TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Pha ̣m Hồng Ngo ̣c Tên Luận văn: Nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của mô ̣t số chủng Parvovirus gây bệnh trên chó tại Hà Nội
Vật liệu và phương pháp
Địa điểm, thời gian nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/2018 – 05/2019.
Vật liệu nghiên cứu
Mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm Canine Parvovirus được thu nhận tại các phòng khám thú y Hà Nội
Bảng 3.1 Danh sách mẫu CPV thu nhận ở Hà Nội sử dụng trong nghiên cứu giải mã gen
STT Kí hiệu Giống Tuổi Triệu chứng điển hình
VN Fox 3 tháng Tiêu chảy, phân lẫn máu Phân và nước phân
VN Fox 4 tháng Nôn mửa, tiêu chảy
3 HN-VN Becgi e lai 3 tháng Nôn và tiểu ra máu Phân và nước phân
3.2.2 Dụng cụ và thiết bị a Thiết bi ̣
- Tủ lạnh thường; tủ lạnh âm sâu -80 o C (Sanyo, Nhật Bản);
- Máy ly tâm Centrifuge 5415D (Eppendorf, Đức)
- Máy PCR GeneAtlas 322 (Astec, Nhâ ̣t Bản);
- Máy điện di kiểm tra sản phẩm PCR (Bio-Rad, Mỹ);
- Máy soi gel Dolphin-Doc (Wealtech, Mỹ);
- Máy ổn nhiệt (Bio-Rad, Mỹ)
- Máy Votex VM-10 (Daihan, Hàn Quốc)
- Máy vi tı́nh (HP, Mỹ)
- Lò vi sóng (Sam Sung, Hàn Quốc)
Hı̀nh 3.1 Mô ̣t sô trang thiết bi ̣ trong phòng thı́ nghiê ̣m b Dụng cụ
- Bộ pipetman (10àl, 20àl, 100àl, 200àl, 1000àl và 5000 àl)
- Bộ Kit tách chiết GeneJET genomic DNA purification Kit của hãng Thermo (Mỹ)
- Bộ Kit Dream Taq PCR master mix của hãng Thermo (Mỹ)
- Bộ Kit tinh sạch GeneJET PCR purification Kit và GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo (Mỹ)
- Dung di ̣ch Ethidium Bromide
Phương pháp nghiên cứu
Hı̀nh 3.2 Sơ đồ quy trı̀nh thı́ nghiê ̣m 3.3.1 Phương pháp thu nhận mẫu
Mẫu bệnh phẩm được cung cấp bởi phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Các mẫu bệnh phẩm là các tăm bông chứa phân của chó nghi nhiễm Parvovirus được thu thập từ các phòng khám thú y trên địa bàn Hà Nội
Các mẫu đã được chẩn đoán sơ bộ dựa trên quan sát triệu chứng lâm sàng và kiểm tra bệnh tích Sau đó, kết quả xác định dương tính với Canine Parvovirus (CPV) thông qua bộ kit chẩn đoán nhanh Canine Parvovirus Antigen Test Kit Quá trình kiểm tra này được thực hiện bằng phương pháp Blot Test (BINOTE) tại phòng khám thú y, đảm bảo độ chính xác cao trong xác định bệnh.
Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -20 0 C
3.3.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Toàn bộ DNA tổng số, gồm DNA của nhân tế bào chủ và DNA của hệ gen virus, được thu nhận bằng bộ kit tách chiết DNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất Để thu nhận DNA tinh sạch, cần loại bỏ các thành phần tạp nhiễm, đặc biệt là protein, nhằm đảm bảo chất lượng mẫu Quá trình tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử (nucleic acid và protein) trong hai pha không hòa tan như phenol, chloroform và nước, giúp tách biệt và loại bỏ các tạp chất hiệu quả.
Phương pháp tiến hành theo thứ tự:
- Phá vỡ màng tế bào, màng nhân
Sau quá trình tách chiết, DNA tinh sạch được giữ trong thể tích dung dịch lớn, dễ dàng bảo quản Quá trình ly tâm giúp thu nhận DNA dưới dạng cặn tủa, dễ dàng lưu trữ và vận chuyển Khi cần sử dụng, DNA có thể được hòa tan lại trong nước theo nồng độ mong muốn, đảm bảo hiệu quả sử dụng trong các ứng dụng nghiên cứu và sinh học.
Tách chiết DNA tổng số theo hướng dẫn của Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit Các bước cụ thể được thể hiện ở bảng 3.1 như sau:
Bảng 3.2 Quy trình tách chiết DNA tổng số
1 Bổ sung 150 àl H2O vào ống eppendorf chứa tăm bụng cú mẫu bệnh phẩm, vortex nhiều lần, ủ 37 o C qua đêm
2 Bỏ tăm bụng (vắt kiệt nước nhất cú thể), bổ sung 180 àl Digest solution và 20 àl Protease K, vortex
3 Ủ 56 o C, vortex liên tục 10 phút/lần cho đến khi dung dịch đồng nhất
4 Bổ sung 20 àl enzyme RNase A, vortex, để ở nhiệt độ phũng 10 phỳt
5 Bổ sung 200 àl Lysis solution, vortex cho đến khi dung dịch đồng nhất
6 Bổ sung 400 àl Ethanol 50%, vortex
7 Chuyển dịch lên cột lọc, li tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch phía dưới ống hứng
8 Bổ sung 500 àl WB1, li tõm 13.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, bỏ dịch phı́a dưới ống hứng
9 Bổ sung 500 àl WB2, li tõm 13.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, bỏ dịch phía dưới ống hứng
10 Li tâm làm khô ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch phía dưới ống hứng
11 Chuyển cột lọc sang ống thu, bổ sung 45 àl EL, để nhiệt độ phũng 2 phút, li tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút
12 Bảo quản DNA ở nhiệt độ -20 o C
Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng
Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR là khuếch đại một đoạn gen quan tâm bằng mồi đặc hiệu trong điều kiện nhiệt độ phù hợp Mồi tác động trên mạch DNA 5’ – 3’ gọi là mồi xuôi (Forward primer, ký hiệu F), trong khi mồi tác động trên mạch DNA 3’ – 5’ gọi là mồi ngược (Reverse primer, ký hiệu R) Khi các mồi này kết hợp chính xác với các sợi DNA bổ sung của chúng trong điều kiện đã được kích hoạt, các đoạn DNA mục tiêu sẽ được khuếch đại qua phản ứng dây chuyền nhờ enzyme polymerase.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm ba giai đoạn:
Trong Giai đoạn 1 của quá trình, nhiệt độ 94°C trong vòng 5 phút gây ra sự biến tính của DNA mạch kép, khiến các phân tử DNA tách thành sợi đơn Quá trình này tạo điều kiện để các sợi đơn làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào, đồng thời enzyme polymerase xúc tác tổng hợp DNA mới, mở đầu cho quá trình nhân bản DNA hiệu quả.
Giai đoạn 2 của quá trình PCR là gắn mồi, diễn ra ở nhiệt độ từ 50 đến 65°C trong vòng 1 đến 2 phút, tùy thuộc vào đoạn mồi Trong giai đoạn này, các đoạn mồi sẽ bám dính chính xác vào các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tử DNA khuôn, đảm bảo quá trình mở rộng DNA diễn ra hiệu quả.
- Giai đoạn 3: Tổng hợp 68 – 72 o C trong 30 giây – 2 phút Thời gian kéo dài phụ thuộc vào cả DNA – polymerase và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại
Quá trình này diễn ra từ 30 đến 40 chu kỳ, đảm bảo hiệu quả cao trong quá trình làm sạch DNA Sau khi hoàn tất các chu kỳ, nhiệt độ được duy trì ở 72°C trong vòng 5 đến 10 phút để các sợi đơn DNA đóng xoắn lại thành mạch đôi, đảm bảo sự ổn định của DNA tổng hợp.
Kiểm tra sản phẩm PCR được thực hiện trên thạch agarose 0,8 – 1% và băng DNA sẽ được nhìn thấy rõ dưới tia cực tím sau khi được nhuộm Ethidium Bromide
Trong nghiên cứu, cặp mồi sử dụng được thiết kế dựa trên so sánh trình tự tương đồng của chuỗi nucleotide của tất cả các chủng CPV-2 hiện có trong Ngân hàng gen, theo nghiên cứu của Đoàn Thị Thanh Hương và cộng sự năm 2018.
Trình tự của că ̣p mồi như sau:
Mồi xuôi CPVF2b: 5’-TTGGCGTTACTCACAAAGACG- 3’ (vi ̣ trı́ 2160 –
Mồi ngược CPVR4: 5’-GCATTTACATGAAGTCTTGG -3’ (vi ̣ trı́ 5023 –
Că ̣p mồi trên đươ ̣c sử du ̣ng để khuếch đa ̣i vùng gen có kı́ch thước 2,9 kb chứa toàn bô ̣ gen VP2 gồm 1755 nucleotide
Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày trong bảng 3.2 và bảng 3.3:
Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng PCR
Thành phần Thể tớch(àl)
DreamTaq TM PCR Master Mix (2X) 25
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Giai đoa ̣n Nhiệt độ( o C) Thời gian Số chu kì
3.3.4 Phương pháp điện di trên gel Agarose
Phương pháp điện di dựa trên nguyên lý các acid nucleic mang điện tích âm trong môi trường pH trung tính, do có các gốc phosphat trong cấu trúc hóa học của chúng Khi đặt trong một điện trường liên tục, các phân tử di chuyển từ cực âm sang cực dương và dừng lại tại điểm đẳng điện đặc trưng của từng loại acid nucleic Trọng lượng phân tử ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển, với các phân tử lớn di chuyển chậm hơn so với các phân tử nhỏ Sản phẩm điện di được nhận biết bằng cách nhuộm Ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím để xác định vị trí của các phân tử nucleic hoặc protein.
Trong kỹ thuật điện di nghiên cứu di truyền và sinh học phân tử, có hai loại gel chính được sử dụng là gel agarose và gel polyacrylamide Gel agarose thường được dùng trong các máy điện di để phân tách DNA và RNA có kích thước lớn, giúp xác định độ dài của các phân tử nucleic acid Trong khi đó, gel polyacrylamide phù hợp để phân tách các phân tử acid nucleic nhỏ hơn, đặc biệt trong quá trình giải trình tự DNA nhờ khả năng phân tách chính xác và độ phân giải cao Các loại gel này đóng vai trò quan trọng trong các kỹ thuật phân tích gen và nghiên cứu sinh học phân tử.
Chỉ thị phân tử DNA thường được sử dụng là DNA của thực khuẩn thể Lambda, dài 43kb, được cắt thành 8 đoạn bởi enzyme giới hạn HindIII gồm các kích thước 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,125kb Nhờ vào chỉ thị này, người ta có thể xác định chính xác chiều dài của đoạn DNA cần nghiên cứu.
3.3.5 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm sau PCR được kiểm tra điện di trên gel agarose 1%, tinh sạch theo hướng dẫn của kit GeneJET PCR Purification (Thermo, Mỹ)
Các bước cụ thể được trình bày ở bảng 3.4 như sau:
Bảng 3.5 Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR
1 Bổ sung dung dịch Binding Buffer vào ống chứa sản phẩm PCR với tỉ lệ
1:1 theo thể tích, trộn đều bằng pipet
2 Chuyển dịch lên cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch trong ống hứng phía dưới
3 Bổ sung dung dịch 700 àl Wash Buffer, ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 1 phút, loại bỏ dịch trong ống hứng phía dưới
4 Ly tâm làm khô 13000 vòng/phút trong 2 phút
Chuyển cột lọc vào ống Eppendorf 1.5ml để thu DNA Thêm 50µl dung dịch Elution Buffer và để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút Tiếp theo, ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút để thu nhận DNA đã elution Cuối cùng, loại bỏ cột lọc và lưu mẫu DNA để sử dụng tiếp.
3.3.6 Phân tích và xử lý số liệu
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit GeneJET PCR Purification của Thermo (Mỹ), đảm bảo chất lượng cao cho quá trình xử lý mẫu Sau đó, mẫu PCR đã được gửi đến Macrogen tại Hàn Quốc để phân tích và giải trình tự DNA trực tiếp, cung cấp kết quả chính xác và đáng tin cậy cho nghiên cứu của bạn.
Các trình tự gen VP2 của các chủng Canine Parvovirus (CPV) đã được đăng ký trên Ngân hàng gene và các tạp chí quốc tế, đóng vai trò quan trọng trong việc so sánh và đối chiếu với các chuỗi VP2 trong nghiên cứu này Phương pháp phân tích sử dụng phần mềm GENEDOC 2.7 (Nicholas) nhằm nâng cao độ chính xác trong xác định đặc điểm gen của các chủng CPV, góp phần vào việc hiểu rõ hơn về sự đa dạng và đột biến của virus.
Phân tích phả hệ nguồn gốc được thực hiện bằng phần mềm MEGA6.06, sử dụng phương pháp "kết nối liền kề" (neighbor-joining, NJ) để xác định các quan hệ di truyền Độ tin cậy của cây phả hệ được đánh giá bằng hệ số bootstrap 1000, đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của các nhánh phân tích Phương pháp này dựa trên các dữ liệu di truyền, giúp xác định rõ nguồn gốc và mối liên hệ giữa các mẫu vật nghiên cứu một cách chính xác Máy tính MEGA6.06 hỗ trợ mạnh mẽ trong việc xây dựng cây phả hệ, cung cấp kết quả chi tiết phù hợp với tiêu chuẩn phân tích phả hệ hiện đại theo các nghiên cứu của Tamura et al., 2013.
Bảng 3.6 Danh sách các chủng CPV sử du ̣ng trong nghiên cứu
Quốc gia Năm phân lâ ̣p
1 TH1-VN Viê ̣t Nam 2017 Nghiên cứu này
2 TH2-VN Viê ̣t Nam 2017 Nghiên cứu này
3 HN-VN Viê ̣t Nam 2018 Nghiên cứu này