Melamine đi vào chuỗi thực phẩm và độc tính của nó (Melamine/Cyanuric Acid) docx

Melamine đi vào chuỗi thực phẩm và độc tính của nó Melamine/Cyanuric Acid PGS.TS.. Sự nhiễm melamine đầu tiên vào thức ăn thú kiểng, tiếp theo là vào thức ăn chăn nuôi, gần đây vào s

Melamine đi vào chuỗi thực phẩm và độc tính của nó

(Melamine/Cyanuric Acid)

PGS.TS Dương Thanh Liêm

Bộ môn Dinh dưỡng Khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm

Bản chất hóa học và mục

tiêu sử dụng của melanine

Bản chất hóa học:

• Melamine (1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) là một base hữu cơ

• Melamine có chứa 66% nitrogen; Urea chứa 46% Nitrogen; Protein chứa 16% Nitrogen.

Mục tiêu sử dụng:

• Melamine được sử dụng để sản xuất ra melamine resin

(polymer công nghiệp).

• Sản xuất keo dán gổ trong công nghiệp

• Sản xuất dụng cụ gia đình (cốc, kính mica, Ca nhựa…)

• Làm chất chậm cháy

• Dùng làm phân bón ở một số nước Đông Nam Á.

N N

N

NH 2

N

Các dẫn xuất của Melamine

► Acid cyanuric

1,3,5-triazine-2,4,6-triol

Acid cyanuric cũng là hóa chất được sản xuất với số lượng lớn

● Sản xuất thuốc diệt cỏ

● Sản xuất thuốc nhuộm

● Sản xuất chất dẽo

● Là chất chống khuẩn

● Là chất ổn định và tẩy uế nước trong các bể bơi

N N N OH

O

NH

N H

N H

O

O O

Mục tiêu sử dụng của acid cyanuric:

Vì sao melamine lại đi vào

chuỗi thực phẩm?

Con đường thứ nhất - Do ô nhiễm môi trường:

Sử dụng dụng cụ có liên quan với chất dẽo để chế biến hoặc

chứa đựng thực phẩm trong các hoàn cảnh nhiệt độ và pH khác nhau, có thể melamine từ dụng cụ đó đi vào thực phẩm, hoặc vào trong nước, rồi từ nước đi vào thực phẩm, với số lượng như là một vi chất.

Con đường thứ hai - Do cố tình, gian lận:

Đưa 1% melamine vào trong thực phẩm thì làm tăng lên 4,13% protein thô Việc kiểm tra hàm lượng protein trong thực phẩm, chỉ kiểm tra protein thô, nên những nhà sản xuất gian lận lợi dụng

điều này để làm mau đầy két tiền nhà mình và gây ra những cái chết đáng thương của một số trẻ thơ và hàng chục ngàn trẻ em Trung Quốc phải nhập viện để điều trị Đây mới là con đường

chính thống mà melamine đã đi vào chuỗi thực phẩm gây ngộ

độc cho thú kiểng và người trên phạm vi Thế giới.

Mùa xuân 2007

● Đã gây chết nhiều mèo, chó với triệu chứng giống nhau, tất cả đều có sỏi hữu cơ trong thận Ước tính có 1950 con mèo và 2200 con chó

●Từ cái chết thú kiểng, người ta đã thu hồi tiêu hủy thức ăn bị nhiểm độc mua bán trên thị trường Quốc tế.

●Từ sự kiện này FDA bắt đầu nghiên cứu trên phạm vi rộng lớn, để đáp trả lại sự kiện nghiêm trọng này trong lịch sử

Câu trả lời là từ sự nhiễm độc “gluten lúa mì” và “protein gạo”

do người ta đưa thêm melamine (melamine, cyanuric acid,

ammeline, ammelide ) để tăng hàm lượng đạm thô trong thức ăn

► Sự bùng nổ ngộ độc melamine trong

thức ăn thú kiểng trên thế giới

► Nghiên cứu mô bệnh học trên thận mèo.

Những tinh thể

Melamine cyanurate trong thận (Xác định bởi kính hiển vi FTIR)

Thương tổn trên ống lượn gầncủa thận

Ngộ độc thận cấp tính với những tinh thể sỏi hữu cơ cyanurate được lập lại thí nghiệm trên các loài động vật khi cho chúng ăn melamine và acid cyanuric:

melamine-● Mèo melamine-● Chó melamine-● Heo melamine-● Chuột

Tất cả đều có triệu chứng và cơ chế gây độc giống nhau.

Hạt sỏi hữu cơ hình thành trong thận trẻ nhiễm độc chất Melamine

Hạt sỏi melamine-cyanurate

Nguồn tài liệu: http://en.wikipedia.org/wiki/Crystal

► Độc học của melamine và acid cyanuric

Có rất nhiều nghiên cứu, cho thấy độc tính từng chất

riêng lẻ rất thấp, với liều LD50 khảo sát được như sau:

LD50 qua miệng, trên chuột trắng = 3.161 mg/kg LD50 qua miệng, chuột = 3.296 mg/kg

LD50 qua da, trên thỏ > 1.000 mg/kg

Với acid cyanuric

LD50 qua miệng, chuột trắng > 10.000 mg/kg LD50 qua da, thỏ > 7.940 mg/kg

Mức gây độc của từng chất riêng lẻ rất cao, có thể

Với Melamine

Vì sao Melamine, acid cyanuric được hấp thu trong ống tiêu hóa

lại gây độc hại cho cơ thể ở thận?

Vào cơ thể

phân bố

khắp nơi

Tạo ra melamine- cyanurate kết tủa ở thận

► Độc tính của Melamine + acid cyanuric

Khả năng hòa tan trong nước:

Ameline Melamine

Amelide

Acid cyanuric

Sự chuyển hóa melamine bởi vi khuẩn

Melamine cyanurate

Phản ứng tạo polymer không tan giữa melamine

(màu xanh) và acid cyanuric (màu đỏ)

Sự nhiễm melamine đầu tiên vào thức ăn thú kiểng, tiếp theo là vào thức ăn chăn nuôi, gần đây vào sữa bột cho người ở Trung Quốc Các loài động vật ăn thức ăn nhiễm melamine đều có hại cho sức khỏe của chúng:

● Gia cầm

● Heo

● Các loài thủy sản nuôi trồng

rồi “tuôn vào” chuổi thực phẩm của người

Đánh giá nguy cơ của FDA

► Sự ô nhiễm melamine vào chuổi

thực phẩm của người

●

Những hiểu biết đến nay về độc tính của melamine chưa

đầy đủ lắm, cần phải làm sáng tỏ trong những đánh giá

được cập nhật tiếp theo trong tương lai

● Sự nhiễm vào thực phẩm / thức ăn chăn nuôi

Nhiều tài liệu ghi nhận có sự bùng nổ ngộ độc hư thận

(nephrotoxicity) trên thú kiểng ở châu Á năm 2004

Cũng có những tài liệu ghi nhận có sự nhiễm melemine

trong bột cá và bột thịt ở Italy trong thời gian 1979-1987

●72% số mẫu kiểm tra dương tính, mức nhiễm trên 1.9% melamine

(theo trọng lượng)

Kiểm tra thức ăn công nghiệp của thú kiểng và người nhận thấy:

● Nhiễm melamine trong gluten nhưng không ghi trên nhãn

● Thức ăn cho những người ăn chay có chứa hàm lượng cao gluten

►Nguồn nhiễm tiềm ẩn vào thực phẩm

(melamine / acid cyanuric)

● Nguồn nhiễm khác

Một số polymer melamine ở mặt đáy dụng cụ nấu nướng có thể tách ra những phần melamine có ý nghĩa vào trong thực phẩm

● Từ dụng cụ này có thể làm tan khoảng 2.5 mg/100 cm2

khi nấu với thực phẩm có tính acid

Acid cyanuric là một bộ phận hợp thành của biuret được FDA

thừa nhận, đây lại là chất bổ sung NPN cho thú nhai lại (từ đây

có thể chuyển hóa đưa đên trên 30% acid cyanuric và triuret

Acid cyanuric là chất dùng làm ổn định và tẩy uế bễ bơi

● Mức khuyến cáo 100 ppm (có thể cao hơn trong các bễ bơi quản lý tồi)

● Nước bễ bơi có thể vào bụng ước tính khoảng 154 mL (với trẻ em khibơi trong bễ bơi) tương đương khoảng ~15.4 mg acid cyanuric

► Melamine/acid cyanuric

Nguồn nhiễm tiềm ẩn melamine trên người

Sữa bột nhiễm độc Melamine ở

Trung Quốc đã gây chết 6 em bé

và 300.000 em bé khác nhiễm độc

phải nhập viện

• Người ta cho melamine vào sữa bột để tăng lượng đạm của sữa Theo Tân Hoa xã cho biết, Tập đoàn

Trung Quốc, đã thu hồi hàng trăm ngàn tấn sản phẩm của họ, sau khi hàng trăm em bé bị sỏi thận

và một số em bị chết Các xét nghiệm của Sanlu cho thấy sữa của họ nhiễm melamine, một loại hóa chất được dùng trong công nghệ chất dẻo.

Các em bé bị trúng độc do sữa bột có chứa chất Melamine

Linked Video clip

Tình hình nhiểm độc melamine

ở Việt nam

Video clip

Ảnh hưởng của melamin trong thức ăn chăn nuôi đến tình trạng sức khỏe

vật nuôi

Nguồn tài liệu: Assoc.Prof Dr Jowaman Khajarern Department of Animal Science, Khon Kaen University

Trên gà thịt

Bàn chân nổi những hạt ké

Thận trương nở to ra

Có hạt sỏi tinh thể trong thận

Có sỏi kết tủa trong tinh hoàn

Tinh thể sỏi trong thận

Trên heo lớn

Sỏi kết tinh dưới bàn chân heo

Trên heo con

melamine-cyanurate

Trên thận heo

Thận bị tổn thương (bên phải) do các hạt sỏi gây ra

Hạt sỏi melamine-cyanurate

kết tủa trong thận

Hạt sỏi còn kết tinh trong

lớp mỡ ở thận heo

Ruột cá bị sưng lên, da lở loét

Trong ruộc cá da trơn (Catfish) có sỏi

Vẩy cá đội lên do sỏi melamine-cyanurate

Tinh thể melamine tạo nên các

đốm trên vỏ tôm.

Tổ chức gan thận sưng to trên tôm

Trong ống tiêu hóa của tôm viêm nổi lên các cục phồng to

Hạt sỏi kết tinh trong

ống tiêu hóa

Ống sinh dục của tôm cũng bị

sưng lên

Tinh thể melamine-cyanurate

trong ống sinh dục tôm

Tích tụ hạt sỏi ngày càng lớn

hơn trong ống tiêu hóa

Độc lực của melamine trên

động vật

• Liều gây chết 50% trên chuột qua miệng (LD50)

là 3.161 mg/kg (OECE, 2002)

• Thí nghiệm ảnh hưởng melamine trên động vật qua

miệng được thực hiện trên chó (in a dog study; OECD, 2002) cho thấy:

• Giảm tiêu thụ thức ăn

• Giảm trọng lượng

• có sỏi trong bàng quang

• Thương tổn thận, bàng quang

• Tỷ lệ sống rất thấp

Phát triển các phương pháp

kiểm tra melamine

Kiểm tra dưới kính hiển vi

Melamine trong gluten lúa mì

Mẫu kiểm tra nhiễm

melamine

Mẫu đối chứng không nhiễm

melamine

melamine

Solution C (Test kit C)

Test kit nầy chỉ sử dụng để xác định melamine

• Melamine = Phản ứng cho màu đỏ anh đào trong 1 phút.

Test sàn lọc melamine

Test chuẩn với 0.3% Solution C

Solution C cho phản ứng dương tính với melamine

Phát triển phương pháp kiểm tra melamine trong

thực phẩm bằng công cụ ELISA

Các bước thao tác kiểm tra melamine trong thức ăn Pet Food

www.romerlabes.com

Mỗi giếng chì cần đưa vào

150 µ l chất chuẩn hay mẫu

thử để gắn với kháng thể

là đủ tốt rồi

Đưa 50 µ l enzyme liên kết kháng thể và lắc nhẹ trong

1 phút.

Ủ trong 30 phút ở nhiệt độ

phòng để cho phản ứng.

Rửa nước cho trôi những chất không kết dính ra khỏi giếng, rửa kỹ khoảng

4 lần Rửa càng kỹ càng tốt.

Làm cho khô các giếng

trong mâm thử

Đưa vào giếng 100 µ l cơ chất cho phản ứng với

Cho dung dịch làm dừng

lọc có bước sóng 450 nm.

Link Video clip

Kiểm tra melamine trong sữa, trứng bằng phương pháp ELISA

http://www.dailymotion.com/gb/video/x78ftz_more-toxic-eggs_news?from=rss

AgraQuant® Melamine Sensitive ELISA Test Kit

The AgraQuant® Melamine Sensitive Test Kit do phòng thí nghiệm Romer Labs® là phương pháp cho kháng thể liên kết với enzyme EIA

(enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Nó được nghiên cứu phát triển đặc biệt cho việc phân tích melamine trong sản phẩm sữa

như: sữa, nước uống yogurt và sữa bột

AgraQuant® Melamine Sensitive Test Kit có thể định lượng được với mức biến động từ 0.10 - 5.00 mg/kg cho sữa, nước uống yogurt và 0.50-25 mg/kg cho sữa bột Mỗi một kit có đầy đủ với chất chuẩn melamine,

giếng được bọc kháng thể; kháng thể được kết hợp với enzyme, cơ

chất và chất làm dừng (stop solution), v.v

AgraQuant® Melamine Sensitive Kit khá chính xác Có thể thực hiện

phương pháp thử lập lại; kết quả 2 lần thử phù hợp nhau có thể quan sát được AgraQuant® Melamine Sensitive Kit thực hiện kiểm tra

nhanh, cần có thời gian ủ ấm trong 50 phút Chiết xuất mẫu đơn giản và không yêu cầu những bước làm sạch mẫu cao độ; thực hiện test thử mẫu dễ dàng Một mâm gồm có 96 giếng thử nhỏ, tiêu hao hóa chất, nước rửa và thuốc thử ít, giá thành mẫu thử thấp

Link Video clips

Sự phối hợp giữa kiểm tra sàn

lọc và kiểm tra sâu sắc

Kiểm tra sàn lọc:

Kiểm tra sàn lọc: Sử dụng phương pháp ELISA

(chọn lựa EIA test kit) có bán trên thị trường Thế giới Ưu điểm của phương pháp:

- Thực hiện nhanh (Âm tính là không có, dương tính có thể có, có thể không)

- Độ phát hiện nhạy với hàm lượng pbb (định lượng không chính xác)

Kiểm tra sâu:

Kiểm tra sâu: Sử dụng phương pháp sắc ký khối

phổ Nếu có kinh nghiệm thì chính xác, thiết bị đắt tiền, giá thành kiểm tra mẫu cao.

Phương pháp phân tích melamine được đề nghị chính thức bởi EC trong các nước thành viên để kiểm tra nguồn thức ăn giàu protein

Diagram sắc ký với các dẫn xuất hóa học của Melamine

Bộ Y tế VN qui định ngưỡng melamine

nhiễm chéo trong thực phẩm

Ngày 12/12, Bộ Y tế đã ban hành quyết định số

38/2008/QĐ-BYT về “Quy định mức giới hạn tối đa của melamin nhiễm chéo trong thực phẩm” Bộ Y tế

đã chấp nhận ngưỡng melamine trong thực phẩm dành cho trẻ em dưới 36 tháng tuổi không vượt quá 1mg/kg thực phẩm; các loại thực phẩm khác không vượt quá 2,5mg/kg thực phẩm.

Giới hạn này sẽ được thay đổi khi có cơ sở khoa học

về độc tính của melamine và các chất liên quan

được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Tổ chức Nông lương Liên hiệp quốc (FAO) công bố bổ sung Hiện tại WHO qui định mức nhiễm tối đa cho phép 0,2

mg/kg thể trọng.

► Chìa khóa cho những nghiên cứu bổ

sung thêm để đánh giá về độc tính

của melamine / acid cyanuric

Cần phải có sự kết hợp trong những nghiên cứu tiếp

theo với các vấn đề sau đây:

● Nghiên cứu để hiểu biết tốt hơn tác dụng về hóa học của melamine;

●Đánh giá độc tính khi phối hợp melamine và acid cyanuric

trên các loài động vật khác nhau;

● Xác định sự xuất hiện những biomarker khi có biểu hiện những

thương tổn ở thận với melamine / acid cyanuric

● Nên có những nghiên cứu ảnh hưởng lâu dài của melamine/acid

► Điều chỉnh cho thích hợp hơn những phương pháp hiện hành để sử dụng cho xét nghiệm những mẫu máu và nước tiểu khi nhiễm độc melamine.

► Xác định liều xác đáng trong nghiên cứu động học độc tố của melamine

► Xác định biên độ của liều cho những nghiên cứu NOAEL*

(3♂, 3♀; 400, 100, 25, 5, và 0 mg/kg; 28 ngày)

► Những công việc cần làm:

Phase 1- Phát triển phương pháp phân tích (LC-MS) và tìm phép đo thích hợp trên chuột khi nhiễm độc melamine:

* NOAEL (No observable adverse effect level)

► Cung cấp riêng lẻ từng chất một;

► Cung cấp đồng thời cùng lúc melamine và acid cyanuric;

► Cung cấp đồng thời cùng lúc cho những hợp chất tiền cấu tạo

(pre-formed) của melamine cyanurate;

► Cung cấp theo thời gian so le của 2 chất melamine và acid cyanuric

Xác định NOAEL* khi xử lý kết hợp đưa melamine và acid cyanuric trên chuột trong 28 và 90 ngày để kiểm tra thời điểm trước khi hư thận và

sự đáp ứng nhiểm độc tạo sỏi trong thận như thế nào

(12 ♂, 12 ♀; 4 mức liều + đối chứng)

Phase 2- Nghiên cứu tác dụng hóa học trên chuột để

tìm hiểu sự hấp thu, phân bố melamine và acid cyanuric

khi cung cấp cho chuột thí nghiệm:

Phase 3- Xác định NOAEL trên mô hình chuột thử nghiệm

Phase 4 - Tìm hiểu những Biomarker sinh ra do sự cố ở thận làm thay đổi trao đổi chất protein Phát hiện sớm những biomarker do những rối loạn

bởi melamine + cyanuric gây tổn thương thận, có thể đo lường qua nước tiểu.

► Homovanillic acid sulfate

► 4-Hydroxyproline

► α- GST (α-glutathione S-transferase)*

► μ-GST (μ-glutathione S-transferase) *

► RPA-1 (Replication protein A1)*

► Clusterin (inhibits apoptosis)*

► Urine metabonomic profiling by 1H NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance)

undergoing evaluation by the FDA

•Human nephrotoxicity biomarkers currently

Phase 5- Xác định NOAEL* và nghiên cứu tác dụng hóa học

Cho “heo mini” ăn để xác định NOAEL* khi kết hợp melamine và

acid cyanuric trong mô hình thí nghiệm trên heo

Thí nghiệm này nhằm để suy ra trên người Như vậy có thể kết luận

cho đánh giá nguy cơ của melamine và acid cyanuric trên người

Phase 6- Những nghiên cứu tiếp theo

Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu đã đạt được, tiếp tục nghiên

cứu cận lâm sàng, ngộ độc mãn tính và những biểu hiện của nó khi

nhiễm melamine và acid cyanuric ở mức thấp