Phương pháp nghiên cứu: Tiến hành khảo sát đa hình 5 chỉ thị TOM236, SSR383, SSR69, LB3 và SCU602F3R3 với vật liệu giống thí nghiệm đã biết kiểu gen Ph3 và xác định mức độ liên kết của c
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ sinh học, thuộc Viện Nghiên cứu Rau quả, Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội.
Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 02/2017 đến tháng 10/2017 Thí nghiệm được tiến hành vào vụ Xuân Hè năm 2017.
Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu gồm các mẫu giống cà chua nhập nội, các tổ hợp lai cà chua thế hệ F1 và F2, cùng gene Ph3 kháng bệnh sương mai do Viện Nghiên cứu Rau Quả cung cấp Các giống được liệt kê rõ ràng theo từng thí nghiệm để đảm bảo tính chính xác và minh bạch trong nghiên cứu Các mẫu giống này giúp đánh giá khả năng kháng bệnh và lai tạo các dòng cà chua có năng suất cao, chống chịu bệnh tốt hơn Nghiên cứu tập trung vào việc xác định đặc tính sinh trưởng và khả năng kháng bệnh của các dòng cà chua nhập nội và lai tạo này.
- Hóa chất phục vụ nghiên cứu được đặt mua của hãng Sigma và Fermentas Các cặp mồi đặt mua từ công ty Invitrogen cung cấp
- Thiết bị sử dụng như máy PCR, máy điện di, máy nghiền, máy ly tâm, tủ định ôn… tại Viện Nghiên cứu Rau quả.
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát sự đa hình với gen Ph3 của các chỉ thị phân tử
- Xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen kháng bệnh sương mai cà chua Ph3
- Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen kháng Ph3 xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua
Bài viết đánh giá năng suất, đặc điểm nông sinh học, cũng như tình hình sâu bệnh của các tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 tại vụ Xuân Hè ở Gia Lâm, Hà Nội, nhằm cung cấp thông tin chính xác về khả năng sinh trưởng và chống chịu dịch bệnh của các giống lai này Các kết quả cho thấy các tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 có năng suất cao, phù hợp với điều kiện khí hậu địa phương, đồng thời có khả năng kháng sâu bệnh hiệu quả, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp tại khu vực Thông qua nghiên cứu này, người nông dân và nhà sản xuất có thể lựa chọn giống lai phù hợp để tăng năng suất và giảm thiểu thiệt hại do sâu bệnh, thúc đẩy phát triển bền vững ngành trồng trọt.
Phương pháp nghiên cứu
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các giống cà chua kháng, chống chịu và nhiễm bệnh sương mai tiến hành thí nghiệm như danh sách trong bảng 3.1:
Bảng 3.1 Danh sách các giống cà chua nghiên cứu
Dòng/giống Kiểu gen Ph3 Nơi thu thập
(08TP76 X 08TP65)5-3-7-3-3-1-1 Ph3/Ph3 FAVRI
Hồng đào Ph3/ph3 Công ty Sygenta
Anna ph3/ph3 Công ty Seminis
Savior ph3/ph3 Công ty Sygenta
Nguồn: DNA này sẽ được dùng để khảo sát các chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 kháng bệnh sương mai b Chỉ thị phân tử
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng năm chỉ thị phân tử đã được xác định từ các nghiên cứu trước đó để đánh giá chính xác các đặc điểm sinh học Các chỉ thị bao gồm TOM236 (Zhu et al., 2006), SCU602F3R3 (Trương Thị Hồng Hải và cộng sự, 2015) cùng ba chỉ thị còn lại là SSR383, SSR69 và LB3, dựa trên kết quả đề tài từ năm 2009 Việc sử dụng các chỉ thị phân tử này nhằm mục đích phân lớp giống cây trồng, nâng cao độ chính xác trong chọn giống và hỗ trợ quá trình nghiên cứu di truyền Các kết quả cho thấy rằng, sự kết hợp của các chỉ thị phân tử này giúp cải thiện độ tin cậy của phân tích và góp phần thúc đẩy tiến bộ trong ứng dụng khoa học cây trồng.
2012) Các chỉ thị lựa chọn tập trung trên vai dài nhiễm sắc thể số 9, gần vị trí chỉ thị TG591 (chỉ thị RFLP)
Hình 3.1 Vùng khảo sát chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 trên nhiễm sắc thể số 9 c Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA từ mẫu lá non giai đoạn 2 đến 3 lá được thực hiện để xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3, theo phương pháp của Dorokhov và Klocke (1998) có cải tiến Quá trình này giúp đảm bảo độ chính xác trong phân tích gen Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA, chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, giúp đánh giá hiệu quả tách chiết và chất lượng mẫu DNA.
Dưới tác dụng của điện trường và tích điện âm, DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương, trong đó các đoạn DNA dài di chuyển chậm hơn so với các đoạn ngắn, giúp phân tách các đoạn DNA trong gel agarose Sau đó, thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi liên kết với gen Ph3 kháng bệnh sương mai và các mẫu giống khác nhau để xác định sự hiện diện của gen mục tiêu.
Phản ứng PCR qua 5 chỉ thị nghiên cứu xác định trên các mẫu giống được liệt kờ trong bảng 3.1 Thành phần mỗi phản ứng 10àl như bảng 3.2 dưới đõy:
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR với mồi
Húa chất Thể tớch (àl)
Nước (Di H2O) 5,9 Đệm (Buffer 10X) 1,0 dNTPs (10mM) 1,0
Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Bước Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Số chu kỳ
( * ): Nhiệt độ gắn mồi- có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi cụ thể
- Kiểm tra kết quả điện di sản phẩm PCR của từng chỉ thị Điện di trên gel agarose1,5%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, dưới hiệu điện thế 160V trong
70 phút Sau đó, các băng DNA được quan sát khi đưa vào máy Geldoc
3.5.1.2 Phương pháp xác định mức độ liên kết của chỉ thị phân tử thông qua đánh giá sự tương đồng giữa kiểu gen và kiểu hình tính kháng bệnh
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng năm chỉ thị phân tử đã được công bố liên kết với gen Ph3 để kiểm tra đa hình trên các dòng, giống và bố mẹ kháng bệnh Tiến hành điều tra kiểu gen Ph3 bằng phương pháp phân tử DNA trên quần thể F2 được tạo ra từ hạt của tổ hợp lai F1 giữa dòng 08TP73-10-4 (chứa gen kháng Ph3) và dòng nhiễm bệnh không chứa gen kháng là 08TP03-15-3-1 Đồng thời, chúng tôi đã đánh giá khả năng kháng nhiễm bằng cách lây nhiễm nhân tạo để xác định kiểu hình kháng bệnh Khoảng cách di truyền được tính theo phương pháp của Nei (1978) dựa trên tỷ lệ phần trăm cá thể trao đổi chéo của từng chỉ thị phân tử So sánh tỷ lệ trao đổi chéo của 5 chỉ thị nghiên cứu, chỉ thị phân tử nào có tỷ lệ trao đổi chéo thấp nhất sẽ cho thấy mức liên kết chặt chẽ nhất với gen Ph3 kháng bệnh sương mai, từ đó xác định chính xác các marker liên quan đến gen kháng này để hỗ trợ chọn giống hiệu quả.
Hình 3.2 Sơ đồ tạo quần thể F2 của tổ hợp lai 08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4
Nguồn: Viện Nghiên cứu Rau quả
Hạt giống được xử lý bằng dung dịch NaOCl 1% trong 15 phút, sau đó rửa sạch bằng vòi nước trong 30 phút và hong khô trước khi gieo trồng Trong nhà lưới, hạt được gieo vào các khay nhựa 72 lỗ chứa giá thể hữu cơ GT05 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa cung cấp, được phối trộn với xơ dừa sạch theo tỉ lệ 1:1 (theo thể tích) Để đánh giá khả năng kháng nhiễm của cây, 96 cây ngẫu nhiên trong quần thể F2 được chọn để tiến hành tách chiết DNA và gắn thẻ để xác định kiểu kháng nhiễm qua quá trình lây nhiễm bệnh nhân tạo.
Lây nhiễm bệnh nhân tạo
Theo Leontine Colon et al (2004), quá trình lây nhiễm bệnh nhân tạo được thực hiện bằng phương pháp lá tách rời, cụ thể sau 30-35 ngày gieo trồng, khi cây đạt 5-6 lá thật, người ta sẽ ngắt lá thật thứ 4 đã phát triển đầy đủ, sạch bệnh và ghi thẻ đánh dấu phù hợp với cây nghiên cứu, sau đó giữ trong khăn ẩm, mát Lá cà chua được đặt úp lên môi trường thạch nước (Water agar dung môi đã được autoclav hóa ở 121°C trong 17 phút) trong đĩa Petri, rồi nhỏ micropipet chứa dịch bào tử nấm sương mai (5000 bào tử/ml) vào giữa mỗi lỗ chột Sau khi tiến hành lây nhiễm, hộp Petri được đậy kín và giữ trong tủ ấm ở nhiệt độ 17°C Việc đánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh của 96 cá thể quần thể F2 được thực hiện sau 7 ngày bằng phương pháp đếm số lượng bào tử hình thành, trong đó: Kháng bệnh (R): 0-≤1x10^4 bào tử/ml; Chống chịu (H): 1,5-10 4 bào tử/ml
Hình 3.3 Lây nhiễm bệnh nhân tạo trên lá tách rời Nguồn nấm bệnh:
Chủng phân lập RIFAV được thu thập tại khu ruộng thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Rau Quả, Gia Lâm - Hà Nội, trong vụ Đông Xuân 2017 Lá bệnh điển hình được thu thập và phân lập theo phương pháp của Caten và Jinks (1968), với những cải tiến trên môi trường V8 để đảm bảo độ chính xác và hiệu quả cao trong phân tích.
A B C Hình 3 4 Quá trình phân lập nấm sương mai (A-mẫu bệnh, B- Phân lập trên môi trường V8, C- Hình dạng bọc bào tử động dưới kính hiển vi)
Sau quá trình phân lập, nguồn bệnh đã được xác định lại qua kiểm tra hình thái bọc bào tử dưới kính hiển vi để đảm bảo chính xác Để duy trì tính độc cao của các isolate nấm, chúng được lưu trữ liên tục trên mẫu lá cà chua tươi ở nhiệt độ từ 17°C đến 18°C, nhằm giữ cho đặc tính sinh học của chúng không thay đổi.
3.5.2 Phương pháp xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua
Sử dụng chỉ thị phân tử LB3 liên kết chặt nhất với gen Ph3 thu được từ thí nghiệm để xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua Phương pháp này giúp xác định chính xác sự phân bố kiểu gen, từ đó nâng cao hiệu quả chọn giống và đảm bảo giống cà chua đạt chất lượng Việc sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt đảm bảo độ chính xác trong phát hiện kiểu gen, hỗ trợ nghiên cứu di truyền và cải thiện năng suất cây trồng.
Bảng 3 4 Các tổ hợp lai cà chua tiến hành xác định kiểu gen Ph3
TT Ký hiệu Tên giống/tổ hợp lai Nơi thu thập
Gieo hạt trong nhà lưới đến khi cây có 5-6 lá thật để chuẩn bị tách chiết DNA và xác định khả năng chứa gen Ph3 Tiếp theo, tiến hành điều tra khả năng chứa gen này để phục vụ các nghiên cứu phân tích gene Sau đó, thực hiện nhiễm nhẫn tạo sử dụng chủng phân lập đã được xác định để đảm bảo hiệu quả và chính xác của quá trình nghiên cứu.
3.5.3 Đánh giá năng suất, đặc điểm nông sinh học và tình hình sâu bệnh của các tổ hợp lai cà chua ở vụ Xuân Hè năm 2017 tại Gia Lâm- Hà Nội
Các tổ hợp lai đã được xác định kiểu gen Ph3 và tiến hành so sánh đánh giá về năng suất, đặc điểm nông sinh học cũng như tình hình sâu bệnh hại vụ Xuân Hè năm 2017, theo quy chuẩn QCVN 01-63:2011/BNNPTNT Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh gồm 3 lần nhắc lại với 5 tổ hợp lai (V1 đến V5), trong đó V1 là giống lai F1 Savior làm đối chứng Hạt giống được gieo ngày 5 tháng 2 năm 2017 trên khay có kích thước 40 x 60 cm, dùng giá thể sạch GT05 pha trộn với xơ dừa theo tỷ lệ 1:1, mỗi khay chứa 40-50 lỗ và giữ ẩm thường xuyên, đặt trong nhà lưới để tránh côn trùng và che mưa Cây con được trồng ra ruộng khi có từ 5 đến 6 lá thật, tại Viện Nghiên cứu Rau quả, vùng Đồng bằng sông Hồng, trên luống rộng 1,5 m (kể cả rãnh) cao 20 cm, trồng theo hàng đôi với khoảng cách hàng 65 cm và cây 40 cm, mật độ trồng khoảng 28.000 cây/ha Phân bón lót gồm 100% phân hữu cơ, 100% phân lân và một phần ba đạm cùng kali, phần còn lại được chia đều bón thúc định kỳ ba lần kèm theo xới vun, nhằm đảm bảo dinh dưỡng tối ưu cho cây trồng.
Theo dõi đánh giá các tính trạng nông sinh học
- Theo dõi đặc điểm về chỉ tiêu sinh trưởng của cây:
+ Chiều cao cây cuối cùng (cm): Đo tính từ cổ rễ đến đỉnh sinh trưởng cây
+ Dạng hình sinh trưởng: Tùy theo khả năng sinh trưởng mà chia thành các dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn, hữu hạn và vô hạn
- Theo dõi các đặc điểm hình thái và phẩm chất quả:
+ Chiều cao quả (mm) (H): Đo bằng thước kẹp của 10 quả trung bình
+ Đường kính quả (mm) (D): Đo bằng thước kẹp tại vị trí to nhất của 10 quả trung bình
Độ dày thịt quả được đo từ vỏ đến chỗ tiếp xúc ngăn hạt tại phần lớn nhất của quả, đảm bảo chính xác và thống nhất trong quá trình đánh giá Thường lấy mẫu từ chùm quả 2 đến chùm quả 3, với mỗi lần đo thực hiện trên 10 quả để có dữ liệu đầy đủ và đáng tin cậy Các phép đo được thực hiện bằng thước panme để đảm bảo độ chính xác cao nhất.
+ Độ Brix (%): Đo bằng chiết quang kế
+ Số ngăn hạt trên quả: Đo 10 quả tính trung bình
Hình dạng quả được xác định dựa trên chỉ số hình dạng quả, công thức tính là I = H/D, trong đó I là chỉ số hình dạng quả, H là chiều cao quả, và D là đường kính quả Dựa vào chỉ số này, quả được phân thành ba dạng: quả dài với I > 1,1; quả tròn với I từ 0,8 đến 1,1; và quả dẹt với I < 0,8.
+ Màu sắc quả khi chín: Vàng, đỏ vàng, đỏ bình thường, đỏ cờ, đỏ thẫm
- Các yếu tố cấu thành năng suất bao gồm:
+ Khối lượng trung bình quả (g): Số quả mẫu 5 quả/ lần nhắc lại
+ Năng suất thực thu (tấn/ha): Tổng khối lượng quả đến khi kết thúc thu hoạch trên 1 đơn vị diện tích (Thu hoạch khi quả chín)
Năng suất thương phẩm (tấn/ha) đo lường tổng khối lượng quả thương phẩm thu được trên một đơn vị diện tích, dựa trên tiêu chuẩn TCVN 4845:2007 về quả cà chua tươi Đánh giá tình hình nhiễm sâu bệnh ngoài đồng là bước quan trọng để đảm bảo năng suất và chất lượng sản phẩm Cụ thể, các bệnh như sương mai và xoăn vàng lá được đánh giá theo quy chuẩn quốc gia QCVN 01-63:2011/BNNPTNT về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng giống cà chua, giúp xác định mức độ ảnh hưởng của bệnh đối với cây trồng và đề xuất biện pháp phòng trừ phù hợp.
- Bệnh sương mai (Phytophthora infestans Debary): Giai đoạn sau trồng