Luận văn thạc sĩ HUS nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen GmGLP1 vào cây đậu tương (glycine max) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Trước thực trạng đó, việc nghiên cứu phát triển những giống cây trồng mới có khả năng thích ứng, chống chịu tốt trong điều kiện hạn hán đang là một trong những mục tiêu hàng đầu của các

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Đỗ Thị Như Quỳnh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY

ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) THÔNG QUA

VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Đỗ Thị Như Quỳnh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY

ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) THÔNG QUA

VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Đồng

TS Lê Hồng Điệp

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Nguyễn Văn Đồng – người thầy luôn kiên nhẫn và hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện luận văn

Tôi xin gửi tới TS Lê Hồng Điệp lời cảm ơn chân thành, người đã luôn hỗ trợ và giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình, những

ý kiến đóng góp quý báu cũng như sự chỉ dẫn tận tình của TS Nguyễn Anh Vũ trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Kỹ sư Lương Thanh Quang cùng tập thể cán bộ Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông Nghiệp về sự nhiệt tình giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể thực hiện được đề tài này một cách suôn sẻ và thuận lợi

Cuối cùng, tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị, người thân cùng bạn bè lời cảm ơn thân thương nhất - những người đã luôn sát cánh, quan tâm và dành cho tôi tình cảm chân thành trong suốt thời gian tôi học tập và hoàn thành luận văn này cũng như đã luôn luôn bên cạnh và ủng hộ tôi trong cuộc sống

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Học viên cao học

Đỗ Thị Như Quỳnh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đậu tương và tầm quan trọng của cây đậu tương 3

1.1.1 Giới thiệu chung về đặc điểm sinh học của cây đậu tương 3

1.1.2 Vai trò của cây đậu tương đối với đời sống của con người 6

1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương trên Thế giới và Việt Nam 7

1.2 Cơ chế chống chịu các yếu tố phi sinh học của thực vật 10

1.3 Đặc tính chịu hạn và một số gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu tương 12

1.3.1 Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương 12

1.3.2 Các gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu tương 13

1.4 Gen GmGLP1 14

1.5 Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 15

1.5.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 15

1.5.2 Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen 18

1.5.3 Phương pháp chuyển gen bằng xung điện 18

1.5.4 Phương pháp chuyển gen qua ống phấn 19

1.6 Nguồn gốc và đặc tính sinh học của 4 giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 20

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

2.2 Vật liệu nghiên cứu 22

2.2.1 Vật liệu 22

2.2.2 Hóa chất và môi trường 23

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 23

2.2.4 Trình tự mồi và enzyme cắt giới hạn sử dụng trong nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 24

2.3.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá 26

2.3.3 Phương pháp nhân bản trình tự ADN bằng kỹ thuật PCR 27

2.3.4 Phương pháp thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR 28

2.3.5 Phương pháp lai Southern blot 29

2.4 Các tiêu chí đánh giá 31

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết quả đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của 4 giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 32

3.1.1 Đánh giá nguồn vật liệu khởi đầu 32

3.1.2 Khả năng tái sinh tạo đa chồi 33

3.1.3 Khả năng tái sinh rễ tạo cây hoàn chỉnh 35

3.2.2 Kiểm tra sự có mặt của gen cần chuyển GmGLP1 bằng kỹ thuật PCR 38

3.3 Phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T1 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

KẾT LUẬN 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 60

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Tình hình sản xuất đậu tương trên Thế giới trong những năm gần đây 7

Bảng 2 Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên Thế giới 8

trong những năm gần đây 8

Bảng 3 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam trong những năm gần đây 9

Bảng 4 Trình tự cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm 24

Bảng5 Thành phần phản ứng PCR 28

Bảng 6 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 28

Bảng 7 Thành phần phản ứng cắt giới hạn bằng enzyme Bam HI 30

Bảng8 Kết quả khảo sát tỷ lệ này mầm của 4 giống đậu tương 33

ĐT22, ĐT26, ĐVN9, DT84 33

Bảng 9 Khả năng phát sinh chồi của 4 giống đậu tương nghiên cứu sau 14 ngày 34

Bảng 10 Khả năng sống sót sau chọn lọc và khả năng kéo dài chồi của 4 giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 35

Bảng 11 Sự phát sinh rễ tái sinh cây hoàn chỉnh 36

Bảng 12 Cây tái sinh hoàn chỉnh sống sót và phát triển ở môi trường ngoài 36

Bảng 13 Tỷ lệ cây sống sót sau khi phun basta 38

Bảng 14 Thống kê số cây T0 sinh trưởng và phát triển tốt sau khi phun basta và đã dương tính với PCR 41

Bảng 15 Phân tích cây T1 chuyển gen dựa vào tỷ lệ phân ly 3:1 và 15:1 43

Bảng 16 Kết quả phân tích cây chuyển gen T1 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Cơ chế chống chịu của thực vật với stress 12

Hình 2 Hạt đậu tương của 4 giống ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 được sử dụng trong thí nghiệm 22

Hình 3 Cấu trúc vector biểu hiện gen GmGLP1 trong vector pZY101Asc 23

Hình 4 Quy trình chuyển gen đậu tương thông qua vi khuẩn A tumefaciens 37

Hình 5 Cây phản ứng với Basta sau 5 ngày phun 37

Hình 6a Ảnh điện di kiểm tra chất lượng DNA tổng số cây T0 giống ĐT22 38

Hình 6b Ảnh điện di kiểm tra chất lượng DNA tổng số cây T0 giống đậu tương ĐT26 và DT84 39

Hình 6 Ảnh điện di DNA tổng số cây đậu tương chuyển gen giống ĐT22 ở thế

hệ T0 39

Hình 7a Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT22 được chuyển gen thế hệ T0 40

Hình 7b Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT26 và DT84 được chuyển gen thế hệ T0 40

Hình 7 Phân tích PCR gen cần chuyển – GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT22, ĐT26 và DT84 được chuyển gen thế hệ T0 40

Hình 8 Cây đậu tương chuyển gen dương tính với PCR giống ĐT22 ở thế hệ T0 42 Hình 9 Hạt cây đậu tương chuyển gen giống ĐT22 ở thế hệ T0 42

Hình 10 Phản ứng của cây chuyển gen ở thế hệ T1 với Basta 43

Hình 11 DNA tổng số cây T1sống sót sau khi phun Basta 44

Hình 12 PCR kiểm tra sự có mặt của gen GmGLP1 trong cây T1 45

Hình 13 Kết quả lai Southern Blot 46

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic

GmGLP1 Glycine max Germin – like protein 1

PCR Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi polymerase

SEM Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi SIM Shoot induction medium – môi trường tạo đa chồi

MỞ ĐẦU

Đậu tương (Glycine max(L.) Merr ) [1] hay còn gọi là cây đậu nành là cây

công nghiệp ngắn ngày có hiệu quả kinh tế và giá trị dinh dưỡng cao Đậu tương là cây trồng lấy hạt, và là cây cho dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới, chỉ đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô Do có khả năng thích ứng rộng nên cây đậu tương được trồng khắp các châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ - chiếm

tỷ lệ 76,96%, tiếp đến là Châu Á – 18,54% [85] Ở Việt Nam, diện tích gieo trồng đậu tương đang được mở rộng, tính đến tháng 11/2013 diện tích gieo trồng đậu tương khoảng 117,8 triệu ha, sản lượng đạt khoảng 168,3 nghìn tấn [8]

Tuy nhiên, hiện nay cả thế giới đang phải đối mặt với hiện tượng biến đổi khí hậu, nền nhiệt hằng năm tăng cao dẫn đến tình trạng hạn hán Mức độ hạn hán thường khó dự đoán do phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm tần suất và sự phân bố lượng mưa, mức độ nước bay hơi, và khả năng giữ nước của đất [76, 29] Theo Boyer (1982) [13], hạn hán là yếu tố phi sinh học có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất cây trồng trên toàn thế giới, đồng thời hạn hán có khả năng tác động lên nhiều giai đoạn phát triển khác nhau của cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng [29] Bởi sự ấm lên của khí hậu toàn cầu, và nhu cầu thực phẩm tăng ngày càng cao dưới áp lực của gia tăng dân số, tần suất và sự ảnh hưởng của hạn hán càng trở nên

rõ rệt [68, 63, 22] Trước thực trạng đó, việc nghiên cứu phát triển những giống cây trồng mới có khả năng thích ứng, chống chịu tốt trong điều kiện hạn hán đang là một trong những mục tiêu hàng đầu của các nhà khoa học trên thế giới cũng như các nhà khoa học Việt Nam

Các nghiên cứu trước đây về cơ chế phân tử chỉ ra rằng tính trạng chịu hạn ở thực vật được kiểm soát bởi nhiều gen và được chia làm hai nhóm chính là nhóm các gen điều hòa và nhóm các gen chức năng [38, 61, 11] Trong nhóm gen chức năng thì họ gen mã hóa cho germin-like proteins (GLPs) đóng vai trò thiết yếu đối

với tiềm năng chịu hạn ở cây Ở đậu tương, họ gen GmGLP được biết đến gồm 21 gen [45], GLPs được biết đến với khả năng SOD, POD là các hoạt tính enzyme

chống oxi hóa Nhờ đó đóng vai trò quan trọng trong việc thể hiện khả năng chống

chịu của cây trồng với các điều kiện bất lợi Ở đậu tương, gen mã hóa cho protein

này được đặt tên là Glycine max GmGLP1 – Soybean Oxalate oxidase

Việc nghiên cứu và sử dụng hệ thống gen chống chịu với các điều kiện bất lợi trong việc chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng kháng hạn đã và đang là tâm điểm của hàng loạt các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên

cứu khả năng tiếp nhận gen GmGLP1 vào cây đậu tương (Glycine max) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”

Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu biến nạp gen GmGLP1 vào 4 giống đậu tương Việt Nam: ĐT22,

ĐVN9, ĐT26 và DT84

Yêu cầu của nghiên cứu

Biến nạp thành công gen GmGLP1 vào một trong bốn giống đậu tương

ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84

Phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T0 và cây T1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đậu tương và tầm quan trọng của cây đậu tương

1.1.1 Giới thiệu chung về đặc điểm sinh học của cây đậu tương

Đậu tương hay còn gọi là đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine

max(L.) Merr theo khóa phân loại của Hymowitz, và Newel (1981) [37].Căn cứ

vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể, đậu tương

được xếp vào Bộ (Fabales), Họ (Fabaceae), Phân họ (Leguminosae), Chi (Glycine)

Đậu tương có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 40

Đặc điểm hình thái học của cây đậu tương Glycine max(L.) Merr

- Rễ đậu tương bao gồm: rễ chính và rễ phụ Rễ chính có thể ăn sâu 50cm và có thể trên 1m Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ tập trung nhiều ở tầng đất 7-8cm rộng 30-40cm2 [1] Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần

30 Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông nhỏ, thân trung bình có 14-15 lóng Toàn thân có 1 lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cả cuống lá

- Lá cây đậu tương có 3 loại lá:

* Lá mầm (lá tử diệp): lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục,

khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh

* Lá nguyên (lá đơn): Lá nguyên xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3

ngày và mọc phía trên lá mầm Lá đơn mọc đối xứng nhau

* Lá kép: Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét Lá chét mọc so

le, lá kép thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu

- Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1-10 hoa và mỗi chùm thường có 3-5 hoa Hoa đậu tương thuộc loại hoa lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa, có 10 nhị và 1 nhụy, vì thế cây đậu tương là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phẩn rất thấp chỉ chiếm 0,5 – 1%

- Số quả đậu tương biến động từ 2-20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể đạt tới

400 quả trên một cây Một quả chứa từ 1-5 hạt, nhưng hầu hết ở các giống đậu

tương thường thấy chỉ có từ 2-3 hạt Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, có chiều dài từ 2-7cm hoặc hơn Quả có màu sắc biến động từ vàng đến trắng tới vàng sẫm hoặc đen

- Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt, Rốn hạt có màu sắc khác nhau và đặc trưng cho mỗi giống

Đặc điểm quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương

Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương được chia làm hai giai đoạn chính là (i): giai đoạn phát triển sinh dưỡng và (ii): giai đoạn sinh sản Trong từng giai đoạn trải qua các bước khác nhau

(i) Giai đoạn phát triển sinh dưỡng: chia ra làm 6 giai đoạn nhỏ

- Giai đoạn nảy mầm: hạt đậu tương bắt đầu nảy mầm khi hấp thụ đủ lượng nước bằng hoặc tương đương 50% khối lượng hạt Rễ chính xuất hiện đầu tiên rồi đến thân mầm sau đó lá mầm xuất hiện Sự nảy mầm hạt diễn ra trong vòng từ 5 –

10 ngày Hạt nảy mầm phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ môi trường, độ ẩm và độ sâu của hạt trong đất… Trong 5 ngày tính từ ngày gieo hạt, lông rễ xuất hiện và có chức năng hấp thu chất dinh dưỡng và nước cho cây Rễ thứ sinh bắt đầu phát triển

từ rễ chính Thân mầm tiếp xúc với ánh sáng, kéo lá mầm lên khỏi mặt đất, trụ lá mầm bắt đầu sinh trưởng, lá đơn xuất hiện

- Giai đoạn lá mầm: giai đoạn lá mầm bắt đầu khi những lá đơn xuất hiện

Trong giai đoạn này, lá mầm duy trì nguồn dinh dưỡng cần thiết cho cây non

Khoảng 70% khối lượng khô của lá mầm dần bị mất đi bởi quá trình chuyển dinh dưỡng từ lá mầm tới các phần còn lại của cây

- Giai đoạn xuất hiện lá kép đầu tiên: giai đoạn này được đánh dấu bằng sự xuất hiện của chiếc lá kép đầu tiên

- Giai đoạn lá kép thứ 2: cây cao khoảng 15,24 – 20,32 cm, xuất hiện 3 đốt trên thân và có thêm chiếc lá kép thứ 2 Ở giai đoạn này, quá trình cố định nito từ vi khuẩn bắt đầu diễn ra Các nốt sần của rễ xuất hiện trong phạm vi 25,4 cm từ mặt đất xuống rễ Những nốt sần có màu sắc khác nhau, nốt sần có mầu hồng hay đỏ

diễn ra sự cố định nitơ tích cực; trong khi đó những khối u màu trắng, nâu hay xanh

lá cây không diễn ra sự cố định nitơ

- Giai đoạn lá kép thứ 3 tới giai đoạn sinh trưởngthứ 5: cây cao khoảng 17,78 – 22,86 cm, có 4 đốt và 3 lá kép Đến giai đoạn 5, cây cao từ 25,4 – 30,48 cm, lá kép tiếp tục xuất hiện Ở giai đoạn 5 này, xuất hiện các chồi phụ ở đỉnh – các chồi này sau này sẽ phát triển thành chùm hoa

- Giai đoạn xuất hiện hoa sớm: cây cao từ 30,48 – 35,56 cm Lá mầm và lá đơn trong giai đoạn này có thể bị già hóa

(ii): Giai đoạn sinh sản: chia ra làm 7 giai đoạn nhỏ:

- Bắt đầu nở hoa: ít nhất 1 hoa nở ra từ một trong các đốt phát triển từ thân chính của cây

- Nở hoa hoàn toàn: xuất hiện một hoa đã nở từ 1 trong 2 đốt ở phần ngọn cây Một trong hai đốt này có 1 lá đã phát triển hoàn toàn Chiều cao cây đạt 50%

chiều cao của cây trưởng thành, và đạt 50% tổng số đốt ở cây trưởng thành Rễ phụ hướng sâu vào lòng đất, sự cố định nitơ tăng lên nhanh chóng

- Hình thành quả đậu:một quả phát triển từ 4 đốt trên cùng dài khoảng 0,15

cm Nhiệt độ, độ ẩm ảnh hưởng lên tổng số quả được hình thành, số lượng hạt được tạo thành trên mỗi quả và kích thước của hạt

- Hình thành quả: giai đoạn diễn ra sự phát triển nhanh của quả, sự phát triển của hạt bắt đầu diễn ra Khối lượng khô của quả tăng nhanh từ giai đoạn hình thành quả tới giai đoạn hình thành hạt Có một quả đậu dài 1,9 cm phát triển từ 4 đốt trên cùng Quá trình hình thành hoa diễn ra ở đỉnh thân chính Đây là giai đoạn quan trọng đối với năng suất tạo hạt Bất kỳ điều kiện bất lợi nào cũng làm giảm năng suất cây

- Hình thành hạt:hạt có kích thước 0,31 cm trong quả phát triển từ 4 đốt trên cùng của thân chính Vào giữa giai đoạn này, cây đạt được chiều cao tối đa, số lượng đốt tối đa và diện tích bề mặt lá tối đa Sự cố định nitơ đạt đỉnh và bắt đầu giảm Hạt vẫn tiếp tục tích lũy hàm lượng khô Cuối giai đoạn này, sự tích lũy dinh

dưỡng trong các lá cây đạt đỉnh và bắt đầu quá trình dịch chuyển sinh dưỡng đến hạt Khả năng phục hồi của cây với điều kiện bất lợi là rất thấp

- Hình thành hạt hoàn toàn: khối lượng hạt trong giai đoạn này đạt đỉnh Tốc

độ sinh trưởng diễn ra nhanh nhưng bị chậm lại ở giữa giai đoạn này, và đạt đỉnh ở giai đoạn bắt đầu trưởng thành Trong giai đoạn này, hạt phát triển chiếm hết không gian trong khoang hạt Sự hóa vàng của lá bắt đầu diễn ra Sự sinh trưởng của rễ diễn ra hoàn toàn vào khoảng giữa giai đoạn này

- Bắt đầu trưởng thành: giai đoạn này được đánh dấu bằng việc một quả trên thân chính có màu nâu, màu xanh của vỏ quả chuyển sang màu vàng Chất khô trong mỗi hạt bắt đầu đạt đỉnh Ở bước trưởng thành về mặt sinh lý, các hạt đạt khoảng 60% độ ẩm Điều kiện bất lợi ở giai đoạn này hay sau đó hầu như không gây ra ảnh hưởng lên năng suất của cây trồng

- Hoàn toàn trưởng thành: 95% số quả trên cây chuyển sang màu nâu

1.1.2 Vai trò của cây đậu tương đối với đời sống của con người

Cây đậu tương đóng vai trò quan trọng trong đời sống con người bởi nó là nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu đạm, giàu chất béo, giàu các chất khoáng và các vitamin Hàm lượng protein trung bình khoảng 35,5 – 40% trong khi

đó, hàm lượng protein trong gạo chỉ từ 6,2 – 12%, ngô từ 9,8 – 13,2%, thịt bò 21%, thịt gà 20%, cá từ 17 – 20% và trứng từ 13 – 14% Hàm lượng lipit trung bình từ 15 – 20% và với thành phần chủ yếu là các axit béo không no khoảng 60 – 70% có hệ

số đồng hóa cao và mùi vị thơm như axit linoleic khoảng 52 – 65%, oleic khoảng 25 – 36%, linolenolic khoảng 2 – 3% [1]

Vai trò của cây đậu tương với ngành công nghiệp

Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không Tuy nhiên, đậu tương chủ yếu được dùng làm nguyên liệu để ép dầu:hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật

Vai trò của cây đậu tương với ngành nông nghiệp

Trước tiên, đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, với tỉ lệ 1kg hạt đậu tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi Các bộ phận thân, lá, rễ, quả, hạt của cây đậu tương đều có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân, lá tươi và nghiền khô đều là thức ăn tổng hợp cho gia súc Sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao (N: 6,2% ; P2O5: 0,7% ;

K2O: 2,4%) và cũng được dùng sản xuất thức ăn cho gia súc [1]

Tiếp đến, cây đậu tương đóng vai trò trong việc cải tạo đất Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng vụ sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng đồng thời giảm chi phí cho việc bón nitơ Thân, lá đậu tương có thể dùng để bón ruộng thay phân hữu cơ bởi hàm lượng nitơ trong thân chiếm 0,05% trong lá chiếm 0,19% [1]

1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

Với những giá trị kinh tế và sử dụng của cây đậu tương, nên cây đậu tương được xem là một trong những loại cây trồng chiến lược trên toàn thế giới, đứng ở

vị trí thứ 4 chỉ sau cây lúa, cây ngô và cây lúa mì Do có khả năng thích nghi rộng với các điều kiện môi trường khác nhau nên cây đậu tương được trồng rộng rãi trên toàn thế giới, nhưng điều kiện khí hậu khác nhau ở các châu lục do đó, cây đậu tương được trồng nhiều nhất ở Châu Mỹ chiếm tỷ lệ 76,96%, tiếp đến là Châu Á chiếm tỷ lệ 18,54%[85] Theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp Quốc, diện tích gieo trồng đậu tương trên thế giới tăng khoảng 11,6 triệu

ha trong vòng 4 năm trở lại đây (diện tích gieo trồng năm 2009 là 99,34 triệu ha đến năm 2013 diện tích gieo trồng tăng lên 111,27 triệu ha) (bảng 1) [27]

Bảng 1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới trong những năm gần đây

Năm Diện tích gieo trồng

(triệu ha)

Năng suất (Tạ/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

2011 103,8 25,23 261,94

(Nguồn: FAOSTAT, 2014) Trong đó, 4 quốc gia sản xuất nhiều đậu tương nhất là Mỹ, Brazil, Argentina

và Ấn Độ (Bảng 2) Mỹ là nước có diện tích gieo trồng và sản lượng đậu tương lớn nhất trên thế giới vào khoảng 30,7 triệu ha năm 2013

Tuy diện tích gieo trồng đậu tương tăng đều qua các năm (bảng 1), nhưng sản lượng đậu tương trên thế giới lại biến động không đồng đều qua các năm Năm

2009 sản lượng đậu tương trên toàn thế giới đạt 223,41 triệu tấn, năm 2010 sản lượng tăng lên 265,04 triệu tấn nhưng tới năm 2011 sản lượng giảm xuống 261,94 triệu tấn, năm 2012 sản lượng đậu tương tiếp tục giảm xuống còn 241,14 triệu tấn, tới năm 2013 sản lượng tăng trở lại 276,4 triệu tấn cao nhất trong 4 năm trở về trước

Bảng 2 Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới

trong những năm gần đây

trồng (triệu ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (triệu ha)

Mỹ là quốc gia có diện tích gieo trồng và tổng sản lượng đậu tương cao nhất trên thế giới nhưng Mỹ không phải là quốc gia có sản lượng đậu tương lớn nhất trên thế giới (sản lượng đậu tương của Mỹ năm 2013 là 29,15 tạ/ha thấp hơn so với Brazil sản lượng đậu tương đạt 29,32 tạ/ha)

Có nhiều nguyên nhân gây ra sự không ổn định về năng suất và sản lượng đậu tương mặc dù diện tích đất canh tác đậu tương qua các năm tăng đồng đều, chẳng hạn như là do dịch bệnh, yếu tố kỹ thuật Nhưng đáng chú ý nhất là do tình hình biến đổi khí hậu và hạn hán là yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất đậu tương trên toàn thế giới Theo thống kê của cơ quan nông nghiệp Hoa Kỳ, sản lượng đậu tương của Argentina đạt hơn 49 triệu tấn năm 2009, năng suất khoảng hơn 25 tạ/ha Nguyên nhân gây ra tình trạng này là do tình trạng hạn hán của một số nước Châu Mỹ Latinh trong đó có Argentina Sự tụt giảm nắng suất của Ấn Độ và Argentina gây ra sự suy giảm sản lượng đậu tương trên thế giới

Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam

Cây đậu tương đã được gieo trồng từ lâu đời ở Việt Nam Tuy nhiên, Việt Nam là một quốc gia có nền nông nghiệp truyền thống lâu đời, ngành nông nghiệp hoạt động chủ yếu dựa trên phương pháp canh tác truyền thống, nên năng suất cây trồng thấp và sản xuất còn nhỏ lẻ Nhưng do những giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như giá trị về mặt công nghiệp của cây đậu tương là rất lớn nên hằng năm Việt Nam nhập khẩu một lượng lớn đậu tương từ các quốc gia khác trên thế giới (năm 2013, Việt Nam nhập khẩu khoảng 556 nghìn tấn đậu tương từ Hoa Kỳ)

Bảng 3 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam trong những năm gần đây

Năm Diện tích gieo trồng

vực trồng đậu tương chính tập trung ở vùng Đồng bằng sông Hồng Diện tích canh tác đậu tương ngày càng bị thu hẹp, bên cạnh đó sản lượng đậu tương qua các năm tương đối đồng đều nhưng tổng sản lượng chung qua các năm biến động và theo chiều hưởng giảm (bảng 3) [8] Mặc dù chưa có thống kê cụ thể nguyên nhân của việc diện tích đất gieo trồng đậu tương ngày càng bị thu hẹp, tuy nhiên, kết hợp với tình hình đánh giá sản lượng đậu tương của các Quốc gia trên thế giới có thể ban đầu kết luận rằng hạn hán cũng đang góp phần ảnh hưởng tới năng suất và diện tích gieo trồng đậu tương

Trước những thực trạng ở cả Việt Nam và trên thế giới, việc nghiên cứu tìm

ra gen có khả năng kháng hạn và chuyển vào cây trồng nói chung và cây đậu tương đang là vấn đề cấp bách nhất Thêm vào đó, ngày 16 tháng 5 năm 2013, Bộ Tài Nguyên và Môi trường đã ban hành Thông tư số 08/2013/TT-BTNMT quy đinh trình tự, thủ tục cấp và thu hồi Giấy chứng nhận an toàn sinh học với cây trồng biến đổi gen, từ đó cho phép người nông dân được canh tác các loại cây trồng biến đổi gen, cũng như mở ra triển vọng cho các nhà khoa học Việt Nam nghiên cứu tạo ra những loại cây trồng có khả năng kháng hạn nói chung và cây đậu tương có khả năng kháng hạn nói riêng

1.2 Cơ chế chống chịu các yếu tố phi sinh học của thực vật

Trước những diễn biến của khí hậu theo hướng bất lợi như nền nhiệt độ cao dẫn tới hạn hán, nước biển xâm lấn đất liền dẫn đến đất nhiễm mặn … Thực vật là đối tượng chịu ảnh hưởng nhiều nhất bởi các yếu tố phi sinh học bởi thực vật không

có khả năng di chuyển như các loài động vật Do đó, để sống sót và tiếp tục duy trì nòi giống thực vật có những cơ chế chống chịu khác nhau với các yếu tố phi sinh học

Các nhân tố phi sinh học (abiotic stress) như hạn hán, mặn và lạnh là những điều kiện môi trường bất lợi ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng và năng suất cây trồng trên toàn thế giới [42] Thực vật thường là đối tượng chịu sự tác động trước hết của các điều kiện môi trường bất thuận như các yếu tố phi sinh học - nguyên nhân gây ra các tác nhân phi sinh học ảnh hưởng đến năng suất cây trồng

[13] cũng như gây ra sự phân bố của các loài thực vật trên các loại môi trường khác nhau [14] Thực vật thường phải đối mặt với các điều kiện bất lợi phi sinh học như

sự thiếu hụt về nước, sự khắc nghiệt về nhiệt độ (nóng hoặc lạnh), nguồn dinh dưỡng trong đất bị suy giảm hoặc do sự dư thừa của các ion độc hại, thừa ánh sáng

và sự khô cằn của đất làm cản trở quá trình sinh trưởng của rễ [75] Thực vật có khả năng đáp ứng hoặc thích nghi với môi trường khác nhau một cách trực tiếp hoặc gián tiếp liên quan đến tính bền vững và khả năng phục hồi của quá trình quang hợp, đồng thời kết hợp với các quá trình khác để sinh trưởng và phát triển đặc biệt

là sinh sản [14] Một điểm nổi bật của khả năng thích ứng với điều kiện bất lợi phi sinh học là sự kích hoạt các đáp ứng phức tạp bao gồm tương tác gen và xen kẽ (crsoss-talk) với nhiều con đường phân tử khác nhau

Các điều kiện bất lợi hạn, lạnh và mặn đều là những điều kiện bất lợi mang tính thẩm thấu Đầu tiên chúng gây ra hiện tượng mất nước ở tế bào và dẫn tới làm giảm khả năng thẩm thấu của tế bào Tuy nhiên, mức độ mất nước của tế bào gây ra bởi các điều kiện bất lợi khác nhau là khác nhau: i) điều kiện bất lợi do muối làm giảm hàm lượng nước trong tế bào do giảm thế năng nước bên ngoài, làm nồng độ ion tăng (chủ yếu là Na+ và Cl-) dẫn đến khó hấp thu nước qua rễ và vận chuyển nước đến các tế bào thực hiện hoạt động trao đổi chất; ii) điều kiện bất lợi do lạnh gây ra làm giảm hàm lượng nước tế bào có thể gọi là hạn sinh lý, tức là không có khả năng vận chuyển nước có sẵn trong đất đến các tế bào sống, chủ yếu diễn ra ở phần thịt lá; iii) sự giảm hàm lượng nước trong tế bào gây ra bởi điều kiện bất lợi hạn là do tình trạng thiếu nước trong đất hoặc trong khí quyển Để thích nghi với các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh, thực vật phản ứng lại các điều kiện bất lợi thông qua hai con đường chính là con đường phụ thuộc acid absisic (ABA) và con đường không phụ thuộc ABA (hình 1)

Hình 1 Cơ chế chống chịu của thực vật với điều kiện bất lợi

Thực vật có khả năng chống lại tất cả các yếu tố phi sinh học ảnh hưởng tới

sự sinh trưởng và phát triển của cây Trong tất cả các yếu tố phi sinh học, yếu tố nào cũng đang là bài toán đối với các nhà khoa học và các nhà chọn giống trên toàn thế giới Tuy nhiên, trong phạm vi đề tài nghiên cứu này, chúng tôi chỉ quan tâm và đưa

ra giải pháp cho vấn đề chịu hạn ở thực vật mà đối tượng chính ở đây là cây đậu tương

1.3 Đặc tính chịu hạn và một số gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu tương

1.3.1 Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương

Khi gặp các điều kiện bất lợi về nước, thực vật có ba cơ chế chính để có thể thích ứng sinh trưởng và phát triển: (i): cơ chế trốn thoát điều kiện hạn, (ii): cơ chế tránh hạn; (iii): cơ chế chống chịu hạn Ở đậu tương, cơ chế trốn thoát điều kiện hạn hán cho phép cây hoàn thành chu kỳ sống của mình sớm và thường các giống đậu tương có cơ chế trốn thoát điều kiện hạn hán là những giống đậu tương ngắn ngày

và chín rất sớm (xem mục 1.1.1) Đối với giống đậu tương có cơ chế tránh hạn sẽ có

các cơ chế để duy trì lượng nước trong cây trong suốt giai đoạn hạn thông qua việc tăng khả năng hấp thụ nước từ rễ và giảm sự thoát hơi nước ở những bộ phận khác của cây Các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, cây sẽ có khả năng duy trì sức căng của các mô và tế bào, do đó các quá trình trao đổi chất có thể diễn ra bình thường trong điều kiện lượng nước bên ngoài môi trường xuống rất thấp [49]

1.3.2 Các gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu tương

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu tìm ra những gen có khả năng kháng hạn ở thực vật đang được hết sức quan tâm Bởi không phải bất kỳ loài thực vật nào cũng có khả năng tự mình chống chịu lại với điều kiện hạn hán Do đó việc tìm ra những gen có khả năng kháng hạn, phân lập và chuyển vào cây trồng quan tâm đang được tiến hành ở hầu hết các phòng thí nghiệm về thực vật Cho tới nay,

có rất nhiều công bố liên quan tới việc phân lập tách chiết cũng như chuyển thành công đoạn gen kháng hạn vào cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng

Gen GmDREB2 và gen P5CR là hai trong số các gen có chức năng chịu hạn

đã từng được nghiên cứu và biến đổi ở cây đậu tương[23, 16] Cả hai gen

GmDREB2 và P5CR, mã hóa lần lượt cho Dehydration Responsive Element

Binding protein và L-∆1-Pyrroline-5-Carboxylate Reductase, đều có mặt tự nhiên

trong hệ gen của đậu tương [24] Trong điều kiện hạn hán, gen GmDREB2 được

kích hoạt biểu hiện và mã hóa cho một yếu tố phiên mã có khả năng liên kết với yếu

tố di truyền DRE của nhiều gen tham gia vào phản ứng chịu hạn, góp phần kích hoạt phản ứng thích ứng với môi trường thiếu nước Chính từ đặc điểm này, các nhà

nghiên cứu đi đến hướng tăng cường sự biểu hiện của gen GmDREB2 nhằm nâng

cao tính chống chịu trong điều kiện môi trường thiếu nước ở thực vật, mà Arabodopsis chính là một ví dụ liên quan Trong khi đó, theo Ronde và các cs

(2004)[23], với việc chuyển thêm bản copy của gen P5CR vào trong cây, đậu tương

được xác định có khả năng chống chịu với hạn hán tốt hơn Theo nghiên cứu này

chỉ ra rằng số lượng gen P5CR có mối liên hệ đến hàm lượng nước trong tế vào,

cũng như hàm lượng proline tự do Lý do cây chịu hạn tốt hơn là vì proline tự do sẽ liên kết và làm ổn định màng tế bào

có một họ gen GmGLP có 21 gen [45] Khác với những germin – được biểu hiện ở hạt đang nảy mầm – các gen GLPs được biểu hiện ở nhiều bộ phận khác nhau của

cây, như ở lá mầm, rễ, lá, hoa, và hạt [45, 62] Sự biểu hiện này phản ánh vai trò đa dạng của GLPs trong quá trình phát triển của cây: thực tế, GLPs tồn tại ở dạng glycoprotein thường kết chuỗi lại trong ma trận ngoại bào nhờ các liên kết ion, và

có các chức năng isomerase, cyclase, dioxygenase Ngoài ra, một số gen GLPs có

biểu hiện tăng cường trong điều kiện khô hạn [40] Hai trong số những chức năng

nổi bật đã biết của họ gen GLPs là: mã hóa cho proteins đóng vai trò thụ thể của

auxin—phân tử tín hiệu thực vật tham gia vào rất nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển ở thực vật; mã hóa cho proteins mang hoạt tính enzyme superoxide dismutase (SOD) giúp chống oxy hóa và giúp cây chống chịu với nấm gây bệnh

như Rhizoctonia solaani và Verticillium longisporum [41, 62] Năm 2010, Joydeep Banerjee và cs [10] sử dụng chủng vi khuẩn A.tumefacien LBA4404 mang đoạn gen

OsGLP1 chuyển nạp gen vào cây thuốc lá bằng phương pháp lây nhiễm qua lá để

xác định ảnh hưởng của gen OsGLP1 tới chiều cao cây và khả năng kháng sâu bệnh Cũng năm 2010, Katrin Knecht và cs [41] sử dụng vi khuẩn A.tumefacien chủng GV3101 mang gen BvGLP1 chuyển nạp vào Arabidopsis thaliana thông qua phương pháp tổn thương lá, kết quả thu được cho thấy biểu hiện của gen BvGLP1 trong cây Arabidopsiskháng được hai loại nấm gây bệnh là Verticillium

longisporum và Rhizoctonia solaani Năm 2009, Yuqin Ke và cs [40], nghiên cứu

sự biểu hiện khác nhau của các loại protein và photphoprotein trong điều kiện hạn hán ở cây lúa, nghiên cứu chỉ ra rằng trong điều kiện khô hạn, protein GLP1 bị giảm mức độ photphoryl hóa mạnh

Ở đậu tương gen mã hóa cho protein này được đặt tên là Glycine max

GmGLP1- Soybean Oxalate oxidase ( Gen ID: |EU916269.1|)

1.5 Các phương pháp chuyển gen vào thực vật

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật đã được nghiên cứu và ứng dụng vào nhiều loại cây trồng khác nhau như: chuyển gen thông qua vi

khuẩn A tumefaciens, chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen, chuyển gen qua ống

phấn, chuyển gen bằng vi tiêm … Nhưng hai phương pháp chuyển gen thành công nhất và được ứng dụng nhiều nhất là phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn

A tumefaciens và phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen

1.5.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Phương pháp này sử dụng vi khuẩn A tumefaciensnhư một vector sinh học

để chuyển một đoạn ADN của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả tạo được cây biến

đổi gen [34], [80] Vi khuẩn A tumefaciens xâm nhiễm vào cây trồng thông qua vị

trí bị tổn thương của cây Khi bị tổn thương, mô thực vật sẽ tiết ra một số hợp chất

phenol, hợp chất này đóng vai trò dẫn dụ vi khuẩn A tumefaciensbiểu hiện vùng gen Vir nằm trên Ti – plasmid [35] Kết quả biểu hiện cácgen Vir, sợi đơn T-ADN

sẽ được chuyển và tổng hợp trong hệ gen thực vật Vấn đề chính của phương pháp chuyển gen này là làm thế nào để có thể kết hợp giữa tế bào chủ với vector tương ứng

Mặc dù ban đầu đậu tương không phải là đối tượng được xem xét để lây nhiễm với vi khuẩn [21] cho tới khi Pederson và cs (1983) [59] đã chứng minh đậu tương là vật chủ thích hợp với loại vi khuẩn này Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen vẫn bị kiểm soát bởi yếu tố giống [25, 54] Mặt khác, khả năng thu được các chồi chuyển gen từ những khối mô có khả năng tái sinh như phôi vô tính và nốt lá mầm ban đầu rất thấp Để nâng cao hiệu quả chuyển gen ngày càng có nhiều nghiên cứu nhằm tối ưu quy trình như: bổ sung hợp chất có vai trò xúc tác như acetosyringone

để kích thích sự biểu hiện của các gen Vir, L-cystein [53], thiol [52] hoặc sử dụng

các chủng vi khuẩn có khả năng gây độc tính cao [32], xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua nốt lá mầm [48, 55], cải tiến nốt lá mầm

làm vật liệu biến nạp [58], kết hợp lây nhiễm với tái sinh [15] Vấn đề khác khi sử

dụng vi khuẩn A tumefaciens còn phụ thuộc vào chủng khuẩn [47], số lượng bản

sao ADN được tổng hợp trong hệ gen thực vật [60, 71], pH môi trường [65], mức

độ gây tổn thương của cây [65, 70] Trái ngược với phương pháp chuyển ADN trực

tiếp, chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens có thể cho kết quả với số bản

copy nhiều hơn, có thể là các mảnh hoặc các đoạn được kết hợp trong một khuôn mẫu không được kiểm soát

Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được tao ra bằng phương pháp nốt

lá mầm sử dụng vi khuẩn A tumefaciens làm trung gian được báo cáo vào năm

1988 [20] Nốt lá mầm của giống Peking được lây nhiễm với chủng vi khuẩn A

tumefaciens mang gen chỉ thị gus, gen kháng kanamycin và glyphosate Mẫu được

nuôi cấy trong môi trường có chứa BAP để cảm ứng tạo chồi , kanamycin cùng với các kháng sinh khác có tác dụng loại bỏ lượng vi khuẩn còn lại sau khi đồng nuôi cấy Sau một vài tháng, cây con được tái sinh và được kiểm tra thông qua sự biểu

hiện của gen gus hoặc khả năng kháng glyphosate Chỉ 6% tổng số chồi lựa chọn

được chuyển gen Tám cây được tái sinh và phân tích, kết quả cho thấy chúng có một sợi ADN được chèn vào Mặc dù sự biến nạp cho hiệu quả không cao nhưng báo cáo chỉ ra rằng có thể tái sinh các tế bào chuyển gen của một giống đậu tương

khi được lây nhiễm với chủng vi khuẩn A tumefaciens thích hợp

Gần đây vi khuẩn A tumefaciens và phương pháp chuyển gen bằng nốt lá

mầm cũng được sử dụng để chuyển gen tổng hợp protein vỏ của virus Bean Pob Mottle (một loại virus gây bệnh đốm vỏ trên hạt đậu) vào đậu tương [26] Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển nạp gen thấp, chỉ có 5 cây chuyển gen sơ khởi của 5 lá mầm khác nhau được tạo ra từ 400 lá mầm ban đầu Phân tích Southern blot cho thấy sự

tích hợp gen BPMVCP-P vào bộ gen và thể hiện qua các cây T1 Khoảng 30% cây

T2 có nguồn gốc từ 1 dòng chuyển gen ban đầu được xét nghiệm ELISA linked Immuno Sorbent Assay) cho thấy khả năng kháng hoàn toàn với virus này

(Enzym-Tình trạng hình thái không bị biến đổi so với thế hện T1

Parrott và cs (1989) [54] đã đưa ra phương pháp chuyển gen khác đó là sử

dụng vi khuẩn A tumefaciens lây nhiễm với mẫu mô lá mầm hạt non để tạo phôi vô

tính sau đó tái sinh thành cây hoàn chỉnh Ba cây chuyển gen có chứa gen zein kích thước 15kD được hình thành Tuy nhiên, những cây chuyển gen này đều bị khảm và khi phân tích các cây ở thế hệ sau không thấy có một cây nào có chứa gen mã hóa zein 15kD

Gần đây, một phương pháp mới và có khả năng cho hiệu quả hơn đã được

phát triển để biến nạp vi khuẩn A tumefaciens mang gen vào thẳng tế bào mô đích

Kỹ thuật mới này gọi là SAAT (Sonication Assisted Agrobacterium – media

transformation) [74] Sử dụng SAAT với nuôi cấy huyền phù phát sinh phôi vô tính

đã cho hiệu quả chuyển gen ổn định và không có hiện tượng thể khảm Phương pháp này có ưu điểm là thời gian nuôi cấy cộng sinh mô thực vật với

Agrobacterium được rút ngắn Với kỹ thuật quét điện tử hiển vi, nhóm tác giả khám

phá ra SAAT, tạo ra những rãnh và khe nhỏ giống nhau, xuyên qua mô, cho phép A

tumefaciens dễ dàng đi vào mô đích mong muốn không giống như phương pháp

chuyển nạp gen khác Sử dụng kỹ thuật SAAT để chuyển gen vào đỉnh sinh trưởng

đã làm gia tăng hiệu quả chuyển nạp gen tạm thời trong nhiều cơ quan như: lá, nốt

lá mầm, phôi hữu tính, phôi vô tính, rễ, thân, chồi, hạt qua sự thể hiện GUS tăng gấp 100-400 lần trên cây Ohio buckeye, đậu đũa (cowpea), cây vân sam trắng

(white spuruce), lúa mì, ngô và đậu tương, đồng thời gen chuyển nạp tương đối ổn định qua các thế hệ Cũng với phương pháp trên Meurer và các cs (1998) [48] áp dụng trên 28 giống đậu tương Nhóm tác giả cho rằng, để thực hiện thành công phương pháp SAAT thì cần khảo sát các yếu tố như: chủng vi khuẩn, xác định tế bào chủ và khả năng tiếp nhận gen của mô mong muốn Với phương pháp SAAT , chọn những cụm phôi có 10 – 20 phôi (đường kính 2 – 4mm) được lây nhiễm với

1ml dịch khuẩn A tumefaciens có nồng độ OD600 = 0,1 – 0,5 trong thời gian 0-300 giây Sau 2 ngày trên môi trường lây nhiễm có 0,1mM Acetosyringone mẫu được chuyển lên môi trường chứa 400 mg/l timetin Hai tuần sau khi SAAT, chuyển mô

sang môi trường có 20 mg/l hygromycin và 400 mg/l Timentin Những dòng chuyển gen được quan sát và phân lập trong khaongr 6-8 tuần sau khi SAAT

Kỹ thuật này cho hiệu quả chuyển gen cao hơn so với các phương páp

chuyển gen khác Mở ra một hướng mới sử dụng vi khuẩn A tumefaciens để biến

nạp gen cho các mô đích khác nhau

1.5.2 Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen

Kỹ thuật chuyển gen sử dụng súng bắn gen là phương pháp chuyển gen dựa trên gia tốc của các hạt bọc ADN về phía tế bào thực vật Nhờ có gia tốc lớn mà các hạt ADN có thể đâm xuyên qua thành tế bào và màng tế bào Bên trong tế bào, ADN được phân tách từ các hạt nhỏ và được tổng hợp ở trong hệ gen thực vật Ưu điểm của súng bắn gen là có thể loại bỏ các tác nhân sinh học không thích hợp, đặc biệt là những loại mẫu không thích hợp với chuyển trực tiếp gen quan tâm vào mô phân sinh đỉnh của thực vật Tuy nhiên phương pháp này yêu cầu phải có dụng cụ, máy móc chuyên dụng mới có thể phân chia chính xác các hạt ADN trong mô phân sinh đích [46] Báo cáo đầu tiên về chuyển gen bằng súng bằng gen vào đậu tượng

sử dụng chồi phân sinh đỉnh làm mô đích được McCabe và cs tiến hành năm 1988 [46] Chồi đỉnh sau khi biến nạp được cảm ứng tạo đa chồi trước khi tái sinh thành cây hoàn chỉnh Phân tích khối mô chuyển gen nhận thấy có các hạt nhỏ mang ADN

và có sự tái tổ hợp ADN trong tế bào chủ [31, 66, 39] Khả năng tổng hợp ADN trong tế bào được xem như biểu hiện của quá trình chuyển gen có hiệu quả [39]

1.5.3 Phương pháp chuyển gen bằng xung điện

Sử dụng xung điện cho hiệu quả biến nạp khá cao đối với tế bào động vật

Fromm và cs (1985) [30] lần đầu tiên cho rằng có thể cải tiến phương pháp này để biến nạp gen vào thực vật Năm 1985, nhóm tác giả đã sử dụng kỹ thuật xung điện

để chuyển gen vào tế bào trần của cây ngô và họ đã thu được cây ngô chuyển gen bền vững bằng phương pháp này [30] Cùng với các thí nghiệm thu được trên cây thuốc lá của nhiều tác giả khác, phương pháp này đã được sử dụng để chuyển gen cho cây đậu tương [19]

Chowrira và cs (1995) [18] sử dụng phương pháp xung điện để biến nạp gen vào điểm sinh trưởng của cây mầm đậu tương Cây mầm 7-10 ngày được loại bỏ lá mầm, ADN được tiêm vào đỉnh chồi bằng hệ thống ống tiêm có chứa dung dịch lipofectin ADN được chuyển vào bằng một dòng điện xung, cây sinh trưởng mà không cần tác nhân chọn lọc Quá trình này đã được thực hiện trên nhiều mô phân sinh và thu được một vài thể khảm

1.5.4 Phương pháp chuyển gen qua ống phấn

Hầu hết các phương pháp chuyển gen hiện tại đều dựa trên cơ sở nuôi mô tế bào, nó đòi hỏi các tế bào chuyển gen phải được tái sinh thành cây [12] Phát triển một hệ thống chuyển gen độc lập với nuôi cấy tế bào đã giành được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học Cách tiếp cận này cho phép vượt qua rào cản về kiểu gen của cây biến nạp vốn ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả chuyển gen Mặt khác chi phí tài chính và thời gian chọn tạo sẽ được rút ngắn Phương pháp chuyển gen qua ống phấn lần đầu tiên được báo cáo thành công trên cây bông [84] Kỹ thuật này sau

đó được sử dụng để chuyển gen ở một số cây trồng như: ngô [20], bông [50], lúa [28, 77], đậu tương [67, 43], lúa mì [79, 83], dưa hấu [17] Một số báo cáo đã chỉ ra rằng có thể chuyển gen vào đậu tương thông qua ống phấn [36, 44] Li và cs (2001) [43]đã thu được xấp xỉ 5000 hạt đậu tương sau khi xử lý hoa với ADN mang gen

bar Khi kiểm tra tất cả các hạt thu được từ cây xử lý với ADN có chứa gen bar đều

không cho kết quả dương tính với gen này Quan sát hình thái của một vài cây thấy

có sự khác nhau, nhưng hạt của chúng không có khả năng nảy mầm Thí nghiệm

khác với gen GUS, nhóm tác giả thu được gần 2% số hạt của các cây được xử lý với ADN chứa gen GUS dương tính khi kiểm tra Tuy nhiên, khi cho hạt nảy mầm và tiến hành lấy lá phân tích thì không cho thấy có sự hoạt động của gen GUS 3% hạt thu từ các cây thế hệ sau được kiểm tra đều không thấy có biểu hiện của gen GUS

Shou và cs (2002) [67] đã tiến hành chuyển gen vào 8 giống đậu tương, trong đó có giống mô hình William 82 bằng kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn dựa trên phương pháp của Liu và cs (1992) [44] Tuy nhiên kết quả đã không thành công như mong

muốn Nhiều báo cáo trước đây khi sử dụng phương pháp chuyển gen này cũng đều chỉ ra những hạn chế của phương pháp [36, 84]

1.6 Nguồn gốc và đặc tính sinh học của 4 giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26

và DT84

Giống đậu tương ĐT22

Tác giả: Trần Đình Long, Trần Thị Trường, Hoàng Minh Tâm, Quách Ngọc Truyền, Nguyễn Thị mỹ Hạnh, Nguyễn Thị Chúc, Lê Tuấn phong, Nguyễn Đạt Thuần Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Giống ĐT22 do trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ dòng đột biến của hạt lai (DT95 x ĐT12) và được Hội đồng Khoa học Công nghệ (Bộ NN&PTNT) công nhận là giống mới Quyết định số 219 QĐ/BNN-KHCN ngày 19/01/2006

Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trưởng trung bình từ 85-90 ngày Hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đâm, quả chín có màu nâu Khối lượng 1000 hạt khoảng 155-160g Có khả năng kháng bệnh phấn trắng Năng suất từ 18-27 tạ/ha, tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh ĐT22 thích hợp gieo trồng trong cả 3

vụ trong năm

Giống đậu tương ĐVN9

Giống đậu tương ĐVN9 do nhóm các nhà khoa học của Viện nghiên cứu Ngô lai tạo và chọn lọc từ tổ hợp lai ĐT12 x VN205

Những đặc tính chính: ĐVN9 là giống đậu tương chín sớm: vụ xuân khoảng 88-90 ngày, vụ hè: từ 75 – 77 ngày, vụ đông: 78-80 ngày Dạng cây đứng, lá hình trứng nhọn, hoa tím, vỏ quả chín màu vàng rơm, hạt vàng, rốn hạt nâu nhạt Chiều cao cây trung bình 27,3 - 56,5 cm; phân cành mạnh khoảng 1,7 – 3,1 cành cấp 1 trên một cây; sai quả khoảng 22,9 – 49,5 quả trên một cây Khối lượng 1000 hạt khoảng 148,5 – 171,8 gam Năng suất trung bình ở vụ xuân đạt 17 tạ/ha, vụ hè đạt

21 tạ/ha

Giống đậu tương ĐT26

Tác giả: Trần Đình Long, Trần Thị Trường, Nguyễn Thị Loan, Nguyễn Thị Chinh, Nguyễn Văn Thắng, Trần Thanh Bình và CTV Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Giống đậu tương ĐT26 được chọn từ tổ hợp lai ĐT2000 x ĐT12 Được công nhận cho sản xuất thử theo Quyết định số 111/QĐ-TT-CCN ngày 3 tháng 6 năm

2008

Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trường trung bình từ 90-95 ngày

Chiều cao cây 45-60 cm, hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chính có màu nâu, phân cành khá nhiều từ 2-3 cành/cây, có 30-35 quả chắc/cây, tỷ lệ quả 3 hạt 20-40% Khối lượng 1000 hạt 180-190g Năng suất 21-29 tạ/ha, tùy thuộc vào mùa

vụ và điều kiện thâm canh Giống thích hợp trong vụ xuân và vụ đông

Giống đậu tương DT84

Giống đậu tương DT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp chọn tạo bằng phương pháp xử lý đột biến dòng 33-3 (tổ hợp lai ĐT80 x ĐH4) được công nhận giống Quốc gia năm 1995 và đưa vào khảo nghiệm, sản xuất từ năm 1995

Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trưởng 85 – 90 ngày Chiều cao cây

từ 50 – 60 cm, cây sinh trưởng khỏe, ít phân cành Hạt to, màu vàng sáng, hoa màu tím, khối lượng 1000 hạt 160 – 180 hạt, năng suất đạt 15 – 20 tạ/ha Giống được trồng cả 3 vụ: xuân, hè, đông , thích hợp trồng thâm canh

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài luận văn được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ

Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam từ tháng 7/2012 đến tháng 12/2014

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu Vật liệu thực vật

Thí nghiệm sử dụng 4 giống đậu tương: ĐT22, ĐVN9, ĐT26, DT84 được cung cấp bởi Trung tâm Đậu đỗ và phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp

Hình 2 Hạt đậu tương của 4 giống ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 được

sử dụng trong thí nghiệm Vật liệu vi khuẩn

Chủng vi khuẩn A tumefaciens – EHA101 [33] chứa vector biểu hiện pZY101Asc mang đoạn gen GmGLP1, gen kháng kháng sinh Streptomycin và

Spectinomycin làm chỉ thị chọn lọc vi khuẩn, gen kháng Glufosinate làm chỉ thị chọn lọc thực vật được cung cấp bởi phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ

Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp

Hình 3 Cấu trúc casstte biểu hiện gen GmGLP1 trong vector pZY101Asc 2.2.2 Hóa chất và môi trường

Tất cả các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm được sử dụng của hãng Sigma, Fermentas, Merk và một số hãng khác

Môi trường

Các loại môi trường sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật bao gồm: GM, CCM, SIM, SEM, RM

Môi trường sử dụng nuôi khuẩn trong thí nghiệm: YEP đặc và YEP lỏng

Thành phần và hàm lượng các chất trong môi trường đã sử dụng trong thí nghiệm được trình bày trong phần phụ lục

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: Box cấy vô trùng, tủ nuôi khuẩn, máy lắc, máy đo OD, máy ly tâm, máy đo nanodrop, máy PCR, tủ lạnh các loại: 4oC, -20oC, -80oC; bể ổn nhiệt; máy làm khô; bể điện di

Dụng cụ: Chày cối sứ; ống eppendorf các loại: 2ml, 1.5ml và 0.5ml, pipetman, đầu côn các loại, lưỡi dao các loại sử dụng trong nuôi cấy mô

2.2.4 Trình tự mồi và enzyme cắt giới hạn sử dụng trong nghiên cứu

Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu (bảng 4)

Bảng 4 Trình tự cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm

Nhiệt

độ gắn mồi

Kích thước

GmGLP1-35S-Forward GTGACAGATAGCTGGGCAATG

57oC ~ 881bp

GmGLP1 - Reverse TTATTTCTTAGGAGCAAGCCTAGAC 2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens

Phương pháp tạo vật liệu vô trùng và phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương được tiến hành theo quy trình của Olhofl et al (2003) [51] và Zhang (2004) [81] có cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

Tạo vật liệu vô trùng

Hạt đậu tương được đặt trong đĩa petri 15x100 mm thành một lớp đơn và đưa vào hộp hút khô có chứa ca thủy tinh đựng hỗn hợp 100ml Clorox + 4ml HCl đặc

Hộp hút khô được đóng kín và hạt giữ trong vòng 16h để khử trùng

Nảy mầm hạt

Hạt đậu tương sau khi khử trùng được cấy trên đĩa môi trường GM Gói đĩa chứa hạt thành từng chồng 5 đĩa Các chồng hạt được nuôi trong phòng nuôi cấy trong điều kiện: nhiệt độ 24oC, 18h sáng, 6h tối, với cường độ ánh sáng 100-150E trong vòng 5 ngày

Chuẩn bị khuẩn biến nạp

Chủng khuẩn A.tumefaciens – EHA101 chứa vector pZY101Asc – mang gen

Bar chọn lọc glufosinate và gen cần chuyển GmGLP1 – được lưu giữ trong tủ

-80oC Trước khi sử dụng khuẩn cho biến nạp thực vật, khuẩn được nuôi phục hồi trên môi trường YEP đặc có bổ sung 4 loại kháng sinh chọn lọc vi khuẩn: 50mg/ml Spectomycin, 50mg/ml Streptomycin, 25mg/ml Rifamycin, và 25mg/ml Kanamycin Nuôi khuẩn sau 3 ngày trên môi trường YEP đặc, thu khuẩn lạc và nuôi lắc trong 5ml môi trường YEP lỏng được bổ sung 4 loại kháng sinh chọn lọc (50mg/ml Spectomycin, 50mg/ml Streptomycin, 25mg/ml Rifamycin, và 25mg/ml

Kanamycin).Nuôi lắc trong 8 giờ, dịch khuẩn thu được được chuyển sang bình chứa 150ml YEP lỏng Tiếp tục nuôi lắc khuẩn 16h ở 28oC , V = 250 v/p Sử dụng máy

đo OD ở bước sóng 650nm để kiểm tra mật độ tế bào có mặt trong dịch khuẩn nuôi cấy OD650 khuẩn đạt giá trị nằm trong khoảng 1,0 – 1,2 được sử dụng để lây nhiễm cho thực vật Ly tâm dịch khuẩn để thu cặn khuẩn ở 3500 v/p, 10 phút ở nhiệt độ phòng Hòa tan lại cặn khuẩn sử dụng dung dịch CCM lỏng sao cho OD650 sau khi hòa tan đạt giá trị0,6 Dung dịch CCM lỏng có giá trị OD650 đạt 0,6 được gọi là dung dịch đồng nuôi cấy

Đồng nuôi cấy

Nảy mầm hạt sau 5 ngày, loại bỏ phần trụ dưới lá mầm, tách đôi hai lá mầm (

½ lá mầm sau đây sẽ được gọi là mẫu nuôi cấy) bằng dao nuôi cấy sao cho mỗi lá mầm chứa ½ chồi đỉnh Loại bỏ chồi đỉnh trên mẫu nuôi cấy, gây tổn thương mẫu nuôi cấy tại vị trí nốt lá mầm khoảng 5 – 7 đường, mỗi đường sâu khoảng 0,5mm và dài khoảng 3 – 4 mm Mẫu nuôi cấy đã gây tổn thương được ngâm trong dung dịch

đồng nuôi cấy khoảng 30 phút để lây nhiễm với vi khuẩn A.tumefaciens Chuyển

mẫu nuôi cấy sang môi trường đồng nuôi cấy (môi trường CCM đặc) Nuôi mẫu trên môi trường CCM đặc trong 5 ngày ở điều kiện nhiệt độ 24oC, điều kiện ánh sáng: 18h sáng và 6h tối, cường độ ánh sáng 100 – 150E

Kích thích ra chồi

Sau 5 ngày đồng nuôi cấy trên môi trường CCM đặc, loại bỏ khuẩn bám trên

bề mặt mẫu nuôi cấy bằngmôi trường SIM lỏng trước khi chuyển sang môi trường SIM đặc Giữ mẫu nuôi cấy trong môi trường SIM đặc trong 14 ngày nhằm kích thích vị trí gây tổn thương tạo cụm đa chồi Chuyển mẫu nuôi cấy đã phát sinh được cụm đa chồi sang môi trường SIM đặc có chứa chất chọn lọc thực vật glufosinate nồng độ 10mg/l, nuôi mẫu nuôi cấy trong 14 ngày

Kéo dài chồi

Những mẫu nuôi cấy sống sót qua chọn lọc được loại bỏ những chồi chết trên cụm chồi đồng thời được cắt loại bỏ phần trụ lá mầm Chuyển tiếp mẫu nuôi cấy sang môi trường SEM chứa chất chọn lọc glufosinate nồng độ 5mg/ml giảm ½

so với môi trường SIM đặc Cứ sau 14 ngày tiến hành chuyển những mẫu sống sót xanh sang môi trường SEM mới Chú ý loại bỏ những chồi chết trong mỗi lần chuyển mẫu Mẫu đýợc chuyển cho tới khi cụm đa chồi bật lęn đýợc chồi

Kích thích ra rễ

Những chồi dài 3 – 4 cm trong cụm đa chồi, được cắt khỏi cụm đa chồi để kích thích ra rễ tái sinh cây hoàn chỉnh Chồi sau khi được cắt khỏi cụm đa chồi được ngâm khoảng 2 – 5 phút trong dung dịch IBA 1 mg/ml Chồi được nuôi trên môi trường RM cho tới khi chồi phát sinh rễ.Chuyển cây con sau khi tái sinh hoàn chỉnh ( có thân, lá và rễ đầy đủ) ra đất

Chọn lọc cây con ra đất bằng Basta

Tùy thuộc vào tốc độ thích ứng của phát triển của cây con ngoài môi trường

mà chọn thời gian phun basta cho hợp lý Thương cây con được sử dụng trong thí nghiệm phun basta là những cây phát sinh khoảng 3 – 5 lá thật Nồng độ basta sử dụng trong thí nghiệm chọn lọc là 100mg/l Cây con sau khi phun basta được che chắn để giảm tác động của môi trường ( mưa, nắng, gió, sương…) tới kết quả phun basta Thí nghiệm phun basta được tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần cách nhau 3 ngày Những cây con sống sót sau 3 lần phun basta, được tiếp tục chăm sóc làm vật liệu cho những phân tích đánh giá tiếp theo

Chúng tôi sử dụng phương pháp chuyển gen thực vật thông qua A

tumefaciens như được trình bày ở trên trong các thí nghiệm với 4 giống đậu tương:

ĐT22, ĐT26, DT84, và ĐVN9 Với từng giống, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.3.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá

Quy trình tách chiết ADN được tiến hành theo quy trình tách chiết ADN của Doyle et al (1987) [27] được cải tiến cho phù hợp với điều kiện và hóa chất của phòng thí nghiệm

Bước 1: Thu mẫu lá từ những cây con sống sót sau 3 lần phun basta Giữ mẫu lá thu được trong nito lỏng, nghiền mẫu lá ngay sau khi thu mẫu

Bước 2: Nghiền nhỏ 1 gam mẫu lá bằng chày cối sứ trong nito lỏng và chuyển vào ống eppendoft 2ml

Bước 3: Bổ sung 1,5ml dung dịch đệm CTAB (xem phụ lục) mỗi ống eppendoft Lắc đều mẫu và ủ mẫu trong bể ổn nhiệt ở 650C, t = 60 phút

Bước 4: Ly tâm hỗn hợp dịch chiết mẫu lá V = 13000 v/p, t = 10 phút, ở 4oC

Bước 5: Thu dịch nổi, chuyển sang ống eppendoft 2ml Bổ sung dung dịch

25 : 24 : 1 ( phenol : chloroform : isoamylalcohol ) vào ống chứa dịch chiết theo tỷ

lệ 1 : 1 Lắc đều hỗn hợp và ly tâm ở 4oC, V = 13000 v/p, t = 10 phút

Bước 6: Thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft 2ml Bổ sung dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1) theo tỷ lệ 1 : 1 vào ống chứa dịch chiết Lắc đều hỗn hợp và ly tâm lạnh ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút

Bước 7: Thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft 1,5ml Bổ sung dung dịch isopropanol theo tỷ lệ 1 : 1 vào ống chứa dịch chiết Lắc nhẹ nhàng Giữ mẫu trong

tủ -20oCtrong vòng 2h Ly tâm ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút Loại bỏ dịch nổi, giữ lại tủa ADN

Bước 8: ADN được làm khô bằng cách mở nắp và để trong tủ hút trong vòng 2h Hòa tan lại ADN bằng hỗn hợp NaCl 1M + Rnase 1mg/ml, ủ hỗn hợp ở tủ 37oC,

Bước 11: Rửa lại tủa ADN thu được ở bước 10 bằng dung dịch Ethanol 70%,

ly tâm lạnh 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút Lặp lại bước này 2 lần

Bước 12: Làm khô tủa ADN sử dụng máy hút chân không Hòa tan ADN bằng nước cất khử ion Bảo quản ADN trong tủ -20oC

Bước 13: Kiểm tra chất lượng ADN tách chiết được bằng máy đo nanodrop

và bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%

2.3.3 Phương pháp nhân bản trình tự ADN bằng kỹ thuật PCR

Dung lượng hỗn hợp PCR cho mỗi mẫu là 20µl Phản ứng PCR được tiến hành trên máy chu trình nhiệt model PTC-100