TIỂU LUẬN môn hóa SINH THỰC PHẨM đề tài các kỹ THUẬT hóa SINH

Trong hỗn hợp các chấtphân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khảnăng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển vớitố

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

TIỂU LUẬN MÔN: HÓA SINH THỰC PHẨM

Đề tài:

CÁC KỸ THUẬT HÓA SINH

HỌC VIÊN: Cao Hồ Kim Ngân

Mã học viên: 2070083

GVHD: TS Võ Đình Lệ Tâm

Tháng 12 /2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

TIỂU LUẬN MÔN: HÓA SINH THỰC PHẨM

Đề tài:

CÁC KỸ THUẬT HÓA SINH

Tháng 12 /2020

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH i

CHƯƠNG I: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY – HPLC) 1

1.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng 1

1.2 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 1

1.2.1 Pha động trong sắc ký lỏng 1

1.2.2 Bộ phận khử khí (degasser) 2

1.2.3 Bơm (pump) 2

1.2.4 Injector, Autosampler 2

1.2.5 Cột sắc ký 2

1.2.6 Đầu dò (detector) 3

1.2.7 Bộ xử lý dữ liệu 4

1.2.8 Dung môi thải 4

1.2.9 Dây nối 4

1.2.10 Thiết kế gradients 4

1.3 Phân tích bằng HPLC 6

1.3.1 Phân tích định tính 6

1.3.2 Phân tích định lượng 7

1.3.3 Phương pháp nội chuẩn 7

1.4 Chuẩn bị mẫu 7

1.4.1 Chiết lỏng - lỏng 8

1.4.2 Chiết pha rắn 8

1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp 8

1.5.1 Ưu điểm 9

1.5.2 Nhược điểm 9

1.6 Sự cố và xử lý 9

1.6.1 Đường nền bị nhiễu 9

1.6.2 Trôi đường nền cơ sở 10

1.6.3 Hình dạng đỉnh kém 10

CHƯƠNG 2: POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 11

2.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR 11

2.1.1 Giai đoạn biến tính 11

2.1.2 Giai đoạn lai ghép 12

2.1.3 Giai đoạn kéo dài 12

2.2 Thành phần chủ yếu của phương pháp PCR 14

2.2.1 Đoạn mồi (primers) 14

2.2.2 DNA polymerase (Taq polymerase) 14

2.2.3 Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) 14

2.2.4 DNA đích từ mẫu 15

2.2.5 Dung dịch đệm 15

2.2.6 Magie clorua (MgCl2) 15

2.3 Phát hiện và phân tích sản phẩm PCR 15

2.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp 15

2.4.1 Ưu điểm 15

2.4.2 Nhược điểm 16

2.5 Sự cố và xử lý sự cố 16

2.5.1 Không khuếch đại DNA 16

2.5.2 Sản phẩm không đặc hiệu 17

CHƯƠNG 3: ENZYMEE-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 17

3.1 Nguyên tắc chung của ELISA 17

3.2 Các loại ELISA 18

3.2.1 ELISA trực tiếp 18

3.2.2 ELISA cạnh tranh 19

3.2.3 ELISA gián tiếp 20

3.2.4 ELISA cạnh tranh gián tiếp 21

3.2.5 Sandwish ELISA 22

3.4 Quy trình thực hiện kiểm tra mẫu bằng bộ kit ELISA 24

3.4.1 Chuẩn bị chất chuẩn 24

3.4.2 Chuẩn bị dung dịch rửa 24

3.4.3 Các bước phân tích 24

3.4.4 Giai đoạn đọc kết quả 25

3.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp ELISA 26

3.5.1 Ưu điểm 26

3.5.2 Nhược điểm 26

CHƯƠNG 4: PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) 26

4.1 Nguyên tắc 26

4.2 Thiết bị và quy trình thực hiện 27

4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp 28

4.3.2 Cường độ trường 30

4.3.3 Định hướng lại góc 30

4.3.4 Nồng độ agarose trong gel 31

4.3.5 Thành phần và nhiệt độ của đệm điện di 31

4.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp 31

4.4.1 Ưu điểm 31

4.4.2 Nhược điểm 31

CHƯƠNG 5: SẮC KÝ KHÍ (GC) 32

5.1 Nguyên tắc của sắc ký khí 32

5.2 Chọn điều kiện chạy sắc ký 34

5.2.1 Cột 34

5.2.2 Lựa chọn khí mang 34

5.2.3 Tối ưu hóa chương trình nhiệt độ lò cột 35

5.2.4 Tối ưu hóa loại đầu phun, nhiệt độ và thể tích tiêm 35

5.2.5 Lựa chọn pha tĩnh 36

5.2.6 Tối ưu hóa đầu dò và nhiệt độ đầu dò 36

5.3 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu 37

5.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp 37

5.4.1 Ưu điểm 37

5.4.2 Nhược điểm 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao 3

Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 5

Hình 1.3 Sắc ký đồ của mẫu chạy đẳng dòng 5

Hình 1.4 So sánh hai giản đồ của sự phân tách bằng chế độ đẳng dòng (trái) và gradient (phải) 6

Hình 1.5 Quy trình chiết pha rắn 8

Hình 2.1 Giai đoạn biến tính DNA mẫu 12

Hình 2.2 Giai đoạn lai 12

Hình 2.3 Giai đoạn kéo dài 13

Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp các bước của phương pháp PCR 14

Hình 3.1 Nguyên lý hoạt động của phương pháp ELISA 18

Hình 3.2 ELISA trực tiếp để phát hiện kháng nguyên (a) và kháng thể (b) 18

Hình 3.3 ELISA cạnh tranh để phát hiện kháng nguyên (a) và kháng thể (b) 19

Hình 3.4 ELISA gián tiếp để phân tích kháng thể 21

Hình 3.5 ELISA cạnh tranh gián tiếp để phát hiện kháng nguyên 22

Hình 3.6 Sandwich ELISA để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu 23

Hình 3.7 Máy rửa (a), đầu đọc kết quả (b) và máy in (c) được sử dụng trong quy trình ELISA 25

Hình 4.1 Sơ đồ thể hiện cơ chế phân đoạn DNA trong quá trình điện di trên gel trường xung 27

Hình 4.2 Giản đồ thể hiện hình dạng điện cực trong các dụng cụ thường dùng cho điện di gel trường xung 28

Hình 4.3 Ví dụ về phân đoạn và xác định kích thước của DNA nhiễm sắc thể bằng điện di trên gel trường xung với đoạn dốc thời gian xung 29

Hình 5.1 Sơ đồ của hệ thống sắc ký khí 33

CHƯƠNG I: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HIGH

PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY – HPLC)

1.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng (Meyer, 2005)

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặcchất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng - lỏng) Mẫu phân tíchđược chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chấtphân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chấtphân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khảnăng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển vớitốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

1.2 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (Meyer, 2005)

Nên mua dung môi có chuyên dụng cho máy HPLC Ngay cả nước, một thànhphần phổ biến của chất rửa giải, phải đạt cấp HPLC nếu phòng thí nghiệm không đượctrang bị hệ thống lọc nước tạo ra nước siêu tinh khiết Các chất phụ gia cũng phảitương thích với máy dò

Pha động có thể chia làm 2 loại:

- Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên đểphân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực Pha động loạinày được dùng trong sắc ký pha ngược

- Pha động có độ phân cực thấp: là các dung môi ít phân cực như cyclopentan,n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS ), CCl4, toluene…2

Để tách một nhóm chất thông thường pha động một thành phần đôi khi khôngđáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có

được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thayđổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi làgradient pha động.

1.2.3 Bơm (pump)

Quá trình phân tách HPLC được thực hiện ở áp suất 50–300 bar (0,5–3 × 10 Pa).7Tốc độ dòng chảy thường nằm trong khoảng từ 0,5 đến 2 ml/phút (hoặc trongkhoảng 0,1 ml /phút nếu sử dụng cột có lỗ hẹp)

Máy bơm phải cung cấp dòng pha động chính xác ở bất kỳ tốc độ dòng nào màkhông có xung nhịp, bất kể độ nhớt của dung môi và áp suất ngược của cột

Tiêm mẫu thủ công cũng là một lựa chọn nếu không có đủ mẫu Thay vì các lọ,cũng có thể tiêm trực tiếp từ các đĩa giếng nếu sử dụng giá đỡ thích hợp

1.2.5 Cột sắc ký

Cột là phần quan trọng nhất của máy sắc ký vì sự phân tách diễn ra ở đây Nó làmột ống thép không gỉ có đường kính trong 2 – 4,6 mm và chiều dài 5–30 cm

Cột được nhồi các hạt có cở đường kính 3, 4, 5, 10 µm Chất nhồi trong cộtthường là silicagen hoặc silicagen có bọc hoặc gắn hóa học một màng mỏng chất hữu

cơ Bên cạnh silicagen người ta còn dùng Al2O3, hạt polime xốp, hạt chất trao đổi ion.Các cột vi mô có đường kính trong nhỏ hơn 1 mm cũng có sẵn và chỉ nên được

sử dụng với các thiết bị HPLC vi mô được thiết kế đặc biệt Cột được lắp đặt giữa vankim phun và đầu báo

Hình 1.1 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hầu hết các cột đều không có hướng dòng chảy định trước nhưng một khi cột đãđược sử dụng, dòng chảy không được đảo ngược

Tiền cột là bộ phận được gắn giữa kim phun và cột để bảo vệ cột khỏi bụi bẩnhoặc các chất gây tắc nghẽn Tiền cột khá rẻ và được thay thế khi cần thiết

Đối với nhiều sự phân tách, cần phải kiểm soát nhiệt độ cột hoặc làm việc ở nhiệt

độ cao Do đó, lò cột là một phần tiêu chuẩn của nhiều thiết bị HPLC, nhưng chúngcũng có thể được lắp đặt sau

1.2.6 Đầu dò (detector)

Trong HPLC, mẫu được bơm vào một đầu của cột và các peak đã tách được rửagiải ở đầu kia Do nồng độ thấp và dải rửa giải hẹp nên cần một thiết bị có độ tinh vicao để phát hiện chúng

Một số máy dò đo đặc tính phần lớn của chất rửa giải như chiết suất hoặc độ dẫnđiện Tuy nhiên, hầu hết các máy dò được xây dựng để phát hiện các hợp chất có cácđặc tính nhất định Một số đầu dò thông dụng là UV/VIS, huỳnh quang, chỉ số khúc

xạ, độ dẫn điện, điện hóa, tán xạ ánh sáng bay hơi (đối với các hợp chất không bayhơi) hoặc máy dò phân cực

Ngoài ra, có thể ghép nối trực tuyến HPLC với phổ khối phổ MS hoặc phổ cộnghưởng từ hạt nhân NMR Máy dò biến đổi hiện tượng quan sát được thành tín hiệuđiện, thường là điện áp.

1.2.7 Bộ xử lý dữ liệu

Các tín hiệu của máy dò được trình bày trên màn hình hoặc giấy dưới dạng đồ thịcủa cường độ so với thời gian Những sắc ký đồ này cung cấp thông tin định tính (cócác peak rửa giải không, chúng xuất hiện tại thời điểm nào?) Và cả thông tin địnhlượng (kích thước của các pic là bao nhiêu?)

Việc xác định và tính toán kích thước pic cần thiết thường được thực hiện bằngmáy tính, nó cũng được sử dụng để điều khiển toàn bộ thiết bị HPLC

1.2.8 Dung môi thải

Một nhược điểm của HPLC là đắt tiền và trong một số trường hợp phải sử dụngcác dung môi độc hại hoặc có hại cho môi trường Cách tốt nhất để giữ cho khối lượngdung dịch rửa giải mới và cả lượng dung môi thải ở mức thấp là sử dụng các cột cóđường kính bên trong nhỏ, ví dụ: 3, 2 hoặc 1 mm thay vì các cột 4,6 mm thường được

sử dụng

1.2.9 Dây nối

Các bộ phận khác nhau của máy sắc ký được nối với các ống mao dẫn có đườngkính trong 0,25 hoặc 0,18 mm và các phụ kiện thích hợp Chúng được làm từ thépkhông gỉ hoặc nhựa chịu hóa chất Không phải tất cả các vật liệu đều tương thích vớitất cả các pha động có thể có, và nhựa có giới hạn áp suất trên nhất định tùy thuộc vàothành phần hóa học, độ dày thành và pha động được sử dụng

1.2.10 Thiết kế gradients

Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

Hình 1.2 cho thấy chỉ có một bình chứa dung môi, do đó chế độ chạy này gọi là

sự phân tách đẳng dòng Trong chế độ này, thành phần của pha động không đổi trongtoàn bộ thời gian của sắc ký đồ Đỉnh càng muộn thì hình dạng của nó càng rộng và ítcao hơn

Hình 1.3 Sắc ký đồ của mẫu chạy đẳng dòng

Việc tách trong hình 1.3 được thực hiện bằng cách sử dụng chế độ chạy đẳngdòng Số lượng các hợp chất có thể được tách ra bị hạn chế

Đối với các hỗn hợp phức tạp, cần phải làm việc ở chế độ được gọi là chế độgradient nơi thành phần của dung dịch rửa giải bị thay đổi trong quá trình phân tách.Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng hai (hoặc nhiều) máy bơm, mộtmáy bơm cho mọi dung môi được sử dụng và một bộ phận trộn, đây là thiết kếgradient áp suất cao Một giải pháp thay thế rẻ hơn là sử dụng một máy bơm duy nhất

và thay đổi các tỷ lệ cần thiết của các dung môi khác nhau bằng van chuyển mạch điềukhiển bằng máy tính, đây là thiết kế gradient áp suất thấp

Với gradient, thời gian tách có thể kéo dài đến một giờ và có thể phân tích cáchỗn hợp rất phức tạp Các hợp chất có thể có các đặc tính tương tự hoặc khác nhaumạnh Không có sự mở rộng đỉnh cao đáng chú ý theo thời gian

Hình 1.4 So sánh hai giản đồ của sự phân tách bằng chế độ đẳng dòng (trái) và

UV, MS và NMR cho phép làm sáng tỏ cấu trúc ngay lập tức

Trong nhiều trường hợp, bản chất của các chất phân tích được biết đến và chúng

có thể được xác định bằng cách tiêm chất chuẩn Sự đồng nhất chỉ được chứng minh

nếu chất chuẩn và hợp chất chưa biết có thời gian lưu giống hệt nhau trong nhiều hệthống phân tách, tốt nhất là có các ký tự khác nhau như pha bình thường và pha đảongược hoặc pha đảo ngược và trao đổi ion.

1.3.2 Phân tích định lượng

Có thể sử dụng diện tích peak hoặc chiều cao peak để định lượng

Mối quan hệ giữa lượng chất phân tích được bơm vào và kích thước peak chỉ cóthể được mô tả bằng hệ số đáp ứng thực nghiệm, do đó cần phải thực hiện phân táchhiệu chuẩn với lượng hoặc nồng độ đã biết của chất phân tích nếu cần định lượng Nếu peak của chất phân tích được phân giải tốt khỏi các peak lân cận thì có thể

sử dụng hợp chất chuẩn tinh khiết Nếu không, tốt hơn là sử dụng chất đối chiếu hỗnhợp với một lượng chất phân tích đã biết hoặc để hòa tan hợp chất đối chiếu trong hỗnhợp nhân tạo Cách tiếp cận này cho phép hiệu chuẩn trong các điều kiện thực tế Đường chuẩn theo thể tích có 5–8 điểm tham chiếu với nồng độ khác nhau, nồng

độ chất phân tích dự kiến của mẫu phải nằm ở giữa dải hiệu chuẩn

1.3.3 Phương pháp nội chuẩn

Đối với nhiều phép phân tích định lượng, nên làm việc với chất nội chuẩn Đây làmột hợp chất có độ tương đồng hóa học cao với các chất phân tích được quan tâm, ví

dụ như đồng phân Do đó, nó sẽ hoạt động tương tự trong quá trình chuẩn bị mẫu vàsắc ký

Ban đầu, chất nội chuẩn được thêm vào cả mẫu thử và mẫu tham chiếu với lượnggiống hệt nhau Từ tỷ lệ khối lượng hoặc nồng độ đã biết của chất nội chuẩn và chấtphân tích trong mẫu chuẩn, có thể tính được lượng "thực" của chất phân tích trongmẫu bằng cách so sánh với tỷ lệ kích thước peak

Sự mất mát của chất phân tích trong quá trình chuẩn bị mẫu hoặc các vấn đề vềtiêm mẫu có thể được bù đắp ở mức độ cao với phương pháp này

1.4 Chuẩn bị mẫu (Meyer, 2005)

Nhiều chế phẩm thuốc chứa các chất phân tích ở nồng độ khá cao và ở dạng hỗnhợp tương đối đơn giản

Với các mẫu có nguồn gốc sinh học, tình hình hoàn toàn khác Máu, nước tiểuhoặc các mô đại diện cho một lượng lớn các hợp chất, nhiều trong số chúng ở nồng độrất thấp Để tìm và thậm chí định lượng một chất phân tích nào đó không đơn giảnchút nào, và các bước chuẩn bị mẫu phức tạp là cần thiết để phân lập và cô đặc

Hơn nữa, hầu hết các quy trình HPLC không cho phép tiêm trực tiếp dịch cơ thểchưa được xử lý do có thể nhiễm bẩn hoặc tắc nghẽn cột nhanh chóng Theo nguyêntắc chung, khi kết thúc quá trình chuẩn bị mẫu, các chất phân tích quan tâm phải đượchòa tan trong pha động được sử dụng để tách HPLC, có thể có ngoại lệ nhưng theo yêucầu tối thiểu là dung dịch mẫu phải hòa tan dễ dàng trong pha động.

- Lắc đều và để yên để hỗn hợp tách pha

+ Làm bay hơi dung môi hữu cơ

+ Sử dụng nước để chiết lại thành pha nước (chất phân tích hòa tan chất vàodung môi hữu cơ), lắc dung dịch với đệm bazo sau đó sử dụng sắc ký pha đảo hoặctrao đổi ion để tách

- Hòa tan chất cần phân tích vào dung môi pha động

1.4.2 Chiết pha rắn

Hình 1.5 Quy trình chiết pha rắn

Bước 1: Chuẩn bị cột chiết (pha tĩnh là chất rắn, thường là silicagel, pha động làhỗn hợp dung môi A)

Bước 2: Cho mẫu vào cột chiết

Bước 3: Các chất trong mẫu được hấp phụ vào cột

Bước 4: Rửa giải các tạp chất hoặc chất ảnh hưởng bằng dung môi B

Bước 5: Rửa giải chất phân tích bằng dung môi C

1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp (Meyer, 2005)

1.5.1 Ưu điểm

- Độ nhạy cao

- Khả năng định lượng tốt, độ chính xác cao

- Có khả năng định lượng đồng thời các chất có độ phân cực gần nhau

- Lượng mẫu phân tích nhỏ

1.5.2 Nhược điểm

- Thời gian làm sạch và ổn định cột sau các lần chạy lâu

- Thiết bị đắt tiền

- Hao tốn dung môi

- Cột dễ bị nghẹt nếu không xử lý mẫu kỹ

1.6 Sự cố và xử lý (Meyer, 2005)

1.6.1 Đường nền bị nhiễu

Bộ phận của máy HPLC hoạt động kém

- Thay thế khóa của bơm Làm sạch van một chiều của bơm hoặc thay thếchúng

- Kiểm tra tất cả các bộ phận xem có rò rỉ không

- Thay đèn UV hoặc đèn huỳnh quang sau khoảng thời gian được ghi trong sáchhướng dẫn

- Di chuyển thiết bị đến nơi không làm ảnh hưởng đến điện trường, gió lùa, daođộng nhiệt độ hoặc ánh nắng trực tiếp

Pha động không được hòa trộn đều

- Đối với phân tách đẳng dòng, nên chuẩn bị dung dịch rửa giải trong một chaiduy nhất thay vì trộn các thành phần trong thiết bị

- Ngay cả với phân tách gradient, đường nền bị nhiễu thấp hơn có thể đượcquan sát nếu pha động ban đầu (chẳng hạn như 80% nước với phụ gia /20% dung môihữu cơ) được trộn sẵn trong bình chứa A

- Bộ khử khí kém cũng ảnh hưởng Trong một số trường hợp, ví dụ: với pháthiện điện hóa, quy trình khử khí hai bước (helium cộng với chất khử khí màng) là cầnthiết

Dung môi và thuốc thử phải tương thích với đầu dò

- Để sử dụng với chất lượng tốt, không nên sử dụng thuốc thử có khả năngtương thích hoàn hảo với tia UV để phát hiện điện hóa và ngược lại

- Trong nhiều trường hợp, không sử dụng hệ pha mà detector có thể làm phátsinh các hiện tượng không mong muốn như các cực đại phụ hoặc cực đại âm (ví dụ,nếu cần phát hiện tia cực tím ở 210 nm hoặc thấp hơn)

Hằng số thời gian của máy dò quá thấp

- Chọn hằng số thời gian cao hơn trong lần tiếp theo (nhưng hãy cẩn thận vớihằng số thời gian quá cao có thể dẫn đến các đỉnh bị cắt)

1.6.2 Trôi đường nền cơ sở

Trôi đường cơ sở rất phổ biến với sự phân tách gradient Độ dốc của nó phụthuộc vào thành phần pha động và máy dò được sử dụng Thuốc thử và dung môi chấtlượng cao là yêu cầu bắt buộc, như đã đề cập ở trên Một số nguyên tắc phát hiện nhưphát hiện chỉ số khúc xạ không tương thích với gradient

Có thể quan sát thấy hiện tượng trôi khi dao động nhiệt độ, với sự thay đổi thànhphần của các pha động đã trộn sẵn (bay hơi, khử khí heli quá mạnh), với việc bơmkhông hoàn toàn hoặc thời gian cân bằng cột quá ngắn khi dung dịch rửa giải bị thayđổi

Trong nhiều trường hợp, hình dạng pic kém xuất phát từ nồng độ đệm quá thấp,

do làm việc với hệ thống không có bộ đệm mặc dù bộ đệm là cần thiết và do việc sửdụng hệ thống pha không thuận lợi

CHƯƠNG 2: POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

2.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR (K Kadri, 2019)

PCR là kỹ thuật tạo ra một lượng lớn chuỗi DNA từ một mẫu DNA ban đầu.Khuôn mẫu DNA có thể là bộ gen hoặc DNA thu được bằng cách phiên mãngược từ RNA hoặc có thể là DNA ty thể

Kỹ thuật này được chia thành ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn lai ghépvới mồi và giai đoạn kéo dài Sản phẩm của mỗi bước tổng hợp đóng vai trò là khuônmẫu cho các bước sau, do đó đạt được sự khuếch đại theo hàm mũ

Phản ứng chuỗi polymerase được thực hiện trong một hỗn hợp phản ứng baogồm chiết xuất DNA (DNA khuôn mẫu), Taq polymerase, các đoạn mồi và bốndeoxyribonucleoside triphosphat (dNTPs) dư thừa trong dung dịch đệm

Các ống chứa hỗn hợp mẫu phải chịu các chu kỳ nhiệt độ lặp đi lặp lại vài chụclần trong khối gia nhiệt của bộ tuần hoàn nhiệt (thiết bị có vỏ bọc nơi các ống mẫuđược lắng đọng và trong đó nhiệt độ có thể thay đổi, rất nhanh và chính xác, từ 0 đến100°C bởi hiệu ứng Peltier)

Thiết bị này cho phép lập trình khoảng thời gian và sự liên tiếp của các chu kỳcủa các bước nhiệt độ Mỗi chu kỳ bao gồm ba khoảng thời gian vài chục giây Quytrình của PCR được chia thành ba giai đoạn như sau:

2.1.1 Giai đoạn biến tính

Đây là giai đoạn phân tách của hai sợi DNA, thu được bằng cách tăng nhiệt độ.Thời kỳ đầu tiên thực hiện ở nhiệt độ 94°C, gọi là nhiệt độ biến tính Ở nhiệt độ này,DNA mẫu, đóng vai trò là chất nền trong quá trình sao chép bị biến tính

Hình 2.1 Giai đoạn biến tính DNA mẫu

Các liên kết hydro không thể duy trì ở nhiệt độ cao hơn 80°C do đó DNA sợi kép

bị tách thành 2 DNA sợi đơn (single-stranded DNA)

2.1.2 Giai đoạn lai ghép

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ từ 40 đến 70°C, đây được gọi là nhiệt độlai mồi

Giảm nhiệt độ cho phép các liên kết hydro mới được hình thành và do đó các sợiđơn được bổ sung để lai hóa

Hình 2.2 Giai đoạn lai

Các đoạn mồi, trình tự sợi đơn ngắn bổ sung cho các vùng bên hông DNA đượckhuếch đại, sự lai ghép sẽ dễ dàng hơn so với DNA mẫu sợi dài Nhiệt độ lai hoá càngcao thì sự lai hoá càng chọn lọc, càng đặc hiệu

2.1.3 Giai đoạn kéo dài

Giai đoạn thứ ba được thực hiện ở nhiệt độ 72°C, gọi là nhiệt độ kéo dài Đây làgiai đoạn tổng hợp các sợi bổ sung

Ở 72°C, Taq polymerase liên kết với DNA sợi đơn đã được mồi và xúc tác saochép bằng cách sử dụng deoxyribonucleoside triphosphat có trong hỗn hợp phản ứng.

Do đó, các vùng của DNA khuôn mẫu ở cuối của mồi được tổng hợp một cách chọnlọc

Hình 2.3 Giai đoạn kéo dài

Trong chu kỳ tiếp theo, các đoạn được tổng hợp ở chu kỳ trước lần lượt là khuônmẫu và sau một vài chu kỳ, đoạn gen ưu thế tương ứng với trình tự DNA giữa cácvùng mà mồi lai với nhau

Cần 20–40 chu kỳ để tổng hợp một lượng DNA có thể phân tích được (khoảng0,1 μg) Theo lý thuyết, mỗi chu kỳ sẽ tăng gấp đôi số lượng DNA có trong chu kỳtrước

PCR có thể khuếch đại các trình tự DNA có kích thước nhỏ hơn 6 kilobase Phảnứng PCR cực kỳ nhanh chóng, chỉ kéo dài vài giờ (2–3 giờ đối với phản ứng PCR 30chu kỳ)

Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp các bước của phương pháp PCR

2.2 Thành phần chủ yếu của phương pháp PCR (Dey P., 2018)

2.2.1 Đoạn mồi (primers)

Các đoạn mồi là những đoạn nhỏ của chuỗi DNA nhân tạo, đây là những đoạn bổsung ở đầu 3′ của mỗi sợi DNA đích

Các đoạn mồi thường bao gồm 20–30 nucleotide

Mồi là các DNA sợi đơn mà sự lai ghép trên các trình tự nằm bên cạnh trình tựyêu cầu sẽ cho phép sao chép của nó một cách có chọn lọc

2.2.2 DNA polymerase (Taq polymerase)

Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase có tác dụng tổng hợp sợiDNA mới Nó kết hợp ở phần cuối của đoạn mồi và sau đó liên tiếp thêm cácnucleotide mới vào sợi DNA ở đầu 3′ bổ sung cho DNA đích

Nhiệt độ cao (94°C) là cần thiết để tách DNA sợi kép DNA polymerase thôngthường bị phá vỡ trong nhiệt độ này Tuy nhiên, Taq polymerase có đặc điểm duy nhất

là hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ cao hơn

Taq DNA polymerase này được chiết xuất từ vi khuẩn Thermus aquaticus.Những vi khuẩn này sống trong suối nước nóng và có thể tồn tại ở đó

2.2.3 Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs)

Deoxynucleotide triphosphat (dNTP) là dATP, dCTP, dGTP và dTTP Đây lànguyên liệu cơ bản của các sợi DNA mới Taq polymerase bắt các dNTP này từ dungdịch làm việc và gắn chúng vào phần cuối của mồi để kéo dài chuỗi DNA.

Magie clorua hoạt động như một đồng yếu tố của enzym Taq polymerase

2.3 Phát hiện và phân tích sản phẩm PCR (Dey P., 2018)

Sản phẩm của PCR bao gồm một hoặc nhiều đoạn DNA (trình tự hoặc các trình

tự quan tâm) Việc phát hiện và phân tích các sản phẩm có thể được thực hiện rấtnhanh chóng bằng điện di trên gel agarose (hoặc acrylamide)

DNA được phát hiện bằng cách nhuộm ethidium bromide Do đó, các sản phẩm

có thể nhìn thấy ngay lập tức bằng cách chiếu tia cực tím (280–320 nm) Các sản phẩmrất nhỏ thường có thể nhìn thấy rất gần với mặt trước di chuyển dưới dạng nhiều hoặc

ít dải khuếch tán Chúng tương ứng với các chất dimer của mồi và đôi khi với chínhcác mồi

Tùy thuộc vào các điều kiện phản ứng, các đoạn DNA không đặc hiệu có thểđược khuếch đại ở mức độ lớn hơn hoặc nhỏ hơn, tạo thành các dải lưới hoặc “vếtbẩn” Trên các hệ thống tự động, máy phân tích mảnh hiện được sử dụng Thiết bị này

sử dụng nguyên tắc điện di mao quản Phát hiện phân mảnh được thực hiện bởi mộtdiode laser Điều này chỉ có thể thực hiện được nếu PCR được thực hiện với các mồikết hợp với fluorochromes

2.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp (Dey P., 2018)

- PCR còn có thể cho ra kết quả định lượng chính xác số bản copies virus/1 mlmáu Từ đó hỗ trợ rất đắc lực cho bác sĩ đánh giá được hiệu quả điều trị, cũng như tiênlượng giai đoạn bệnh.

- Phát hiện các đột biến gen gây ung thư, gây các bệnh di truyền khác nhằm cóbiện pháp phòng ngừa bệnh

- Xác định mối quan hệ huyết thống giữa những cá thể khác nhau

2.4.2 Nhược điểm

- Ngoại nhiễm cao do khả năng nhân bản DNA mạnh

- Sai sót của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp

- Kết quả phụ thuộc rất lớn vào toàn bộ thao tác

- Điều kiện phản ứng quá nghiêm ngặt: Nếu điều kiện phản ứng được duy trì rấtnghiêm ngặt, thì có thể không có bất kỳ sự khuếch đại nào của sản phẩm PCR

- Thuốc thử không được thêm vào: Có thể không thêm một hoặc nhiều thuốcthử vào hỗn hợp phản ứng Toàn bộ phản ứng nên được thực hiện lại bằng cách thêmcẩn thận các thuốc thử

- Thuốc thử không ở nồng độ tối ưu hoặc hết hạn sử dụng: Thuốc thử phải đượclàm mới và thay đổi một thuốc thử mới tại một thời điểm để tìm ra vấn đề của thuốcthử nào

- Nhiệt độ biến tính quá cao hoặc quá thấp: Trong điều kiện đó, thay đổi nhiệt

độ thấp hoặc cao 1°C tại một thời điểm

- Nhiệt độ ủ mồi quá cao: Trong trường hợp này, hãy hạ nhiệt độ xuống 2°Ccùng một lúc

- Hình thành mồi mới: Hai mồi có thể tự ủ hoặc ủ với nhau Trong trường hợpnày, điện di trên gel cho thấy một sản phẩm nhỏ có ít hơn 100 cặp bazơ Việc bổ sung

DMSO có thể giải quyết vấn đề này Ngoài ra, chu kỳ nhiệt có thể giải quyết vấn đềnày.

- Số chu kỳ nhiệt dưới mức tối ưu: Số chu kỳ nhiệt dưới mức tối ưu có thể tạo

ra lượng sản phẩm PCR ít hơn Trong điều kiện đó, tăng thêm 5–10 số chu kỳ nhiệt

- Mồi bị lỗi: mồi có thể bị lỗi và do đó PCR có thể không hoạt động Trongtrường hợp đó, hãy thiết kế lại mồi

- Nồng độ magie quá cao: Điều chỉnh nồng độ và giảm nồng độ xuống thấp

- Mồi bị lỗi: Thiết kế lại mồi

- Bị ô nhiễm: Thay đổi nơi thực hiện PCR

CHƯƠNG 3: ENZYMEE-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

3.1 Nguyên tắc chung của ELISA (Sakamoto S và cộng sự, 2017)

ELISA dựa trên khái niệm về phản ứng kháng nguyên - kháng thể, đại diện cho

sự tương tác hóa học giữa các kháng thể được tạo ra bởi tế bào B của bạch cầu vàkháng nguyên Phản ứng miễn dịch cụ thể này đóng một vai trò quan trọng trong việcbảo vệ cơ thể khỏi những kẻ xâm lược như mầm bệnh và độc tố

Bằng cách khai thác phản ứng này, ELISA cho phép phân tích định lượng/địnhtính có độ nhạy cao và chọn lọc đối với các kháng nguyên, bao gồm protein, peptit,axit nucleic, hormone, thuốc diệt cỏ và các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật

Để phát hiện các phân tử này, một kháng nguyên hoặc kháng thể được đánh dấubằng cách sử dụng các enzym, cái gọi là xét nghiệm miễn dịch enzym, trong đóalkaline phosphatase (ALP), horseradish peroxidase (HRP), và β-galactosidase thườngđược sử dụng