Luận văn thạc sĩ HUS phân tích đột biến gen tARN và ND3 của AND ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Đặc biệt, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể như một chỉ thị sinh học đang phát triển nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác nhau liên quan đến các bệnh chuyển hóa hiếm gặp, lão hóa, xác

-   -

NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN

TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

-

Nguyễn Thị Ngọc Tú

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN

TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Trịnh Hồng Thái

Hà Nội – 2012

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT a DANH MỤC CÁC BẢNG c DANH MỤC CÁC HÌNH d

MỞ ĐẦU 1

Chương 1- TỔNG QUAN 3

1.1 TY THỂ 3

1.1.1 Hệ genome ty thể 3

1.1.2 Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể 5

1.1.3 Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thư 7

1.2 UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 10

1.2.1 Khái quát về ung thư đại trực tràng 10

1.2.2 Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng 11

1.2.3 Phân loại các dạng ung thư đại trực tràng theo mô học 12

1.2.4 Các phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng [20] 15

1.3 ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 16

1.3.1 Đột biến gen tARN của ADN ty thể 17

1.3.2 Đa hình trên gen ND3 của ADN ty thể 19

1.3.3 Các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh 22

1.3.4 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 24

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

2.1 NGUYÊN LIỆU 26

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.2 Hóa chất 26

2.1.3 Thiết bị 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số từ mô 28

2.2.4 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn 32

2.2.5 Tinh sạch ADN 35

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN ĐIỂM A3243G CỦA GEN tARN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP 37

3.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thư đại trực tràng 37

3.1.2 Kết quả nhân đoạn gen 3243 của ADN ty thể 38

3.1.3 Kết quả phân tích RFLP đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể 38

3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA HÌNH A10398G CỦA GEN ND3 ADN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP 40

3.2.1 Kết quả nhân đoạn gen 10398 của ADN ty thể 40

3.2.2 Kết quả phân tích RFLP đoạn gen mang đa hình A10398G 41

3.2.3 Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến A10398G 42

3.2.4 Phân tích mối liên quan giữa đa hình A10398G với các đă ̣c điểm bê ̣nh học lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng 46

KẾT LUẬN 59

KIẾN NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC i

Phụ lục 1 Danh sách bệnh nhân cùng đặc điểm lâm sàng i

Phụ lục 2 Kết quả giải trình tự đoạn 10398 vi

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

CPEO Chronic progressive external ophthalmoplegia (Bệnh liệt mắt cơ

ngoài tiến triển mãn)

DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography

(Sắc ký lỏng biến tính hiệu năng cao) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid KSS Kearn–Sayre syndrome (Hội chứng Kearn-Sayre) LHON Leber hereditary optic neuropathy (Bệnh liệt thần kinh thị giác di

truyền Leber)

MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke -like

episodes (Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với các biểu hiện tương tự đột quỵ)

MERRF Myoclonus epilepsy and ragged red fibers (Chứng động kinh co giật

cơ và có sợi đỏ nham nhở)

mtDNA Mitochondrial DNA (ADN ty thể) NARP Neuropathy, ataxia, and retinitis pigmentosa (Bệnh thần kinh, mất

điều hòa và thoái hóa võng mạc)

PCR Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

(Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) ROS Reactive oxygen species (Các loại oxy phản ứng)

SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide)

TNM TumorNodeMetastasis

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Hệ thống phân loại TNM đối với ung thư đại trực tràng [29] 13

Bảng 2 Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác nhau [29] 15

Bảng 3 Thống kê mẫu sử dụng 26

Bảng 4 Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 26

Bảng 5 Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 27

Bảng 6 Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR 29

Bảng 7 Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l 30

Bảng 8 Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII va ̀ DdeI 32

Bảng 9 Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid nucleic [6] 33

Bảng 10 Khả năng phân tách của gel polyacrylamide đối với acid nucleic [6] 34

Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thước 7cm 35 Bảng 12 Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại trực tràng theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75] 4

Hình 2 Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64] 6

Hình 3 Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thư [19] 8

Hình 4 Hình ảnh đại trực tràng [76] 11

Hình 5 Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [77] 15

Hình 6 Một số đột biến điểm trên tARN ty thể người [59] 17

Hình 7 Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô 37

Hình 8 Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3243 38

Hình 9 Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 3243 vớ i enzyme HaeIII 39

Hình 10 Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 10398 41

Hình 11 Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 10398 vớ i enzyme DdeI 42

Hình 12 Kết quả giải trình tự mẫu không mang đột biến A10398G 43

Hình 13 Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể 44

Hình 14 Kết quả giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G 44

Hình 15 Kết quả so sánh trình tự mẫu mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể 45

Hình 16 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí mô 48

Hình 17 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giới tính 49

Hình 18 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo tuổi 50

Hình 19 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí khối u 51

Hình 20 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo kích thước u 52

Hình 21 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo số hạch 53

Hình 22 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giai đoạn TNM 54

Hình 23 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo mức độ biệt hóa 55

MỞ ĐẦU

Ty thể là bào quan phổ biến ở các tế bào nhân chuẩn Ty thể được coi

là trung tâm năng lượng của tế bào, ở đây diễn ra quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành năng lượng mà tế bào có thể sử dụng được là ATP Ngoài ra, ty thể còn đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa khác như apoptosis (quá trình tự chết của tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển quá trình trao đổi chất của tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32] Cho đến nay, người ta

đã thống kê được trên 150 bệnh di truyền theo mẫu hệ khác nhau do ADN ty thể quyết định Các bệnh do rối loạn ADN ty thể thường được biểu hiện rất đa dạng, chúng có thể liên quan đến rối loạn quá trình mã hóa protein hoặc đơn thuần chỉ là những đột biến do thay đổi các nucleotide [57]

Trong vài năm trở lại đây, những rối loạn ty thể liên quan đến các bệnh ty thể được xem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ bản của di truyền học và y học Đặc biệt, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể như một chỉ thị sinh học đang phát triển nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác nhau liên quan đến các bệnh chuyển hóa hiếm gặp, lão hóa, xác định các đặc tính di truyền quần thể sử dụng các dấu chuẩn di truyền của mẹ… Trong số các lĩnh vực này phải kể đến ung thư – đề tài thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học

Ung thư đại trực tràng là một trong các loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới, đứng hàng thứ hai sau ung thư phế quản ở nam giới và ung thư vú ở nữ giới

Trên thế giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh này và hàng năm có thêm khoảng 600000 trường hợp mới được phát hiện [79] Ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng cũng chiếm một tỷ lệ cao, đứng thứ hai về tỷ lệ mắc bệnh của ung thư đường tiêu hóa, chỉ đứng sau ung thư dạ dày Để đạt được hiệu quả điều trị tốt thì bệnh nhân cần được chẩn đoán càng sớm càng tốt Với sự phát triển của khoa học, ngày

nay nghiên cứu ở mức độ phân tử, trong đó có nghiên cứu về đột biến ADN ty thể, đang ngày càng góp phần vào công tác chẩn đoán và điều trị bệnh có hiệu quả

Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng”

với mục đích:

 Phát hiện đột biến gen tARN và ND 3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật PCR-RFLP

 Đánh giá mối liên quan giữa đột biến gen tARN và ND 3 của ADN ty

thể với các đặc điểm lâm sàng của bệnh ung thư đại trực tràng ở người Việt Nam

Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Chương 1- TỔNG QUAN

1.1 TY THỂ

Ty thể là bào quan có chức năng chuyển hóa năng lượng trong chất dinh dưỡng thành năng lượng trong ATP Ty thể có trong tất cả tế bào nhân chuẩn Ty thể được Atman phát hiện vào năm 1894 và đến năm 1897 được Benda đặt tên là mitochondria (theo tiếng Hy lạp- mito là sợi và chondria là hạt) vì chúng thường có dạng sợi, hoặc dạng hạt khi quan sát dưới kính hiển vi thường [3]

Ty thể được coi là trung tâm năng lượng của tế bào vì là nơi chuyển hóa các chất hữu cơ thành năng lượng tế bào có thể sử dụng được là ATP Ngoài ra, ty thể đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa như: Apoptosis (quá trình

tự chết của tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển quá trình trao đổi chất của

tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32]

1.1.1 Hệ genome ty thể

Ty thể có chứa ADN, do đó nó là một hệ di truyền tự lập khác với hệ di truyền của nhân tế bào ADN ty thể là phân tử sợi kép, dạng vòng có kích thước 16569bp, gồm hai chuỗi khác nhau về thành phần nucleotide: chuỗi nặng có chứa nhiều guanine, chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosine Chuỗi nặng mã hóa cho 28 gen, chuỗi nhẹ mã cho 9 gen trong tổng số 37 gen của hệ gen ty thể Trong 37 gen này có

13 gen ghi mã cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa Số gen còn lại ghi mã cho 22 tARN, 2 rARN có vai trò trong sự dịch mã của ty thể [10] (hình 1) Các chuỗi polypeptide còn lại cần thiết cho cấu trúc và chức năng của ty thể đều được ghi mã bởi genome nhân và được tổng hợp trong ribosome của

gen ty thể không có vùng intron và các gen không có, hoặc có rất ít các bazo không

mã hóa ở giữa chúng Trong nhiều trường hợp không xuất hiện các codon kết thúc

mà chỉ có sự polyadenin hóa sau phiên mã D- Loop là vùng duy nhất trong hệ gen

ty thể không tham gia mã hóa Vùng D-Loop có kích thước 1,1 kb chứa các yếu tố quan trọng cho quá trình phiên mã và dịch mã như chứa promoter phiên mã của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, có vùng gắn với các yếu tố phiên mã ADN ty thể…Khi vùng D-Loop xảy ra đột biến sẽ ảnh hưởng tới tính toàn vẹn của các chuỗi polypeptide được mã hóa trong ty thể [41]

Hình 1 Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75]

Các đặc điểm của hệ gen ty thể như không có intron, không có histon bảo vệ, lại phân bố gần chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa, nơi mà các gốc tự do được tạo ra trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, đã làm cho khả năng bị đột biến của ADN

ty thể cao hơn ở nhân (khoảng 10 lần) [51] Bởi ADN ty thể có nhiều bản sao nên phân tử bị đột biến có thể cùng tồn tại với dạng dại (wild type) không bị đột biến, tạo nên hiện tượng không đồng nhất (heteroplasmy) ADN ty thể có thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy) khi tất cả các bản sao của genome ty thể là như nhau

Trong nhiều trường hợp, đột biến dạng heteroplasmy không gây ra những biểu hiện lâm sàng hay cả những biểu hiện hóa sinh cho tới khi nó đạt tới ngưỡng đột biến

[51] Vì vậy, xác định được mức độ không đồng nhất của đột biến ADN ty thể có ý nghĩa cao trong chẩn đoán bệnh ty thể

1.1.2 Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể

Những đặc điểm của hệ gen ty thể được phát hiện từ đầu những năm 1980,

và tới năm 1988 những đột biến đầu tiên có liên quan tới các bệnh đã được tìm thấy [68] Bệnh ty thể là thuật ngữ được dùng để chỉ một nhóm các bệnh gây ra do các

hư hại trong quá trình tạo ATP Khi lượng ATP được sinh ra thấp hơn nhu cầu tối thiểu của mô thì bệnh ty thể sẽ xuất hiện do sự hư hỏng của các protein tham gia vào chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa Số lượng các phân tử ADN ở các mô, các cơ quan là khác nhau do có nhu cầu năng lượng khác nhau Bởi vậy, các mô bị ảnh hưởng nhiều nhất của đột biến ADN ty thể là hệ thống thần kinh trung ương, cơ xương, tim, thận, gan, tụy Các bệnh được mô tả khá rõ dựa trên các biểu hiện lâm sàng, hình thái và hóa sinh, tuy vậy bệnh khó nhận ra bởi biểu hiện lâm sàng của bệnh rất biến đổi và khởi đầu bệnh diễn ra rất âm thầm, đặc biệt trong giai đoạn đứa trẻ còn nhỏ [57] Tuy nhiên, hiện nay, do tiến bộ của các phương pháp sinh học phân tử, việc xác định bệnh ty thể đã có nhiều khả quan Các nghiên cứu dịch tễ học trong những năm gần đây cho thấy bệnh ty thể là một trong những bệnh liên quan đến đột biến gen phổ biến ở người, ảnh hưởng tới ít nhất 1 trên 5000 người trong quần cư dân [22] (hình 2)

Hình 2 Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64]

Cho đến nay đã có hơn 150 đột biến ADN ty thể gây ra các bệnh ở người được phát hiện Các bệnh này có thể xuất hiện ở bất kỳ giai đoạn nào trong cuộc đời, từ đứa bé mới sinh đến người trưởng thành ở mọi lứa tuổi Ngoài ra, nhiều đột biến được di truyền theo dòng mẹ, bởi vậy mà những chẩn đoán cho một người có thể được dùng cho nhiều thế hệ trong gia đình [57] Các nghiên cứu cho thấy đột biến ADN ty thể có liên quan đến tình trạng cơ, thần kinh và tim mạch Các đột biến ty thể gây bệnh bao gồm đột biến điểm và đột biến mất đoạn có liên quan tới các bệnh ở người, hầu hết trong số đó ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương và

ngoại biên Sau đây là một số bệnh có liên quan với đột biến ADN ty thể [57]:

Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON): có tới 16 đột biến điểm

gây bệnh, tuy vậy chỉ có ba đột biến gây bệnh chính chiếm tới 90% là G3460A, G11778A và T14484C Cả ba đột biến này đều ở gen thuộc phức hệ I của chuỗi hô hấp Bệnh tiến triển cấp, bán cấp, mất thị lực trung tâm dẫn đến chức năng thị giác chung giảm kèm chứng loạn màu sắc

Bệnh thần kinh, sắc tố võng mạc, mất điều hòa (NARP): bệnh gây ra bởi đột

biến T8993G trên gen ATPasa 6 thuộc phức hệ V Người bệnh có biểu hiện chậm phát triển, sắc tố võng mạc, mất trí nhớ, mất điều hòa, yếu cơ thần kinh

Hội chứng Leigh: Bệnh cũng gây ra bởi đột biến T8993G trên gen ATPasa 6,

giống với bệnh NARP, tuy nhiên bệnh nhân mang hơn 90% đột biến thể hiện hội chứng Leigh Người bệnh có biểu hiện rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển, biểu hiện sớm trong năm đầu tiên của trẻ, có tổn thương ở một hoặc nhiều khu vực của

hệ thần kinh trung ương

Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với các biểu hiện tương tự đột quỵ (MELAS): bệnh gây ra bởi đột biến A3243G thuộc gen tRNA (leu) Bệnh có các

triệu chứng rối loạn thần kinh trung ương, liệt nửa người, mù và nôn mửa

Chứng động kinh co giật cơ và có sợi đỏ nham nhở (MERRF): Bệnh gây ra

bởi đột biến A8344G, T8356C thuộc gen tRNA (lys) Người bệnh có biểu hiện tai biến, co giật cơ, lưỡi, nhiễu loạn thính giác, suy nhược thần kinh do teo não, nhược

cơ

1.1.3 Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thư

Mối liên quan giữa sự mất chức năng của ty thể với bệnh ung thư đã được Otto Warburg lần đầu tiên phát hiện ra từ những năm 1930, khi ông giả thiết rằng

sự tăng tốc độ của quá trình đường phân hiếu khí trong nhiều loại mô u là do sự hư hại chuỗi hô hấp trong những tế bào này [70] Theo Warburg, một số biến đổi của ty thể có liên quan đến ung thư là những đột biến của ADN ty thể, những biến đổi trong sự biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị của chuỗi hô hấp

Hoạt động của chuỗi hô hấp của ty thể có liên quan với sự tạo thành các loại oxy phản ứng (Reactive oxygen species _ ROS) Trong điều kiện các electron bị thừa quá mức (ví dụ như khi nhu cầu calo tăng lên), hoặc do sự ức chế phức hệ enzym chuỗi hô hấp, các ROS được tạo ra rất nhiều Sự tăng của ROS, hoặc stress oxy hóa có thể gây đột biến ADN ty thể và nhân, làm hư hại các thành phần lipid và

gần chuỗi hô hấp, khả năng sửa chữa sai hỏng bị giới hạn [51] Đột biến ADN ty thể

có thể gây ra sự biểu hiện khác thường của các tiểu đơn vị thuộc chuỗi vận chuyển điện tử được mã hóa bởi ADN ty thể, dẫn đến làm giảm độ hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử, giảm khả năng phosphoryl hóa oxy hóa Khi chuỗi vận chuyển điện

tử bị suy giảm về chức năng, nó sẽ tác động đến quá trình tạo thành ATP và ROS, làm biến ðổi sự biểu hiện của một số gen nhân, tác động đến quá trình điều hòa protein và quá trình tổng hợp nucleotide của tế bào Như vậy biến đổi của hệ gen ty thể có liên quan đến bệnh ung thư [27] Một số đột biến ADN ty thể đã được xác định trong nhiều loại ung thư khác nhau, như ung thư vú, đại trực tràng, buồng trứng, ruột, gan, tụy, tuyến tiền liệt, phổi…Đột biến ADN ty thể có thể xuất hiện ở vùng ghi mã và vùng không ghi mã [19] (hình 3) Cho đến nay nhiều dạng biến đổi ADN ty thể đã được xác định trong ung thư Các biến đổi này bao gồm: đột biến điểm, thêm hoặc mất base, lặp đoạn, mất đoạn và thay đổi số lượng bản sao ADN ty thể

Hình 3 Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thư [19]

Đột biến điểm

Phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thư vú, Tan và cs (2002) đã giải trình tự genome ty thể trên 19 cặp mô ung thư và mô bình thường của cùng bệnh nhân và đã cho thấy có 74% bệnh nhân mang đột biến soma, trong đó có 81,5% đột biến thuộc vùng D-loop, phần còn lại (18,5%) được xác định trong các gen 16S rRNA, ND2 và ATPase 6 [58] Trong số các đột biến trên, đột biến thêm hoặc mất base chiếm 42% thuộc vùng D-Loop, còn lại 52% là đột biến điểm thuộc vùng ghi

mã và không ghi mã [55]

Đột biến ADN ty thể được tìm thấy ở bệnh ung thư đại trực tràng Polyak và

cs đã tìm thấy đột biến ADN ty thể trong các vùng ghi mã ND1, ND4, ND5, cytochrome b, COXI, COXII và COXIII, cũng như các gen rRNA 12S và 16S [53]

Với bệnh ung thư buồng trứng, Liu và cs đã xác định được 60% đột biến ADN ty thể, trong đó phần lớn là dạng đồng nhất (homoplasmy) và hầu hết là đột biến điểm T→C hoặc G→A Bốn vùng có các đột biến này là D-Loop, 12sRNA, 16S rRNA và cytochrome b, chứng tỏ các vùng này là những vùng nóng có khả năng bị đột biến cao trong bệnh ung thư buồng trứng [45]

Phân tích ở bệnh ung thư dạ dày, Wu và cs đã xác định được 48% mang đột biến soma ở vùng D-Loop, trong số đó có tới 67% là đột biến thêm hoặc mất base tại vị trí nucleotide 303-309 (vị trí D310) [72]

Thêm đoạn

Wu và cs đã xác định được đột biến thêm đoạn nhỏ (≈260bp và ≈520bp) trong vùng D-Loop của ADN ty thể trong mô ung thư của 1 bệnh nhân ung thư dạ

dày [72] Hai đột biến này đặc trưng bởi có 2 hoặc 3 đoạn lặp lại kế tiếp nhau

Thay đổi số bản sao ADN ty thể

Biến đổi về số bản sao ADN ty thể đã được phát hiện ở nhiều loại bệnh ung thư Số bản sao ADN ty thể tăng ở ung thư tuyến giáp [47], ung thư phổi [15], ung thư đại trực tràng [44] Biến đổi theo hướng giảm số bản sao ADN ty thể được xác định thấy ở bệnh ung thư vú [63], ung thư biểu mô tế bào gan [42], ung thư buồng trứng [69] Như vậy biến đổi về hàm lượng ADN ty thể có liên quan với loại ung thư

Người ta cho rằng số lượng bản sao ADN ty thể trong bệnh ung thư có thể phụ thuộc vị trí của đột biến trong bệnh ung thư đó Ví dụ như các đột biến trong vùng D-Loop, điều khiển sự nhân bản ADN ty thể sẽ làm giảm số bản copy Mặt khác, đột biến ADN ty thể ở các gen mã hóa cho các protein của chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa lại có thể làm tăng số bản copy, như là một cách để đáp ứng lại sự mất chức năng của ty thể [38]

1.2 UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.2.1 Khái quát về ung thư đại trực tràng

Ung thư đại trực tràng hay còn gọi là ung thư ruột kết (colon cancer) bao gồm ung thư đại tràng và ung thư trực tràng Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N bao gồm các đoạn ruột kết lên (ascending colon), đoạn ngang (transverse colon) và đoạn xuống (descending colon) Trực tràng (rectum) là phần ruột thẳng để chứa phân, nối

giữa đại tràng và hậu môn (hình 4) Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng

và trực tràng, thường hai loại ung thư này có liên hệ với nhau và khó có thể xác định ung thư nào xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau vì thế thường được gọi chung là ung thư đại trực tràng [79]

Hình 4 Hình ảnh đại trực tràng [76]

Ung thư đại trực tràng là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới hiện nay, chiếm tỉ lệ cao thứ 3 trong các trường hợp được chẩn đoán là do ung thư Hàng năm, trên thế giới có khoảng 1 triệu ca mắc mới và trên nửa triệu ca tử vong Tỉ lệ mắc bệnh không giống nhau, ước tính tỉ lệ bệnh nhân ở các nước phát triển (Mỹ, Nhật) cao gấp 4–10 lần các nước đang phát triển Trên thực tế, số lượng bệnh nhân ở cả hai nhóm nước đang gia tăng nhanh chóng do sự già hóa dân số và đời sống ngày càng được nâng cao Ung thư đại trực tràng thường đươ ̣c phát hiện ở giai đoạn sau 45–50 tuổi, ở tuổi 70 là đa số (khoảng ½ số người), tuy nhiên bệnh có

xu hướng trẻ hóa do chế độ ăn uống, sinh hoạt, sử dụng nhiều rượu bia, thuốc lá [78]

1.2.2 Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng

Ung thư đại trực tràng bắt nguồn từ một polyp tuyến khởi sinh Có 2 dạng polyp phổ biến ở ung thư đại trực tràng là: polyp không phải khối u, không phát sinh ung thư sau này và polyp ác tính, sẽ phát triển thành u tuyến nhỏ với mức độ loạn sản cao rồi thành u tuyến lớn và dần hình thành ung thư xâm lấn Tuy nhiên, một vài nghiên cứu lại cho rằng nguy cơ mắc ung thư trực tràng tăng lên ở một số gia đình nhiều thành viên là do ảnh hưởng của dạng polyp không phải khối u [33] Các nhà khoa học chỉ ra rằng có rất nhiều nguyên nhân hình thành ung thư đại trực tràng và tất cả đều dẫn đến

việc biến đổi bệnh học xảy ra ở các tế bào biểu mô đại trực tràng bình thường Thống

kê cho thấy có 2 nhóm nguyên nhân chính gây ra bệnh này đó là:

 Yếu tố di truyền: Hoạt hóa các gen tiền ung thư, bất hoạt các gen ức chế khối

u, sai hỏng trong sửa chữa ADN và di truyền gia đình

 Yếu tố không di truyền: các tác nhân vật lí, hóa học; quá trình lão hóa, chế

độ ăn uống ít xơ, giàu đạm hay thói quen sử dụng bia rượu, hút thuốc lá thường xuyên có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng, gây viêm loét đại tràng

Ngoài 2 nhóm nguyên nhân chính trên còn có các nguyên nhân khác như tuổi, giới tính, chủng tộc cũng góp phần làm tăng nguy cơ dẫn đến ung thư đại trực tràng [33]

1.2.3 Phân loại các dạng ung thư đại trực tràng theo mô học

Theo phân loại mô học của Tổ chức Y tế thế giới năm 2000, các u biểu mô đại trực tràng gồm các dạng: u tuyến, ung thư biểu mô, carcinoid (u nội tiết biệt hóa cao), ung thư biểu mô tuyến – carcinoid kết hợp Ngoài ra, một số dạng hiếm gặp khác như sacom (gồm các sacom cơ trơn, sacom mạch máu, sacom mỡ với tổn thương dạng khối lớn), u hắc tố ác tính, ung thư biểu mô tế bào hình thoi (xuất hiện riêng lẻ hay kết hợp với ung thư biểu mô tuyến hoặc ung thư biểu mô vảy và được gọi là ung thư biểu mô – sacom), ung thư biểu mô tế bào sáng (xuất hiện riêng lẻ hay kết hợp với một loại khác của ung thư đại trực tràng), ung thư biểu mô vảy đơn thuần…Trong các dạng này thì ung thư biểu mô tuyến là dạng rất hay gặp, chiếm đến 95% trong tổng số các dạng ung thư đại trực tràng Đây là dạng ung thư xuất phát từ niêm mạc ruột với tổn thương ban đầu có dạng nốt nhỏ, gồ cao, khi có phát sinh từ một u tuyến, biểu hiện của nó được xác định theo các giai đoạn phát triển và loại cấu trúc trước đó là dạng polyp hay dạng nhú [7]

Hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng:

Việc xác định giai đoạn của ung thư cho biết kích thước của khối u và mức độ lan rộng của nó khỏi vị trí ban đầu có ý nghĩa rất quan trọng, giúp cho bác sĩ quyết định liệu pháp phù hợp nhất để điều trị ung thư Hiện nay có một số hệ thống phân giai đoạn ung thư được sử dụng rộng rãi trên thế giới Sự khác nhau giữa các hệ thống này phụ thuộc vào mục đích của từng người sử dụng trong việc chẩn đoán và

bệnh án của từng bệnh nhân [20] Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đề cập

đến hệ thống TNM (Tumor–Lymph Node–Metastases) Đây là hệ thống phân loại

được áp dụng đối với các mẫu chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu

Hệ thống TNM phân giai đoạn ung thư đại trực tràng dựa vào kích thước, mức

độ lan rộng của khối u đến các hạch bạch huyết (Bảng 1) Trong đó:

T cho biết kích cỡ, mức độ lan sâu vào thành ruột của khối u

N cho biết cho khối u đã lan đến các hạch bạch huyết chưa và số lượng hạch bạch

huyết bị lây nhiễm

M cho biết mức độ di căn của ung thư đến các cơ quan hoặc bộ phận khác của cơ thể

Bảng 1 Hệ thống phân loại TNM đối với ung thư đại trực tràng [29]

T – Khối u nguyên phát

Tx U nguyên phát không được đánh giá

T0  Không có bằng chứng của u nguyên phát

Tis – Ung thư biểu mô tại chỗ: nội biểu mô hay xâm nhập lớp đệm

T1 – Ung thư biểu mô xâm nhập hạ niêm mạc

T2 – Ung thư biểu mô xâm nhập lớp đệm cơ niêm

T3 – Ung thư biểu mô xâm nhập qua lớp đệm cơ niêm tới dưới thanh mạc hoặc vào mô quanh đại tràng và trực tràng không có phúc mạc

T4 – U xâm nhập trực tiếp các cơ quan khác hoặc cấu trúc và/ hoặc gây thủng phúc mạc tạng

N – Hạch lympho

Nx – Hạch bạch huyết vùng không được đánh giá

N0 – Không di căn hạch bạch huyết vùng

Nói chung, ung thư đại trực tràng được chia làm các giai đoạn (hình 5) [29]:

 Giai đoạn 0: Trong giai đoạn 0, các tế bào bất thường được tìm thấy trong các lớp trong cùng của đại trực tràng Những tế bào bất thường có thể trở thành ung thư và

lây lan vào các mô bình thường gần đó Giai đoạn 0 cũng được gọi là ung thư biểu

mô tại chỗ

 Giai đoạn I: Ung thư đã bắt đầu lây lan, nhưng vẫn còn trong lớp lót bên trong

 Giai đoạn II: Ung thư đã lan đến các cơ quan khác ở gần đại trực tràng hoặc trực tràng nhưng chưa lây lan đến các hạch bạch huyết

 Giai đoạn III: Ung thư đã lan đến hạch bạch huyết nhưng chưa lan đến những phần xa của cơ thể

 Giai đoạn IV: Ung thư đã lan đến các phần xa của cơ thể thông qua hệ thống bạch huyết, được gọi là di căn Các cơ quan mà ung thư đại trực tràng thường di căn đến

là phổi và gan

Hình 5 Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [77]

Tỷ lệ sống sót của bệnh nhân ở các giai đoạn bệnh được thể hiện trong bảng 2

Bảng 2 Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác nhau [29]

Giai đoạn TNM Khả năng sống sót sau 5 năm

Giai đoạn IIIC T bất kỳ, N2M0 2527%

Giai đoạn IV T bất kỳ, N bất kỳ, M1 07%

1.2.4 Các phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng [20]

Ngày nay, sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là các kỹ thuật sinh học phân tử đã góp phần chẩn đoán, phân biệt, phát hiện sớm và theo dõi hiệu quả điều trị ung thư đại trực tràng Các phương pháp chẩn đoán bệnh này bao gồm:

 Chẩn đoán lâm sàng có thể dựa trên các triệu chứng: tiêu chảy hoặc táo bón,

có máu lẫn trong phân, phân chặt, khó chịu chung ở bụng (căng phồng hoặc co thắt), đầy hơi thường xuyên, sụt cân không rõ lý do

 Chẩn đoán hình ảnh: phương pháp phổ biến nhất hiện nay đó là nội soi đại

tràng sigma bằng ống soi mềm giúp nhìn rõ các khối u và làm sinh thiết

 Chẩn đoán mô học và tế bào học: phương pháp này cho phép phân biệt giữa

các tế bào bình thường, loạn sản và ung thư biểu mô tại chỗ Phổ biến hơn cả là kỹ thuật chọc hút kim nhỏ

 Chẩn đoán dựa vào xét nghiệm sinh hóa máu: Một số các xét nghiệm phổ

biến có thể kể tới là xét nghiệm sinh hóa phát hiện kháng nguyên ung thư (CEA), xét nghiệm máu trong phân (FOBT)

1.3 ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu phát hiện đột biến ADN ty thể ở vùng mã hóa và vùng không mã hóa (D-Loop) ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Năm

1998, Polyak và cs đã xác định được đột biến ADN ty thể ở các vùng mã hóa: ND1,

ND4L, ND5, cytochrome b, COXI, COXII và COXIII, cũng như các gen rRNA 12S

và 16S [53]

Trong một nghiên cứu khác, Mansoureh và cs khi phân tích cặp mô thường

và mô bệnh của 30 bệnh nhân ung thư đại trực tràng, đã phát hiện 15 mẫu mang đột biến trên vùng ND1, trong đó có 7 đột biến khác nhau Đột biến T4216C chiếm 27%, khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa mô thường và mô bệnh [49]

Alonso và cs (1997) xác định sự có mặt của đột biến ADN ty thể (23%) trên vùng D-Loop Những đột biến này là đột biến điểm A→T, G→C, đột biến mất 1bp, và đột biến thêm 2 bp [9] Skonieczna và cs (2012) khi tổng kết lại một số nghiên cứu về đột biến điểm của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thấy rằng 88,6% đột biến là dạng transition (biến đổi giữa các purin (A, G) hoặc giữa các pyrimidine (C, T), 11,4% còn lại là đột biến dạng transversion (biến đổi giữa một purin với một pyrimidine) Khoảng 19% đột biến điểm nằm trên các gen rRNA

60% đột biến nằm trên các gen mã hóa cho protein, trong đó 85% số đột biến này làm thay đổi acid amin [56] Trong luận văn này chúng tôi muốn đi sâu vào đột biến ADN ty thể trên gen tARN (Leu) (tại vị trí A3243G) và gen ND3 (tại vị trí A10398G)

1.3.1 Đột biến gen tARN của ADN ty thể

Đột biến điểm tARN ty thể là đột biến chiếm phần lớn trong các đột biến ty thể gây ra bệnh ty thể Hai đột biến tARN được phát hiện đầu tiên là A8344G trên tRNALys và A3243G trên tARNLeu(UUR) là phổ biến và được nghiên cứu nhiều nhất

Đột biến A3243G có liên quan đến rất nhiều biểu hiện lâm sàng và thường gây ra hội chứng MELAS [31] MELAS cũng có thể bị gây ra bởi những đột biến khác trên tARNLeu(UUR) Đột biến A8344G liên quan đến chứng MERRF, cũng là bệnh về

cơ thần kinh Bệnh này còn có thể bị gây ra bởi một vài đột biến khác trên tRNALys

[56] Ngoài ra, có thể kể đến đột biến A7445G trên tARNSer(UCN) có liên quan đến bệnh mất thính giác [54], đột biến A4269G trên tRNAIle gây bệnh liệt cơ tim hoặc liệt mắt cơ ngoài tiến triển mãn (CPEO) [59] (hình 6)

Hình 6 Một số đột biến điểm trên tARN ty thể người [59]

1.3.1.1 Đột biến A3243G và các bệnh liên quan

Đột biến A3243G trên gen MT -TL1 mã hóa cho tRNALeu (UUR)

đã đươ ̣c phát hiện ra đầu tiên như là mô ̣t nguyên nhân di truyền củ a bệnh MELAS [31] Đột biến A3243G liên quan tớ i MELAS là mô ̣t trong số những đô ̣t biến gây bê ̣nh phổ biến nhất của ty thể với tần số đư ợc xác định trong khoảng từ 0,95- 18,4/100000 dân số

Bắc Âu [22] Đột biến điểm mtDNA A3243G được gây ra bởi sự thay thế Adenine ở

vị trí 3243 thành Guanine trên gen mã hóa cho tRNALeu (UUR)

của ADN ty thể Đột biến này làm thay đổi nucleotide của bô ̣ ba đối mã dẫn đến ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp protein ty thể và giảm hoa ̣t động của các phức hệ của chuỗi hô hấp [28]

Cũng giống như nhiều đột biến ảnh hưởng tới chuỗi hô hấp , đột biến A3243G không chỉ có ảnh hưởng tới bê ̣nh MELAS , nó còn ảnh hưởng tới m ột số bệnh khác , gồm CPEO và DMDF (đái tháo đư ờng và điếc )…[36] Đột biến này thường ở da ̣ng không đồng nhất (heteroplasmic), có nghĩa là ADN dạng dại và dạng đột biến cùng t ồn tại trong một tế bào Các biểu hiện lâm sàng của bệnh xuất hiện khi các phân tử ADN mang đột biến đạt đến một tỷ lệ nhất định Tỷ lệ này ở các mô

và các bệnh khác nhau là khác nhau Wallace và cs (2002) đã xác định được tỷ lệ không đồng nhất ở trong máu bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường do bị đột biến A3243G ADN ty thể là 10%, trong khi đó tỷ lệ này trong mô cơ hoặc não ở bệnh nhân mắc bệnh MELAS có thể tới 70% [67]

1.3.1.2 Đột biến A3243 và bệnh ung thư đại trực tràng

Cho đến nay các nghiên cứu về đột biến A3243G chỉ tập trung vào một số bệnh cơ thần kinh, tiểu đường Chỉ có một nghiên cứu duy nhất phát hiện đột biến A3243G trên bệnh nhân ung thư trực tràng Lorenc và cs (năm 2003) khi nghiên cứu các đột biến ADN ty thể gồm đột biến tRNA, rRNA và một số gen ty thể trên một số mẫu ung thư, đã phát hiện một mẫu ung thư trực tràng có đột biến A3243G dạng đồng nhất (homoplasmic) [46]

1.3.2 Đa hình trên gen ND3 của ADN ty thể

Cũng giống như genome nhân, hệ gen ty thể mang những trình tự đa hình

Đa hình là sự khác biệt về chuỗi ADN giữa những cá thể, các nhóm, hoặc các quần thể Nó bao gồm đa hình đơn nucleotide (Single nucleotide polymorphism - SNP), các chuỗi lặp, thêm đoạn, mất đoạn và tái tổ hợp Đa hình gen có thể là kết quả của

sự thay đổi quá trình, hoặc được tạo nên bởi yếu tố bên ngoài (như virus hoặc chiếu xạ) [35] Người ta cho rằng đa hình giúp ty thể ít nhạy cảm hơn với sự thay đổi năng lượng, do đó tạo nhiều nhiệt và các gốc tự do, giúp con người thích ứng khi di

cư tới nơi có khí hậu lạnh hơn, như từ châu Phi sang châu Âu [52] Ngày nay, số lượng đa hình được biết đến đã vượt quá 1000 [22] Một số nghiên cứu gần đây cho thấy đa hình ở ty thể có liên quan đến một số bệnh như: đái đường [34] , bệnh Parkinson [22], Alzheimer [24], và một số bệnh ung thư như ung thư vú [18], ung thư tuyến tiền liệt [16], ung thư đại trực tràng [40], ung thư phổi [23]…

1.3.2.1 Đa hình A10398G và các bệnh

Vị trí nucleotide 10398 trên gen ND3 trong hệ genom ty thể người có tính đa hình cao Đa hình này làm biến đổi Threonine (alen A) thành Alanine (alen G) ở đầu C của dưới đơn vị ND3 của phức hệ I của chuỗi hô hấp Đa hình 10398A tăng trong các bệnh thoái hóa thần kinh tuổi già như bệnh Parkinson [66], Alzheimer [65], và bệnh teo cơ xơ cứng [48] Ngoài ra trong một nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc đã cho thấy alen G trong thay thế 10398AG làm tăng nguy cơ gây hô ̣i chứng chuyển hóa [34]

A10398G là một trong những SNP thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học bởi nó có liên quan với việc tạo thành những khối u Canter và cs (2005) lần đầu tiên phát hiện mối liên quan giữa đa hình 10398A với bệnh ung thư vú trên những người phụ nữ Mỹ gốc Phi, nhưng không thấy mối liên hệ nào ở người Mỹ da trắng Các tác giả cho rằng sự tương tác giữa các yếu tố gen và môi trường có thể gây ra sự khác nhau giữa các tộc người [18] Tuy vậy, trong một số nghiên cứu khác trên đối tượng là phụ nữ Mỹ gốc Phi không thấy vai trò của đa hình 10398A đối với

khác nhau về kết quả của các nghiên cứu này là do sự khác nhau của các điều kiện trong các khu vực địa lý khác nhau Bai và cs (2007) khi nghiên cứu trên 156 người phụ nữ Mỹ gốc Âu mắc bệnh ung thư vú và 260 mẫu đối chứng thấy rằng 10398G

có liên quan với làm tăng nguy cơ ung thư vú [12] Một nghiên cứu độc lập khác cũng phát hiện 10398G có liên quan với sự phát triển ung thư vú trên đối tượng là người Ba Lan [25] Khi nghiên cứu trên đối tượng là người Mỹ gốc Phi mắc ung thư tiền liệt tuyến, người ta thấy rằng 10398G làm tăng tỷ lệ và mức độ ác tính của bệnh Trong một nghiên cứu khác, 10398G được tìm thấy ở bệnh ung thư tuyến giáp [74] Nghiên cứu của Choi và cs (2011) đã xác định vị trí 10398 trên gen ND3 là điểm nóng gây đột biến ở bệnh ung thư phổi [23] Theo trình tự ADN ty thể sửa lại của Cambridge, base kiểu dại là A, tuy vậy ở nhiều quần thể G lại là kiểu dại [11] Kết quả của các nghiên cứu về đa hình A10398G còn nhiều trái ngược và chưa kết luận được alen nào có liên quan đến bệnh lý

Để giải thích cho những kết quả dường như trái ngược này, Fang và cs (2010) cho rằng sự kết hợp giữa đa hình nucleotide đơn của ADN ty thể với các yếu

tố khác được mã hóa bởi nhân có thể đóng vai trò trong việc hình thành khối u Kết quả tiếp theo có thể là sự thay đổi của tín hiệu calci hoặc tín hiệu khử [30] Ngoài

ra, theo một số nhà nghiên cứu, sự tăng của ROS là một cơ chế mà nhờ đó các SNPs

ty thể tham gia vào quá trình phát triển khối u Nó có thể hoạt hóa con đường hình thành ung thư, hoặc có thể hoạt hóa phản ứng apoptosis (chết theo chương trình) vốn đóng vai trò bảo vệ trong giai đoạn cuối của ung thư Kết quả của sự biến đổi A→G ở vị trí 10398 dẫn tới sự thay thế threonine bằng alanine ở vị trí 114 thuộc dưới đơn vị ND3 của phức hệ I Phức hệ này có tham gia vào quá trình tạo gốc tự

do trong ty thể, cung cấp electron cho oxy, tạo thành superoxide anion O2

- Sự biến đổi của gen ND3 thuộc phức hệ I có thể đã làm tăng sự thoát ra của electron và sự tạo thành ROS Để hiểu hơn về vai trò của alen A và G trong đa hình A10398G, nhóm nghiên cứu của Kazuno (2006) đã xác định sự ảnh hưởng của đa hình ADN ty thể tới giá trị pH của chất nền và sự biến đổi của calci nội bào Kết quả nghiên cứu cho thấy cybrid mang đa hình 10398A có pH chất nền ty thể thấp hơn cybrid mang

10398G Ngoài ra, 10398A cybrid có nồng độ calci tăng và có thể đạt mức calci cao hơn khi bị kích thích bởi histamine so với 10398G [37] Ngoài ra, threonine có thể tạo liên kết hidro liên kết chéo giữa các chuỗi protein và dễ dàng chịu sự biến đổi sau dịch mã Trong khi đó, nguyên tử carbon ở vị trí α của alanine liên kết với nhóm methyl Nhóm methyl này không hoạt hóa và gần như không tham gia trực tiếp vào chức năng của protein Tuy vậy, sự thay thế của các acid amin này vẫn chưa được nghiên cứu ở mức độ hóa sinh in vivo

1.3.2.2 Đa hình ADN ty thể với ung thư đại trực tràng

Nghiên cứu về SNPs trên bệnh ung thư đại trực tràng đã được Lascorz và cs (2012) thực hiện trên 613 bệnh nhân ở khu vực miền bắc nước Đức [40] Kết quả cho thấy có hai SNPs thuộc vùng UQCRB (phức hệ III)là rs7836698 và rs10504961

có liên quan với khả năng sống sót Ba SNPs có liên quan với sự tiến triển của bệnh ung thư đại trực tràng, trong đó hai SNPs thuộc gen COX6B1 (phức hệ IV) là rs6510502 và rs10420252 có liên quan tới sự xuất hiện của hạch lympho, rs6510502 còn liên quan tới di căn xa Đa hình rs7971637 trên gen GAPDH có liên quan tới khối u giai đoạn T3/T4

Nghiên cứu về đa hình của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng trên quần thể người Anh và Scotland cho thấy có 132 SNPs ở quần thể người Anh

và 140 SNPs ở quần thể người Scotland [61, 71] Ở quần thể người Scotland, alen G xuất hiện cao hơn ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở vị trí 750, 1438 (trên gen 12 rRNA), 4769 (trên gen ND2) Ở quần thể người Anh không quan sát thấy mối quan

hệ này

Cho đến nay, trên thế giới có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa đa hình A10398G với bệnh ung thư đại trực tràng Fang và cs (2010) khi nghiên cứu các đa hình đặc trưng của các nhóm đơn bội (haplogroups) trên 108 bệnh nhân mắc bệnh ung thư vú, đại trực tràng và tuyến giáp ở khu vực miền Nam Trung Quốc đã tìm thấy mối liên quan giữa các bệnh nhân thuộc nhóm M với tăng nguy cơ mắc ung thư vú, thuộc nhóm D4a với tăng nguy cơ ung thư tuyến giáp Tuy nhiên, các

trong đó có đa hình A10398G thuộc nhóm N với sự tiến triển của bệnh ung thư đại trực tràng [30] Mối liên quan giữa nhóm đơn bội trong quần thể người Anh và Scotland với bệnh ung thư đại trực tràng cũng được phân tích ở các nghiên cứu [61, 71], tuy vậy không phát hiện được sự khác biệt nào có ý nghĩa thống kê

1.3.3 Các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh

Các đột biến ADN ty thể phần lớn ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy), các đặc điểm lâm sàng của bệnh chỉ biểu hiện khi tỷ lệ không đồng nhất này đạt đến một mức độ nhất định tùy thuộc vào loại mô, tế bào Bởi vậy để chẩn đoán được bệnh chính xác và kịp thời, người ta thường sử dụng các kỹ thuật phân tích trực tiếp ADN ty thể

Phương pháp PCR-RFLP

Phương pháp cơ bản và được sử dụng phổ biến nhất để xác định đột biến điểm của ADN ty thể là PCR-RFLP Đây là sự kết hợp kỹ thuật PCR với kỹ thuật xác định đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP) Đầu tiên, đoạn ADN ty thể

có chứa đột biến được nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR sau

đó được cắt bởi enzym giới hạn thích hợp Cuối cùng, các đột biến sẽ được nhận biết qua phổ băng điện di Phương pháp PCR-RFLP giúp phát hiện đột biến thuận lợi, nhanh chóng và không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền

Phương pháp giải trình tự

Để khẳng định chính xác đột biến, người ta phải xác định trình tự nucleotide đoạn ADN mang đột biến Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977, được gọi là phương pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phương pháp dideoxy)

Theo phương pháp này, một trình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng cách sử dụng một oligonucleotide ngắn, có trình tự bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó Các mồi oligonucleotide được kéo dài nhờ tác dụng của enzyme ADN polymerase Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại deoxynucleotide A, T, G, C trong đó có một loại là di-deoxynucleotide để ngắt phản ứng kéo dài chuỗi Các đoạn ngắn ADN mới được tổng hợp sau đó được điện di

trên gel polyacrylamide, hình ảnh thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự ADN Ngày nay, phương pháp giải trình tự tự động được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý như trên

Người ta đã tiến hành cải tiến, sử dụng chất huỳnh quang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy rất cao Ưu điểm lớn nhất của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến như: loại đột biến, vị trí, hậu quả Tuy nhiên nó có hạn chế là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền Ngoài ra, tỷ lệ không đồng nhất

mà phương pháp này có thể xác định được khoảng 25% trở lên

Với mục tiêu phát hiện sớm bệnh ở giai đoạn đầu để điều trị, người ta sử dụng một số phương pháp có khả năng phát hiện mức độ không đồng nhất của ADN

ty thể ở một tỷ lệ rất thấp mà phương pháp PCR-RFLP không phân tích được Đó là

phương pháp PCR định lượng (Realtime PCR) và sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (DHPLC)

Phương pháp Realtime PCR

Realtime PCR sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại quá trình tăng lượng ADN được nhân lên trong phản ứng PCR tỷ lệ thuận với sự tăng tín hiệu huỳnh quang PCR định lượng cho phép xác định số bản sao ADN ty thể ban đầu có trong mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao Có hai loại phương pháp phân tích hay được sử dụng:

- Phương pháp sử dụng chất nhuộm màu gắn với ADN: Chất nhuộm này có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi ADN, làm cho sợi đôi ADN phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích

- Phương pháp sử dụng đầu dò oligonucleotide có gắn phân tử huỳnh quang

Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của đầu dò lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, khi đó sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận được nguồn sáng kích thích

Phương pháp PCR định lượng cho phép định lượng đột biến ADN ty thể với mức

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (DHPLC)

Phương pháp DHPLC sử dụng cột sắc ký kỵ nước trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN dị sợi kép (heteroduplex) với đồng sợi kép (homoduplex) tại nhiệt độ tối ưu Các mạch ADN được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường [43] Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ty thể, hoặc một vùng nhất định của ADN ty thể để xác định đột biến Để định lượng mức độ không đồng nhất của ty thể, người ta đã xác định mối quan hệ giữa diện tích của đỉnh sắc ký có dị sợi kép và mức độ không đồng nhất của

ty thể Phương pháp DHPLC cho phép định lượng đột biến ADN ty thể thấp tới 1%

[43]

1.3.4 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Cho đến nay các nghiên cứu về đột biến ADN ty thể ở người Việt Nam vẫn chưa nhiều, số liệu còn hạn chế và chưa có tính hệ thống

Phan Văn Chi và cs (2004) khi nghiên cứu giải mã genome ty thể các tộc người Việt Nam đã tìm thấy một số biến đổi của ADN ty thể ở người Việt Nam

thuộc vùng D-loop, các gen ND1, ND2, ND5, ND6, cytochrome b, rRNA 12S, rRNA

16S, COXI, COXII, COXIII, ATP6, ATP8 Ngoài ra, trong nghiên cứu này đã tìm

thấy đột biến A3243G ở bệnh nhân mắc bệnh MELAS (2/34 bệnh nhân mang đột biến) [2]

Chu Văn Mẫn và cs (2009) đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP kết hợp giải trình tự ADN và đã xác định thấy đột biến A3243G có mặt ở bệnh nhân và mẹ bệnh nhân trong một gia đình có người mắc hội chứng MELAS [4]

Phạm Hùng Vân và cs (2010) đã sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp ADN ty thể tách chiết từ máu bệnh nhân mang bệnh LEBER, và đã xác định thấy 9/12 ca có đột biến ADN ty thể, 7 trong số 9 ca này mang đột biến G11778A là đột biến nặng và thường gặp nhất, 2 ca còn lại mang đột biến T14484C [8]

Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Hữu Nghĩa đã sử dụng phương pháp giải trình

tự tách dòng, và đã xác định thấy nhiều đột biến (tại 14 vị trí) trên vùng D-Loop ở một người lao động thường xuyên tiếp xúc với bức xạ ion hóa [5]

Liên quan đến xác định đột biến ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư người Việt Nam, kết quả thu được còn rất ít Cho đến nay, chúng tôi chỉ tìm thấy 1 nghiên cứu trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú [1] Nghiên cứu được thực hiện với số mẫu hạn chế (2 bệnh nhân) Kết quả phân tích đã cho thấy có đột biến điểm và đột biến mất đoạn 280 bp trong vùng D-loop của bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam

Như vậy, như đã tổng quan ở trên, các nghiên cứu điều tra trên thế giới đã cho thấy đột biến ADN ty thể liên quan chặt chẽ với nhiều loại bệnh, nhất là bệnh ty thể và bệnh ung thư Đối với bệnh ung thư đại trực tràng, để đạt được hiệu quả điều trị tốt thì bệnh nhân cần được chẩn đoán càng sớm, càng tốt Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu những biến đổi của các gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng với mục đích tìm ra mối liên quan giữa những biến đổi này với các đặc điểm lâm sàng của bệnh, từ đó giúp cho việc việc chẩn đoán sớm và theo dõi sau điều trị của bệnh ung thư đại trực tràng được tốt hơn

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được lấy tại

vị trí khối u và vị trí lân cận khối u (cách khối u khoảng 5-10 cm) Mẫu mô sử dụng trong nghiên cứu này gồm 61 mẫu do Khoa Tế bào – Giải phẫu bệnh, bệnh viện K Tam Hiệp – Hà Nội và Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức – Hà Nội cung cấp trong thời gian từ tháng 8 năm 2010 đến tháng 6 năm 2012 Mẫu sử dụng đã được thống kê ở bảng 3

Mẫu mô được đựng trong ống eppendorf, vận chuyển từ bệnh viện về trong nitơ lỏng và bảo quản trong tủ lạnh sâu âm 80C cho tới khi tiến hành những nghiên cứu tiếp theo

Bảng 3 Thống kê mẫu sử dụng

Bệnh viện cung cấp mẫu Số mẫu Ung thư

đại tràng

Ung thư trực tràng

Ung thư giữa đại và trực tràng

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 4

Bảng 4 Các hóa chất đươ ̣c sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích

số QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN (Đức) Tinh sạch ADN

SDS, Acrylamide, Bis-Acrylamide Pharmacia (Thụy

Điển)

Các cặp mồi 10398, 3243 IDT (Mỹ)

PCR

Enzyme Fastdigest® HaeIII Enzyme Fastdigest®DdeI

Bảng 5 Các thiết bị đươ ̣c sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất

1 Máy PCR (GeneAmp PCR system 9700) Applied BioSciences (Mỹ)

3 Bể điện di Mini–Sub Cell GT, MiniProtean 3 cell Bio–rad (Mỹ)

7 Máy làm khô chân không (Speed Vac) Thermo Electron (Mỹ)

Ngoài ra, còn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân phân tích, cân kỹ thuật, máy vortex, máy minispin, lò vi sóng…

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để tiến hành phân tích đột biến A3243G và A10398G, chúng tôi thực hiện phương pháp PCR-RFLP Trước hết ADN tổng số được tách chiết từ mô u và mô lân cận u Tiếp đó, đoạn ADN chứa đột biến được nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu Sự có mặt của đoạn gen chứa đột biến này được kiểm tra bằng phương pháp điện di Bước tiếp theo chúng tôi thực hiện cắt đoạn gen này bằng enzym giới hạn thích hợp để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di Để khẳng định kết quả, đoạn gen chứa đột biến được tinh sạch và được gửi đi giải trình tự

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số từ mô

Mẫu mô đại trực tràng bao gồm mẫu mô u và mẫu mô lân cận khối u của cùng một bệnh nhân được lấy ra từ tủ 80C, rã đông và rửa bằng đệm Kali phosphate 100mM, pH 8,0 Sau khi rửa, hai mẫu mô được cân với lượng tương đương 0,03–0,05g/mẫu và cho vào hai ống eppendorf riêng biệt

Tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit tách chiết ADN từ mô- QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất

 Bổ sung vào mỗi ống epp: 180 µl buffer ATL và 20 µl proteinase K, vortex

và ủ ở 56ºC trong khoảng 3h để mô được thủy phân hoàn toàn

 Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp

 Thêm 200 µl buffer AL vào mẫu, vortex trong 15s, và ủ ở 70ºC trong 10 phút Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp

 Thêm 200 µl ethanol (96–100%) vào mẫu, vortex trong 15s Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp

 Cho toàn bộ hỗn hợp vào cột QIAamp Spin Column Đóng nắp, ly tâm 8000 rpm trong 1 phút Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch

 Bổ sung lên cột 500 µl buffer AW1 Đóng nắp, ly tâm ở 8000 rpm trong 1 phút Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch

 Bổ sung lên cột 500 µl buffer AW2 Đóng nắp, ly tâm ở tốc độ tối đa 14.000 rpm trong 3 phút Có thể lặp lại bước này thêm 1 phút nếu chưa hết dịch trên cột

 Thu mẫu trên cột: Đặt cột vào ống 1.5 ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch

Thêm 200 µl buffer AE hoặc nước sạch Đặt ở nhiệt độ phòng trong 1 phút

và ly tâm 8000 rpm) trong 1 phút Lặp lại bước trên 2 lần

 Làm khô dịch thu được bằng máy Speed vac trong 2h

 Hòa tan ADN trong 50µl buffer AE , bảo quản ở –20ºC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

 Kiểm tra quá trình tách chiết ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8–1%

2.2.2 Khuếch đa ̣i đoa ̣n gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR

Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp là kỹ thuật cho phép nhân bản invitro các đoạn ADN (gen) lên hàng triệu lần so với ban đầu (1012–1013

bản sao) Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của ADN

và khả năng tổng hợp ADN invitro của ADN polymerase Phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bước cơ bản: biến tính (Denaturing), gắn mồi (Annealing)

PCR đươ ̣c thực hiê ̣n với các thành phần của phản ứng như trong bảng 7

Chu trình nhiệt đối với cặp mồi 10398 như sau:

Chu trình nhiệt đối với cặp mồi 3243 như sau:

2.2.3 Phân tích RFLP

Phương pháp RFLP sử dụng các enzyme giới hạn thích hợp phân cắt sản phẩm PCR để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di

+ Vớ i đoa ̣n gen 10398 ADN ty thể: sử du ̣ng enzyme FastDigest® DdeI Enzyme

này có vị trí nhận biết trên ADN như sau:

5’…C/TNAG…3’

3’…GANT/C…5’

Phân tích vi ̣ trí nhâ ̣n biết các enzyme giới ha ̣n trên đoa ̣n gen 246 bp và nhâ ̣n

thấy trong trường hợp 10398A thì enzyme DdeI sẽ cắt đoa ̣n gen ở một vị trí và tạo

thành các đoa ̣n oligonucleotide có kích thước 50 bp và 196 bp

Trong trường hợp 10398 G thì enzyme DdeI sẽ cắt đoa ̣n gen ở 2 vị trí và kết

quả cắt enzyme thu được các đoạn oligonucleotide có kích thước 38 bp, 50 bp và

158 bp

+ Vớ i đoa ̣n gen 3243 ADN ty thể: sử du ̣ng enzym e cắt FastDigest® HaeIII nhâ ̣n

biết vi ̣ trí cắt trên ADN ta ̣i trình tự:

5’…GG/CC…3’

3’…CC/GG…5’

Đoa ̣n gen 3243 đươ ̣c nhân lên có kích thước 218 bp Trong trường hợp

không đột biến (3243A) thì HaeIII cắt đoa ̣n gen này ta ̣i hai vi ̣ trí , dẫn tới sản phẩm

thu đươ ̣c là các đoa ̣n có kích thước 22 bp, 27 bp và 169 bp

Trong trường hợp có đột biến 3243G thì vi ̣ trí này sẽ trở thành vi ̣ trí cắt của

thước 22 bp, 27 bp, 72 bp và 97 bp