BÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤTBÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤTBÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤTBÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤTBÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤTBÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤTBÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT

SỞ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG THCS – THPT ĐINH THIỆN LÝ

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT

Lĩnh vực nghiên cứu

Hóa – sinh

Người thực hiện:

Phạm Phương Thảo

Đỗ Lê Hoàng

Người hướng dẫn khoa học:

Nguyễn Hoài Phương

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 9 NĂM 2018

LỜI CẢM ƠN

Thầy Nguyễn Hoài Phương, giáo viên bộ môn đã hỗ trợ suốt quá trình thực hiện dự án Thầy Lê Thành Vĩnh và các giáo viên tổ Hóa - Sinh của trường Đinh Thiện Lí đã hướng dẫn đề tài có đường đi đúng đắn

Chân thành cám ơn Tiến sĩ Bùi lan Anh, giảng viên trưởng Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM, thầy Trần Quốc Tân - nghiên cứu viên của Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM, đã nhiệt tình hỗ trợ nhóm dụng cụ và giúp đỡ hướng dẫn thực hiện các thao tác nuôi cấy vi khuẩn và thử hoạt tính của cao

Xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên TP.HCM đã hỗ trợ hóa chất, thiết bị và phòng thí nghiệm để nhóm thực hiện đề tài

MỤC LỤC

Chương 1: Mở đầu

Chương 2: Tổng quan nghiên cứu

2.1.1 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của vỏ măng cụt 5

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu

3.2.2 Khảo sát sự hiện diện của α-mangostin trong các cao phân đoạn 7

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Mục đích nghiên cứu

Măng cụt là một loại trái cây nhiệt đới phổ biến tại Đông Nam Á cũng như tại Việt Nam Phần ruột măng cụt là một loại thực phẩm giàu dinh dưỡng với hương vị thơm ngọt, trong khi đó phần vỏ măng cụt với nhiều hoạt tính sinh học thường bị bỏ phí Các nghiên cứu cho thấy trong vỏ măng cụt chứa nhiều các xanthone mà đặc biệt là α-mangostin có khả năng kháng khuẩn, hoạt tính kháng sinh, kháng dị ứng, kháng oxy hóa, kháng nấm, Hiện nay chỉ có ở Thái Lan có sản phẩm kem trị mụn chiết xuất từ măng cụt, ở Việt Nam chưa có một sản phẩm cũng như công trình nghiên cứu nào về ứng dụng chiết xuất từ

vỏ quả măng cụt trong điều trị mụn Các chế phẩm kem bôi đặc trị mụn hiện nay tại chủ yếu có nguồn gốc hóa học với thành phần chính như lưu huỳnh, benzoyl peroxide Các hoạt tính kháng khuẩn, kháng sinh, chốn oxy hóa cũng như kháng viêm của vỏ măng cụt

có tiềm năng trong việc điều trị mụn Do đó, nhóm thực hiện đề tài đề nghị hướng nghiên cứu sử dụng vỏ quả măng cụt một cách hiệu quả để làm ra chế phẩm có nguồn gốc tự nhiên giúp hỗ trợ điều trị mụn cũng như tận dụng nguồn vỏ măng cụt bị bỏ phí

1.2 Nhiệm vụ của đề tài

Nhiệm vụ 1: Điều chế ra cao thô và các cao phân đoạn từ vở quả măng cụt khô

Nhiệm vụ 2 : Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của cao chiết

Nhiệm vụ 3 : Tạo ra chế phẩm cuối cùng - kem bôi trị mụn

1.3 Đối tượng nghiên cứu, phạm vi nghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Chế phẩm trị mụn chiết xuất từ vỏ quả măng cụt

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Chiết xuất thô từ vỏ quả măng cụt

Cách điều chế chế phẩm trị mụn từ vỏ quả măng cụt

Khả năng diệt khuẩn mụn

1.4 Giả thuyết khoa học

Cao chiết từ vỏ quả măng cụt sẽ có các hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxi là nguồn nguyên liệu tiềm năng để điều chế một chế phẩm trị mụn hiệu quả và an toàn lành tính với da

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Cơ sở thực tiễn

2.1.1 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lá chuối

2.2 Cơ sở lý luận

Các xanthone trong vỏ quả có khả năng chống oxy hóa tốt, giúp cho da khỏe đẹp Khả năng kháng vi khuẩn của các xanthone sẽ giúp tiêu diệt được các vi khuẩn gây mụn Ngoài ra, các xanthone là những chất có từ thiên nhiên, không phải chất nhân tạo hay kháng sinh, cho nên sản phẩm gây mụn sẽ được người tiêu dùng tin tưởng hơn, đặc biệt là khách hàng châu Á do lịch sử sử dụng thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên lâu đời

Sáp ong là lựa chọn phù hợp để tạo ra sản phẩm cuối cùng do những công dụng hữu ích, dễ tiếp cận và phù hợp với thời gian làm đề tài Vaseline sẽ giữ cho hỗn hợp cao - sáp ong không bị khô, và sẽ không ảnh hưởng tới quá trình thử hoạt tính do không có khả năng kháng khuẩn

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nguyên liệu và dụng cụ

3.1.1 Thu mẫu, xử lý mẫu

Măng cụt được mua ở chợ (có nguồn gốc từ Long Khánh, Việt Nam) chọn các quả trái nhỏ, chín, vỏ quả màu tím Vỏ lấy được sau khi tiêu thụ phần ruột (2,5 Kg vỏ quả) Vỏ quả sau khi thu thập được miếng nhỏ vỏ quả, 2- 3 cm và phơi trong bóng râm trong vài ngày (03 - 05 ngày) , đến khi vỏ quả trở nên khô hoàn toàn và cứng Sau đó xay thành bột (1 kg)

Hình 1 Quả măng cụt 3.1.2 Hóa chất

Các hóa chất chiết được sử dụng dung môi tinh khiết của hãng Chemsol

Sắc ký lớp mỏng dùng bảng mỏng Silica gel của Merck

Môi trường nuôi vi khuẩn Lysogeny Broth

Chuẩn định tính α-mangostin được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm hóa hữu cơ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp chiết cao (Cao thô, cao phân đoạn)

Bột vỏ quả măng cụt được ngâm dầm với ethanol Sau mỗi 24 giờ dịch chiết được lọc và tiến hành đuổi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao ethanol thô Sau đó, cao ethanol thô được phần tán vào nước và chiết lỏng lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexane và ethyl acetate) Đuổi dung môi thu được các cao tương ứng

Chiết lỏng lỏng bằng cách cho cao thô đã phân tán trong nước vào chai thủy tinh (khoảng 250 mL), cho tiếp dung môi cần chiết (mỗi lần khoảng 50mL), khuấy từ với tốc

độ 100 rpm trong 15 phút để hỗn hợp khuấy trộn đều Sau đó ngừng khuấy, để yên cho các chất lỏng tách lớp, hút lấy phần dung môi hữu cơ

3.2.2 Khảo sát sự hiện diện của α- mangostin trong các cao phân đoạn

Tiến hành sắc ký lớp mỏng: chấm đồng thời các cao phân đoạn và chất chuẩn α

mangostin để tìm phân đoạn có chứa nhiều αmangostin với hệ dung môi giải li hexane -ethyl acetate 70:30

Cao chiết phân đoạn và chất chuẩn được hoàn tan trong methanol Chấm 10 µL của mỗi dung dịch lần lượt lên lớp mỏng Sau khi dung dịch lên vạch mốc, lấy ra để bay hơi dung môi Hiện vết với dung dung dịch axit sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 110oC đến khi hiện vết

(3)

(4) (5)

Hình 2 (1) Quá trình chiết lỏng lỏng

(2) Dịch hexane sau khi chiết lỏng lỏng

(3) Dịch ethyl acetate sau khi chiết lỏng lỏng (4) Cao hexane (5) Cao ethyl acetate

3.2.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn mụn cao phân đoạn

Propionibacterium acnes, hay P.Acnes hay Cutibacterium acnes, sống trên da và

đóng vai trò lớn trong việc giúp cho da khỏe mạnh Mặc dù vậy, P.Acnes cũng là mầm bệnh tiềm năng gây ra mụn

3.2.3.1 Nuôi cấy

Nhân mụn được lấy từ 5 tình nguyện viên bất kì (da mặt được làm sạch với nước, lau bên ngoài vùng da lấy mụn bằng cồn 70o, dụng cụ lấy nhân mụn được sát khuẩn bằng

ồn 70o và hơ nóng) sau đó được pha loãng với nước muối sinh lý (dung dịch NaCl 0,9 %) Dùng pipet lấy 1 mL dịch vi sinh vật ở độ pha loãng 1/100 vào ống nghiệm 10 mL nước muối vô trùng, lắc bằng tay, được dung dịch có độ pha loãng 1/1000 Tiếp tục làm thế với 3 ống ta được các dịch có nồng độ thấp dần Bỏ các dịch này vào 5 lọ chứa môi trường LB lỏng

Vi khuẩn sau khi hoạt hóa được cấy và trải đều lên đĩa petri chứa môi trường LB-agar trải mỏng

3.2.3.2 Thử hoạt tính với vi khuẩn đã nuôi

Hòa tan các cao chiết trong methanol với nồng độ 10mg/50µL: Cao Ethyl Acetate: 2.045g/1mL methanol Cao Hexane: 2.013g/1mL methanol

Chứng dương: Kanamycin Thực hiện 2 mẫu chứng âm gồm 1 mẫu nước và một mẫu methanol Mẫu thử cao ethyl acetat và cao hexan

Các dung dịch được nhỏ vào các giếng 50 µL tương đương 10 mg hoạt chất

(Kanamycin/ cao ethyl acetat khô/ cao hexan khô)

3.2.3 Điều chế sản phẩm trị mụn

Chiết xuất phân đoạn có hàm lượng cao α-mangostin sẽ được sấy khô và nghiền mịn sau đó được trộn với sáp ong và vaselin

Khảo sát tỉ lệ vaselin và sáp ong để thu được hỗn hợp có độ mềm mịn phù hợp

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát cao phân đoạn chứa α-mangostin

Kết quả sắc ký lớp mỏng cao phân đoạn ethyl acetat, cao hexan và mẫu chuẩn với hệ dung môi Acetone - Ete dầu hỏa tỉ lệ 3:7 cho thấy:

- Trong cao hexane xuất hiện một số vết kém phân cực mà không hiện diện trên sắc

ký đồ của cao ethyl acetate

- Vết α-mangostin hiện diện trong cả cao hexan và cao ethyl acetate

Kết quả cho thấy rằng ở cao ethyl acetate vẫn còn hiện diện α-mangostin có trong cao hexane, chỉ rằng quá trình khuấy chưa chiết kiệt hết α-mangostin Mặc dù vậy, nhóm cũng nhận thấy rằng những chất kém phân cực khác trong cao Hexane lại không hiện diện ở cao ethyl acetate, chứng tỏ chất ɑ-mangostin rất khó tan và không thể chiết kiệt được Vì vậy, nhóm quyết định thử hoạt tính của cả hai cao để tìm ra cao tốt hơn

α-mangostin

(1) (2) (3)

7

Hình 3 Sắc ký lớp mỏng các cao chiết từ vỏ quả măng cụt

4.2 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các cao chiết

Kết quả thử kháng khuẩn được trình bày trong bảng sau

Cao chiết Vòng kháng khuẩn (mm) Trung bình

Chứng âm

Nước Methanol

0 0

0 0

Cao hexane

6,0

5,3 ± 0,8

4,5 5,0 5,0 6,0

Cao ethyl acetate

12,5

10,8 ± 1,7

9,5 12,5 9,5 10,0

Hình 4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

E: cao ethyl acetate H: Cao hexane (+) chứng dương

4.3 Khảo sát tỉ lệ sáp ong và vaselin

Sau khi điều chế được cao và trộn với sáp ong (tỉ lệ 1:10 của sáp ong:cao), đun cách thủy hỗn hợp để sáp ong tan ra tạo hỗn hợp đồng nhất Hỗn hợp sau khi khô lại đông rắn khó sử dụng Do đó, chúng tôi tiến hành thêm vào vaselin để một tạo hỗn hợp mềm mịn hơn

Khảo sát khảo sát cao-sáp ong và vaselin được trình bày trong bảng sau:

Tỉ lệ cao – sáp ong và vaselin Cảm quan

1 : 3 Hỗn hợp màu vàng, khô cứng, mềm, khó bôi

1 : 5 Hỗn hợp màu vàng, khô cứng, mềm hơn, khó bôi

1 : 8 Hỗn hợp màu vàng, mềm mịn, dễ bôi, không rít

tay

1 : 10 Hỗn hợp màu vàng, rất mềm, hơi ướt, dễ bôi,

không rít tay

Từ Kết quả khảo sát chúng tôi quyết định chọn tỉ lệ cao-sáp ong và vaselin là 1 : 8 để điều chế sản phẩm

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN

Kết luận

Đề tài nghiên cứu đã khảo sát được quá trình chiết cao phân đoạn của vỏ quà măng cụt Kết quả cho thấy vì α-mangostin nên cả cao hexan và cao ethyl acetat đều có sự hiện diện của α-mangostin mặc dù các chất kém phân cực khác đã được chiết kiệt với hexan

Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn gây mụn cho thấy các cao chiết đều có khả năng diệt khuẩn mụn tốt đặc biệt là cao ethyl acetat

Sản phẩm thu được khi trộn cao ethyl acetat – sáp ong (1 : 10) và vaselin theo tỉ lệ

1 : 8 thu được dạng kem mềm mịn, màu vàng, không bết dính và rít tay dễ bôi và sử dung

Hướng nghiên cứu phát triển

Khảo sát phương pháp SPE để chiết cao phân đoạn: có thể thay đổi quy trình chiết

để tăng nồng độ các xanthone đặc biệt là α-mangostin bằng cách chiết pha rắn (SPE: solid phase extraction): cao thô methanol được hấp phụ với silica gel sau đó cho vào phễu Buchner, có hút chân không; giải ly với hexan để loại bỏ các chất kém phân cực sau đó là

ethyl acetat hoặc hỗn hợp hexan - ethyl acetat để thu được phân đoạn chứa nồng độ α-mangostin cao hơn

Phân lập các vi khuẩn và định danh cụ thể để thu được các vi khuẩn P acnes các vi

khuẩn từ nhân mụn

Khảo sát khả năng diệt khuẩn mụn của sản phẩm thu được để tìm ra tỉ lệ cao chết – sáp ong thích hợp

Khảo sát điều kiện bảo quản cũng như tính an toàn với da của sản phẩm

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Fabiola Gutierrez-Orozco, Mark L Failla (2013), biological Activities and Bioavailability

of Mangosteen Xanthones: A Critical Review of the Current Evidence, Nutrients, 5, 3163-3183.

2 Guoqing Chen, Yong Li, Wei Wang, Liping Deng (2018), Bioactivity and pharmacological Properties of α-mangostin from the mangosteen fruit: a review, Expert Opinion on

Therapeutic Patents , 415 - 427

3 Human Metabolome Database (HMDB), sổ: Hexane, số HMDB0029600 (Cập nhật lần cuối: 20/5/2018).

4 Ghi chú của EPA Air Toxics về hexane, (9/2016).

5 Human Metabolome Database (HMDB), sổ: Ethyle Acetate, số HMBD0031217 (Cập nhật lần cuối: 20/5/2018).

6 04/2017 sapong.com.vn - Công ty SP Việt Nam sáp ong tự nhiên, sáp ong nguyên chất