Khảo sát cấu trúc các hợp chất tự nhiên doc

NMR tube thông dụng: o.d... Nguyên tắc chung1.2... PHỔ HMBC Là phổ tương tác 2D giữa C và H qua nhiều nối Heteronuclear Multiple Bond Coherence 5.1... PHỔ NOESY Là phổ tương

1

• Trình bày được từng bước cần làm để xác định cấu trúc hóa học (CTHH) của 1 hợp chất tự nhiên (HCTN).

• Khai thác được các thông tin cấu trúc từ các dữ liệu phổ học, chủ yếu là phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

• Trình bày được các dữ liệu phổ học trong một văn bản khoa học để xác nhận cấu trúc của hợp chất ng cứu

• So sánh được cấu trúc của mình làm ra với các cấu trúc (hợp chất) đã được công bố trong các TLTK

• Hiệu chỉnh được các dữ liệu cấu trúc chưa hợp lý của các TLTK

M

3

Hợp chất (compound, CxHyOzNt ≠ đơn chất Na, Fe, N2 …)tùy yêu cầu về sự chính xác, có thể được mô tả bằng:

- công thức phân tử (nguyên, thô) C6H11NO3

- công thức khai triển (nhóm chức…) HO-C6H10-NO2

- cấu trúc hóa học (phẳng, kh gian, mô hình phân tử…)

Ở đây, khảo sát cấu trúc  1 cấu trúc 3-D duy nhất,

loại bỏ các dạng đồng phân không phù hợp

H

NO2HO

H

H

NO2H

NO2HO

Flavonoid glycosid C21H20O10=432 (Ω = 12)

aglycon = 286 (Flavon + 4.OH)

aglycon = 270 (Flavon + 3.OH)

Glucosyl (m/z 162) Rhamnosyl(m/z 146)

rhamnosyl (840 cấu trúc)

(R-1)

(R-2) O

O

OH

OH HO

O

O

OH

OH HO

(G-1)

(G-2)

glucosyl (360 cấu trúc)

• Phổ nhiễu xạ đơn tinh thể tia X (Phổ tia X, X-Ray)

- Hạn chế về thiết bị

- Điều kiện nghiêm ngặt (của tinh thể)

- Lượng mẫu cần rất ít, không thu hồi được

• Các phương pháp phổ học kết hợp khác

- NMR đóng vai trò rất quan trọng

- Vẫn tận dụng được các th tin định hướng “cổ điển”

- Khả năng thu hồi mẫu: OK (NMR !)

- Chi phí (th gian, nhân lực, thiết bị, tài chính): OK

12

Khác biệt về cấu trúc   Khác biệt về (dữ liệu) phổ

Phổ chủ yếu khai thác sự khác biệt về…

UV sự phân bố è (tự do…)

IR các nhóm chức (-NH-, -OH, -COOR…)

X-Ray mạng tinh thể (lập phương, đơn tà…)

NMR “môi trường hóa học” của C, H, N, P…

Phép biến đổi Fourier (Fourier Transform, FT); biểu diễn

một dao động tắt dần (Free induction decay, FID) từ dạng chu kỳ dạng dạng tần số   Phổ (IR, NMR…)

FT

FT

tần số thấp

tần số cao hơn

2 giao động

ν2

ν1

OH

OH

OH OH

OH

OH OH

- Khi được đặt vào 1 từ trường B)o, các è quanh nhân sẽ xoay và hạt nhân sẽ tạo ra 1 từ trường B) trái chiều với B)o.

B)o B)o

B)

- Khi nhận thêm 1 năng lượng E = hv; hạt nhân (đang // hoặc

đối song với B)o) sẽ xoay sang 1 hướng mới và ở 1 mức năng

lượng cao, kém bền; có kh.hướng trở về trạng thái bền (E thấp, theo tác dụng của B)o) E được gọi là “năng lượng cộng hưởng”.

- Khi dao động tắt dần để trở về trạng thái bền này, hạt nhân sẽ giải phóng 1 năng lượng ∆E = hv.

- Ghi nhận được ∆E có thể mô phỏng lại các “dao động tắt dần” này (Free Induction Decay, FID).

- Nhờ phép “biến đổi Fourier” (Fourier Transform, FT); máy sẽ biến các FID thành tín hiệu phổ và được ghi lại thành 1 phổ đồ

spin I = 1/2 hoặc hướng “lên”, hoặc hướng “xuống”

chưa có từ trường B)o có từ trường B)o

spin ngẫu nhiên

(quay hỗn độn)

B)o

A) N Z

A) = mass N o (số khối) A) = (số proton + neutron)

Z = atomic N o (số ng tử)

Z = (số proton, stt / bảng)

A) chẵn và Z chẵn  I = 0

không cho tín hiệu NMR

không cho tín hiệu NMR

thông dụng nhất

ít thông dụng hơn

I ≠ 0: cho tín hiệu NMR

NMR tube thông dụng: o.d 5 mm x 18 cm

Yêu cầu

- Dung dịch đo phải trong (lọc !), đều

- mẫu không có tạp kim loại

- Dung môi đo phải thật giàu 2H, nghèo 1H

Vd CDCl3 chỉ chứa ~ 0.02% CHCl3 là đã đủ

cho tín hiệu mạnh ở 7.27 (H) và 77.0 (C)

Thường, với máy 300 MHz cần ~ 10 mg mẫu pha / ~ 0.4 ml d.môi deuterium (h ~ 4 cm)

độ dời hóa học = độ dời (Hz) so với chuẩn TMS

tần số đo của máy (MHz)

(  , ppm)

5.000 4.375 3.750 3.125 2.500 1.875 Hz

Phần 1: NMR abc

1.1 Nguyên tắc chung1.2 Yêu cầu về mẫu

1.3 Yêu cầu về dung môi đo

1.4 Các thông số căn bản (C, H, J, sự phân đỉnh)

35

Phổ của đơn vị thông tin

NMR hạt nhân δ (ppm) toàn bộ cấu trúc

X-Ray điện tử, nối tọa độ, d (Å) cấu trúc 3D

Ý NGHĨA) CỦA) CÁC PHỔ

Ý NGHĨA) CỦA) CÁC KỸ THUẬT NMR

13C-NMR tình trạng của từng carbon (khung)

1H-NMR tình trạng, sự phân bố của (các) H

DEPT bậc Carbon (CIV, CH, CH2, CH3)

HSQC H nào “gắn vào” C nào (single, 1 nối)

HMB)C H nào “dòm thấy” C nào (multi bond)

COSY H nào kế H nào trên khung (Hn x Hn±1)

NOESY H nào gần H nào trong không gian

CDCl3 (77.0; t)

Tín hiệu dung môi / phổ 13C-NMR

dung môi DMSO 39.5 (m=8)

70.1 – 71.1

NS = 512

Tín hiệu dung môi / phổ 13C-NMR

2.50 s (DMSO)

Tín hiệu dung môi / phổ 1H-NMR

43

1 Phổ 13C-NMR

1.1 Dấu hiệu nhận biết

- Thang chia từ 0 ppm – 200* ppm, đường nền đậm

- Thường ở dạng “giải ghép với proton”

- Tín hiệu dạng vạch (không chẻ đầu, không có chân)

- Không có số tích phân (1 C, 2 C, 3 C ) bên dưới

- Dễ thấy chùm tín hiệu dung môi đo (thường rất mạnh)

1 Phổ 13C-NMR

1.2 Cung cấp thông tin gì

- Số lượng Carbon trong khung:

Do thường ở dạng “giải ghép với proton”

01 vạch tín hiệu # 01 C đương lượng

- Dạng Carbon (>C=O; -COOR; -O-C-O-; >CHn= ) (1 cách tương đối)

C olefinic ceton

ceton có Δ

ester, lacton

cao

-

1 tín hiệu của 2 C

1 tín hiệu của 2 C

TÌNH TRẠNG CỦA) CÁC CA).RB)ON

• Tài liệu cũ (còn ghép với H)

- C IV (s, singlet) - CH2 (t, triplet)

- CH (d, doublet) - CH3 (q, quartet)

• Tài liệu hiện nay (hủy ghép với H)

Mỗi C tương đương đều cho 1 singlet (dễ quan sát)

Khuyết điểm: 1 vạch có thể là vạch chính của C này

hoặc 1 vạch phụ của C khác (thua !)

CH2 COOH CH

CH3

OH

(a)

(d) (c) (b)

(a) (b)

(c) (d)

52

(1) Vòng thơm (4) Carbonyl (>C=O)

(a) có oxy 160-155 (no o/p Oxy)

149-139 (có o/p Oxy)

(a) amido (b) lactam

176-174 ppm 160-157 ppm

(b) không-oxy 128-118 (no o/p Oxy)

130-102 (có o/p Oxy)

(c) acetoxy (d) lacton

172-168 ppm 164-160 ppm

(a) có oxy 90-65 ppm methylen dioxy 102-100 ppm

(b) không-oxy 42-30 ppm -OMe thơm 60-55 ppm

(c) C gắn N 60-44 ppm -OMe nhánh 59-57 ppm

N-Me 42-39 ppm

(3) Olefinic (> C=C<) epoxy-C 54-51 ppm

140-115 ppm acetoxy-Me 23-20 ppm

δC (ppm) of Crinum alkaloids [PC 24(10), 1985, 2141-2156]

C gắn Oxy sẽ làm:

- tăng δC các C meta (downfield)

- giảm δC các C para, ortho (upfield)

60

Kiểu C / Flavonoid C (ppm)

>C=O (C-4) 210 - 170 Vòng thơm & olefin

a có Oxy 165 - 155 (o/p không Oxy)

150 - 130 (o/p có Oxy)

b ko Oxy 135 - 125 (o/p không Oxy)

125 - 90 (o/p có Oxy)

Mạch nhánh

a có Oxy 83 - 69 (ose)

b ko Oxy 80 - 40 (C-2,3 flavanon)

-O-CH2-O- ~ 100 (C-1 / O-glycosid)

-OMe 55 - 63 (60-63: 2 thế ortho) C-Me, CO-Me ~ 17 - 20

C của các ose thường gặp / Flavonoid

K.R Markham (1982), Techniques of Flavonoid Identification, A).cad Press

63

2 PHỔ 1H-NMR

2.1 Dấu hiệu nhận biết

- Thang chia từ 0 ppm – 12 ppm, đường nền mảnh

- Tín hiệu dạng vạch + phân đỉnh + có chân

- Có ghi số tích phân (số H) 1 H, 2 H, 3 H bên dưới

- Số scan thường nhỏ, đo nhanh (NS 8, 16, 32)

- Tín hiệu của dung môi đo khó phân biệt

(7.27 s / CDCl3; 2.50 s / DMSO )

2 PHỔ 1H-NMR

2 PHỔ 1H-NMR

tín hiệu tạp

(từ mẫu)

2 PHỔ 1H-NMR

68

ở 30 o C,  3 tín hiệu (1/4)+(2/3/5/6)+(7/8)

ở -60 o C,  6 tín hiệu (1)+(4)+(2/5)+(3/6)+(7)+(8)

1

2 3

4

4 3

2

1

6 5

4 3 2 1

p-dimethyl-cyclohexan

e e

2.2 Thông tin khai thác từ phổ 1H-NMR

- Số lượng H của từng tín hiệu (x)

- Tình trạng của từng H (δH khác nhau)

- Môi trường H quanh H này (sự phân đỉnh)

- Định hướng của H này ( / β; dựa vào J)

2 PHỔ 1H-NMR

* đỉnh đơn (s, singlet) * đỉnh ba (t, triplet)

* đỉnh đôi (d, doublet) * đỉnh bốn (q, quartet)

* ngoài ra còn dd, ddd, multiplet (m)

* hằng số ghép J (coupling constant, J = Hz)

75

SỰ TẠO THÀNH PHÂN ĐỈNH

Sự phân đỉnh của các proton

a về cường độ: tuân theo luật “Tam giác Pascal)

* doublet: (1 : 1)

* triplet: (1 : 2 : 1)

* quartet: (1 : 3 : 3 : 1)

b về khoảng cách giữa các đỉnh = hằng số ghép J

J = ΔH × tần số máy

79

J = 3.5 Hz

>CH-Me -Me

H

H H

KHUNG

cả 3 H của C*-methyl đều tương đương

- cho 1 singlet nếu C* không có H

- cho 1 doublet nếu C* có 1 H

Jaa và Jae J

ea và Jee

H H H

R

1 2

Jad = 11 Hz Jab = 11 Hz Jac = 4 Hz Jbc = 5 Hz

Sự bố trí H trong glucose và rhamnose

O

H H

1

1

O

H H

H

H H

các J đều lớn 1 số J nhỏ

Các proton ghép đôi thì có cùng hằng số ghép J

(độ rộng của các “khe” thì bằng nhau)

Me-3 (J = 8 Hz)

H-3 (J = 8 Hz)

HO

2 3

H Me

• Khi chưa ghép với Hb, Hc; proton Ha  s

• Ha ghép với Hb  2 đỉnh (d; Hab & Hba)

• Hab ghép với Hc  2 đỉnh (d; Habc & Hcab)

• Hba ghép với Hc  2 đỉnh (d; Hbac & Hcba)

J1 = 16 Hz (J trans)

J2 = 12 Hz (J cis)

J3 = 4 Hz (J gem)

Sự tạo thành dd (của Ha / meta nitrostyren)

J trans > J cis > J gem

b c d

Sự tạo thành dd của Hc / meta nitrostyren)

Sau Kinh

Sau Kinh

Sau Kinh

95

H (ppm) Kiểu proton / Flavonoid

~ 6.0 -O-CH2-O-, s. H-2 flavanon: 5 - 5.5 ppm

6.0 - 8.0 H thơm / A) & B)

7.5 - 8.0 H-2 isoflavonon (s)

9 - 11 -OH / 3, 7, 4’ (s yếu, ngay cả / DMSO)

12 - 14 OH /5 (s, chỉ thấy thật rõ / DMSO-d6)

O

O

2

3 4 5

6 7

8 9

O OH

97

3 PHỔ DEPT

3.1 Dấu hiệu nhận biết

Là bộ phổ 13C-NMR (thang đến 200 ppm)

Thường chia thành 3 phổ nhỏ (DEPT 90, DEPT 135, CPD)

3.2 Thông tin

- DEPT 90 : các tín hiệu của CH only ()

- DEPT 135: các tín hiệu của CH và CH3 (); CH2 ()

- C13-CPD : tất cả các tín hiệu CH3, CH2, CH và C IV

- Lưu ý : tín hiệu mới ở CPD chính là của C IV

4 PHỔ HSQC # HETCOR

Là phổ tương tác một nối C–H (single quantum)

4.1 Dấu hiệu nhận biết

- Ô chữ nhật (phổ 13C x phổ 1H)

- số peak tương tác: ≤ 2 (cross peaks)

4.2 Thông tin

- Carbon nào gắn trực tiếp với (các) Hydro nào

- C IV không cho cross peak

- CH cho 1 cross peak duy nhất

- CH2 cho 2 cross peak với 2 proton (thường # nhau)

- CH3 cho 1 cross peak mạnh với 1 tín hiệu H methyl

Hc Hd He

C-k (-CH=)

H-k

5 PHỔ HMB)C

Là phổ tương tác 2D giữa C và H qua nhiều nối

(Heteronuclear Multiple B)ond Coherence)

5.1 Dấu hiệu nhận biết

Ô chữ nhật (13C x 1H)Cross-peak: n thường ≥ 2, phức tạp

5.2 Thông tin

H này “dòm thấy” C nào (qua 1-4 liên kết)Rất cần khi xác định vị trí nhóm thế, glycosid

7

8 9

10

1' 2'

3' 4'

5' 6'

1''

2''

3'' 4''

5'' 6''

H

6 PHỔ COSY

Là phổ tương tác giữa 2.H lân cận trên khung

6.1 Dấu hiệu nhận biết

Ô vuông (1H x 1H), cross-peak: n thường≤ 2; đơn giản

Đối xứng qua đường phân giác (chéo) rõ

6.2 Thông tin

H này kế cận H nào trên khung (Hn và Hn±1)

7 PHỔ NOESY

Là phổ tương tác giữa 2.H gần nhau trong không gian

6.1 Dấu hiệu nhận biết

Ô vuông (1H x 1H), cross-peak: n thường≤ 2; phức tạp

Đối xứng qua đường phân giác (chéo) rõ

6.2 Thông tin

H này ở gần H nào trong không gian

9 10

17 16

117

• Đồng vị 1H (cho tín hiệu NMR) ≈ 99.98% / tự nhiên  các dung môi giàu 1H sẽ cho tín hiệu quá lớn trên phổ, cản trở tín hiệu của các 1H / mẫu.

• Đồng vị 13C (cho tín hiệu NMR) ≈ 1.1% trong tự nhiên nên mức độ cản trở << so với H (khỏi quan tâm)

• Dung môi đo NMR là các dung môi giàu 2H, rất ít 1H Vì vậy tín hiệu của dung môi (do 1H) sẽ nhỏ vừa đủ

• Một số dung môi thông dụng:

CHCl3-d (CDCl3), DMSO-d6, MeOH-d4, Pyridin-d5

• Trên C-NMR: cho các tín hiệu rất mạnh, tập trung thành:

- 1 nhóm (CDCl3, DMSO-d6, MeOD…)

- vài nhóm (Pyridin-d5 có 3 nhóm…)

• Trên H-NMR: cho 1 (hay vài) tín hiệu có hình dạng # các tín hiệu của mẫu đo (tránh nhầm lẫn)

• Trên phổ 2D: không cho các cross peak mạnh

Giá trị C và H của các dung môi này được ghi trong mọi

tài liệu về NMR

Nếu có dùng chuẩn nội TMS sẽ thấy các tín hiệu ở vùng

trường cao nhất trên phổ (C 0,00 và H 0,000 ppm)

CHCl3

CDCl3

7.27 ppm

(CHCl3)

CDCl3

39.5 ppm DMSO

DMSO

2.50 ppm (DMSO)

77.0 (t)

CHCl3 49.0 (t)MeOH

CDCl3 + MeOD

77.0 (t)

CHCl3 49.0 (7)MeOH

CDCl3 + MeOD

pyridin-d5

H2O pyridin-d5

Phổ 1 H-NMR (Pyridin-d5; 500 MHz) của G-Re

PYRIDIN-d5

• Là các tín hiệu do vết dung môi còn sót lại trong mẫu đo

• Xuất xứ: Do sử dụng khi phân lập, tinh chế, kết tinh mẫu,

bảo quản mẫu, rửa tube (aceton)

• Ảnh hưởng: Gây nhiễu các tín hiệu chính của mẫu thử,

 sai lầm khi giải cấu trúc

• Các dung môi hay gặp: nước, EtOH, MeOH cùng các dung môi kém phân cực thông dụng khác (n-hexan, Et2O, B)z,

CHCl3, DCM, aceton, EtOA).c, A).cOH, ForOH…)

Tham khảo: J Org Chem., 1997, 62, 7512-7515

aceton-d6 (2.05)

DMSO-d6 (2.50)

MeOD-d4 (3.31)

D2O (4.79)

1.97 4.05 1.20

1.99 4.03 1.17

2.01 4.09 1.24

2.07 4.14 1.24

(Trích từ: J Org Chem., 1997, 62, 7512-7515)

aceton-d6 (2.05)

DMSO-d6 (2.50)

MeOD-d4 (3.31)

D2O (4.79)

1.09

3.31 3.12

3.16 4.01

EtOH

1.25 3.72 1.32

1.12 3.57 3.39

1.06 3.44 4.63

1.19 3.60

1.17 3.66

Tham khảo thêm J Org Chem., 1997, 62, 7512-7515.

Glycosid có thể là mono, bi, tridesmosid (1-3 mạch ose)

Mỗi mạch có thể 1 vài ose (thẳng hoặc phân nhánh)

- Nhận biết glycosid nhờ các tín hiệu của ose

- Nhận biết ose nhờ các tín hiệu trên MS, NMR là chính

Thường gặp βD-glucopyranose, αL-rhamnopyranose

O

OH HO

Me H

OH 6' 5'

4'

3' 2'

1'

O

OH HO

4'

5' 6'

O H

HO HO

6'

5' 4'

3' 2'

1'

- MS cho sự giảm khối ∆m/z = 162 (=180–18)

- Mọi –OH đều equatorial Mọi H đều axial (Jaa lớn)

- C-1’ (anomer) thường ≈ 101 ppm* (-O-C-O-)

- C-6’ là –CH2OH (c 62-63 ppm; DEPT )

βD-glucopyranose (M = 180)

- C-1’ ≈ 101-102 ppm (-OCO-); H-1’ ≈ 5.2 - 5.3 ppm

đôi khi C-1’ ≈ 98 ppm (như ở 20-O-glc / ginsenosid)

- C-2’ 5’ ≈ 70-80 ppm (rời rạc > rham, 70-75 ppm)

- C-6’ (CH2OH) ≈ 62-63 ppm; H-6’ ≈ 4.3 - 4.5 ppm

O O

1 2

β-glycosid (J ae = 4.5 – 6.5 Hz) vừa

(J aa = 7.5 – 9.0 Hz) lớn

-glycosid (J ea = 2.5 – 3.2 Hz) nhỏ

3 4 5 6 7

8

9 10

11 12 13

14

15

16 17 18

27

28 29

30

2

Me H

OH 6' 5'

4'

3' 2'

1' 1'

2' 3'

4'

5' 6' O

Me H

HO

Rhamnose = 6-desoxy-Glc (C-6’ là methyl; M = 164)

Rhamnose thường là -L-rhamnosyl

∆m/z = 164 – 18 = 146 Da

Liên kết glycosid thường ở OH / C-1’ (OH-anomer)

nối với aglycon nối với aglycon

-L-rhamnose; C6H12O5; M = 164; ∆m/z = 146

7

8 9

10

1' 2'

3' 4'

5' 6'

1''

2''

3'' 4''

5'' 6''

OH

OH OH

H

145

a Phổ 13C-NMR: cho các tín hiệu đáng chú ý

- bộ tứ rhamnosyl: gồm 4 tín hiệu δC 70-75 ppm

- Me-6’ có δC 17.5-19, C-1’ (-OCO-) δC 101-102 ppm

- cho tương tác rõ với C tương ứng / aglycon

e Phổ COSY, NOESY

- cho tương tác rõ với các H # / rhamnose

bộ tứ rhamnose 70-71 ppm

Me-6’ (17.5 ppm)