Danh Sách Chữ Viết Tắt Viết tắt Chữ viết đầy đủ Nghĩa tiếng việt ASC Antibody secreting cells Tế bào chế tiết kháng thể CPE Cytopathic effect Bệnh tích tế bào DNA Desoxyribonucleic acid
GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Bệnh tiêu chảy cấp trên heo (Porcine epidemic diarrhea - PED) là bệnh truyền nhiễm do virus gây ra, lây lan rất nhanh trong đàn heo và có tỷ lệ mắc bệnh gần như toàn bộ (100%) Các triệu chứng lâm sàng đặc trưng gồm ói mữa và tiêu chảy xuất hiện ở mọi lứa tuổi heo (Pospischil et al., 2002) Bệnh gây ra tỷ lệ chết rất cao, đặc biệt ở heo con theo mẹ, với tỷ lệ tử vong dao động từ 30% đến 90%, thậm chí lên đến 100% trong các ổ dịch tại châu Á như Hàn Quốc, Thái Lan, Philippines (Kim et al., 2001; Pensaert and Yeo, 2006).
PEDV không gây tử vong trên heo trưởng thành, nhưng ảnh hưởng đáng kể đến năng suất sinh sản, với tỷ lệ đẻ giảm 12,6%, không lên giống lại 5,7%, sảy thai 1,3% và thai khô 2,0% Heo nái mang thai lứa đầu nhiễm PEDV có thể gặp phải ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất sinh sản trong các lứa sau.
Nhiều nghiên cứu về gene và đặc điểm dịch tễ phân tử của PEDV tại các quốc gia experiencing outbreaks cho thấy sự đa dạng cao về gene của virus, chủ yếu do đột biến nhanh và khả năng lây lan từ các quốc gia khác Các nghiên cứu này bao gồm các công trình của Duarte và Laude (1994), Kocherhans et al (2001), Yeo et al (2003), Park et al (2007), Puranaveja et al (2009), Lee et al (2010) và Duy et al (2011).
Vào cuối năm 2008, dịch tiêu chảy cấp lần đầu xuất hiện tại Đồng Nai, Việt Nam, rồi nhanh chóng lây lan tới nhiều tỉnh thành khác Bệnh gây thiệt hại nặng nề cho đàn heo ở các tỉnh miền Đông Nam bộ, với tỷ lệ mắc bệnh có thể lên đến 100% ở các lứa tuổi Đặc biệt, tỷ lệ tử vong cao ở nhóm heo con theo mẹ, đạt mức 50-100%, gây ảnh hưởng lớn đến ngành chăn nuôi heo của khu vực.
Các chủng PEDV ở Việt Nam có mức độ tương đồng gene rất cao với các chủng phân lập từ Trung Quốc và Thái Lan, với sự khác biệt nhỏ từ 0,56-2,86% và 0,00-1,71% Các chủng PEDV tại Việt Nam bắt đầu thể hiện sự đa dạng về đột biến điểm tại các địa phương như Bình Dương, Đồng Nai và TP HCM Phân tích trình tự nucleotide và amino acid của gene S cho thấy các chủng PEDV ở phía Bắc có tỷ lệ tương đồng cao với các chủng tham chiếu trước đó của Việt Nam, cho thấy mức độ liên quan chặt chẽ của các dòng virus trong khu vực.
Bệnh tiêu chảy cấp do PEDV xuất hiện gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi heo ở Việt Nam Tuy nhiên, các nghiên cứu liên quan chủ yếu mới chỉ tập trung tại các tỉnh miền Đông Nam Bộ và một số khu vực phía Bắc, còn thiếu dữ liệu toàn diện về tác động của bệnh ở các vùng khác.
Phòng chống bệnh tiêu chảy do PEDV gây ra chủ yếu dựa vào việc sử dụng vaccine, tuy nhiên hiện nay tỷ lệ tiêm phòng vaccine vẫn còn rất hạn chế Điều này làm giảm hiệu quả kiểm soát dịch bệnh và gây ảnh hưởng lớn đến ngành chăn nuôi lợn Việc tăng cường công tác tiêm phòng vaccine là cần thiết để giảm thiểu thiệt hại do PEDV gây ra và đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm.
Việc cập nhật đặc tính phân tử của các chủng PEDV là rất quan trọng để lựa chọn vaccine phù hợp và hiệu quả cho công tác phòng chống dịch bệnh Tuy nhiên, khả năng phân tích di truyền các chủng PEDV lưu hành tại Việt Nam còn hạn chế, gây khó khăn trong việc định hướng sử dụng vaccine Dịch tiêu chảy cấp đã xuất hiện tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, vùng chăn nuôi heo trọng điểm khu vực Tây Nam Bộ, đòi hỏi phải xác định rõ sự hiện diện của PEDV để hình thành chiến lược phòng bệnh phù hợp Nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng, bệnh tích, kiểu gene của virus gây bệnh và mối liên hệ di truyền với các chủng quốc tế đóng vai trò quan trọng trong xác định nguồn gốc tiến hóa và sự biến đổi di truyền của các chủng PEDV, góp phần xây dựng chiến lược sản xuất vaccine tương lai.
Heo (Porcine Epidemic Diarrhea) Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long: Đặc Điểm Bệnh Học và Di Truyền Virus” đƣợc tiến hành.
Mục tiêu của nghiên cứu
Bài viết đánh giá sự lưu hành của dịch tả heo châu Phi (PEDV) và xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh PED trên heo tại một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long nhằm hỗ trợ công tác kiểm soát dịch bệnh hiệu quả Nghiên cứu cho thấy mức độ phát tán của PEDV có ảnh hưởng đáng kể bởi yếu tố môi trường, quy trình chăn nuôi, và mức độ kiểm soát dịch của các trang trại Các yếu tố nguy cơ như mật độ heo cao, quản lý vệ sinh kém và việc vận chuyển giữa các tỉnh làm tăng khả năng lây lan của bệnh PED Việc đánh giá chính xác sự lưu hành của bệnh giúp các cơ quan chức năng xây dựng các biện pháp phòng ngừa, kiểm soát dịch bệnh phù hợp để bảo vệ ngành chăn nuôi heo địa phương Các kết quả của nghiên cứu góp phần nâng cao nhận thức và kỹ năng phòng chống dịch cho người dân và doanh nghiệp chăn nuôi trong vùng.
Để nâng cao khả năng chẩn đoán bệnh PED, cần xác định đặc điểm bệnh học của PED tại một số tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long Đồng thời, việc đánh giá sự biến đổi di truyền của virus PEDV trong khu vực là yếu tố quan trọng để xây dựng cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về dịch tễ học và phát triển vaccine hiệu quả hơn.
Nội dung nghiên cứu
Khảo sát sự lưu hành của virus PEDV trên heo nái tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy tỷ lệ kháng thể dịch thể cao ở các đàn heo chưa tiêm vaccine phòng PED Nghiên cứu này giúp đánh giá mức độ lây nhiễm và khả năng miễn dịch tự nhiên của đàn heo nái trong khu vực Kết quả cho thấy, việc theo dõi huyết thanh và sự hiện diện của kháng thể giúp xác định nguy cơ lây lan của PEDV và đề xuất các biện pháp phòng ngừa phù hợp Thống kê từ khảo sát cung cấp thông tin cần thiết để xây dựng các chiến lược kiểm soát dịch bệnh hiệu quả trên địa bàn Đồng bằng sông Cửu Long.
Khảo sát các yếu tố nguy cơ có liên quan đến bệnh PED tại một số tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long
Khảo sát tỷ lệ bệnh do PEDV trên các đàn heo con theo mẹ và heo nái mắc bệnh tiêu chảy
Dưới khảo sát, tần suất xuất hiện các triệu chứng lâm sàng của bệnh PED được ghi nhận phổ biến, giúp nhận biết sớm các dấu hiệu chính của bệnh Đồng thời, các mẫu bệnh tích đại thể và vi thể trên các ca bệnh PED tại một số tỉnh trong Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy các đặc trưng đặc hiệu của tổn thương, góp phần chẩn đoán chính xác và xây dựng phương pháp phòng ngừa hiệu quả Nghiên cứu này cung cấp dữ liệu quan trọng về tình hình dịch bệnh PED, giúp các địa phương nâng cao hiệu quả công tác kiểm soát và giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra.
Nghiên cứu di truyền PEDV tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy sự đa dạng gen đặc trưng của virus này trong khu vực Phân tích so sánh với các chủng đã được phân lập tại Việt Nam và các quốc gia khác trên thế giới cho thấy sự tương đồng và khác biệt về gen, góp phần hiểu rõ nguồn gốc và khả năng lây truyền của PEDV Việc đối chiếu các mẫu virus với dữ liệu từ ngân hàng gene giúp xác định các biến thể đặc biệt, từ đó hỗ trợ chiến lược phòng chống dịch hiệu quả hơn Các kết quả này đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao khả năng dự đoán và kiểm soát sự lây lan của PEDV tại Việt Nam và khu vực.
Ý nghĩa của luận án
Kết quả của luận án xác nhận sự hiện diện của PED tại các trại chăn nuôi heo khu vực đồng bằng sông Cửu Long, đồng thời đã xác định các đặc điểm lâm sàng cơ bản giúp người chăn nuôi dễ dàng chẩn đoán dịch bệnh Nghiên cứu cũng nêu bật các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh PED, góp phần xây dựng các giải pháp hiệu quả để kiểm soát dịch bệnh trên heo tại đồng bằng sông Cửu Long.
Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng về tình hình lưu hành của virus PEDV và các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh PED trên đàn heo tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long Phân tích di truyền các chủng PEDV thu nhận được cho thấy sự biến đổi phức tạp của virus này trong khu vực Những phát hiện này tạo nền tảng khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về đặc điểm dịch tễ học của PED và phát triển vaccine phòng bệnh hiệu quả.
Các triệu chứng lâm sàng của PED xác định rõ ràng, góp phần chẩn đoán chính xác bệnh Bệnh tích vi thể và đặc điểm đại thể khi heo mắc PED cung cấp những dấu hiệu quan trọng để nhận biết bệnh một cách chính xác Việc xác định các đặc điểm này là nền tảng giúp phân biệt PED với các bệnh lý khác, từ đó đưa ra phương hướng điều trị hiệu quả.
Những điểm mới của luận án
- Nghiên cứu đầu tiên tương đối toàn diện về PED trên đàn heo ở Đồng bằng sông Cửu Long
- Nghiên cứu hồi cứu đầu tiên về PED trên đàn nái qua xét nghiệm kháng thể kháng PEDV bằng kỹ thuật ELISA
- Phân tích được tương đối đầy đủ các yếu tố nguy cơ có liên quan đến bệnh PED
- Phân tích di truyền đầu tiên, tương đối đầy đủ cả về 4 gene cấu trúc S,
E, N và M của các chủng PEDV tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 01/2015 đến tháng 06/2018
3.1.1.2 Địa điểm nghiên cứu Địa điểm lấy mẫu: Các mẫu huyết thanh heo nái chƣa tiêm phòng vaccine PED, mẫu phân heo tiêu chảy, các mẫu bệnh phẩm (phân, ruột…) của heo con mắc bệnh tiêu chảy do PEDV đƣợc thu thập tại các cơ sở chăn nuôi ở tỉnh Tiền Giang, Bến Tre, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Hậu Giang và Sóc Trăng Địa điểm nghiên cứu:
Xét nghiệm tìm kháng thể kháng PEDV đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển Vemedim
Xét nghiệm RT – PCR và giải trình tự gene được thực hiện tại Phòng Chẩn đoán xét nghiệm Thú Y Hàn Việt – Đại học Nông Lâm TP.HCM cùng với sự hợp tác của công ty Macrogen (Hàn Quốc) Các dịch vụ này giúp đảm bảo độ chính xác cao trong chẩn đoán bệnh, hỗ trợ công tác kiểm soát dịch bệnh hiệu quả Việc sử dụng công nghệ tiên tiến của Macrogen cùng đội ngũ chuyên gia tại Thú Y Hàn Việt đảm bảo kết quả xét nghiệm nhanh chóng, đáng tin cậy Đây là các phương pháp cốt lõi trong việc xác định chính xác các virus gây bệnh trên động vật, góp phần nâng cao chất lượng công tác chẩn đoán và phòng chống dịch bệnh trong ngành thú y.
Theo dõi triệu chứng lâm sàng và mổ khám quan sát các bệnh tích đại thể đƣợc thực hiện tại các ổ dịch PED tại cơ sở chăn nuôi
Mẫu tiêu bản vi thể đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm bệnh học – Đại học Y Dƣợc Cần Thơ
3.1.2 Vật liệu 3.1.2.1 Thiết bị, dụng cụ Ống tiêm 5 và kim 23, 18 Tube đựng huyết thanh, micropipetle, pipetle Đĩa 96 giếng dùng pha loãng mẫu
Các ống đong chia độ: 5-50 ml và 500 ml
Máy ly tâm và tủ đông trữ mẫu -20 o C đến -86 o C
Máy đọc ELISA, máy lắc vortex, tủ ấm
Hệ thống PCR (Máy luân nhiệt, máy khuếch đại gene, hệ thống chạy điện di và chụp ảnh…)
Máy đúc block, khuôn đúc, máy cắt, phiến kính, lamen, dao, kéo, panh, kẹp, cốc đựng hóa chất
3.1.2.2 Hóa chất và sinh phẩm dùng cho phản ứng ELISA và test nhanh
Bộ kit thương mại ELISA Porcine epidemic diarrhea virus antibody test kit, Swinecheck R PED indirect của hãng Biovet – Canada
Test nhanh Anigen rapid PED Ag test Kit của hảng Bionote - Hàn Quốc
3.1.2.3 Hóa chất và sinh phẩm dùng cho RT – PCR
GeneJET Viral DNA and RNA Purification Kit (Thermo Scientific, Mỹ) RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Mỹ) GoTaq Green master mix (Promega, Mỹ)
3.1.2.4 Hóa chất và sinh phẩm dùng cho khảo sát bệnh tích vi thể
Formol 10%, cồn các loại, xylen paraffin, thuốc nhuộm eosin, hematoxylin
3.1.2.5 Hóa chất và sinh phẩm dùng cho giải trình tự gene
Hóa chất ly trích RNA: GenJET Viral DNA and RNA Purification Kit (Thermo, Mỹ)
Hóa chất phản ứng tạo cDNA: RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo, Mỹ)
Hóa chất phản ứng PCR: GoTaq G2 Green Master Mix (Promega, Mỹ)
Hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR: GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit (Thermo, Mỹ)
Hóa chất điện di DNA: Agarose (Promega, Mỹ); Ethidium bromide 10 mg/ml (Sigma, Mỹ); dung dịch đệm TBE 10X (Promega, Mỹ); thang DNA
Hóa chất phản ứng nối: Enzyme T4 DNA ligase và buffer ligase (10X) (Promega, Mỹ)
Hóa chất biến nạp: Dung dịch CaCl 2 ; dung dịch glycerol
Hóa chất khác: IPTG (isopropylthio-β-galactoside) (Thermo, Mỹ); X- Gal (5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside) (Thermo, Mỹ); ampicillin (100 mg/ml)
Môi trường LB (Luria-Bertani), môi trường SOC (2 g tryptone; 0,5 g yeast extract; 1 ml NaCl 1M; 0,25 ml KCl 1M; 97 ml nước cất), LB/ampicillin/IPTG/X-Gal
Chủng E coli DH5α (Genotype: F– Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)
U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK–, mK+) phoA supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1) (Takara Bio Inc)
Vector tạo dòng TA: pGEM-T Easy (Promega, Mỹ)
Hình 3.1 Vector tạo dòng TA: pGEM-T Easy (Promega, Mỹ)
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát sự lưu hành của PEDV bằng phương pháp ELISA và phân tích các yếu tố nguy cơ Đối tƣợng điều tra: Các cơ sở chăn nuôi heo tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long chƣa tiêm phòng vaccine PED cho heo
Theo Thông tư liên tịch số 69/2000/TTLT/BNN-TCTK, các cơ sở chăn nuôi đạt tiêu chí trang trại gồm những cơ sở có số lượng heo từ 20 trở lên, chia thành 3 mức là 20– dưới 50 nái, 50– 100 nái và trên 100 nái; ngoài ra, các cơ sở chăn nuôi nhỏ lẻ được phân thành hai mức là dưới 10 nái và từ 10 đến dưới 20 nái Tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, dữ liệu điều tra về bệnh PED được thu thập qua phiếu điều tra (phụ lục 10) kết hợp lấy mẫu máu trên đàn heo nái để đánh giá tình hình lưu hành bệnh Đối tượng lấy mẫu gồm những đàn heo nái chưa sử dụng vaccine phòng bệnh PED tại các tỉnh này theo bảng 3.1.
Các nghiên cứu gần đây về tình hình nhiễm PEDV trên heo tại các tỉnh miền Nam Việt Nam cho thấy tỷ lệ nhiễm qua xét nghiệm mẫu phân đạt 16,96% (Nguyễn Tất Toàn và Đỗ Tiến Duy, 2012) Dựa trên dữ liệu này, ước tính tỷ lệ nhiễm PEDV tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long khoảng 20% Để thực hiện khảo sát chính xác, cần lấy tối thiểu 246 mẫu theo công thức của Thrusfield (1997) trong quần thể chăn nuôi lớn với độ tin cậy 95% và độ chính xác tuyệt đối 5% Ngoài ra, dữ liệu tổng đàn nái của từng tỉnh sẽ được sử dụng để thu thập mẫu phù hợp, từ đó hỗ trợ công tác giám sát và phòng chống dịch hiệu quả.
Bảng 3.1: Số mẫu thu thập trong nghiên cứu Địa điểm Tổng đàn heo
Số mẫu đã thu thập
Sử dụng dây dù để khớp mõm và cố định heo giúp đảm bảo an toàn trong quá trình lấy mẫu Trước khi lấy máu, dùng bông gòn tẩm cồn 70 độ để sát trùng vị trí lấy mẫu nhằm ngăn ngừa nhiễm khuẩn Các mẫu máu được lấy bằng ống tiêm 5 hoặc 10 ml có kim số 18 hoặc 23, với lượng từ 2-5 ml tại tĩnh mạch chủ trước, đảm bảo độ chính xác và an toàn trong xét nghiệm.
Đầu tiên, gỡ kim và bơm nhẹ nhàng để máu chảy vào ống nghiệm đã được vô trùng và dán nhãn rõ ràng ghi số tai và ngày lấy mẫu Sau đó, máu được để đông và bảo quản trong thùng đá làm mát, rồi chuyển đến phòng thí nghiệm để tiến hành tách huyết thanh Trong phòng thí nghiệm, huyết thanh được ly tâm với tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút nhằm loại bỏ tạp chất Cuối cùng, huyết thanh được chiết vào ống nhựa vô trùng, ghi ký hiệu mẫu, và bảo quản ở nhiệt độ -20°C để sẵn sàng cho xét nghiệm.
Phương pháp thực hiện phản ứng ELISA (Theo bộ kít Porcine epidemic diarrhea virus antibody test kit, Swinecheck R PED indirect của hãng Biovet – Canada)
* Thành phần của bộ kit ELISA thương phẩm Đĩa 96 giếng đã gắn kháng nguyên Đối chứng dương, đối chứng âm Dung dịch pha loãng mẫu
Concentrate conjugate A Concentrate conjugate B Nước rửa đậm đặc Substrate
Dung dịch ngừng phản ứng
*Chuẩn bị dung dịch rửa
Pha loãng dung dịch rửa đậm đặc với nước cất theo tỷ lệ 1/10 (40 ml dung dịch rửa đậm đặc với 360 ml nước cất dùng cho một đĩa phản ứng)
Lấy huyết thanh ra để ở nhiệt độ phòng và pha loãng theo hướng dẫn của bộ kit, với tỷ lệ 200 lần Đầu tiên, pha loãng 10 lãm mẫu với 190 lãm dung dịch pha loãng mẫu, tạo ra dung dịch có nồng độ 1/20 Sau đó, lấy 20 lãm dung dịch pha loãng lần 1 trộn với 180 lãm dung dịch pha loãng mẫu để được dung dịch có nồng độ 1/200.
Huyết thanh âm tính và dương tính đối chứng không pha loãng
Để đảm bảo kết quả chính xác, cần cẩn thận thay đổi các đầu tip phù hợp cho từng mẫu và ghi lại vị trí của mỗi mẫu trên đĩa theo hướng dẫn trong bảng 3.2 Trước khi đưa mẫu vào các giếng chứa sẵn kháng nguyên PEDV, hãy trộn đều mẫu để đảm bảo phân phối đồng đều.
Mang tất cả các thuốc thử để nhiệt độ phòng trước khi sử dụng Pha loãng dung dịch Concentrate conjugate A và Concentrate conjugate
B với dung dịch pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1/250
* Quy trình phản ứng Thực hiện theo các bước sau
Bảng 3.2 Bảng phân phối mẫu trong xét nghiệm ELISA
H PC: Positive control – đối chứng dương
NC: Negative control – đối chứng âm
S1, S2, S3, : Mẫu huyết thanh kiểm tra
1 Làm bảng sơ đồ phân bố của các mẫu kiểm tra và đối chứng
2 Cho 100 àl mẫu đó được pha loóng, đối chứng dương và đối chứng õm vào các giếng đã phủ sẵn kháng nguyên PEDV
3 Che các giếng và ủ ở nhiệt độ 23 ± 2 0 C trong 60 phút
4 Cho 300 àl dung dịch rửa vào mỗi giếng cho 1 lần rửa, khoảng 10 giõy đổ bỏ dung dịch rửa Làm ráo giếng bằng cách đập đĩa nhẹ lên giấy thấm Lập lại 3-5 lần (tránh làm khô giếng giữa các lần rửa và trước khi cho dung dịch conjugate vào)
5 Cho vào mỗi giếng 100 àl dung dịch conjugates A
6 Che các giếng và ủ ở nhiệt độ 23 ± 2 0 C trong 60 phút
8 Cho vào mỗi giếng 100 àl dung dịch conjugates B
9 Che các giếng và ủ ở nhiệt độ 23 ± 2 0 C trong 60 phút
11 Cho vào mỗi giếng 100 àl dung dịch substrate
12 Che các giếng và ủ trong tối ở nhiệt độ 23 ± 2 0 C trong 10 phút
13 Cho vào mỗi giếng 100 àl dung dịch ngừng phản ứng
14 Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450 nm Nên đọc kết quả trong khoảng 15 phút sau khi bổ sung các dung dịch ngừng phản ứng
OD S - M OD N S/P RATIO M OD P - M OD N
OD s : Giá trị OD của mẫu
M ODN: Trung bình giá trị OD của đối chứng âm
M ODP: Trung bình giá trị OD của đối chứng dương Điều kiện
Các tiêu chí sau đây phải đƣợc đáp ứng để xác nhận kết quả:
• Đối chứng âm phải có giá trị OD nhỏ hơn 0,40
• Đối chứng dương phải có giá trị OD lớn hơn 0,70
• Tỷ số S/P < 0,4 đƣợc coi là âm tính
• Tỷ số S/P ≥ 0,4 được coi là dương tính
Hình 3.2 Bộ kit ELISA phát hiện kháng thể IgG của PEDV (hãng
Hình 3.3 Kết quả phản ứng ELISA
Phân tích các yếu tố nguy cơ
Phương pháp điều tra hồi cứu kết hợp phỏng vấn người chăn nuôi về nguồn giống, điều kiện vệ sinh thú y, công tác phòng trị bệnh, cùng với xét nghiệm kháng thể kháng PEDV trên mẫu huyết thanh thu thập tại các cơ sở chăn nuôi nhằm phân tích tình hình dịch bệnh Việc này giúp xác định các yếu tố liên quan đến bệnh PED dựa trên phân tích yếu tố nguy cơ OR, từ đó đưa ra các giải pháp kiểm soát dịch hiệu quả.
3.3.2 Nội dung 2: Đánh giá tỷ lệ bệnh do PEDV Đối tƣợng lấy mẫu: 191 đàn (2.262 con) heo con theo mẹ con và 525 heo nái (Nái nuôi con: 110, mang thai: 96, chờ phối: 153, hậu bị: 166) trong các cơ sở chăn nuôi ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long mắc bệnh tiêu chảy đƣợc thu thập mẫu để xét nghiệm đánh giá tỷ lệ bệnh do PEDV
Phương pháp lấy mẫu bao gồm việc lấy mẫu phân của heo con và heo nái mắc bệnh tiêu chảy trực tiếp từ hậu môn để xét nghiệm nhanh bằng bộ dụng cụ PED – Ag Test Kit Các mẫu được chọn ngẫu nhiên từ các heo con cùng mẹ trong các đàn dương tính với PEDV nhằm đảm bảo tính đại diện Ngoài ra, cần thực hiện mổ khám và thu thập mẫu ruột của heo để xét nghiệm khẳng định chính xác bằng phương pháp xét nghiệm chuẩn.
Phương pháp chẩn đoán bệnh bằng PED-Ag test kit (hãng Biovet - Cannada) – Phụ lục 4
Phương pháp RT-PCR dùng để chẩn đoán các ca tiêu chảy nghi bệnh do PEDV
Mẫu ruột heo gồm tá tràng, không tràng, hồi tràng và ruột già bị tiêu chảy trong các đàn heo dương tính với PEDV (PED – Ag test kit) được thu thập bằng phương pháp mổ khám thường quy Các mẫu này được bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8ºC để tiến hành xét nghiệm ngay lập tức hoặc trữ ở nhiệt độ -86ºC để phân tích vào các ngày sau, đảm bảo độ chính xác và chất lượng mẫu.
Mẫu dịch ruột được nghiền bằng cối vô trùng, pha loãng với dung dịch đệm PBS để tạo huyết dịch 10% Sau đó, huyết dịch được ly tâm lạnh ở 3.000 vòng/phút, 4°C trong vòng 5-10 phút để loại bỏ các tạp chất Tiếp theo, lấy 1 ml huyết dịch đã qua ly tâm và chuyển vào ống nhựa vô trùng để tiến hành ly trích RNA theo hướng dẫn Quá trình này giúp đảm bảo an toàn và tối ưu hiệu quả trong việc trích xuất RNA từ mẫu dịch ruột.
Quy trình ly trích RNA (Thermo Scientific):
1 Thờm 50 àl Column Preparation Liquid vào giữa cột Spin Column để làm ẩm màng
2 Cho 200 àl mẫu vào tube 1,5 ml
3 Thờm 200 àl Lysis Solution (đó thờm Carrier RNA), và 50 àl Proteinase K, trộn đều bằng cách vortex Ủ ở 56°C trong 15 phút Ly tâm nhanh 3-5 giây
4 Thờm 300 àl ethanol (96-100%), trộn đều bằng cỏch vortex Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút Ly tâm nhanh 3-5 giây
5 Chuyển dịch tan vào cột Spin Column Ly tâm trong 1 phút ở 6.000 vòng/phút Thay tube 2 ml mới
Hình 3.4 Các bước thực hiện phản ứng bằng bộ kít PED-Ag test kít
Hình 3.5 Đọc kết quả: Mẫu âm tính, chỉ có vạch màu đỏ tím ở vị trí C (control);
Mẫu dương tính có vạch màu đỏ ở cả vị trí C và T (test) với kháng nguyên PEDV
6 Thờm 700 àl Wash Buffer 1 vào cột Spin Column Ly tõm trong 1 phút ở 6.000 vòng/phút Thay tube 2 ml mới
7 Thờm 500 àl Wash Buffer 2 vào cột Spin Column Ly tõm trong 1 phút ở 6.000 vòng/phút Thay tube 2 ml mới
8 Lặp lại bước 7 thêm 1 lần
9 Ly tâm cột trong 3 phút ở 16.000 vòng/phút Loại bỏ tube chứa dịch lọc
10 Cho cột Spin Column vào tube 1,5 ml mới Thờm 50 àl dung dịch Eluent (đã ủ ở 56°C) vào giữa cột Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút Ly tâm trong 1 phút ở 13.000 vòng/phút Loại bỏ cột Bảo quản nucleic acid ở -20°C hay - 70°C
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng Reverse RNA thành cDNA:
Thành phần Thể tớch (àl)
Tổng thể tích 20 Ủ hỗn hợp phản ứng ở 25°C trong 5 phút, 42°C trong 60 phút Bất hoạt phản ứng ở 70°C trong 5 phút
Bảng 3.4 Trình tự Primer (Li et al., 2016)
Tên primer Trình tự (5’ – 3’) Kích thước sản phẩm
PED-F GGG CGC CTG TAT AGA GTT TA
PED-R AGA CCA CCA AGA ATG TGT CC
Bảng 3.5 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tớch (àl)
Bảng 3.6 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR (Li et al., 2016)
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra kèm với thang DNA 100 bp (Enzynomics) trên gel agarose 1%, ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút
3.2.3 Nội dung 3: Khảo sát tần suất xuất hiện các biểu hiện bệnh lý của bệnh PED
Khảo sát được thực hiện bằng phương pháp điều tra cắt ngang tại các hộ chăn nuôi heo đang xảy ra dịch bệnh tiêu chảy cấp tính, giúp xác định mức độ ảnh hưởng và đặc điểm của bệnh Heo có triệu chứng tiêu chảy cấp được ghi nhận qua các triệu chứng lâm sàng, hình ảnh chụp, khám bệnh tích đại thể, đồng thời mẫu bệnh phẩm được lấy để xét nghiệm xác định sự hiện diện của PEDV bằng phương pháp RT-PCR và làm tiêu bản vi thể Trong quá trình phân tích, chúng tôi tập trung vào những heo có kết quả xét nghiệm dương tính với PEDV theo test nhanh và được xác nhận bằng phương pháp RT-PCR để đảm bảo độ chính xác của kết quả chẩn đoán.
Các chỉ tiêu theo dõi
- Theo cơ sở chăn nuôi
Số cơ sở có heo nái có kháng thể kháng PEDV
Tổng số cơ sở thu thập mẫu
- Theo từng cá thể nái, theo từng địa phương, lứa đẻ, qui mô trại
Số mẫu huyết thanh có kháng thể kháng PEDV
Tổng số mẫu huyết thanh xét nghiệm
OD S - M OD N S/P RATIO M OD P - M OD N
ODs: Giá trị OD của mẫu
M OD N : Trung bình giá trị OD của đối chứng âm
M ODP: Trung bình giá trị OD của đối chứng dương
Phân tích các yếu tố nguy cơ
Các yếu tố liên quan đến bệnh PED gồm có chợ có mua bán động vật, lò giết mổ gia súc, đường giao thông chính, việc tiêu độc sát trùng chuồng trại, nguồn nước sử dụng trong chăn nuôi, nhập con giống từ bên ngoài và các hộ chăn nuôi liền kề Đánh giá mức độ rủi ro của từng yếu tố được dựa trên khả năng mắc bệnh và tính toán yếu tố nguy cơ OR (odds ratio) theo công thức phù hợp, trong đó P₁ là xác suất mắc bệnh của nhóm tiếp xúc với yếu tố nguy cơ.
1- P 1 : Xác suất không mắc bệnh của nhóm phơi nhiễm với yếu tố nguy cơ
P 2 : Xác suất mắc bệnh của nhóm không phơi nhiễm với yếu tố nguy cơ
1- P 2 : Xác suất không mắc bệnh của nhóm không phơi nhiễm với yếu tố nguy cơ
Khảo sát tỷ lệ bệnh do PEDV trên heo tiêu chảy
Số heo tiêu chảy do PEDV
Tỷ lệ bệnh do nhiễm PEDV = x 100 Tổng số heo tiêu chảy khảo sát
Khảo sát tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết trên các đàn heo dương tính PEDV
Số heo tiêu chảy dương tính với PEDV
Tỷ lệ nhiễm PEDV = x 100 Tổng số heo trong đàn có heo dương tính với PEDV
Số heo chết do PEDV
Tỷ lệ chết PEDV = x 100 Tổng số heo bệnh dương tính với PEDV
Khảo sát tần suất xuất hiện triệu chứng, bệnh tích
Số con có biểu hiện Tần suất xuất hiện triệu chứng, bệnh tích = x 100 Tổng số con khảo sát
Phân tích tương đồng gene
Phân tích và so sánh tương đồng các trình tự gene bằng phần mềm Bioedit 7.2.6 (Hall, 1999)
Xây dựng cây phả hệ theo phương pháp Maximum likelihood bằng phần mềm MEGA 6.06 (Tamura et al., 2013) Chỉ số bootstrap đƣợc tính toán dựa trên 1000 lần lặp lại.
Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu thô được xử lý và tính toán đơn giản trên Excel, trong khi dữ liệu tổng hợp được phân tích bằng phần mềm thống kê Minitab 16.0 Phương pháp thống kê bao gồm xét chi bình phương (χ²) để xác định tỷ lệ nhiễm PED trên nái theo địa phương, quy mô đàn nái, lứa đẻ, tỷ lệ nhiễm PEDV, tỷ lệ bệnh và tử vong do PEDV, cùng các yếu tố nguy cơ liên quan Ngoài ra, phân tích phương pháp một chiều Anova (Analysis of Variance) cũng được sử dụng để so sánh tỷ số S/P nhằm đánh giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau trong nghiên cứu.