhiều vào thể tích thiết bị, tiến hành phức tạp, thiết bị đắt tiền [19]

Ngoài ra, phương pháp chiết còn được phân loại dựa vào các yếu tố sau:

- Dựa vào chế độ làm việc có các phương pháp chiết sau: Gián đoạn, bán liên tục,

liên tục

- Dựa vào chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha, có các phương pháp: Ngược

dòng, xuôi dòng, chéo dòng

- Dựa vào áp suất làm việc, có các phương pháp chiết ở: Áp suất thường, áp suất

giảm áp suất chân không , áp suất cao làm việc có áp lực

- Dựa vào trạng thái làm việc của hai pha, có các phương pháp chiết sau: Ngâm,

ngấm kiệt Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp siêu âm, phương pháp tạo dòng xoáy, phương pháp mạch nhịp [19]

Trong đề tài nghiên cứu này, sử dụng phương pháp chiết Soxhlet và chưng ninh trong quá trình chiết mẫu thực vật phục vụ việc phân lập, định danh, xác định thành phần, cấu trúc hóa học Lựa chọn phương pháp chưng ninh hồi lưu để xây dựng quy trình chiết tạo ra cao chiết bổ sung vào quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm

1.2.1.1 Phương pháp chưng ninh hồi lưu

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng phương pháp chưng ninh hồi lưu, cây mật nhân cũng từng là đối tượng được nghiên cứu trước đó Phương pháp chưng ninh hồi lưu được định hướng từ các nghiên cứu của nhóm tác giả Anisa Rahmalia và cộng

sự vào năm 2011, nhóm tác giả Zakia Khanam và cộng sự vào năm 2015[20] [21]

1.2.1.2 Phương pháp chiết Soxhlet

Lựa chọn phương pháp Soxhlet được định hướng từ các nghiên cứu của nhóm Tee Thiam Tsui và cộng sự vào năm 2005, nhóm nghiên cứu Đào H ng Cường và cộng sự năm 2010 và nhóm nghiên cứu Nursyazura Khari và cộng sự vào năm 2014 [22] [23] [24]

1.2.1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết

a Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của nguyên liệu

- Màng tế bào dược liệu

- Chất nguyên sinh

- Một số tạp chất có thể có trong nguyên liệu

Những yếu tố này thì không thể thay đổi được trong quá trình sản xuất, mà phụ thuộc vào nguyên liệu sử dụng, do vậy, trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi không nghiên cứu sâu về nội dung này [8]

b Những yếu tố thuộc về dung môi

- Độ phân cực của dung môi: Dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các chất không

phân cực và khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa tan các chất ít phân cực [8]

- Theo tác giả Rajeev Bhat và cộng sự, trong thành phần rễ cây mật nhân thành

phần chủ yếu là các quassinoid và alkaloid, trong đó, các alkaloid là những hợp chất

có tính chất phân cực mạnh, còn các quassioid là những dẫn xuất của triterpen, là những hợp chất phân cực vừa Do đó, những thành phần này có thể hòa tan tốt trong các dung môi phân cực như nước Mặt khác, nước là một dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, an toàn khi bổ sung vào thực phẩm, lại không gây m i vị khó chịu đối với thực phẩm Ngoài ra, dung môi ethanol 80 % trong nước được xem là dung môi vạn năng, có thể hòa tan hầu hết các hợp chất từ phân cực mạnh đến ít phân cực, ethanol cũng có thể sử dụng trong thực phẩm Vì vậy, lựa chọn nước và ethanol 80 % trong nước làm dung môi trong nghiên cứu sau này [25]

- Độ nhớt, sức căng bề mặt của dung môi: Dung môi có độ nhớt càng thấp hoặc

có sức căng bề mặt càng nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào dược liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất và ngược lại [8]

c Những yếu tố về kỹ thuật

Yếu tố về kỹ thuật là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp kỹ thuật khác nhau, nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Đó có thể là những yếu tố như nhiệt độ, thời gian, độ mịn của dược liệu, khuấy trộn, siêu âm [8]

- Sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha: Trong quá trình trích ly, sự chênh lệch

nồng độ giữa hai pha là động học của quá trình trích ly, do đó sự chênh nồng độ giữa hai pha càng lớn thì quá trình trích ly diễn ra càng nhanh và thuận lợi Chính vì thế,

trong quá trình trích ly người ta luôn tìm mọi cách để tăng sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha: Trích ly ngược chiều, tuần hoàn dung môi, bổ sung dung môi trong quá trình trích ly, thay mới dung môi cuối quá trình trích ly [8]

- Nhiệt độ chiết: Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi nhiệt độ

tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, do đó, theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên Hơn nữa khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm nên tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây ra bất lợi cho những hợp chất k m bền ở nhiệt độ cao, gây phá hủy một số hoạt chất như vitamin, glycosid, alkaloid, Một số bất lợi khác có thể kể đến như khi nhiệt độ tăng làm tăng

độ hòa tan của tạp chất, dung môi dễ bị hao hụt và đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt, độ hòa tan của chúng giảm khi nhiệt độ tăng Vì vậy, tùy trường hợp cụ thể, chúng ta cần lựa chọn nhiệt độ sao cho ph hợp [8]

- Thời gian chiết: Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ sẽ được hòa

tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn

Do đó nếu thời gian chiết quá ngắn sẽ không chiết được hết các hoạt chất trong dược liệu Nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp chất, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Nhưng đến một giới hạn nào đó thì quá trình chiết sẽ đến trạng thái cân bằng d có k o dài thời gian thì quá trình trích ly cũng không tiếp tục diễn ra Vì vậy, cần thiết phải lựa chọn thời gian chiết sao cho ph hợp với thành phần dược liệu, dung môi và phương pháp chiết [8]

Ngoài những yếu tố kể trên, còn nhiều yếu tố khác cũng gây ảnh hưởng đến quá trình chiết như độ mịn, khuấy trộn, áp suất, pH môi trường, chấn động cơ học, dòng điện cao áp [8]

Những yếu tố về kỹ thuật là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp kỹ thuật khác nhau, thay đổi các yếu tố này trong quá trình sản xuất là dễ dàng thực hiện Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn ba yếu tố của quá trình chiết xuất là tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu, nhiệt độ chiết và thời gian chiết để tiến hành quá trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng bằng quy hoạch thực nghiệm và tối

ưu hóa quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu [26]

1.2.2 Tổng quan về phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học

Sau quá trình chiết từ các dung môi khác nhau, dịch chiết được cô khô tạo thành

cao chiết, tách và tinh chế các hợp chất có trong cao chiết bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi thích hợp

Sắc ký cột (CC): Nhằm phân lập các đơn chất từ hỗn hợp Nguyên tắc: Sắc ký hấp phụ có thể được tiến hành trên một cột thủy tinh th ng đứng với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ dưới tác động của trọng lực Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để lấy ra lần lượt trước hoặc sau Sắc ký cột gồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh sử dụng silicagel Đối với các chất phân cực có thể sử dụng sephadex LH-20 hoặc ngược pha RP-18 Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc d ng phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế [19]

Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC): Nhằm xác định hệ dung môi để chạy sắc ký cột, kiểm tra thành phần độ tinh khiết của các hỗn hợp, các phân đoạn của sắc ký cột Nguyên lý: Sắc ký bản mỏng TLC là sắc ký hấp phụ được tiến hành trên một bản mỏng, chất hấp phụ là silicagel hay oxýt nhôm Sau khi nhúng bản mỏng vào dung dịch chiết, lấy ra sấy nhẹ, sẽ phát hiện các vết Sắc ký bản mỏng được

sử dụng để kiểm tra độ tinh khiết cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp [19]

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa các phương pháp vật lý (tonc, []D và các phương pháp phân tích hóa lý:

- Sắc k lỏng khối phổ LC-MS, LC-MS/MS : Sử dụng cho các đối tượng là

những hợp chất có khối lượng phân tử lớn, khó bay hơi

- Hồng ngoại IR : Sử dụng định danh các nhóm chức có trong hợp chất

- Phổ khối va chạm electron EI-MS);

- Phổ khối ion hóa bằng bụi electron ESI-MS);

- Phổ khối có độ phân giải cao HR-ESI-MS);

- Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT và hai chiều HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY) [27] [28]

1.2.3 Tổng quan về phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học

1.2.3.1 Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào ung thư

Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư

Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc

diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro Phương pháp thử nghiệm xác định tính độc tế

bào ung thư cytotoxic assay đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp và đối với các dòng

tế bào nuôi cấy hỗn dịch [29] [30]

a Xác định khả năng gây độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp

Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào ung thư cytotoxic assay đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp là phương pháp dạng SRB Phương pháp này được thực hiện tương tự theo phương pháp của Monks (1991) Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB)

Giá trị OD máy đo được tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn [29]

b Xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch

Phương pháp xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch là phương pháp dạng MTT Phương pháp này được thực hiện tương tự theo phương pháp của Mosmann Bernardes và cộng sự vào năm 1983 Nhóm tác giả sử dụng muối tetrazolium MTT-(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium)) làm thuốc thử trong ph p so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào Vòng tetrazolium của thuốc thử bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động Dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase trong tế bào, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Như vậy, càng nhiều formazan thì tỷ lệ tế bào sống sót càng cao [30]

1.2.3.2 Xác định khả năng ức chế đại thực bào sản sinh NO

Việc sản xuất NO sinh lý là cực kỳ quan trọng để bảo vệ cơ thể, tuy nhiên, sản xuất quá mức và các chất chuyển hóa của nó có liên quan đến sự phát triển của các bệnh lý, ch ng hạn như sốc nhiễm trùng do vi khuẩn và viêm mãn tính Phương pháp khảo sát khả năng ức chế tế bào đại thực bào sinh NO là phương pháp được sử dung phổ biến trong việc thăm dò hoạt tính kháng viêm đối với các loại thực vật nhằm đánh giá tác nhân ngăn chặn sản xuất có thể có lợi cho việc điều trị phản ứng viêm Ngoài

ra, các loài gốc tự do cũng chịu trách nhiệm kích hoạt một số yếu tố phiên mã tiền viêm, có liên quan đến việc thúc đẩy các bệnh viêm [31]

Đến thời điểm nghiên cứu, chưa có công bố nào về khả năng kháng viêm trên đối tượng dịch chiết rễ cây mật nhân, do đó, trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, khảo sát khả năng này nhằm tìm ra đặc tính mới, bổ sung giá trị cho nguyên liệu đã lựa chọn nghiên cứu

1.2.3.3 Xác định hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase

Chứng tăng đường huyết sau khi ăn dẫn đến sự tiến triển của bệnh tiểu đường

tu p 2, do đó phương pháp ức chế hoạt động của enzyme -glucosidase trong điều trị tiểu đường tu p 2 là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay

Khảo sát khả năng ức chế enzyme α- glucosidase qua đó đánh giá được khả năng kháng bệnh đái tháo đường tuýp 2 của dịch chiết nước Dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất p-nitrophenyl--D-glucopyranoside nhờ tác động của enzyme  - glucosidase, qua

đó giải phóng sản phẩm là p-nitrophenol có màu vàng Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 410 nm ở thời điểm 30 phút sau phản ứng, phản ánh lượng sản phẩm p-Nitrophenol sinh ra, qua đó phản ánh hoạt độ của enzyme  - glucosidase [32]

1.2.3.4 Xác định hoạt tính kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền viêm và cytokine gây viêm

Viêm là một cơ chế bảo vệ do các yếu tố hóa học khác nhau gây ra, và bao gồm các thay đổi phức tạp, tuần tự để loại bỏ nguyên nhân ban đầu, nhiều bệnh được theo sau bởi các quá trình viêm cấp tính hoặc mãn tính với sản xuất nhiều chất trung gian hóa học, ch ng hạn như xơ vữa động mạch, bệnh Alzheimer, ung thư, hen suyễn và các bệnh nhiễm tr ng, như bệnh lao [31]

Cytokine là các protein hay glycoprotein không phải kháng thể được sản xuất

và phóng thích bởi các tế bào bạch cầu viêm và một số tế bào khác không phải bạch cầu Các protein này hoạt động trong vai trò là các chất trung gian điều hòa giữa các tế bào trong cơ thể, các nghiên cứu và hiểu biết về vai trò sinh l cũng như sinh l bệnh của cytokine đã đạt được những thành tựu đáng kể Cytokine tham gia vào rất nhiều quá trình sinh học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo máu, đáp ứng miễn dịch, viêm Tuy nhiên các phân tử này cũng đóng vai trò khá quan trọng trong các bệnh l như: Bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư

Cytokine tham gia vào nhiều quá trình sinh lý bao gồm điều chỉnh các phản ứng miễn dịch và viêm Các phân tử hiệu ứng này được tạo ra tạm thời và cục bộ kiểm soát biên độ và thời gian của phản ứng Phương pháp xác định hàm lượng cytokine tiền viêm và cytokine gây viêm giúp đánh giá khả năng kháng viêm của tế bào vì nếu quá trình sản xuất quá nhiều hoặc không đủ cytokine có thể góp phần đáng kể vào sinh lý bệnh của một loạt bệnh tự miễn dịch, các bệnh truyền nhiễm và đào thải khi ghép tạng (ví dụ, IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-alpha) [33]

1.2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng tương tự phương pháp nghiên cứu của Hadacek và cộng sự vào năm 2000 [34]

Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện

hoạt tính là MIC Minimum inhibitor concentration - nồng độ tối thiểu ức chế), IC50 (50 % inhibitor concentration - nồng độ ức chế 50% , MBC Minimum bactericidal

concentration - nồng độ tối thiểu diệt khuẩn Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm

những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người như:

- Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram + , sinh bào tử, thường không gây bệnh

- Staphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram + , gây mủ các vết thương, vết

bỏng, gây viêm họng, nhiễm tr ng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng

- Lactobacillus fermentum là vi khuẩn Gram + , vi khuẩn đường ruột lên men có

ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật

- Escherichia coli là vi khuẩn Gram (- , gây một số bệnh về đường tiêu hoá như

viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm l trực khuẩn

- Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram (- , trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm

tr ng huyết, các nhiễm tr ng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột

- Salmonella enterica là vi khuẩn Gram - , vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm

tr ng đường ruột ở người và động vật

- Candida albicans là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh

phụ khoa

Môi trường nuôi cấy: MHB Mueller- Hinton Broth), MHA (Mueller - Hinton

Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar cho vi khuẩn; SDB

(Sabouraud – 2 % dextrose broth) và SA (Sabouraud – 4 % dextrose agar cho nấm

Chất tham khảo:

- Kháng sinh ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram +

- Kháng sinh cefotaxim cho các chủng vi khuẩn Gram -)

- Kháng nấm nystatin cho chủng nấm

Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật Giá trị IC50 được tính dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN:

2

( )(%) 100

Giá trị MBC được xác định bằng số khuẩn lạc trên đĩa thạch

1.2.3.6 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa

Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa thường được sử dụng như sau:

a Phương pháp thông qua phản ứng bao vây gốc tự do DPPH

Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu được xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự do Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo

ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethanol bão hoà Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm – 517 nm [35] Phương pháp này thực hiện nhanh chóng, đơn giản, chính xác và có thể đo hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất khác nhau

b Phương pháp dựa vào năng lượng khử

Năng lực khử được xác định tương tự theo các phương pháp được sử dụng của nhóm nghiên cứu Oyaizu và cộng sự năm 1986, nhóm nghiên cứu Nguyễn Xuân Duy

và cộng sự năm 2013 Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp khử kali ferricyanide để xác định quá trình khử, phản ứng chuyển hóa Fe3+

thành Fe2+ Nhiều thể tích khác nhau của dịch chiết được trộn với đệm phosphate pH = 6,6 để đạt thể tích cuối c ng 1,5 mL trước khi thêm 0,5 mL K3(Fe[CN3 1 % Hỗn hợp được ủ ở 50 oC trong 20 phút, sau

đó thêm 0,5 mL TCA 10 % và 2 mL nước cất, cuối c ng 0,4 mL AlCl3 0,1 % được thêm vào Độ hấp thu quang học được xác định tại bước sóng 700 nm Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh Tính toán giá trị IC50, là lượng mẫu làm tăng độ hấp thu quang học lên 0,50 [36] [37]

c Phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa trên mô hình dầu - nước

Hệ nhũ tương dầu - nước được chuẩn bị gồm: 10 % dầu Olive, 85 % nước và 0,5 % Tween 40 Hỗn hợp được đồng hóa ở tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút Lấy chính xác 2 mL dịch chiết được trộn đều với 10 mL hệ nhũ tương dầu – nước chứa trong ống nhựa 50 mL có nắp đậy, được đặt trong tủ ổn nhiệt ở 50 oC, quá trình oxy hoá chất b o được quan sát hàng ngày Hàm lượng hydroperoxide được xác định trên dịch chiết chất b o theo phương pháp của Bligh and Dyer vào năm 1959 Hàm lượng hydroperoxide được xác định theo phương pháp của Richards và Hultin vào năm 2002 Kết quả tính toán hàm lượng hydroperoxide từ đường chuẩn Cumene hydroperoxide (HPO) nồng độ từ 0-120 nmol/mL [36] [38] [39]

Ngoài ra, có một số phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa khác [35]:

- Phương pháp TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity : Xác định hoạt

tính kháng oxy hóa so với khả năng chống oxy hóa của Trolox

- Phương pháp ORAC oxygen radical absorbance capacity : Xác định khả năng

hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động

- Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential : Khả năng

kháng oxy hóa bằng cách bẫy các gốc tự do

- Phương pháp FRAP ferric reducing-antioxidant power : Lực kháng oxy hóa

bằng phương pháp khử sắt

- Phương pháp Conjugated Diene: Khảo sát nối đôi liên hợp

Các phương pháp trên có tính đặc hiệu cao, tuy nhiên, phương pháp phức tạp, khó thực hiện, các hóa chất sử dụng đắt tiền, khó cung cấp, đồng thời phòng thí nghiệm không được trang bị đầy đủ các thiết bị phục vụ phân tích

1.2.3.7 Phương pháp thử độc tính

Thử độc tính để biết được nguy cơ gây tác động xấu đến sức khỏe con người khi tiếp xúc, ảnh hưởng xấu đến môi trường cũng như các sinh vật nơi sử dụng các sản phẩm Giúp thiết lập liều lượng trong thử nghiệm lâm sàng để cung cấp thông tin ban

đầu về mẫu thử nghiệm Các phương pháp được sử dụng phổ biến đối với nghiên cứu trên đối tượng thảo dược như sau:

- Thử độc tính bất thường: Độc tính bất thường hay còn gọi là độc tính cấp là

biểu thị sự tác động xấu hay sự tử vong của sinh vật ngay sau khi tiếp xúc với chất độc Độc tính cấp xảy ra do tiếp xúc với đơn hoặc đa yếu tố trong một thời gian ngắn

và tác động cấp tính là tác động xảy ra trong vòng một vài ngày hoặc thậm chí là một vài giờ đầu tiên sau khi tiếp xúc với chất độc, thông thường thời gian gây độc cấp tính phải ít hơn hai tuần Mặt khác, vì những tác động mãn tính chỉ xuất hiện sau khi tiếp xúc lặp lại với một chất độc, trong nhiều trường hợp cần phải tiếp xúc liên tục hàng tháng Trong khi đó, tác nhân gây độc tính cấp được hấp thụ nhanh chóng vào cơ thể

và sản sinh ra ngay lập tức các hiệu ứng độc cho cơ thể, song cũng có trường hợp, tiếp xúc cấp tính bị suy giảm độc tính Thử độc tính bất thường là một phương pháp để xác định tiêu chuẩn của một dạng thuốc nào đó Đó là tiêu chuẩn về độ an toàn của thuốc Trong thử độc tính bất thường quy định rõ: Động vật thử là gì, tình trạng con vật, cân nặng động vật, số con, liều thử, đường d ng, thời gian theo dõi, không có biểu hiện bệnh l và phải không có con vật nào chết Mục đích: Cung cấp thông tin cho việc xếp loại mức độ độc của thuốc, dự đoán triệu chứng và dự kiến biện pháp điều trị ngộ độc cấp; thiết lập mức liều cho những thử nghiệm độc tính và tác dụng cũng như phạm vi

an toàn của thuốc nghiên cứu tiếp theo [40] [41]

- Thử độc tính bán trường diễn: Thử độc tính dài ngày chỉ được tiến hành sau khi

đã có thông tin về độc tính cấp trên động vật và mẫu thử được dự định sử dụng hoặc tiếp xúc dài ngày trên người Thử độc tính dài ngày nhằm xác định khả năng dung nạp của động vật thí nghiệm khi d ng mẫu thử nhiều lần Thông tin cần xác định có những biểu hiện độc tính sau khi d ng dài ngày, bao gồm:

Mức liều không hoặc có gây thay đổi đáng kể tới chức năng, cơ quan hoặc một

số biểu hiện sống có thể quan sát được trên động vật thí nghiệm;

Những độc tính có thể quan sát được trên động vật và khả năng hồi phục nếu

có [40]

Quy trình thử độc tính bất thường được thực hiện theo hướng dẫn tại phụ lục 13.5 – Dược điển Việt Nam

1.2.3.8 Phương pháp xác định khả năng không gây độc đối với tế bào người

Việc phát triển một loại thảo dược hay thực phẩm mới từ tưởng ban đầu đến khi

đưa ra thành phẩm là một quá trình phức tạp có thể mất 12 ÷ 15 năm và tốn kém Ý tưởng cho một mục tiêu có thể đến từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm nghiên cứu học thuật và lâm sàng và từ lĩnh vực thương mại Xây dựng cơ sở bằng chứng hỗ trợ trước khi chọn mục tiêu cho một chương trình khám phá có thể mất nhiều năm Khi đã chọn được mục tiêu, ngành công nghiệp dược phẩm và gần đây là một số trung tâm học thuật đã đưa ra một số quy trình ban đầu để xác định các phân tử có các đặc tính phù hợp để tạo ra các loại sản phẩm được chấp nhận Đánh giá này sẽ xác định mục tiêu ban đầu, thông qua phát triển thử nghiệm, sàng lọc thông lượng cao, tối ưu hóa và cuối cùng là lựa chọn để phát triển lâm sàng [42]

Phương pháp xác định khả năng không gây độc đối với tế bào người nhằm đánh giá khả năng không gây độc của sản phẩm lên tế bào người khi sử dụng sản phẩm, phương pháp thực hiện trên HEK-293 - tế bào thận gốc phôi ở người (human embryonic kidney cells)

1.2.4 Tổng quan về quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

1.2.4.1 Tổng quan về thực phẩm bảo vệ sức khỏe

a Khái niệm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Căn cứ vào khoản 1, điều 3, Nghị định 15/2018/NĐ-CP quy định: “Thực phẩm

bảo vệ sức khỏe (Health Supplement, Dietary Supplement) là những sản phẩm được

d ng để bổ sung thêm vào chế độ ăn uống hàng ngày nhằm duy trì, tăng cường, cải thiện các chức năng của cơ thể con người, giảm nguy cơ mắc bệnh”

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa một, nhiều hoặc hỗn hợp các chất sau:

- Vitamin, khoáng chất, acid amin, acid b o, enzyme, probiotic và chất có hoạt

tính sinh học khác;

- Chất có nguồn gốc tự nhiên, bao gồm động vật, khoáng vật và thực vật dưới

dạng chiết xuất, phân lập, cô đặc hay chuyển hóa;

- Các nguồn tổng hợp của những thành phần được đề cập trên

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe được trình bày ở dạng chế biến như viên nang, viên hoàn, viên nén, chế phẩm dạng cốm, bột, lỏng và các dạng bào chế khác, được phân liều thành các đơn vị liều nhỏ để sử dụng

b Lợi ích của thực phẩm bảo vệ sức khỏe

- Bổ sung nhanh chóng chất dinh dưỡng và các chất có tác dụng chức năng mà cơ

thể không được cung cấp đầy đủ trong chế độ ăn uống hàng ngày

- Có thể tạm thời thay thế bữa ăn khi không có điều kiện ăn uống bình thường

như khi ở môi trường thiếu thốn thực phẩm hoặc không thể ăn được vì l do bệnh tật

- Các chế phẩm đều ở dạng tinh chế rất tiện lợi, dễ sử dụng và bảo quản

- Có nhiều sản phẩm để chọn lựa ph hợp với tình trạng cơ thể từng người

- Mua và d ng dễ dàng không cần phải có thầy thuốc khám bệnh kê toa

- Khi sử dụng thực phẩm chức năng, người sử dụng sẽ có thức chăm lo cho sức

khoẻ, thay đổi thói quen để có chế độ ăn uống hợp l và lối sống lành mạnh có lợi cho sức khoẻ hơn

- Nguồn cung cấp dồi dào thường xuyên, mạng lưới rộng khắp

1.2.4.2 Tổng quan nguyên liệu chính sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe của đề tài

- Bột rễ mật nhân: Sản xuất cao chiết để sử dụng trực tiếp và bổ sung vào dây

chuyền sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

- Nụ vối: Có tác dụng bình ổn đường huyết lâu dài, hỗ trợ giảm mỡ máu, chống

oxy hóa, trị bệnh đái tháo đường Các nghiên cứu trước đây cũng đã chứng minh nụ vối có nhiều tác dụng sinh học như:

- Kháng viêm [43];

- Kháng khuẩn [44];

- Kháng ung thư [45] [46];

- Tăng cường và kích thích tiêu hóa [46]

Rau má: Là loại rau tương đối phổ biến, có nhiều hoạt tính sinh học đáng qu đối với sức khỏe con người, thường thu hái cả lá và dây Rau má được d ng như thực phẩm và thuốc trong dân gian, rau má có vị hơi đắng, ngọt, tính hơi mát, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tán ứ chỉ thống, lương huyết sinh tân, lợi niệu Rau má thường

d ng để làm thuốc bổ dưỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả l , khí hư, bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy Trong rau má có alkaloid là hydrocotulin và các glycosid, asiaticoside

và centellosid, có tác dụng tới các mô liên kết, giúp cho các mô tái tạo nhanh chóng,

do đó làm các vết thương mau lành và lên da non [47]

Vào năm 2009, nhóm nghiên cứu Frederico Pittella và cộng sự đã công bố rằng dịch chiết rau má có hoạt động đáng kể chống lại khối u ác tính ở chuột (B16F1), ung thư vú ở người (MDA MB-231) và các dòng tế bào chuột glioma (C6), với các giá trị

IC50 lần lượt 698 g/mL, 648 g/mL và 1000 g/mL [48]

1.2.4.3 Quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Thực phẩm nói chung và thực phẩm bảo vệ sức khỏe nói riêng để được công nhận và được thương mại hóa bắt buộc phải tuân thủ quy định về chất lượng của sản phẩm thực phẩm theo Luật an toàn thực phẩm 55/2010/QH12 [49]; Nghị định số 15 năm 2018 về việc quy định chi tiết thi hành một số điều của Luật an toàn thực phẩm [50] Bên cạnh đó, hàm lượng chất bổ sung vào sản phẩm phải tuân theo quy định của Thông tư số 43/2014/TT-BYT - quy định về quản l thực phẩm chức năng [51]; Thông

tư 18/2019/TT-BYT – hướng dẫn thực hành sản xuất tốt GMP trong sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe [52] Vì vậy, quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe về cơ bản bao gồm các nội dung sau đây:

- Khảo sát hàm lượng bổ sung hoạt chất có hoạt tính sinh học;

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất ;

- Kiểm tra chất lượng sản phẩm;

- Xây dựng dự thảo công bố sản phẩm trình cơ quan quản l nhà nước chuyên ngành thẩm định và phê duyệt

a Khảo sát hàm lượng bổ sung hợp chất có hoạt tính sinh học

Việc bổ sung một lượng hợp chất có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ thiên nhiên vào thực phẩm sẽ ảnh hưởng đến chỉ tiêu chất lượng sản phẩm thành phần hóa học, cảm quan v v… , đặc biệt, với mật nhân có vị đắng hậu vị rất khó chịu, phương pháp chế biến nhằm giảm thiểu sự hao hụt, biến tính hoạt chất Trên cơ sở khảo sát hàm lượng hợp chất có hoạt tính cần bổ sung, tiến hành xây dựng quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

b Xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất của một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe quy mô phòng thí nghiệm với nguyên liệu chính được nêu ở mục 1.2.4.2 và một số nguyên liệu bổ sung khác

c Kiểm tra chất lượng sản phẩm

Kiểm tra chất lượng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe nhằm đảm bảo sản phẩm đạt các chỉ tiêu chất lượng với liều lượng chất bổ sung đã xác định, đánh giá cảm quan thị hiếu người d ng, đồng thời, phải đảm bảo các chỉ tiêu an toàn thực phẩm

theo quy định hiện hành

Đây là cơ sở để nhà sản xuất xây dựng bản công bố chất lượng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe và là một trong các tiêu chí quan trọng để đưa sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe ra thị trường

d Công bố chất lượng sản phẩm

Trường hợp công bố sản phẩm tự sản xuất, căn cứ điều 10, Thông tư 43/2014/TT-BYT, cá nhân, tổ chức cần đảm bảo các yêu cầu sau:

- Thành phần chính tạo nên công dụng của sản phẩm phải được liệt kê trước c ng

tên đầy đủ và hàm lượng Các thành phần khác được liệt kê tiếp sau theo thứ tự giảm dần về khối lượng;

- Hàm lượng của vitamin, khoáng chất có trong thực phẩm tính theo liều khuyên

d ng hằng ngày của nhà sản xuất phải đạt được tối thiểu 15 % RNI;

- Hàm lượng tối đa của vitamin, khoáng chất có trong thực phẩm tính theo liều

khuyên dùng hằng ngày của nhà sản xuất không được vượt quá ngưỡng dung nạp tối

đa của các vitamin và khoáng chất được quy định;

- Hàm lượng vitamin và khoáng chất có trong sản phẩm phải được ghi trên nhãn

bằng số và phải được công bố dưới dạng tỷ lệ phần trăm % tính theo RNI, dựa trên liều khuyên d ng hằng ngày của sản phẩm hoặc dựa trên một đơn vị sử dụng (serving size)

Trường hợp Việt Nam chưa có mức RNI và ngưỡng dung nạp tối đa thì áp dụng theo quy định của CODEX hoặc các tổ chức quốc tế có liên quan

- Công bố khuyến cáo về sức khỏe Health claims :

 Công bố khuyến cáo về sức khỏe phải đúng bản chất của sản phẩm, chỉ công

bố công dụng của thành phần cấu tạo có công dụng chính hoặc công bố công dụng hợp thành của những thành phần cấu tạo khi có bằng chứng khoa học chứng minh và không công bố công dụng theo cách liệt kê công dụng của các thành phần;

 Công bố khuyến cáo về sức khỏe, liều lượng, đối tượng sử dụng và cách d ng

ph hợp phải thống nhất và ph hợp với các tài liệu tại hồ sơ;

 Khi hàm lượng vitamin, khoáng chất, các hoạt chất sinh học nhỏ hơn mức

trong các tài liệu khoa học chứng minh thì không được công bố công dụng sản phẩm;

 Khi hàm lượng vitamin, khoáng chất, các hoạt chất sinh học đạt như trong tài

liệu khoa học khuyến cáo thì được công bố công dụng nhưng phải chỉ ra đối tượng, liều d ng ph hợp;

 Khi hàm lượng các thành phần cấu tạo chưa có mức RNI thì phải cung cấp tài

liệu khoa học chứng minh về công dụng của thành phần đó c ng khuyến cáo liều d ng khi công bố

- Đối tượng sử dụng:

 Đối tượng phải ph hợp với công dụng đã công bố và được cơ quan nhà nước

có thẩm quyền chấp nhận thông qua Bản xác nhận công bố ph hợp quy định an toàn thực phẩm;

 Phải cảnh báo đối tượng không được sử dụng nếu có 1.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu mật nhân trong và ngoài nước

Từ nhiều năm trước, các kết quả nghiên cứu về cây mật nhân ở nước ta và trên thế giới đã được công bố, đặc biệt là rễ của chúng, các nghiên cứu chủ yếu đề cập đến thành phần hóa học của các chất phân lập được, khảo sát hoạt tính sinh học của dịch

chiết và một số ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm có lợi cho sức khỏe

1.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học

Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về phân lập, xác định thành phần hóa học của nhiều hợp chất đã được công bố từ những năm 1960 của thế kỷ trước, có thể nêu một số kết quả nghiên cứu sau:

Năm 1968, nhóm nghiên cứu Lê Văn Thới và Nguyễn Ngọc Sương đã phân lập được hợp chất β-sitosterol, campesterol, 2,6- dimetoxybenzoquinon và một số hợp chất có vị đắng là eurycomalacton từ cao chiết ête dầu trích từ vỏ và lá cây mật nhân bằng kỹ thuật sắc ký cột hấp phụ trên alumin [53]

Năm 1982, nhóm nghiên cứu thuộc Trường Đại học Y Dược Hiroshima, Nhật

đã phân lập được hai hợp chất quassinoid có số oxy hoá cao có tên là eurycomanone

và eurycomanol từ rễ cây mật nhân có nguồn gốc Indonesia [54]

Năm 1986, nhóm nghiên cứu của K.L.Chan và cộng sự đã tìm thấy hợp chất mới thuộc nhóm quassinoid là 3,4-dihyroeurycomalacton, 5,6-dehyroeurycomalacton, 6-hydroxy-5,6-dehydroeurycomalacton và nhóm alkaloid có tên là 10-hydroxycantin-6-on, tinh thể màu vàng từ cao ête dầu trích từ rễ cây mật nhân Ngoài ra, từ cao chloroform của rễ cây cũng phát hiện được một hợp chất coumarin là scopoletin [55]

Năm 1989, nhóm nghiên cứu của K L Chan và cộng sự đã phân lập được một quassinoid glycoside có tên là eurycomanol-2-O--D-glucopyranosid trích từ cao n-butanol của rễ cây mật nhân [56]

Năm 1982, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sương và công sự đã phân lập được hai hợp chất laurycolactone A và laurycolactone B, chúng là các quassinoid có

bộ xương cơ bản C18 [57]

Tiếp theo vào năm 1991, nhóm nghiên cứu của K L Chan và cộng sự đã phân lập được từ hợp chất 13β,18-dihydroeurycomanol, kết tinh trong methanol từ dịch trích từ rễ cây với ête dầu [58]

Nhóm Kadono và công sự đã công bố kết quả nghiên cứu các thành phần gây độc tế bào và chống sốt r t của rễ, đã phân lập được bốn alkaloid thuộc nhóm canthin-6-one đó là 9-methoxycanthin-6-one, 9-methoxycanthin-6-one-N-oxide, 9-hydroxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6-one-N-oxide và -carboline-1-propionic acid vào năm 1991 [59]

Cũng vào năm 1991, nhóm nghiên cứu của H Tada và cộng sự đã phân lập được hợp chất paskbumin A eurycomanon và hai hợp chất mới cũng có khung sườn quassinoid là pasakbumin B, pasakbumin C từ cao chiết methanol [60] Nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học y dược, Tokyo - Nhật trong quá trình nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây mật nhân đã phân lập được hai hợp chất mới với khung squallan Đây đồng thời là hai đồng phân lập thể của nhau, một là eurylen, một là teurylen, cả hai đều

có dạng tinh thể không màu, có công thức phân tử là C34H58O8 [61]

Năm 1993, nhóm nghiên cứu của H Itokawa và cộng sự đã phân lập được một hợp chất mang khung squallan tên là longilen peroxide, là một hợp chất không màu, có công thức phân tử là C30H52O8 [62]

Vào năm 2014, nhóm nghiên cứu của Seon Ju Park và cộng sự đã phân lập và định danh cấu trúc của năm hợp chất thuộc nhóm quassinoid: Eurylactone E, eurylactone F, eurylactone G, eurycomalide D, and eurycomalide E [63]

Năm 2015, nhóm nghiên cứu Lê Thị Huyền và cộng sự đã phân lập được 3 chất thuộc nhóm quassinoid từ dịch chiết methanol của rễ cây mật nhân: Pasakbumin-C,

13α,21-epoxyeurycomanone and eurylactone A [64]

Năm 2017, nhóm nghiên cứu Nguyễn Hữu Tùng và cộng sự đã tìm ra một