TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Vân Anh Tên luâ ̣n văn: “Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy tế bào trên hệ thống Microcarrier trong sản xuất vacxin Tai Xanh” Ngành: Thú
Vật liệu- phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
3.1.1 Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
- Xác định tốc độ khuấy thích hợp để nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
- Xác định giá trị DO thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
- Xác định lưu lượng khí cấp vào thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
- Xác định lượng tế bào Marc-145 cấy vào hạt Cytodex trên hệ thống Microcarrier
- Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
3.1.2 Nghiên cứu tính thích ứng của virus Tai Xanh nuôi cấy trên tế bào Marc-145 bằng hệ thống Microcarrier
- Xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào, xử lí dịch ủ virus
- Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm virus
- Xác định liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch thích hợp trên hệ thống Microcarrier
3.1.3 Nghiên cứu quy trình thu hoạch và xử lí dịch virus sau khi thu hoạch 3.2 ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Tế bào Marc-145 đang dùng sản xuất (working cell bank) giữ giống tại công ty Hanvet
- Giống virus nhược độc PRRS Hanvet1.vn đang dùng sản xuất (Product Seed)
- Tủ ấm CO2, tủ ấm thường
- Box cấy an toàn sinh học cấp 2
- Kính hiển vi soi ngược
- Chai schott 500ml, 1 lít, 2 lít, 5 lít, 10 lít
- Pipet man: 200àl, 1ml, 8 kờnh, 12 kờnh
- Pippet thủy tinh10ml, 20ml
- Đầu tuýp 200àl, 1ml, 5ml
- Giá để ống, khay nhôm, rổ nhựa
- Môi trường nuôi cấy tế bào: MEM, DMEM, M199, LH, Hank, PBS
- Hóa chất, huyết thanh : FBS, Tripsin-EDTA, Hepes, Trypan blu
- Môi trường kiểm tra độ thuần khiết: thạch máu, TSB và nước thịt gan yếm khí
- Phòng tế bào- trung tâm nghiên cứu- Công ty TNHH dược Hanvet- KCN phố nối A- Hưng Yên
3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào a Khôi phục tế bào:
Lấy ống tế bào bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng ra và rã đông nhanh chóng trong bể ổn nhiệt 37°C để giữ nguyên chất lượng tế bào Sau đó, chuyển hỗn dịch tế bào vào Laminar Air Flow (LAF) vô trùng nhằm đảm bảo an toàn và tránh nhiễm khuẩn Tiếp theo, chuyển hỗn dịch vào ống ly tâm chứa môi trường nuôi cấy đã được làm ấm phù hợp, giúp tế bào thích nghi tốt hơn Tiến hành ly tâm hỗn dịch tế bào với tốc độ khoảng 1500 vòng/phút trong 5-10 phút để tách tế bào hiệu quả và chuẩn bị cho các bước tiếp theo trong quy trình nuôi cấy.
Sau quá trình ly tâm, loại bỏ phần dịch nổi giúp giữ lại phần tế bào lắng cặn ở dưới để đảm bảo sự tập trung của tế bào Tiếp theo, hoàn nguyên mẫu tế bào bằng cách sử dụng môi trường nuôi phù hợp nhằm duy trì tính toàn vẹn của các tế bào Cuối cùng, trộn đều tế bào và môi trường bằng cách hút nhả bằng pipet để đảm bảo sự đồng đều và chuẩn bị cho các bước xử lý tiếp theo trong quy trình nuôi cấy tế bào.
- Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào này vào chai nuôi tế bào Tfask có môi trường nuôi dưỡng bổ sung huyết thanh và kháng sinh
- Ủ chai nuôi cấy ở tủ ấm 37°C, 5% CO2.
Trong vòng một ngày, cần loại bỏ môi trường nuôi dưỡng cũ để loại bỏ DMSO, sau đó rửa lớp tế bào bằng dung dịch PBS để loại bỏ tạp chất Tiếp theo, bổ sung môi trường nuôi dưỡng mới có chứa huyết thanh để duy trì sự phát triển của tế bào Tế bào được ủ trong tủ nhiệt ở nhiệt độ 37°C với khí CO₂ 5% để đảm bảo điều kiện phù hợp cho sự phát triển và tăng trưởng của tế bào.
- Hằng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi quang học b Tách tế bào
- Rửa chai tế bào bằng PBS(-): 1 – 2 lần Cho TE 0,05% , láng chai Ủ
Để chuẩn bị môi trường nuôi, điều kiện tối ưu là nhiệt độ 37°C trong vòng 5-15 phút, cho đến khi tế bào co tròn và bắt đầu bong khỏi đáy chai Sau đó, nhẹ nhàng vỗ chai để giúp tế bào tự do và trung hòa bằng môi trường chứa 5% huyết thanh Tiếp theo, tiến hành đếm số tế bào sử dụng buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ tế bào chính xác Cuối cùng, tính toán số lượng tế bào và chia ra các chai nuôi đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C để đảm bảo sự phát triển tối ưu của tế bào.
- Hàng ngày quan sát khả năng phát triển của tế trong các chai tế bào trên kính hiển vi quang học
- Nhân số lượng tế bào trên các chai nuôi cấy Để đủ số lượng tế bào Marc-145 nuôi trên hệ thống Microcarrie với dung tích
Để mở rộng quy mô sản xuất, cần sử dụng 10 lít dung dịch và 50g hạt Cytodex-1 để nuôi tế bào Marc-145, thực hiện nhân tế bào theo từng cấp độ với quy mô lớn dần Quy trình nhân số lượng tế bào này được mô tả chi tiết trong hình minh họa dưới đây, giúp đảm bảo quá trình nhân giống hiệu quả và đạt tiêu chuẩn cần thiết cho các mục đích nghiên cứu hoặc sản xuất Việc nhân tế bào theo từng cấp độ giúp tối ưu hóa năng suất và kiểm soát chất lượng, phù hợp với quy mô lớn của dự án.
Hình 3.1 Mô hình nhân số lƣợng tế bào cho nuôi cấy trên hệ thống
Microcarrier c Phương pháp đếm tế bào
Chuẩn bị buồng đếm bằng cách sử dụng vải gạc sạch, tẩm cồn để lau chùi sạch sẽ buồng đếm và phiến kính đậy Sau đó, để buồng đếm và phiến kính đậy khô hoàn toàn, có thể hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn Đặt buồng đếm trên mặt phẳng ngang và nhẹ nhàng đặt phiến kính đậy đúng vị trí, chú ý không để lệch hoặc kênh để đảm bảo kết quả chính xác và tránh nhiễm khuẩn.
Hình 3.2 Buồng đếm tế bào
Trên buồng đếm tế bào có 2 vùng đếm, 1 vùng ở trên và 1 vùng ở dưới
Khi đếm, kết quả đếm được tính trên cả 2 vùng đếm bao gồm 8 ô đếm
- Trong mỗi ô đếm, thứ tự đếm được mô tả như trên hình vẽ
Tiến hành đếm số lượng tế bào
Hướng dẫn sử dụng pipetman để chuẩn bị mẫu tế bào và thuốc nhuộm bằng cách hút lên nhả xuống 5 lần, sau đó lấy một lượng nhỏ hỗn dịch tế bào Tiếp theo, đưa đầu típ vào cạnh của phiến kính đậy và bơm nhẹ nhàng để hỗn dịch tế bào chảy vào buồng đếm nhờ lực mao dẫn, đảm bảo lớp tế bào phủ một lớp mỏng kín buồng Đếm số lượng tế bào bằng kính hiển vi với vật kính 10x, thực hiện đếm trên cả hai buồng đếm, mỗi buồng gồm 4 ô vuông 1mm² để tính chính xác số tế bào trong mẫu.
Chỉ đếm những tế bào sống, biểu hiện bằng các điểm tròn, sáng trên nền xanh Quá trình đếm tập trung vào các tế bào trong mỗi ô có kích thước 1mm², theo mẫu hình zic-zắc từ trái sang phải, từ trên xuống dưới để đảm bảo độ chính xác cao.
Các tế bào nằm giữa các cạnh của ô đếm chỉ được tính nếu nằm giữa cạnh phía trên và cạnh bên trái, không đếm những tế bào trên cạnh phía dưới và cạnh bên phải Để đảm bảo độ chính xác trong đếm tế bào, số lượng tế bào trong mỗi ô đếm nên nằm trong khoảng 20-50 tế bào; nếu số lượng ít hơn 20 hoặc nhiều hơn 50, cần tiến hành đếm lại sau khi điều chỉnh độ pha loãng mẫu.
Nếu hơn 10% tế bào bám thành cụm phải làm lại từ đầu và bảo đảm các tế bào đã tách riêng rẽ
C : Hệ số pha loãng tế bào
A : Số tế bào đếm lần 1
B : Số tế bào đếm lần 2
16 : Số ô đếm của 2 buồng (8 ô 2 buồng đếm)
10 4 : Nghịch đảo thể tích dịch trong 1 ô đếm
V : Thể tích bình nuôi cấy tế bào d Phương pháp nuôi cấy tế bào trên hạt nang Cytodex bằng hệ thống Microcarrier
Cân Cytodex-1 và rửa sạch bằng PBS(-) trong chai Schott hoặc bình tam giác, đảm bảo rửa từ 1-2 lần, láng đều từ 10-15 lần để loại bỏ bụi bẩn và tạp chất Sau đó, để hạt Cytodex 1 lắng xuống, bỏ phần nước nổi để loại bỏ bụi bẩn Tiếp theo, bổ sung PBS(-), đóng nắp và sấy vô trùng ở nhiệt độ 121˚C trong 30 phút để đảm bảo vệ sinh Cuối cùng, bảo quản hạt Cytodex-1 trong điều kiện nhiệt độ từ 2-8˚C để giữ được chất lượng tốt nhất.
Sau khi sấy hạt Cytodex, tiến hành để lắng hạt rồi đổ bỏ dịch trong để loại bỏ dư lượng Tiếp theo, bổ sung môi trường nuôi cấy cùng huyết thanh nhằm loại bỏ PBS(-), sau đó lắc đều để đảm bảo các thành phần hòa trộn đồng đều Quá trình này giúp chuẩn bị hạt Cytodex sạch sẽ và sẵn sàng cho các bước tiếp theo trong quá trình nuôi cấy.
(chú ý: tất cả thao tác đều được làm trong lab, thao tác vô trùng)
Nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
Sau khi hệ thống được xử lý vô trùng và lắp đặt hoàn chỉnh, bước tiếp theo là chuyển tế bào MARC cùng hạt Cytodex-1 vào hệ thống, đảm bảo quy trình được thực hiện chính xác để tối ưu hóa hiệu quả sản xuất.
Sau khi hấp vô trùng, hạt Cytodex được chuyển vào phòng thí nghiệm vô trùng để loại bỏ PBS(-) và tiếp tục bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy có chứa kháng sinh, lắc nhẹ để hạt lắng tại nhiệt độ phòng, đảm bảo điều kiện vô trùng và tối ưu quá trình nuôi cấy.
Hút loại bỏ môi trường, bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy + huyết thanh lắc nhẹ để lắng ở nhiệt độ 37ºC (khoảng 30 – 45 phút)
Hút loại bỏ môi trường cũ và bổ sung lượng tế bào Marc-145 đã chuẩn bị vào chai chứa hạt Cytodex để bắt đầu quá trình nuôi cấy Chuyển hỗn hợp tế bào và hạt Cytodex từ chai 1 lít vào bình nuôi của hệ thống Microcarrier để tối ưu hóa quá trình phát triển tế bào Bổ sung môi trường nuôi cấy theo các công thức đã thiết kế, với nồng độ huyết thanh khác nhau, nhằm điều chỉnh điều kiện nuôi phù hợp và nâng cao hiệu quả sản xuất tế bào.
Kết nối bình nuôi sau khi sấy vào bộ điều khiển và bơm toàn bộ dịch trong bình ra ngoài để chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy tế bào Tiếp theo, liên kết bình nuôi với chai chứa hạt Cytodex và chai hỗn dịch tế bào, sau đó bơm đầy hạt vào bình nuôi rồi tiếp tục bơm hỗn dịch tế bào vào hệ thống Bật cánh khuấy của hệ thống bình nuôi để đảm bảo trộn đều các thành phần Kiểm tra lượng hỗn dịch trong bình nuôi, sau đó kết nối chai môi trường vào bình để bơm đủ 500ml môi trường nuôi cấy Bật hệ thống khí ở chế độ tự động để tự điều chỉnh và sục khí phù hợp vào bình nuôi, đồng thời kết nối hệ thống để cân chỉnh điện cực DO và pH nhằm đảm bảo các điện cực hoạt động chính xác và hiển thị đúng các thông số đo (Kjell Nilsson 1988).
1 Kiểm tra đảm bảo điện cực pH đã được nối đúng với bộ điều khiển
2 Cắm điện và bật công tắc nguồn hệ thống nuôi cấy tế bào
3 Chờ cho thiết bị khởi động xong, Manu chính hiện lên
5 Nhấn dòng pH để hiệu chuẩn pH
6 Dùng nước cất rửa sạch điện cực pH, thấm khô bằng giấy thấm, nhúng điện cực vào dung dịch pH 7 chuẩn sao cho phần đầu đo ngập hoàn toàn
7 Nhấn cửa sổ bên dưới dòng Set Zero, dùng bàn phím nhập giá trị 7,00
Hình 3.3 Cân chỉnh điện cực pH
8 Chờ 2-3 phút cho hệ thống cân bằng- giá trị Current value trên màn hình tương đối ổn định.
9 Nhấn Set Zero, dùng bàn phím nhập lại giá trị 7,00 để xác nhận
10 Dùng nước cất rửa sạch điện cực, thấm khô bằng giấy thấm trung tính, sau đó nhúng ngập đầu điện cực vào dung dịch pH 4 chuẩn
11 Nhấn cửa sổ bên dưới dòng Set Span, dùng bàn phím nhập giá trị 4,00
12 Chờ 2-3 phút cho hệ thống cân bằng- giá trị Current value trên màn hình tương đối ổn định
Địa điểm nghiên cứu
- Phòng tế bào- trung tâm nghiên cứu- Công ty TNHH dược Hanvet- KCN phố nối A- Hưng Yên.
Thời gian nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu
Lấy ống tế bào bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng ra và rã đông nhanh chóng trong bể ổn nhiệt 37°C để bảo đảm giữ nguyên đặc tính của tế bào Sau đó, chuyển ống vào buồng khí vô trùng Laminar Air Flow (LAF) để tránh nhiễm khuẩn trong quá trình xử lý Tiếp theo, chuyển hỗn dịch tế bào vào ống ly tâm chứa môi trường nuôi cấy đã được làm ấm phù hợp với điều kiện tế bào Ly tâm hỗn dịch tế bào với cường độ khoảng 1500 vòng/phút trong thời gian từ 5 đến 10 phút để tách tế bào hiệu quả.
Sau quá trình ly tâm, loại bỏ phần dịch nổi để giữ lại phần tế bào lắng cặn ở dưới, sau đó hoàn nguyên mẫu bằng môi trường nuôi tế bào Việc trộn đều tế bào được thực hiện bằng cách sử dụng pipet hút nhả nhằm đảm bảo sự phân phối đồng đều của các tế bào trong môi trường nuôi.
- Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào này vào chai nuôi tế bào Tfask có môi trường nuôi dưỡng bổ sung huyết thanh và kháng sinh
- Ủ chai nuôi cấy ở tủ ấm 37°C, 5% CO2.
Trong quá trình chăm sóc tế bào, cần loại bỏ môi trường nuôi dưỡng cũ cùng với dung dịch DMSO để đảm bảo tế bào không bị nhiễm bẩn Sau đó, rửa lớp tế bào bằng dung dịch PBS để làm sạch bề mặt, tiếp tục thay thế bằng môi trường nuôi dưỡng mới chứa huyết thanh nhằm hỗ trợ sự phát triển của tế bào Các chai nuôi tế bào được đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C với khí CO₂ 5%, tạo điều kiện tối ưu để tế bào sinh trưởng và phát triển khỏe mạnh.
- Hằng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi quang học b Tách tế bào
- Rửa chai tế bào bằng PBS(-): 1 – 2 lần Cho TE 0,05% , láng chai Ủ
Để nuôi tế bào hiệu quả, giữ nhiệt độ 37°C trong 5-15 phút giúp tế bào co tròn và bắt đầu bong khỏi đáy chai Sau đó, nhẹ nhàng vỗ chai để loại bỏ tế bào dư thừa và trung hòa bằng môi trường 5% huyết thanh Tiến hành đếm số tế bào trên buồng đếm, đồng thời đếm hồng cầu để xác định số lượng tế bào chính xác Cuối cùng, tính toán và phân chia tế bào đều vào các chai nuôi được đặt ở tủ ấm 37°C để phát triển tối ưu.
- Hàng ngày quan sát khả năng phát triển của tế trong các chai tế bào trên kính hiển vi quang học
- Nhân số lượng tế bào trên các chai nuôi cấy Để đủ số lượng tế bào Marc-145 nuôi trên hệ thống Microcarrie với dung tích
Để nhân tế bào Marc-145 hiệu quả, bắt đầu với 10 lít và 50g hạt Cytodex-1, quy trình cần thực hiện theo từng cấp độ với quy mô ngày càng lớn Quá trình nhân số lượng tế bào được mô tả rõ ràng trong hình minh họa dưới đây, giúp đảm bảo sự phát triển đồng đều và tối ưu hóa năng suất tế bào trong quy trình sản xuất.
Hình 3.1 Mô hình nhân số lƣợng tế bào cho nuôi cấy trên hệ thống
Microcarrier c Phương pháp đếm tế bào
Chuẩn bị buồng đếm bằng cách lau sạch buồng đếm và phiến kính đậy bằng vải gạc sạch tẩm cồn, đảm bảo cả hai đều khô hoàn toàn, có thể hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để làm khô nhanh Đặt buồng đếm trên mặt phẳng ngang, sau đó đặt phiến kính đậy đúng vị trí, chú ý không để phiến kính đậy bị lệch hoặc kênh để đảm bảo kết quả chính xác trong quá trình quan sát.
Hình 3.2 Buồng đếm tế bào
Trên buồng đếm tế bào có 2 vùng đếm, 1 vùng ở trên và 1 vùng ở dưới
Khi đếm, kết quả đếm được tính trên cả 2 vùng đếm bao gồm 8 ô đếm
- Trong mỗi ô đếm, thứ tự đếm được mô tả như trên hình vẽ
Tiến hành đếm số lượng tế bào
Để chuẩn bị mẫu tế bào, sử dụng pipetman hút lên rồi nhả xuống 5 lần để trộn đều hỗn dịch tế bào và thuốc nhuộm Tiếp theo, hút một lượng nhỏ hỗn dịch tế bào và nhẹ nhàng đưa đầu típ vào cạnh của phiến kính đậy, sau đó bơm từ từ để hỗn dịch tế bào chảy vào buồng đếm bằng lực mao dẫn, đảm bảo hỗn dịch phủ một lớp mỏng kín đáo Sử dụng kính hiển vi với vật kính 10x để đếm số lượng tế bào, thực hiện đếm trên cả hai buồng đếm, mỗi buồng chứa 4 ô vuông rộng 1mm², giúp xác định chính xác mật độ tế bào trong mẫu.
Chỉ tập trung vào việc đếm các tế bào sống, những điểm tròn sáng nổi bật trên nền xanh Quá trình đếm diễn ra trong khu vực 1mm², theo mô hình hình zic-zắc từ trái sang phải và từ trên xuống dưới để đảm bảo tính chính xác trong khảo sát.
Các tế bào nằm giữa các cạnh của ô đếm chỉ được tính nếu nằm giữa cạnh phía trên và cạnh bên trái, không đếm các tế bào trên cạnh phía dưới và cạnh bên phải Để đảm bảo tính chính xác của kết quả, số lượng tế bào đếm trong mỗi ô nên nằm trong khoảng 20 đến 50 tế bào; nếu ít hơn 20 hoặc nhiều hơn 50, cần đếm lại sau khi điều chỉnh độ pha loãng mẫu để đạt độ chính xác cao hơn.
Nếu hơn 10% tế bào bám thành cụm phải làm lại từ đầu và bảo đảm các tế bào đã tách riêng rẽ
C : Hệ số pha loãng tế bào
A : Số tế bào đếm lần 1
B : Số tế bào đếm lần 2
16 : Số ô đếm của 2 buồng (8 ô 2 buồng đếm)
10 4 : Nghịch đảo thể tích dịch trong 1 ô đếm
V : Thể tích bình nuôi cấy tế bào d Phương pháp nuôi cấy tế bào trên hạt nang Cytodex bằng hệ thống Microcarrier
Cân Cytodex-1 chính xác rồi cho vào một chai Schott hoặc bình tam giác có nắp, sau đó rửa hạt Cytodex-1 1-2 lần bằng PBS(-) và làm đều bằng cách lắc nhẹ 10-15 lần Tiếp theo, để hạt lắng xuống và loại bỏ phần nước nổi, rồi bổ sung PBS(-) mới, đóng nắp và sấy vô trùng ở nhiệt độ 121°C trong 30 phút để đảm bảo vệ sinh Cuối cùng, bảo quản hạt Cytodex-1 ở nhiệt độ 2-8°C để duy trì hiệu quả sử dụng lâu dài.
Sau khi sấy hạt Cytodex, cần để lắng và loại bỏ dịch trong, sau đó bổ sung môi trường nuôi cấy kèm huyết thanh để loại bỏ PBS(-) Quá trình này được thực hiện bằng cách lắc đều để đảm bảo các hạt Cytodex được vệ sinh sạch sẽ, giúp chuẩn bị tốt cho các bước tiếp theo trong quá trình nuôi cấy.
(chú ý: tất cả thao tác đều được làm trong lab, thao tác vô trùng)
Nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
Sau khi hệ thống được xử lý vô trùng và lắp đặt hoàn chỉnh, quá trình chuyển tế bào bắt đầu bằng việc đưa tế bào Marc và hạt Cytodex-1 vào hệ thống Quy trình này đảm bảo quá trình chuyển tế bào diễn ra an toàn, hiệu quả, góp phần nâng cao chất lượng và hiệu suất của quy trình tế bào học.
Hạt Cytodex được hấp vô trùng và chuyển vào phòng thí nghiệm vô trùng để loại bỏ PBS(-) Tiếp theo, bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy chứa kháng sinh, lắc nhẹ để đảm bảo hạt lắng ở nhiệt độ phòng, chuẩn bị cho các bước nuôi cấy tế bào hiệu quả.
Hút loại bỏ môi trường, bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy + huyết thanh lắc nhẹ để lắng ở nhiệt độ 37ºC (khoảng 30 – 45 phút)
Hút loại bỏ môi trường cũ và bổ sung lượng tế bào Marc-145 đã chuẩn bị vào chai chứa hạt Cytodex để đảm bảo quá trình nuôi cấy diễn ra thuận lợi Chuyển hỗn hợp tế bào và hạt Cytodex vào bình nuôi của hệ thống Microcarrier sử dụng chai 1 lít để đảm bảo lượng tế bào phù hợp Bổ sung môi trường nuôi cấy theo các công thức đã thiết kế, điều chỉnh nồng độ huyết thanh khác nhau để tối ưu hóa sự phát triển của tế bào.
Để chuẩn bị hệ thống nuôi cấy, kết nối bình nuôi sau khi sấy vào bộ điều khiển, sau đó bơm toàn bộ dịch trong bình nuôi ra ngoài và kết nối với chai chứa hạt Cytodex cùng chai chứa hỗn dịch tế bào Tiếp theo, bơm toàn bộ hạt vào trong bình nuôi, sau đó bơm hỗn dịch tế bào và bật cánh khuấy của hệ thống để đảm bảo đồng đều phân bố Kiểm tra lượng hỗn dịch trong bình, kết nối chai môi trường bơm vào và đủ 500ml để duy trì môi trường nuôi phù hợp Bật hệ thống khí chế độ tự động để tự chọn loại khí sục phù hợp cho quá trình nuôi cấy, đồng thời kết nối hệ thống để cân chỉnh điện cực DO và pH nhằm đảm bảo các điện cực hoạt động chính xác và hiển thị đúng các thông số đo lường (Kjell Nilsson, 1988).
1 Kiểm tra đảm bảo điện cực pH đã được nối đúng với bộ điều khiển
2 Cắm điện và bật công tắc nguồn hệ thống nuôi cấy tế bào
3 Chờ cho thiết bị khởi động xong, Manu chính hiện lên
5 Nhấn dòng pH để hiệu chuẩn pH
6 Dùng nước cất rửa sạch điện cực pH, thấm khô bằng giấy thấm, nhúng điện cực vào dung dịch pH 7 chuẩn sao cho phần đầu đo ngập hoàn toàn
7 Nhấn cửa sổ bên dưới dòng Set Zero, dùng bàn phím nhập giá trị 7,00
Hình 3.3 Cân chỉnh điện cực pH
8 Chờ 2-3 phút cho hệ thống cân bằng- giá trị Current value trên màn hình tương đối ổn định.
9 Nhấn Set Zero, dùng bàn phím nhập lại giá trị 7,00 để xác nhận
10 Dùng nước cất rửa sạch điện cực, thấm khô bằng giấy thấm trung tính, sau đó nhúng ngập đầu điện cực vào dung dịch pH 4 chuẩn
11 Nhấn cửa sổ bên dưới dòng Set Span, dùng bàn phím nhập giá trị 4,00
12 Chờ 2-3 phút cho hệ thống cân bằng- giá trị Current value trên màn hình tương đối ổn định