(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tạo cây đậu tương (glycine max l ) biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin chuyên biệt ở hạt

Các kết quả khảo sát tạo vết thương mẫu cho thấy sử dụng phương pháp tạo vết thương mẫu thích hợp giúp tăng đáng kể hiệu quả chuyển gen, cụ thể với khả năng biến nạp cấu trúc gen tạo as

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

HOÀNG VĂN DƯƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max L.)

BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ASTAXANTHIN CHUYÊN BIỆT Ở HẠT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH - 2022 -

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

HOÀNG VĂN DƯƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max L.)

BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ASTAXANTHIN CHUYÊN BIỆT Ở HẠT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Nguyễn Hữu Hổ và TS Phan Tường Lộc Nội dung nghiên cứu

và các kết quả trong đề tài này hoàn toàn trung thực Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được trích dẫn nguồn gốc

rõ ràng Một phần trong kết quả nghiên cứu của đề tài này đã được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về sự cam đoan này

Hoàng Văn Dương

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận Án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự động viên, giúp

đỡ từ Thầy Cô, Gia Đình và Bạn Bè

Xin bày tỏ và gửi lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến:

- Thầy - TS Nguyễn Hữu Hổ đã tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều

kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận án

- TS Phan Tường Lộc - Anh vừa là người Thầy luôn theo sát, tận tình chỉ bảo,

hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận án

- Thầy Lê Tấn Đức đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành

luận án

- Các quý Thầy Cô ở Học Viện Khoa Học Công Nghệ đã truyền đạt kiến thức,

giúp đỡ tôi hoàn thành luận án

- Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện

đề tài này

- Các bạn đồng nghiệp phòng Công Nghệ Gen và các bạn sinh viên đã giúp đỡ tôi

trong thời gian qua

- Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Gia Đình đã luôn sát cánh, ủng hộ,

giúp đỡ tôi trong những năm học vừa qua cũng như trên mỗi bước đường trưởng thành trong cuộc sống

Hoàng Văn Dương

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii

TÓM TẮT 1

MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 Chuyển hóa tạo carotenoid ở thực vật 8

1.1.1 Sinh tổng hợp và tích trữ carotenoid 8

1.1.2 Thay đổi chuyển hóa sinh tổng hợp carotenoid 10

1.1.3 Tổng quan về astaxanthin 11

1.2 Biến đổi gen thực vật 19

1.2.1 Chuyển gen vào thực vật sử dụng Agrobacterium tumefaciens 19

1.2.2 Sử dụng promoter trong công nghệ chuyển gen thực vật 22

1.2.3 Sự di truyền của gen biến nạp trong cây chuyển gen 26

1.3 Nghiên cứu phát sinh hình thái và biến đổi gen đậu tương 27

1.3.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương 27

1.3.2 Nghiên cứu phát sinh hình thái ở đậu tương 29

1.3.3 Nghiên cứu biến đổi gen đậu tương 35

1.4 Cách tiếp cận của đề tài 43

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 46

2.1 Vật liệu 46

2.1.1 Giống đậu tương 46

2.1.2 Chủng vi khuẩn, plasmid 46

2.1.3 Kim châm để tạo vết thương cho mẫu chuyển gen 47

2.1.4 Môi trường nuôi cấy mô 47

2.1.5 Hóa chất trong các thí nghiệm khác 48

2.1.6 Thiết bị sử dụng 49

2.2 Nội dung và Phương pháp 50

Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và một nửa hạt 50

2.2.1 Tuyển chọn giống đậu tương 50

2.2.3 Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm và một nửa hạt 51

2.2.4 Ảnh hưởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro 52

Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương 53

2.2.5 Ảnh hưởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt 53

2.2.6 Ảnh hưởng của PPT lên sự sinh trưởng của chồi in vitro 53

2.2.7 Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng kim châm lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm 53

2.2.8 Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương 54

2.2.9 Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp thấm hút chân không lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương 55

Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tương chuyển gen 55

2.2.10 Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST 55

2.2.11 Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương 57

2.2.12 Kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR 58

2.2.13 Kiểm tra cây chuyển gen bằng Southern blot 60

2.2.14 Phân tích hàm lượng astaxanthin trong hạt 62

2.2.15 Đánh giá các giai đoạn sinh trưởng cây chuyển gen trong điều kiện ex vitro 62

2.2.16 Xử lý thống kê 63

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64

Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và một nửa hạt 64

3.1 Tuyển chọn các giống đậu tương 64

3.2 Hiệu quả của các phương pháp khử trùng hạt đậu tương 66

3.3 Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt 67

3.4 Ảnh hưởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro 73

Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương 75

3.5 Ảnh hưởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt 75

3.6 Ảnh hưởng của PPT lên sự sinh trưởng của chồi in vitro 78

3.7 Ảnh hưởng việc tạo vết thương bằng kim châm lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm 79 3.8 Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên

hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương (giống MTĐ 176) 80

3.9 Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp thấm hút chân không lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương 83

Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tương chuyển gen 85

3.10 Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST 85

3.11 Chuyển gen tạo cây đậu tương có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt 87

3.11.1 Chuyển gen bằng vi khuẩn A tumefaciens sử dụng kim châm tạo vết thương mẫu 87

3.11.2 Chuyển gen bằng vi khuẩn A tumefaciens sử dụng dao mổ kết hợp sóng siêu âm, thấm chân không tạo vết thương mẫu 93

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 111

DANH MỤC CÔNG TRÌNH 113

TÀI LIỆU THAM KHẢO 114

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

IBA Indole-3-butyric acid

NAA α-naphthylacetic acid NXS Neoxanthin synthase PCR Polymerase Chain Reaction PDS Phytoene desaturase

PPT Phosphinothricin PSY Phytoene synthase QC1 Qui cách 1

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Nguồn gốc và một số đặc điểm của các giống đậu tương được sử

dụng 46

Bảng 2.2 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy mô và chuyển gen 47

Bảng 3.1 Kiểm tra thành phần β-carotene ở các giống đậu tương 65

Bảng 3.2 Tỉ lệ nảy mầm ở các giống đậu tương 65

Bảng 3.3 Tỉ lệ hạt đậu tương không nhiễm và nảy mầm khi khử trùng bằng dung dịch Javel hoặc khí clo 67

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt giống MTĐ 176 68

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt giống HL 07-15 70

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt giống OMĐN 29 71

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi đậu tương in vitro 75

Bảng 3.8 Ảnh hưởng PPT lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm 76

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của PPT lên khả năng sống của chồi in vitro 78

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng kim châm lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm 80

ảng 3 11 Tỉ lệ mẫu dương tính GUS khi xử l sóng siêu âm ở các thời gian khác nhau 82

ảng 3 12 Tỉ lệ đốt lá mầm dương tính GUS khi xử l áp lực âm ở các thời gian khác nhau 84

Bảng 3.13 Kết quả thu nhận hạt của các dòng chuyển gen D2 và D8 ở thế hệ T1 103 Bảng 3.14 Kết quả định lượng astaxanthin trong hạt của các dòng chuyển gen 106

Bảng 3.15 So sánh một số đặc điểm của cây chuyển gen và đối chứng 109

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Sơ đồ con đường sinh tổng hợp carotenoid [19] 9

Hình 1.2 Bột astaxanthin [36] 11

Hình 1.3 So sánh khả năng chống gốc oxy tự do có hại cho cơ thể của một số chất chống oxy hóa [43] 12

Hình 1.4 Vị trí của phân tử astaxanthin trong màng tế bào [40] 13

Hình 1.5 Qui mô thị trường astaxanthin đến năm 2022 [4] 13

Hình 1.6 Con đường chuyển hoá tạo astaxanthin ở Adonis aestivalis [6] 15

Hình 1.7 Con đường tổng hợp astaxanthin ở một số loài khác nhau [6][57] 16

Hình 1.8 Sơ đồ chuyển hóa tạo astaxanthin trên đậu tương khi được biến nạp các gen mã hóa phytoene synthase và ketolase [63] 18

Hình 1.9 Vi khuẩn A tumefaciens bám trên bề mặt tế bào thực vật [71] 20

Hình 1.10 Vi khuẩn A tumefaciens gây khối u trên thực vật [72] 20

Hình 1.11 Sự ức chế của phosphinothricin lên hoạt động của enzyme 21

Hình 1.12 Phản ứng của X-Gluc với -glucuronidase [77] 22

Hình 1.13 Mô hình cơ bản về cấu trúc và điều hòa phiên mã của gen mã hóa protein [79] 23

Hình 1.14 Cây đậu tương 27

Hình 1.15 Sản lượng của 6 nước sản xuất đậu tương lớn nhất [94] 28

Hình 1.16 Cấu trúc plasmid pITB-AST 45

Hình 2.1 Sơ đồ các bước chuẩn bị mẫu đốt lá mầm 51

Hình 2.2 Sơ đồ các bước chuẩn bị mẫu một nửa hạt 52

Hình 2.3 Minh họa kích thước theo chiều dài, rộng, dày của hạt đậu tương 63

Hình 3.1 Hạt đậu tương nảy mầm sau 5 ngày 65

Hình 3.2 Hạt đậu tương (HL 07-15) nảy mầm 5 ngày sau khi khử trùng 67

Hình 3.3 Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống MTĐ 176 ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy 69

Hình 3.4 Sự đáp ứng của đốt lá mầm và một nửa hạt của giống MTĐ 176 ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy 69

Hình 3.5 Sự hình thành chồi của mẫu một nửa hạt giống MTĐ 176 ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy 70

Hình 3.6 Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống HL 07-15 ở các nồng độ BA

khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy 71

Hình 3.7 Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống OMĐN 29 ở các nồng độ

BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy 72

Hình 3.8 Sự tạo rễ của chồi in vitro của các giống MTĐ 176, HL 07-15 và

OMĐN 29 ở các nồng độ IBA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy 74

Hình 3.9 Sự tái sinh của đốt lá mầm giống MTĐ 176 trên môi trường có PPT 77 Hình 3.10 Sự sinh trưởng đoạn thân giống MTĐ 176 trên môi trường có PPT 79

Hình 3.11 Ảnh hưởng của số lần châm đến khả năng tái sinh của đốt lá mầm

ủ qua đêm trên môi trường có kháng sinh 86

Hình 3.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen hbfd1 từ plasmid của vi khuẩn E

coli và A tumefaciens 86 Hình 3.17 Vật liệu chuyển gen và các giai đoạn phát triển cây chuyển gen 88 Hình 3.18 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar ở các cây kháng PPT bằng PCR 89 Hình 3.19 Kiểm tra sự hiện diện của gen hbfd1 ở các cây kháng PPT bằng PCR 90 Hình 3.20 Kết quả phân tích DNA cây đậu tương chuyển gen bằng Southern

blot 91

Hình 3.22 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar ở các cây kháng PPT bằng PCR 95 Hình 3.23 Kiểm tra sự hiện diện của gen cbfd2 ở các cây kháng PPT bằng PCR 96 Hình 3.24 Kiểm tra sự hiện diện của gen hbfd1 ở các cây kháng PPT bằng PCR 97 Hình 3.25 Kiểm tra sự hiện diện của gen Zm-psy ở các cây kháng PPT bằng

PCR 97

Hình 3.26 Kết quả phân tích DNA cây đậu tương chuyển gen bằng Southern

blot 99

Hình 3.27 Lá cây đối chứng và chuyển gen sau 7 ngày quét dung dịch Basta 100

Hình 3.28 Dòng chuyển gen D2 (a) và D8 (b) phát triển ngoài vườn ươm 101 Hình 3.29 Hạt màu đỏ của dòng D2 và D8 101

Hình 3.31 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen biến nạp ở các dòng T1 102

Hình 3.32 Thử nghiệm quét Basta trên lá cây chuyển gen và đối chứng 103

Hình 3.33 Các hạt chuyển gen biểu hiện màu đỏ không đồng đều 104

Hình 3.34 Hạt của các dòng chuyển gen T2 105

Hình 3.35 Phổ ESI-MS của chuẩn astaxanthin 107

108 Hình 3.36 Phổ ESI-MS của mẫu ly trích từ hạt dòng D2-1 108

Hình 3.37 Phổ ESI-MS của mẫu ly trích từ hạt dòng D8-1 108

Hình 3.38 So sánh kiểu hình cây chuyển gen và cây đối chứng 110

TÓM TẮT

Hiện nay, ứng dụng công nghệ gen để cải tạo giống cây trồng, tạo giống đã

và đang đạt được nhiều thành tựu với ngày càng nhiều giống cây mới được tạo ra, đưa vào sản xuất Một trong những ưu điểm nổi bật của công nghệ này là trong thời gian ngắn so với lai tạo giống truyền thống, giúp tạo được giống mới với nhiều đặc tính vượt trội, có thể gồm những đặc tính từ các sinh vật khác loài Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng tới tạo giống đậu tương mang các gen ngoại lai từ cây hoa

Adonis aestivalis nhằm tạo được astaxanthin, một hợp chất có giá trị kinh tế và ứng

dụng cao, chuyên biệt ở hạt Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A

tumefaciens được sử dụng để chuyển vào đậu tương cấu trúc gen gồm: gen cbfd, hbfd đóng vai trò chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin; gen zm-psy từ ngô giúp

tăng cường con đường tổng hợp β-carotene, gen chọn lọc bar, với chất chọn lọc là

phosphinothricin (PPT) Nhiều yếu tố được khảo sát nhằm tối ưu con đường nuôi cấy mô, chọn lọc thể chuyển gen, và nâng cao hiệu quả chuyển gen Các khảo sát cụ thể gồm: khảo sát các phương pháp khử trùng hạt bằng khí clo và nước Javel; tìm nồng độ BA thích hợp để cảm ứng tạo chồi cho mẫu đốt lá mầm, một nửa hạt; nồng

độ IBA thích hợp để cảm ứng tạo rễ cho chồi in vitro; nồng độ PPT tối ưu cho giai

đoạn chọn lọc chồi và duy trì áp lực chọn lọc ở giai đoạn tạo rễ, phát triển cây;

phương pháp tạo vết thương mẫu thích hợp sử dụng dao mổ, kim châm nhiều mũi, sóng siêu âm, thấm hút chân không Sau đó, kết quả tối ưu từ các thí nghiệm này được áp dụng cho giai đoạn chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương Thể chuyển gen trong nghiên cứu được xác định bước đầu bằng phương pháp PCR, tiếp theo khẳng định sự gắn chèn bền vững của gen bằng phương pháp Southern blot Các dòng chuyển gen phát triển trong vườn ươm sẽ được thử nghiệm tính kháng thuốc

diệt cỏ Basta, nhằm kiểm tra biểu hiện của gen bar trong cây chuyển gen Sự di

truyền của gen biến nạp qua các thế hệ được kiểm tra bằng PCR và thử nghiệm với Basta Hàm lượng astaxanthin trong hạt đậu tương được ghi nhận bằng phương pháp HPLC-MS Ngoài ra, cây chuyển gen ở thế hệ T0, T1 và cây đối chứng không chuyển gen cũng được so sánh các chỉ tiêu kiểu hình và năng suất hạt Những kết quả chính đạt được như sau Thu thập được 7 giống đậu tương, các giống này được kiểm tra và xác nhận có sự hiện diện của β-carotene trong hạt bằng HPLC, đây là cơ

chất ban đầu, điều kiện cần thiết để tổng hợp astaxanthin Các giống đậu tương MTĐ 176, HL 07-15 và OMĐN 29 được ghi nhận có khả năng nảy mầm cao, sức sống tốt, lá mầm không bị nứt, vỡ nên được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

Khảo sát khử trùng hạt đậu tương bằng khí clo trong 16 h cho thấy hiệu quả khử trùng tốt nhất Mẫu đốt lá mầm và một nửa hạt được cảm ứng tạo chồi tốt nhất với môi trường bổ sung 2 mg/l BA, chồi tạo rễ tốt nhất khi bổ sung IBA 1 mg/l với giống MTĐ 176; HL 07-15 và 1,5 mg/l với giống OMĐN 29, chất chọn lọc PPT ở nồng độ 6 mg/l phù hợp để chọn lọc thể chuyển gen với giống MTĐ 176 và 5 mg/l

cho giống HL 07-15; OMĐN 29 Các kết quả khảo sát tạo vết thương mẫu cho thấy

sử dụng phương pháp tạo vết thương mẫu thích hợp giúp tăng đáng kể hiệu quả chuyển gen, cụ thể với khả năng biến nạp cấu trúc gen tạo astaxanthin vào giống đậu tương MTĐ 176: dùng kim châm đâm nhẹ 3 lần để thay thế dao mổ tạo vết thương cho vùng đốt lá mầm đã tăng hiệu quả chuyển gen từ 0,33% lên 1%; kết hợp

sử dụng sóng siêu âm 30s; thấm chân không 60s ở áp lực -20 in Hg trong quá trình tạo vết thương mẫu đốt lá mầm cũng giúp tăng hiệu quả chuyển gen từ 0,67 % lên 2% Nghiên cứu đã tạo được nhiều dòng đậu tương chuyển gen, trong đó hai dòng

có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt và di truyền gen chuyển cho các thế hệ tiếp theo Hàm lượng astaxanthin trong hạt thế hệ T1 của hai dòng đậu tương chuyển gen lần lượt là 0,31 µg/g (D2) và 0,77 µg/g (D8) Trong các giai đoạn sinh trưởng, phát triển cũng như năng suất hạt cho thấy cây chuyển gen và đối chứng không có nhiều khác biệt Như vậy, đề tài đã tạo được các dòng đậu tương có khả năng sản xuất astaxanthin ở hạt, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo để ứng dụng tạo các sản phẩm có giá trị ứng dụng thực tế

ABSTRACT

Currently, application of gene technology to improve plant varieties has been achieving many achievements with more and more new plant varieties being created and put into production One of outstanding advantages of this technology is that in

a short time compared to conventional crossbreeding, it helps to create new varieties with many superb characteristics, which may include those from other organisms In this study, we aimed to produce soybean lines carrying foreign genes

from the red flowered-Adonis aestivalis to produce seed-specific astaxanthin, a

compound with high economic and application value

Method of Agrobacterium-mediated genetic transformation was used to transfer into soybean the genetic structure including: cbfd, hbfd gene, play the role of converting β-carotene into astaxanthin; zm-psy gene from corn, enhances the synthesis of β- carotene; bar-selective gene, with the selective agent phosphinothricin (PPT) Many

factors were investigated to optimize tissue culture pathways, selection of transgenics, and transformation efficiency Specific surveys include: methods of sterilizing seeds with chlorine gas and Javel detergent; appropriate concentrations of

BA to induce shoot regeneration for cotyledonary node, half seed explant; suitable

concentrations of IBA to induce rooting of in vitro shoots; optimal concentrations of

PPT for transgenic shoot selection and maintenance of selective pressure at rooting and plant development stages; appropriate method of wounding explants using scalpel, multi-needle, ultrasound, vacuum infiltration The optimal results from these experiments were then applied to generate transgenic soybean lines producing astaxanthin Transformants in this study were initially determined by PCR, followed

by the confirmation of stable insertion of the transgenes by Southern blot method

Transgenic lines grown in greenhouse will be tested for resistance to Basta

herbicide, to check the expression of bar gene in transgenic plants Inheritance of

transgenes across generations was checked by PCR and herbicide leaf painting assay Astaxanthin content in soybean seeds was analyzed by HPLC-MS method In addition, the transgenic plants in the T0, T1 generation and the non-transgenic control plants were also compared for phenotypic parameters and seed yield The main results obtained are as follows Collected 7 soybean varieties, these varieties were tested and confirmed for the presence of β-carotene in seeds by HPLC, which

is the initial substrate, necessary condition for astaxanthin synthesis Soybean varieties MTD 176, HL 07-15 and OMDN 29 were recorded with high germination ability, good vigor, and cotyledons were not cracked or broken, so they were selected for further studies Sterilizing of soybean seeds with chlorine gas for 16 h showed the best sterilization effect Cotyledonary node and half seed explants were best induced to produce shoots in the medium supplemented with 2 mg/l BA;

The best rooting efficiency was achieved in 1 mg/l IBA with the MTD 176; HL

07-15 varieties and 1.5 mg/l for OMDN 29 variety; PPT selective agent at a concentration of 6 mg/l is suitable for selecting transformants with variety MTD

176 and 5 mg/l for HL 07-15; OMDN 29 The results of the appropriate wounding survey showed that using proper explant wounding method significantly increased efficiency of gene transfer, specifically, in transferring astaxanthin biosynthesis genes into MTD 176 soybean variety: puncturing 3 times with multi-needle to replace scalpel for wounding MTD 176 cotyledonary node has increased the transformation efficiency from 0.33% to 1%; combined use of 30s ultrasound;

60s vacuum infiltration at -20 in Hg during wounding of cotyledonary nodes also increased efficiency of gene transfer from 0.67% to 2% This study generated many transgenic soybean, in which, two lines have ability to produce seed-specific astaxanthin and pass astaxanthin biosynthesis genes to next generations

Astaxanthin content in the T1 generation seeds of two transgenic soybean lines was 0.31 µg/g (D2) and 0.77 µg/g (D8), respectively In stages of growth, development

as well as seed yield, there was not much differences between transgenic and control plants Thus, this research has gernerated value-added soybean lines capable

of producing astaxanthin in seeds, serving as a basis for further studies to create products with practical applications

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Astaxanthin (C40H52O4) là một loại carotenoid màu đỏ, trong tự nhiên được tìm thấy ở động vật, thực vật và vi sinh vật Nhiều nghiên cứu đã chứng minh astaxanthin có tác dụng vượt trội trong lĩnh vực chăm sóc, bảo vệ sức khỏe như chống oxy hóa, bảo vệ DNA, tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị tiểu đường, tim mạch, thần kinh [1][2] Hiện nay, sản phẩm bổ sung astaxanthin đã lưu hành phổ biến trên thị trường gồm viên nang, bột, kem bảo vệ da, gel Ngoài ra, ngành chăn nuôi, thủy sản cũng tiêu thụ khối lượng lớn astaxanthin để tạo màu đỏ tự nhiên cho sản phẩm thịt, cá, tôm bằng cách bổ sung vào nguồn thức ăn Do được sử dụng phổ biến, hiệu quả trên nhiều lĩnh vực nên nhu cầu astaxanthin trên thị trường rất lớn và ngày càng tăng Điều này làm cho giá astaxanthin rất cao, với astaxanthin tự nhiên

là 2500-7000 USD/kg, astaxanthin tổng hợp khoảng 1000 USD/kg, tổng nhu cầu trên thế giới đạt khoảng 280 tấn, trị giá 447 triệu USD năm 2014, ước tính đến năm

2020 đạt mức 1,1 tỉ USD [3][4][5]

Hai nguồn cung chính của astaxanthin gồm sản phẩm tổng hợp hoặc ly trích

từ sinh vật, với nguồn tổng hợp chỉ giới hạn sử dụng để tạo màu tự nhiên cho thực phẩm, còn astaxanthin tự nhiên được dùng trong chăm sóc, bảo vệ sức khỏe Loại

có nguồn gốc tự nhiên chủ yếu đến từ ly trích tảo Haematococcus pluvialis, nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous, hoặc vỏ tôm, cua Trên thực vật, astaxanthin chỉ có ở một số cây có hoa thuộc chi Adonis như Adonis aestivalis [6]

Cánh hoa màu đỏ của các loài thuộc chi Adonis có sản lượng thấp nên khó khai thác

để cung cấp astaxanthin Nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin vào các cây thực phẩm mà các sản phẩm của nó đã được sử dụng phổ biến trong thực tế là một hướng nghiên cứu nhiều tiềm năng Điều này hứa hẹn cung cấp các sản phẩm có giá trị kinh tế và sử dụng cao Nhiều nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin, có nguồn gốc

từ vi khuẩn, tảo , vào các loại cây trồng khác nhau như ngô, gạo, táo đã được thực hiện [7][8] Đậu tương vốn là cây trồng quan trọng với nhiều ưu điểm nổi bật ở giá trị dinh dưỡng của hạt đậu, khả năng thích nghi ở nhiều vùng trồng, giúp cải tạo đất, đồng thời các sản phẩm từ đậu tương rất đa dạng và phổ biến trong đời sống hàng

ngày như đậu hũ, chao, sữa, bột, dầu ăn nên tiềm năng ứng dụng với giống đậu tương mới rất lớn Tuy nhiên, nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin trên đậu tương còn hạn chế Ở Việt Nam, chưa ghi nhận được nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương Do đó, nghiên cứu này đã được thực hiện nhằm chuyển

các gen từ cây hoa Adonis aestivalis vào đậu tương giúp cây có khả năng sản xuất

astaxanthin chuyên biệt ở hạt, từ đó tạo các sản phẩm có thể được ứng dụng

2 Mục tiêu của đề tài

Tạo được dòng đậu tương biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin ở

hạt thông qua phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium

tạo astaxanthin chỉ có ở một số loài thuộc chi Adonis Các gen đóng vai trò chính trong quá trình chuyển hóa tạo astaxanthin đã được xác định gồm gen cbfd (mã hóa enzyme carotenoid β-ring 4-dehydrogenase) và gen hbfd (mã hóa enzyme

carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase) Các gen này lần đầu tiên được sử dụng để chuyển vào một loài thực vật khác, có khả năng hoạt động hiệu quả giúp cây chuyển gen sản xuất astaxanthin, điều này làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo

Nghiên cứu cũng cho thấy ảnh hưởng đáng kể của các phương pháp tạo vết thương mẫu khác nhau đến hiệu quả chuyển gen vào giống đậu tương MTĐ 176

thông qua vi khuẩn A tumefaciens Trong đó, các phương pháp tối ưu dùng kim

châm, dao mổ kết hợp sóng siêu âm, thấm hút chân không đã được xác định, có thể được áp dụng để nâng cao hiệu quả chuyển gen vào các giống đậu tương khác

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Cây đậu tương biến đổi gen có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt có thể được sử dụng để sản xuất các sản phẩm từ hạt đậu có chứa astaxanthin

như thức ăn chăn nuôi, thủy sản hoặc bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm cho

người như bột ngũ cốc

4 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu của đề tài

Nghiên cứu sử dụng một số giống đậu tương được trồng phổ biến ở Việt

Nam Các giống này được dùng để chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens

giúp tạo được cây đậu tương có khả năng sản xuất astaxanthin Cây đậu tương chuyển gen được phân tích sự hiện hiện gen biến nạp bằng PCR và Souhern blot, đồng thời đánh giá so sánh kiểu hình và khả năng sinh sản với cây đối chứng Hạt đậu chuyển gen được phân tích xác định hàm lượng astaxanthin ở thế hệ T1

Nội dung nghiên cứu chính của đề tài:

Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá

mầm và một nửa hạt

Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương

Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương gián tiếp thông qua vi

khuẩn A tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tương chuyển gen

5 Những đóng góp mới của luận án

Các gen cbfd2 (mã hóa enzyme enzyme carotenoid β-ring 4-dehydrogenase)

và gen hbfd1 (mã hóa enzyme carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase) có nguồn gốc từ cây hoa Adonis aestivalis kết hợp với gen Zm-psy (mã hóa enzyme

phytoen sythetase) có nguồn gốc từ ngô khi được chuyển vào đậu tương đã giúp tạo được cây phát triển bình thường, có khả năng sản suất astaxanthin

Xây dựng được qui trình giúp nâng cao hiệu quả chuyển gen trên giống đậu tương MTĐ 176, qui trình này có thể được áp dụng để nâng cao hiệu quả chuyển gen trên các giống khác Cụ thể cải tiến trong phương pháp tạo vết thương mẫu gồm: sử dụng kim châm đâm nhẹ 3 lần hoặc dùng dao mổ cắt nhẹ lên vùng đốt lá mầm 5 lần kết hợp xử lý sóng siêu âm 30 giây hoặc thấm hút chân không 60 giây

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Chuyển hóa tạo carotenoid ở thực vật

Carotenoid là một loại sắc tố hữu cơ tự nhiên có nhiều trong thực vật, đóng vai trò quan trọng giúp bảo vệ, tăng cường sức khỏe như chống oxy hóa, ung thư, tăng cường sức khỏe tim mạch, là tiền chất của vitamin [9][10] Tuy nhiên, con người không thể tự tổng hợp carotenoid mà hấp thu qua thực phẩm Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm thay đổi chu trình chuyển hóa carotenoid ở thực vật để tăng cường các sản phẩm mong muốn, trong đó nổi bật là β-carotene [11][12][13] Bên cạnh đó, astaxanthin, một carotenoid, nằm ở cuối chuỗi chuyển hóa của một số loài

thực vật thuộc chi Adonis cũng đang thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu do có giá trị

thị trường rất cao, với công dụng vượt trội trong bảo vệ, tăng cường sức khỏe [14][15][16][17][18] Sau đây là chu trình chuyển hóa tổng hợp carotenoid ở thực vật

và một số cải biến chính đã được thực hiện

1.1.1 Sinh tổng hợp và tích trữ carotenoid

Carotenoid được tổng hợp từ những tiền chất tạo bởi con đường chuyển hóa MEP (methylerythritol 4-phosphate pathway) diễn ra trong lạp thể Glyceraldehyde-3-phosphate và pyruvate là những cơ chất ban đầu để tổng hợp geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), tiền chất chung để tổng hợp các carotenoid và những hợp chất terpenoid khác (hình 1.1)

Bước đầu tiên trong con đường tổng hợp carotenoid là sự kết hợp hai phân tử GGPP tạo thành 15-cis-phytoene được xúc tác bởi enzyme phytoene synthase (PSY) Phytoene được chuyển thành lycopene bởi hai phản ứng khử bão hòa xúc tác bởi phytoene desaturase (PDS) và zeta-carotene desaturase (ZDS)

Lycopene là điểm phân nhánh của con đường tổng hợp do là cơ chất của hai enzyme cyclase cạnh tranh nhau, β lycopene cyclase (β-LCY) và ε lycopene cyclase (ε-LCY) α-carotene được tạo ra khi β-LCY và ε-LCY hoạt động kết hợp với nhau ở hai đầu của phân tử lycopene, trong khi β-carotene được tạo thành khi chỉ β-LCY hoạt động α-carotene và β-carotene được hydroxyl hóa bởi ε-ring carotene hydroxylase và β-ring carotene hydroxylase để tạo lutein và zeaxanthin

Lutein là sản phẩm cuối cùng của nhánh β, ε còn zeaxanthin được oxy hóa bởi zeaxanthin epoxidase (ZEP) trong hai bước để tạo violaxanthin thông qua antheraxanthin Những phản ứng này có thể đảo ngược bởi violaxanthin deepoxidase (VDE), tạo thành vòng xanthophyll giúp thực vật thích nghi với stress ánh sánh cường độ cao Violaxanthin được chuyển thành neoxanthin bởi neoxanthin synthase (NXS), carotenoid cuối cùng của nhánh β,β [19][20][21]

Hình 1.1 Sơ đồ con đường sinh tổng hợp carotenoid [19]

Tích trữ carotenoid: Carotenoid thường được tổng hợp trong hầu như tất cả các loại lạp thể của lá, rễ, hoa, trái, hạt bao gồm lục lạp, sắc lạp, bột lạp, dầu lạp…

nhưng được tích lũy với lượng lớn trong lục lạp và sắc lạp Trong lục lạp, hầu hết

các carotenoid được tích lũy ở dạng phức protein-chlorophill-chlorophyll trong các màng thylakoid Carotenoid của hạt được giữ trong các ngăn elaioplasts (các lạp thể

dự trữ lipid, vô sắc lạp), có cấu trúc đặc biệt để dự trữ số lượng lớn các carotenoid

Trong sắc lạp phần lớn các carotenoid có thể được dự trữ trong các màng, thể dầu hoặc dạng tinh thể trong stroma [22][23][24]

1.1.2 Thay đổi chuyển hóa sinh tổng hợp carotenoid

Những thay đổi được thực hiện trên một số gen mã hóa các enzyme quan trọng trong con đường sinh tổng hợp carotenoid, giúp tăng cường sự tích lũy hoặc thay đổi tỉ lệ các loại carotenoid được tạo thành Sau đây là một số gen mã hóa các enzyme đã được sử dụng

Phytoene synthase: Phytoene synthase (PSY) là enzyme xúc tác bước đầu

tiên đóng vai trò quan trọng, quyết định đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid, là phản ứng kết hợp hai phân tử GGPP tạo thành phytoene Do đó sự biểu hiện của

gen psy là yếu tố điều hòa quan trọng trong quá trình tích lũy carotenoid ở thực vật

Nhiều nghiên cứu cho thấy khi psy được tăng biểu hiện, có thể kết hợp với sự tăng biểu hiện của gen ở các bước sau như pds, β-lcy, đã giúp tăng đáng kể hàm lượng

carotenoid trong các loại cây trồng như cà chua [25], cà rốt [26], canola [27], gạo Golden Rice [28], khoai tây vàng [29], khoai tây và ngô [30] Carotenoid tổng của các loại cây trồng biến đổi gen có thể tăng 2 - 50 lần ở các loài khác nhau, với từ 1,6

- 3600 lần ở mức độ β-carotene và dẫn đến màu sắc thay đổi sang vàng hoặc cam

Các nghiên cứu chuyển gen ghi nhận gen psy có nguồn gốc khác nhau (ngô,

lúa gạo, arabidopsis, hoa thủy tiên, ) sẽ giúp tăng cường con đường tổng hợp

carotenoid ở mức độ rất khác nhau Paine và cộng sự (2005) nhận thấy gen psy có

nguồn gốc từ ngô giúp tăng cường tổng hợp, tích lũy carotenoid cao hơn đáng kể so

với psy từ các cây khác như Arabidopsis, cà chua, cà rốt, ớt, lúa [28] Nhằm nâng

cao hơn khả năng tích lũy carotenoid của gạo Golden Rice thế hệ đầu tiên, nhóm tác

giả đã thay psy có nguồn gốc từ cây hoa thủy tiên bằng psy từ ngô, kết quả đã giúp

tăng hàm lượng carotenoid ở gạo Golden Rice thế hệ 2 gấp 23 lần, tối đa đạt được là

37 µg/g, so với Golden Rice thế hệ đầu, ngoài ra thành phần β-carotene cũng chiếm chủ yếu với 84% trong carotenoid tổng Các nghiên cứu tổng hợp astaxanthin trên

lúa gạo và ngô cũng cho thấy gen psy từ ngô có khả năng giúp tăng cường con

đường tổng hợp carotenoid, từ đó giúp tăng sự tổng hợp astaxanthin [31] [8] Như

vậy, nhiều nghiên cứu đã cho thấy gen psy từ ngô có thể được sử dụng giúp tăng

đáng kể khả năng tổng hợp carotenoid trong cây chuyển gen nên sẽ được sử dụng trong nghiên cứu này nhằm nâng cao con đường tổng hợp carotenoid trên cây đậu tương, qua đó giúp tăng cường sự tổng hợp astaxanthin

quan đến bước chuyển hóa phytoene thành lycopene như PDS (phytoene desaturase, ZDS (ζ-carotene desaturase), CRTISO (carotenoid isomerase), Z-ISO (15-cis-ζ-carotene isomerase) cũng giúp nâng cao khả năng tổng hợp carotenoid ở thực vật

[32][33]

Lycopene cyclase: Sự cạnh tranh hoạt động của β-LCY và ε-LCY xác định tỉ

lệ lycopene được định hướng vào hai nhánh của con đường carotenoid để tổng hợp

β-carotene hoặc α-carotene [34] Lá của cây Arabidopsis đột biến bất hoạt gen mã

hóa ε-LCY dẫn đến thiếu hụt lutein và tăng cường tổng hợp β-carotene, khoai tây

bất hoạt gen ε-LCY ở thân cũng tăng hàm lượng β-carotene gấp 14 lần [35]

Astaxanthin là một carotenoid, màu đỏ (hình 1.2), cấu tạo bởi 40 phân tử cacbon, được liên kết bằng các nối đôi và đơn xen kẽ Cấu tạo phân tử khác biệt của astaxanthin so với các loại ketocarotenoid khác là cấu trúc vòng ở hai đầu, ngoài nhóm keto (CO), còn có nhóm hydroxyl (OH) Điều này giúp tăng khả năng chống chống oxy hóa, tính phân cực, khả năng ester hóa và tính ổn định cho phân tử astaxanthin [37] Astaxanthin có ba dạng đồng phân, phụ thuộc vào hướng không gian của nhóm OH ở vị trí cacbon số 3 và 3’: (3R, 3′R), (3R , 3′S), (3S, 3′S) [38]

1.1.3.2 Công dụng và giá trị của astaxanthin

Astaxanthin có tính chống oxy hóa, mạnh hơn cả vitamin C, E, các carotenoid khác như β carotene, lycopene, zeaxanthin… (hình 1.3) nên được dùng làm chất chống các gốc tự do có hại cho cơ thể [39] Hơn nữa, phân tử astaxanthin

có cả 2 đặc tính tan và không tan trong lipid, do đó có thể kết nối với màng tế bào

cả bên trong và bên ngoài, giúp tăng hiệu quả chống oxy hóa so với các chất chỉ có một đặc tính (hình 1.4) [40][41][42]

Hình 1.3 So sánh khả năng chống gốc oxy tự do có hại cho cơ thể của một số chất

chống oxy hóa [43]

Nhiều nghiên cứu cho thấy astaxanthin còn có tác dụng bảo vệ DNA, tăng cường hệ miễn dịch, giảm sự phát triển của khối u ung thư trên mô hình động vật, hiệu quả trong hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường, stress oxy hóa, viêm, tim mạch, một

số vấn đề về các chức năng thần kinh… [1][2][44][45] Với nhiều công dụng như trên, hiện nay, các dạng sản phẩm khác nhau của astaxanthin đã được bán trên thị trường như: thuốc viên, syro, dầu, gel, kem, sinh khối, bột… [40]

Hình 1.4 Vị trí của phân tử astaxanthin trong màng tế bào [40]

Ngoài ra, từ năm 2009, cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA)

và Ủy ban Châu Âu đã cho phép sử dụng astaxanthin làm chất tạo màu tự nhiên cho thực phẩm Đến nay, astaxanthin đã được sử dụng phổ biến để tạo màu đỏ tự nhiên cho sản phẩm trong ngành chăn nuôi gia cầm, thủy sản [38][46]

Hình 1.5 Qui mô thị trường astaxanthin đến năm 2022 [4]

Astaxanthin có nhiều công dụng trong bảo vệ sức khỏe, đồng thời cũng được dùng phổ biến làm chất tạo màu nên nhu cầu astaxanthin rất lớn và ngày càng tăng (hình 1.5) [4][47][48] Năm 2014, thị trường thế giới tiêu thụ khoảng 280 tấn, đạt giá trị 447 triệu USD, đến năm 2019 qui mô thị trường astaxanthin đã đạt mức 1 tỉ USD, với mức tăng ước tính khoảng 16,2%/năm đến năm 2027 [3][4][49] Hiện nay, giá astaxanthin trên thị trường rất cao, với astaxanthin tự nhiên là 2.500-7.000

trên thị trường có nguồn gốc tổng hợp từ các sản phẩm hóa dầu, chỉ được sử dụng

để tạo màu cho thực phẩm [50] Năm 2013, quy mô thị trường astaxanthin cho người khoảng 200 triệu USD, dự đoán tăng lên 700 triệu USD năm 2017 [5]

1.1.3.3 Nguồn gốc astaxanthin

Astaxanthin tổng hợp: astaxanthin có thể được tổng hợp hóa học từ các sản

phẩm dầu mỏ và là hỗn hợp của 3 dạng đồng phân khác nhau là (3R, 3′R), (3R, 3′S),

và (3S, 3′S) với tỉ lệ xấp xỉ 1:2:1 [37] Loại astaxanthin này ở dạng tự do, không ester hóa, thường chứa sản phẩm phụ hoặc các chất trung gian do đó được dùng làm

chất tạo màu trong chăn nuôi gia cầm và nuôi trồng thủy sản

Astaxanthin tự nhiên: trong tự nhiên, astaxanthin được tìm thấy ở cả động

vật, thực vật và vi sinh vật Trong đó, động vật gồm tôm, cua, cá hồi, cá hồng, cò

mỏ bẹt hồng…[51][52]; vi sinh vật gồm Haematococcus pluvialis,

Xanthophyllomyces dendrorhous, Pandalus borealis, Pandalus clarkia… [40]; trên

thực vật astaxanthin chỉ có ở một số cây có hoa thuộc chi Adonis như Adonis

aestivalis [6]

Astaxanthin tự nhiên trên thị trường chủ yếu được sản xuất thông qua nuôi

cấy tảo Haematococcus pluvialis, nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous, hoặc

ly trích từ những động vật có hàm lượng astaxanthin cao như vỏ của tôm, cua Tảo

Haematococcus pluvialis sản xuất astaxanthin ở dạng (3S, 3′S), mono hoặc diester,

chiếm 4 - 5 % trọng lượng khô [53] Trạng thái ester hóa giúp tăng độ ổn định cho astaxanthin Astaxanthin từ loại tảo này thường được sử dụng trực tiếp làm tác nhân

trị liệu, tăng cường sức khỏe Nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous sản xuất

astaxanthin, thường ở dạng (3R, 3′R), tự do không ester hóa chiếm 0,5 % trọng lượng khô

1.1.3.4 Con đường biến dưỡng tạo astaxanthin ở Adonis aestivalis

Trong tất cả các sinh vật, astaxanthin đều được hình thành từ phân tử carotene, là một carotenoid hiện diện ở hầu hết sinh vật quang hợp giải phóng oxy [54] Phân tử β-carotene có hai vòng β ở hai đầu, việc tạo thành astaxanthin được thực hiện bằng cách thêm một nhóm OH (hydroxyl) và một nhóm CO (carbonyl) lần lượt tại nguyên tử cacbon số 3 và 4 ở mỗi vòng β Các bước diễn ra và enzyme liên quan đến quá trình chuyển hóa này khác nhau ở các sinh vật Ở thực vật, ngoài

β-một số loài thuộc chi Adonis có thể thực hiện được việc chuyển hóa β-carotene

thành astaxanthin, còn lại đa số chỉ có enzyme thêm nhóm hydroxyl vào vòng carotene [6][55]

β-Sau đây là quá trình chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin ở cây hoa

Adonis aestivalis (hình 1.6) [6] Bước đầu tiên, enzyme carotenoid β-ring

4-dehydrogenase (CBFD, mã hóa bởi gen cbfd) kích hoạt vị trí cacbon số 4 trên vòng

β của phân tử β-carotene Sản phẩm tạo thành gồm hai phân tử 4-hydroxy-β-ring và 3,4-didehydro-β-ring Tiếp theo, enzyme carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-

dehydrogenase (HBFD, mã hóa bởi gen hbfd) xúc tác phản ứng chuyển hóa các sản

phẩm trên gồm hydroxy-β-ring và/hoặc 3,didehydro-β-ring thành phân tử keto-β-ring Cuối cùng, enzyme CBFD xúc tác phản ứng thêm nhóm hydroxyl (OH) vào cacbon số 3 của phân tử 4-keto-β-ring Như vậy, hai enzyme CBFD và HBFD

4-(mã hóa bởi các gen cbfd và hbfd) qua ba bước phản ứng đã chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin trong cây Adonis aestivalis

Hình 1.6 Con đường chuyển hoá tạo astaxanthin ở Adonis aestivalis [6]

Một số sinh vật như vi khuẩn, nấm men, vi tảo lục cũng có các con đường chuyển hóa tạo astaxanthin từ β-carotene riêng với các enzyme xúc tác và thứ tự

phản ứng khác nhau như trong hình 1.7 [6][56][57]

Ngoài các loài thuộc chi Adonis, con đường tổng hợp astaxanthin không diễn

ra tự nhiên ở thực vật mà cần chuyển thêm các gen ngoại lai, gồm gen giúp tăng

cường biểu hiện β-carotene, là cơ chất ban đầu để tạo astaxanthin, như psy, pds,

và các gen chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin Đậu tương không có khả năng tổng hợp astaxanthin một cách tự nhiên, chu trình tổng hợp carotenoid diễn ra theo

sơ đồ chung ở thực vật như đã trình bày ở hình 1.1, kết thúc chu trình là ABA

Trong nghiên cứu này, để giúp cây đậu tương có thể tổng hợp astaxanthin, chúng tôi

đã chuyển vào đậu tương các gen psy từ ngô và cbfd, hbfd từ Adonis aestivalis qua

đó giúp tăng cường con đường tổng hợp β-carotene và chuyển hóa cơ chất này thành astaxanthin

Hình 1.7 Con đường tổng hợp astaxanthin ở một số loài khác nhau [6][57]

1.1.3.5 Chuyển gen tạo astaxanthin vào thực vật

Thực vật biến đổi gen có khả năng sản xuất astaxanthin là một hướng nghiên cứu triển vọng để cung cấp nguồn astaxanthin tự nhiên có nhu cầu ngày càng lớn hiện nay Để tạo astaxanthin từ β carotene cần sự hoạt động đồng thời của hai enzyme β-carotene ketolase và β-carotene hydroxylase [58] Hầu hết thực vật đều

có khả năng tổng hợp β carotene và có enzyme β-carotene hydroxylase, tuy nhiên khả năng chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin chỉ có ở một số loài thuộc chi

Adonis [6] Nhiều nghiên cứu đã tạo được cây tổng hợp astaxanthin thông qua

chuyển các gen mã hóa enzyme β-carotene ketolase, β-carotene hydroxylase và một

số gen khác giúp tăng cường con đường sinh tổng hợp carotenoid như phytoene

synthase, phytoene desaturase Các gen này có thể từ nhiều nguồn khác nhau như vi

khuẩn, nấm men, tảo lục

Trên thuốc lá, một số nghiên cứu đã chuyển gen thành công vào lục lạp để tạo cây tích lũy astaxanthin Mann và cộng sự (2000) chỉ chuyển gen mã hóa β-

carotene ketolase (CrtO từ Haematococcus pluvialis) đã tạo được cây tích lũy

Haematococcus pluvialis

astaxanthin và một số ketocarotenoid không có trong cây đối chứng, hàm lượng ketocarotenoid chiếm 0,2% trọng lượng khô [59] Hasunuma và cộng sự (2008) chuyển 2 gen mã hóa β-carotene ketolase và β-carotene hydroxylase (CrtW và CrtZ

từ vi khuẩn Brevundimonas sp.) tạo được cây thuốc lá tích lũy astaxanthin chiếm

0,5% trọng lượng khô lá [60]

Trên cà chua, Huang và cộng sự (2013) nghiên cứu chuyển các gen mã hóa

β-carotene ketolase (từ Chlamydomonas reinhardtii) và β-carotene hydroxylase (từ

Haematococcus pluvialis) đã tạo được cây cà chua biểu hiện astaxanthin chiếm

1,6% trọng lượng khô quả [7]

Trên xà lách, Harada và cộng sự (2014) chuyển các gen mã hóa β-carotene

ketolase và β-carotene hydroxylase ( từ Brevundimonas sp.) và gen mã hóa enzyme

isopentenyl diphosphate isomerase vào lục lạp đã tạo được lá xà lách có hàm lượng astaxanthin 178 µg/g trọng lượng tươi và chiếm 77,4% hàm lượng carotenoid tổng [61]

Trên ngô, Farré và cộng sự (2016) nghiên cứu chuyển các gen mã hóa

β-carotene ketolase (từ Chlamydomonas reinhardtii) và β-β-carotene hydroxylase (từ

Brevundimonas sp.) và gen mã hóa enzyme phytoene synthase (từ ngô) đồng thời

bất hoạt gen mã hóa enzyme lycopene e-cyclase để hướng tiền chất vào nhánh β, β giúp tăng cường con đường chuyển hóa tạo astaxanthin Kết quả, các tác giả đã tạo được dòng ngô chuyển gen chứa astaxanthin 16,77 µg/g trọng lượng khô hạt và chiếm 60% tổng carotenoid [31]

Trên lúa gạo, Zhu và cộng sự (2018) nghiên cứu chuyển các gen mã hóa

enzymm phytoene synthase (ngô), phytoene desaturase (vi khuẩn Pantoea

ananatis), β-carotene ketolase (tảo Chlamydomonas reinhardtii), và β-carotene

hydroxylase (tảo Haematococcus pluvialis) tạo được hạt gạo tích lũy astaxanthin

16,23 µg/g trọng lượng khô, chiếm 74% lượng carotenoid tổng [8]

Trên táo, Jia và cộng sự (2019) chuyển gen mã hóa carotene ketolase và

β-carotene hydroxylase (Haematococcus pluvialis) đã tạo được các dòng táo có hàm

lượng astaxanthin 12,06 µg/g và canthaxanthin 6,38 µg/g lá tươi Các dòng táo chuyển gen có khả năng chống oxy hóa cao và đề kháng với bệnh cháy nắng [62]

Trên đậu tương, Pierce và cộng sự (2015) chuyển các gen mã hóa enzyme

β-carotene ketolase (Brevundimonas sp và Haematococcus pluvialis) và phytoene

synthase (vi khuẩn Pantoea ananatis) đã tạo được hạt đậu tương chứa 52 μg/g

canthaxanthin trọng lượng khô Các tác giả cũng phát hiện astaxanthin trong hạt đậu (2-7 µg/g), điều này chứng tỏ trong đậu tương có enzyme β-carotene hydroxylase nội sinh hoạt động kết hợp với β-carotene ketolase để tạo thành astaxanthin (hình 1.8) [63] Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin ghi nhận được khá thấp Con đường

chuyển hóa tạo astaxanthin trên cây hoa Adonis aetivalis với sự tham gia của các gen cbfd (carotenoid β-ring 4-dehydrogenase) và hbfd (carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase) diễn ra mạnh Ngoài ra, hoạt động liên hợp của hbfd và cbfd cũng

có thể giúp nâng cao khả năng tạo astaxanthin nên đây là những gen tiềm năng giúp nâng cao sự tích lũy astaxanthin trong hạt đậu tương nói riêng và trên các đối tượng khác nói chung

Hình 1.8 Sơ đồ chuyển hóa tạo astaxanthin trên đậu tương khi được biến nạp các

gen mã hóa phytoene synthase và ketolase (*) hoạt động của enzyme ketolase [63]

1.2 Biến đổi gen thực vật

Hai hệ thống khác nhau có thể được sử dụng để chuyển gen vào thực vật là

hệ thống sinh học (gián tiếp): sử dụng vi khuẩn Agrobacterium hoặc vector virus và

hệ thống phi sinh học (trực tiếp): vi tiêm, xung điện, siêu âm, bắn gen Trong đó,

phương pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium (gián tiếp) và bắn gen (trực tiếp) được

sử dụng phổ biến và hiệu quả nhất trên nhiều loài thực vật khác nhau [64][65]

Phương pháp bắn gen được mô tả lần đầu tiên bởi Sanford và cộng sự (1987) [66] Trong đó, vector biểu hiện bao gồm những gen đích được cố định trên đạn vàng hoặc tungsten Tiếp theo, sử dụng áp lực tạo bởi khí hydro hoặc nitơ đẩy đạn

về phía tế bào đích Một số đạn mang vector sẽ xuyên qua màng tế bào dẫn đến quá trình gắn chèn gen ngoại lai vào bộ gen tế bào [67] Trong phương pháp này, những

tế bào có khả năng sinh phôi được sử dụng hiệu quả nhất do có độ đồng nhất, khả năng tái sinh cao và có thể được trải đều trên bề mặt để bắn gen Ưu điểm của phương pháp là có thể áp dụng với nhiều loài, giống, và có hiệu quả chuyển gen cao trên nhiều loại cây trồng quan trọng Tuy nhiên, hạn chế là chi phí cao, hiệu quả

chuyển gen có thể thấp hơn khi dùng Agrobacterium, ngoài ra phân tử DNA chuyển

vào tế bào dễ bị đứt gãy, thường tạo nhiều bản copy của gen chuyển trong tế bào đồng thời tạo nhiều dòng có sự biểu hiện của gen chuyển không ổn định [64][68]

1.2.1 Chuyển gen vào thực vật sử dụng Agrobacterium tumefaciens

Phân loại

Giới : Bacterium Ngành : Proteobacteria

Lớp : Alpha Proteobacteria

Bộ : Rhizobiales

Họ : Rhizobiaceae

Chi : Agrobacterium

Loài : Agrobacterium tumefaciens

Trong tự nhiên A tumefaciens là một loại vi khuẩn đất, gram âm, gây bệnh

trên thực vật, chủ yếu ở cây 2 lá mầm với triệu chứng điển hình là tạo thành khối u

trên thân, rễ Trong quá trình gây bệnh, A tumefaciens chuyển một đoạn DNA của mình vào bộ gen cây [69] Dựa vào khả năng này, hiện nay A tumefaciens đã được

sử dụng phổ biến để chuyển nhiều loại gen ngoại lai qui định các đặc tính khác nhau vào thực vật như tính kháng sâu, thuốc diệt cỏ, khả năng khử độc môi trường, gia

tăng chất dinh dưỡng, tổng hợp dược phẩm [70]

Cấu trúc giúp A tumefaciens có khả năng chuyển gen nằm trên Ti-plasmid

(Tumour inducing plasmid) với các đặc tính điển hình: kích thước khoảng 200 - 800

kb, dạng vòng xoắn kép [55] Trong Ti-plasmid có hai vùng quan trọng là vùng

T-DNA (transferred T-DNA) và vùng gây độc (virulence - vir gen) Vùng gen vir gồm

những gen mã hóa cho các protein cần thiết cho sự tổng hợp, vận chuyển và hợp

nhất của vùng T-DNA vào tế bào chủ Vùng gen vir có kích thước khoảng 30 - 40

kb, gồm 6 operon quan trọng là: VirA, VirB, VirC, VirD, VirE, VirG và 2 operon khác ít quan trọng hơn là VirF và VirH [73][74]

Vùng T-DNA trên Ti-plasmid đóng vai trò quan trọng trong kỹ thuật chuyển

gen sử dụng A tumefaciens, đây chính là vùng được chuyển vào tế bào thực vật, so

với T-DNA tự nhiên, vùng T-DNA sử dụng trong kỹ thuật chuyển gen có nhiều cải biến gồm: sự loại bỏ các gen gây độc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và thay thế bởi các gen mong muốn biểu hiện trong thực vật như gen kháng sâu bệnh, chậm

chín trái Đồng thời khi biến nạp với A tumefaciens, chỉ một số ít tế bào nhận

được sự hòa nhập bền vững gen mong muốn vào bộ gen nhân Do đó cần thiết phải cấu trúc thêm các gen chọn lọc (selectable marker genes) và gen chỉ thị (reporter genes) trong cấu trúc đồng chuyển với gen mong muốn trên T-DNA

Gen chọn lọc: được sử dụng để chọn lọc thể chuyển gen, mã hóa 1 protein

cho phép những tế bào chuyển gen có khả năng phát triển trên môi trường có những hợp chất độc với tế bào không chuyển gen Gen chọn lọc có thể mã hóa một enzyme

Hình 1.9 Vi khuẩn A tumefaciens bám

trên bề mặt tế bào thực vật [71]

Hình 1.10 Vi khuẩn A tumefaciens gây

khối u trên thực vật [72]

giải độc giúp phân hủy tác nhân chọn lọc, hoặc mã hóa cho một enzyme không nhạy cảm với sự ức chế của tác nhân chọn lọc, enzyme này sẽ thay thế enzyme đã bị biến đổi trong thể chuyển gen Những gen chọn lọc thường được sử dụng trong các

nghiên cứu chuyển gen vào thực vật gồm: nptII, hpt, bar [75]

Hình 1.11 Sự ức chế của phosphinothricin lên hoạt động của enzyme

glutamine synthetase (GS)

Gen bar được phân lập từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus mã hóa cho

enzyme phosphinothricin acetyl transferase có khả năng phosphoryl hóa và làm mất hoạt tính của phosphinothricin, đây là một loại thuốc diệt cỏ, được bổ sung vào môi trường để sàng lọc thể chuyển gen Phosphinothricin ức chế enzyme glutamine synthetase (GS) trong tế bào thực vật do đó cản trở tế bào tổng hợp glutamine, đồng thời làm gián đoạn quá trình chuyển hóa NH4+, dẫn đến sự tích lũy amonia trong tế bào thực vật (hình 1.11) Amonia tích tụ nhiều sẽ trở thành chất độc gây chết tế bào

thực vật, chỉ những tế bào được chuyển gen bar mới có khả năng bất hoạt

phosphinothricin và sống được trên môi trường chọn lọc [76]

Gen chỉ thị: mã hóa sản phẩm thấy được, dùng để phát hiện thể chuyển gen,

ví dụ như: gus, luc, gfp, trong đó gus là gen được sử dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật chuyển gen thực vật Gen gus do Jelferson phân lập từ E coli năm 1986, mã

hóa protein glucuronidase, là một hydrolase xúc tác sự phân giải các

β-1.12) β-glucuronide thường dùng nhất để nhận biết sự tồn tại của gen gus là

X-Gluc (5-bromo-4-clo-3-indolyl--D-glucoronide)

Hình 1.12 Phản ứng của X-Gluc với -glucuronidase [77]

Ưu và nhược điểm của phương pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens

Ưu điểm: Đây là phương pháp chuyển gen tương đối đơn giản, hiệu quả,

không cần sử dụng những thiết bị phức tạp, cho phép chuyển những đoạn DNA có kích thước tương đối lớn, ít xảy ra đứt gãy hoặc tái sắp xếp lại trình tự nên các gen

có tính toàn vẹn và biểu hiện ổn định ở mức độ cao trong tế bào chủ Ngoài ra số lượng bản sao của gen biến nạp trong tế bào chủ thường thấp do đó giảm ảnh hưởng đến hoạt động của bộ gen cây chủ

Nhược điểm: các chủng A tumefaciens có phạm vi ký chủ tương đối hẹp, chủ

yếu là cây hai lá mầm và một số cây một lá mầm Tuy nhiên, dựa trên những hiểu

biết về cơ chế chuyển gen vào tế bào thực vật của A tumefaciens cùng với sự chọn lọc, cải thiện đối với các dòng A tumefaciens tự nhiên, phạm vi ký chủ của A

giúp điều khiển quá trình khởi đầu phiên mã để tạo các RNA Về cấu trúc, promoter gồm các vùng chính là vùng lõi (core), vùng cận biên (proximal) và ngoại biên (distal) (hình 1.13) Vùng lõi, thường nằm cách vị trí bắt đầu phiên mã - 40 base pair (bp) về phía thượng nguồn, chứa các trình tự (TATA box, Initiator element) là vùng gắn của những nhân tố phiên mã chung (GTF, general transciption factor) và RNA polymerase, tạo thành phức hợp khởi đầu phiên mã (PIC, preinitiation complex) Những thay đổi ở vùng này sẽ ảnh hưởng lớn đến khả năng phiên mã, biểu hiện của gen Vùng promoter cận biên thường và ngoại biên thường nằm ở phía thượng nguồn vùng promoter lõi (vùng ngoại biên nằm xa hơn cận biên) Hai vùng này gồm các trình tự nucleotide có chức năng điều hòa phiên mã khác nhau như tăng cường, ức chế, hoạt hóa Trong quá trình khởi đầu phiên mã, những nhân

tố phiên mã gắn với trình tự DNA chuyên biệt có chức năng điều hòa trên promoter đồng thời tương tác với phức hợp khởi đầu phiên mã (PIC) Phức hợp tương tác DNA/protein này giúp hoạt hóa, tăng cường hay ức chế sự phiên mã Có thể thấy, điều hòa phiên mã phụ thuộc nhiều yếu tố như hoạt động của các nhân tố phiên mã,

loại, số lượng, vị trí và sự kết hợp của các yếu tố điều hòa trên promoter [79][80]

Hình 1.13 Mô hình cơ bản về cấu trúc và điều hòa phiên mã của gen mã hóa

protein [79]

Các loại promoter được sử dụng trong công nghệ gen thực vật

Promoter đóng vai trò quan trọng hàng đầu quyết định sự biểu hiện của gen biến nạp trong thực vật chuyển gen, do đó tùy vào yêu cầu, mục đích nghiên cứu cụ thể cần có sự lựa chọn promoter phù hợp Hiện nay, promoter sử dụng trong công

vi rút và được phân thành 4 nhóm chính gồm: promoter liên tục (constitutive promoter), promoter cảm ứng (inducible promoter), promoter chuyên biệt (spatiotemporal promoter) và promoter tổng hợp (synthetic promoter) [80]

Promoter liên tục: là những promoter luôn hoạt động dẫn đến gen biểu hiện liên tục không phụ thuộc loại mô, tế bào, điều kiện môi trường, giai đoạn phát triển

Những promoter này thường có thể hoạt động trên nhiều giống, loài, giới, như promoter của virus khảm súp lơ (CaMV35S), promoter opine, promoter ubiquitin thực vật (Ubi), promoter actin1 của gạo (Act-1)

Promoter cảm ứng: là những promoter mà hoạt động được cảm ứng bởi các tín hiệu bên trong, bên ngoài tế bào, hay do ảnh hưởng của môi trường Promoter cảm ứng được ứng dụng phổ biến trong công nghệ di truyền thực vật do sự biểu hiện gen có thể được bật hoặc tắt bởi sự phun các hóa chất hoặc xử lý các tín hiệu vật l , như các stress sinh học, phi sinh học gồm điều kiện sáng tối, nhiệt độ cao, thấp, mầm bệnh, hóa chất (cồn, hormone, kim loại, steroid, kháng sinh )

Promoter chuyên biệt (vị trí, thời gian: spatiotemporal promoter): điều khiển

sự biểu hiện gen trong tế bào, mô, cơ quan chuyên biệt của một sinh vật ở một giai đoạn phát triển cụ thể Promoter chuyên biệt có thể giúp nâng cao khả năng biểu hiện của gen biến nạp ở một cơ quan nhất định do đó tiết kiệm được năng lượng và dinh dưỡng khi protein đích không cần thiết biểu hiện trên toàn cây Ngoài ra, điều này cũng nâng cao hơn khía cạnh an toàn sinh học của cây chuyển gen Nhiều promoter chuyên biệt đã được sử dụng, ly trích từ nhiều nguồn như: glycinin chuyên biệt hạt từ đậu tương, PGNpr2 chuyên biệt phôi từ ngô,

Promoter tổng hợp là những promoter được thiết kế để kết hợp theo mong muốn những trình tự promoter lõi, vùng promoter cận biên (proximal) và vùng promoter ngoại biên (distal), do đó có thể giúp điều khiển sự biểu hiện gen theo cách không có trong tự nhiên Promoter tổng hợp có thể được cấu trúc dựa trên sự kết hợp của các yếu tố cis gồm yếu tố tăng cường (enhancer), hoạt hóa (activator) hoặc ức chế (repressor) ở phía thượng nguồn (upstream) của trình tự promoter lõi Những sắp xếp này có thể giúp promoter tổng hợp điều khiển sự biểu hiện gen một cách chính xác

Ví dụ: promoter CaMV35S có trình tự tăng cường được nhân đôi giúp nâng cao mức

độ biểu hiện gen và đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu [79]

Promoter biểu hiện gen chuyên biệt hạt ở đậu tương

Sự biểu hiện gen chuyên biệt ở hạt có thể giúp nâng cao hàm lượng chất quan tâm trong hạt, đồng thời hạn chế ảnh hưởng của gen biến nạp ở các bộ phận khác trên cây, cũng như đảm bảo sự sinh trưởng, phát triển bình thường của cây chuyển gen Trong hạt đậu tương, protein chiếm hàm lượng rất cao, khoảng 40% trọng lượng khô, trong đó chủ yếu là glycinin (40% protein tổng) và β-conglycinin (30%

protein tổng), có vai trò dự trữ cacbon và nitơ Gen biểu hiện các protein này hoạt động mạnh, chuyên biệt ở hạt nên promoter của chúng rất phù hợp để điều khiển biểu hiện gen ngoại lai chuyên biệt hạt ở đậu tương nói riêng và các loại cây khác nói chung [81] Một số nghiên cứu đã ghi nhận được các yếu tố điều hòa biểu hiện gen glycinine như như yếu tố RY (5'- CATGCATG-3') có vai trò quan trọng trong việc điều khiển mức độ biểu hiện gen trong hạt, yếu tố cis "CACA" nằm ở vùng 5' tương tác với yếu tố phôi trong điều hòa biểu hiện gen [82]

Promoter của gen glycinin đậu tương đã được nhiều nghiên cứu sử dụng để biểu hiện gen ngoại lai trên hạt Ding và cộng sự (2006) nghiên cứu chuyển gen tổng hợp yếu tố phát triển nguyên bào sợi cơ bản ở người (human basic fibroblast

growth factor, bfgf) và gus vào đậu tương sử dụng promoter glycinin và CaMV35S cho các gen biến nạp Kết quả khi sử dụng promoter glycinin cho cả gen bfgf và gus

đều cho thấy sự biểu hiện chuyên biệt của gen (mRNA, protein) ở hạt, không có sự biểu hiện của các gen này trên các bộ phận khác của cây Ngoài ra, khi so sánh mức

độ biểu hiện cũng cho thấy promoter glycinin giúp tăng khả năng tổng hợp protein

so với promoter liên tục điển hình là CaMV35S (trung bình 1,2% so với 0,04%) [81] Moravec và cộng sự (2007) sử dụng promoter glycinine cũng đã biểu hiện

được hàm lượng cao protein tái tổ hợp LB toxin của vi khuẩn E coli trong hạt đậu

tương chiếm 2,4% protein tổng số trong hạt, trong khi sử dụng promoter CaMV35S

ở đậu tương chỉ thu được lượng protein tái tổ hợp cao nhất là 0,5% protein tổng [83] Như vậy, các kết quả này chỉ ra rằng promoter glycinin có thể giúp biểu hiện gen ngoại lại ở mức độ cao và chuyên biệt ở hạt đậu tương, do đó là promoter tiềm năng có thể được ứng dụng khi cần biểu hiện gen chuyên biệt ở hạt đậu tương

1.2.3 Sự di truyền của gen biến nạp trong cây chuyển gen

Gen biến nạp có thể được di truyền cho thế hệ sau theo qui luật Mendel

Thông thường, chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium số bản sao thấp và

gen biến nạp di truyền theo qui luật Mendel Trong khi phương pháp bắn gen thường tạo nhiều bản sao và hay xảy ra sự tái sắp xếp của cấu trúc đoạn DNA biến nạp Sự di truyền của gen biến nạp không theo Mendel có tần số khoảng 10-50%

Những đoạn DNA đa gen được biến nạp vào bộ gen cây thường liên kết hoàn toàn

và di truyền theo kiểu một locus đơn Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến sự di truyền của gen biến nạp như bản chất của bộ gen cây nhận, gen biến nạp, tương tác giữa chúng Một số biến đổi đã được ghi nhận ở những loci của gen biến nạp như:

mất gen, nhân đôi, tái sắp xếp, tái tổ hợp, tương tác gen… [84]

Tỉ lệ phân ly của gen biến nạp (tính trạng) theo qui luật di truyền Mendel ở thế hệ T1 khi có 1, 2, 3 bản sao của gen biến nạp được chèn vào bộ gen cây là 3:1, 15:1, 63:1 Qui luật này có thể được kiểm tra thông quan phân tích χ2 so sánh giữa giá trị thực tế và lý thuyết [85] Ngoài ra, khi lai cây chuyển gen với đối chứng để nhận được cây F1 có tỉ lệ phân ly theo Mendel là 1:1 hoặc 3:1 tương ứng với 1 hay

2 bản sao của gen biến nạp được chèn vào bộ gen cây [86] Các tính trạng biểu hiện

ở cây chuyển gen như kháng kháng sinh, kháng thuốc diệt cỏ… hoặc sự hiện diện của gen (thông qua PCR) có thể được sử dụng để kiểm tra tỉ lệ phân ly của gen biến nạp [85][86][87]

Một số nguyên nhân dẫn đến sự di truyền không theo qui luật Mendel

Bản chất bộ gen nhận có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện và ổn định của gen biến nạp Ví dụ: sự thiếu ổn định của gen biến nạp có thể do những yếu tố di chuyển (transposable elements) trong bộ gen cây ngô

Khả năng sống của giao tử: vị trí chèn của gen biến nạp có thể ảnh hưởng đến khả năng sống của giao tử dẫn đến những bất thường trong tỉ lệ phân ly Limanton-Grevet và Jullien (2001) ghi nhận tỉ lệ phân ly 1:1 của tính kháng kanamycin và biểu hiện GUS, điều này là do vị trí chèn của gen biến nạp ảnh hưởng đến sức sống của giao tử cái, dẫn đến gen biến nạp chỉ được di truyền qua giao tử đực [88]

Sự bất thường của nhiễm sắc thể: hiện tượng methyl hóa gen biến nạp, các đột biến mất đoạn, lặp đoạn liên quan đến sự gắn chèn gen ảnh hưởng đến sự di truyền, ổn định của gen biến nạp [89]

Sự bắt cặp chéo trong nguyên phân và mất ổn định trong giảm phân: sự trao đổi chéo trong nguyên phân có thể dẫn đến sự đồng hợp tử của gen chuyển ở thế hệ T0 [90] Ngoài ra, quá trình giảm phân cũng có thể dẫn đến sự mất gen biến nạp ở thế hệ sau [91]

1.3 Nghiên cứu phát sinh hình thái và biến đổi gen đậu tương

Đậu tương là cây trồng bị ảnh hưởng lớn bởi mầm bệnh, sâu hại và stress môi trường Do đó, cải tạo giống đậu nhằm nâng cao năng suất và chất lượng hạt đậu là nhu cầu cần thiết Tuy nhiên, cải tạo giống bằng các phương pháp truyền thống gặp nhiều khó khăn do đậu tương là cây tự thụ phấn và nguồn gen của các giống đậu tương ngày nay không phong phú, do hầu hết đều có cùng nguồn gốc chung Việc ứng dụng các kỹ thuật hiện đại như chuyển gen, lai giống hỗ trợ bởi marker phân tử đã giúp tạo nhiều giống mới với các đặc tính ưu việt Thực tế, hiện nay phần lớn diện tích trồng đậu tương sử dụng cây biến đổi gen [92][93]

1.3.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương

Phân loại

Tên khoa học: Glycine max (L.) Merrill

Bộ: Fabales Họ: Fabaceae

Chi: Glycine Loài: Glycine max

Cây đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc, được trồng đầu tiên từ khoảng năm 1700 trước công nguyên (hình 1.14) Ở Việt Nam, đậu tương cũng đã được trồng từ hàng ngàn năm nay Do có khả năng thích nghi rộng nên đậu tương được trồng ở khắp nơi trên thế giới Tuy nhiên, hiện nay chỉ một số nước đóng vai trò

Hình 1.14 Cây đậu tương

cung cấp chính cho toàn thế giới là Mỹ, Brazil, Argentina, Trung Quốc (hình 1.15) [94][95]

Hình 1.15 Sản lượng của 6 nước sản xuất đậu tương lớn nhất [94]

Đậu tương là cây thân thảo, ít phân cành, thân cây đậu tương có hình tròn, nhiều lông, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có khi bò hay nửa bò Mỗi cây có từ

8 - 14 đốt tùy loại hình sinh trưởng hữu hạn hoặc vô hạn Lá kép, mỗi lá kép có 3 lá chét, đôi khi có 4 - 5 lá chét, lá có dạng dài, hẹp hình lưỡi mác hoặc hình thoi Hoa rất bé dài khoảng 0,6 - 0,7 cm màu tím, tím nhạt hoặc trắng Đậu tương là cây có hoa hoàn toàn tự thụ phấn Quả đậu tương thuộc loại quả giáp, có nhiều lông, khi chín biến màu vàng hoặc xám Mỗi quả có từ 1 - 4 hạt Khối lượng hạt rất đa dạng

từ 20 - 400 mg/hạt Thời gian sinh trưởng có 3 loại: chín sớm (75 - 85 ngày), trung bình (80 - 100 ngày), muộn (110 - 120 ngày) [96]

Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng 35 - 40%, lipid từ 15 - 20%, carbonhydrate từ 15 - 16% theo trọng lượng khô Protein trong đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong số các protein của thực vật với đầy đủ và cân đối các loại acid amin cần thiết Ngoài ra, trong hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin: B1, B2, PP, A, E, K, D, C…, khoáng chất: Ca, P, Fe , các chất chuyển hóa hoạt động sinh l như isoflavone, lecithin, tocopherol và saponin, hơn nữa hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng Ở nước ta, đậu tương là

Năm