Xác định và đa dạng phân tử của vi rút làm chậm sự phát triển của cây lúa và vi rút làm chậm sự phát triển của lúa cỏ trong Java, Indonesia

Nghiên cứu này nhằm xác định các loại vi-rút gây bệnh truyền nhiễm bởi rầy nâu BPH tấn công cây lúa ở một số vùng và để tìm ra sự đa dạng phân tử của chúng.. Kết quả xác định bằng xét ng

HỒ SƠ HỒ SƠ

Tất cả nội dung được theo dõi bởi trang này được tải lên bởi Yohanes Andi Trisyono vào ngày 01 tháng 9 năm 2016.

Người dùng đã yêu cầu nâng cấp tệp đã tải xuống.

Xác định và đa dạng phân tử của vi rút làm chậm sự phát triển của cây lúa và vi rút làm chậm sự phát triển của lúa cỏ trong Java, Indonesia

Điềutrong Tạp chí Khoa học Quốc tế: Nghiên cứu cơ bản và ứng dụng (IJSBAR) · Tháng 1 năm 2015 THUẾ

0

ĐỌC 141

4 tác giả:

Suprihanto

Cơ quan nghiên cứu nông nghiệp Indonesia…

4 CÔNG CỘNG 16 CÔNG TY

Susamto Somowiyarjo Đại học Gadjah Mada

37 CÔNG CỘNG 137 CÔNG TY

Sedyo Hartono

Đại học Gadjah Mada

29 CÔNG CỘNG 68 CÔNG TY

Yohanes Andi Trisyono Đại học Gadjah Mada

81 CÔNG CỘNG 283 CÔNG TY

Một số tác giả của ấn phẩm này cũng đang làm việc về các dự án liên quan này:

Tôi đang làm việc về quản lý sâu bệnh hại trong trồng chè.Xem Kế hoạch

Pengembangan Teknik Identifikasi dan Studi Epidemi Penyakit Budok pada Tanaman Nilam (Pengendalian Penyakit) KKP3T 2008 Xem Kế hoạch

Tạp chí Khoa học Quốc tế:

Nghiên cứu cơ bản và ứng dụng

(IJSBAR)

ISSN 2307-4531

(In & Trực tuyến)

http://gssrr.org/index.php?journal=JournalOfBasicAndApplied

Trung tâm Indonesia cho nghiên cứu lúa gạo, Bộ Indonesia Nông nghiệp, Subang, Tây Java, Indonesia (41.256)

b Khởi hành Bảo vệ cây trồng, Khoa Nông nghiệp, Đại học Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia

một Email: s_prihant@yahoo.com

Tóm tắt

Một đợt bùng phát dịch hại của rầy trên cây lúa ở Indonesia ngày nay luôn luôn được theo dõi bởi một căn bệnh

do virus lây lan Nghiên cứu này nhằm xác định các loại vi-rút gây bệnh truyền nhiễm bởi rầy nâu (BPH) tấn công cây lúa ở một số vùng và để tìm ra sự đa dạng phân tử của chúng Nghiên cứu này được tiến hành bởi một

cuộc khảo sát ở một số vùng bị ảnh hưởng bởi BPH ở DIY (Khu vực đặc biệt của Yogyakarta), Trung Java và

Tây Java Phát hiện, xác định và mô tả đặc tính được thực hiện thông qua các triệu chứng, truyền dẫn vectơ, và phát hiện phân tử bằng RT-PCR và giải trình tự Kết quả của nghiên cứu cho thấy rằng các bệnh tấn công cây lúa

ở các vùng bị rầy nâu là hai loại, tức là vi rút gây bệnh rộp gạo (RRSV) và vi rút gây bệnh trên cây lúa (RGSV) Trình tự nucleotide của tất cả RRSV từ những vùng này cho thấy tỷ lệ tương tự cao (hơn 97%), trong khi trình tự nucleotide của các chủng RGSV cho thấy mức độ tương đồng hơn 95% Tất cả các chủng RRSV từ Java - Indonesia có ái lực gần nhất với AF486811-Philippines, trong khi các chủng RGSV có ái lực gần gũi hơn với GQ329710.1- Việt Nam

Từ khóa: nhận dạng;đa dạng phân tử; RRSV;RGSV;Java-Indonesia

-* Tác giả tương ứng.

2

1 Giới thiệu

Do hậu quả của biến đổi khí hậu ngày nay, một cuộc tấn công gây hại trên cây lúa được theo sau bởi sự tấn công của virus vào vụ lúa gây ra hậu quả cho sự tái phát Virus gây bệnh, vốn không phải là virus quan trọng về mặt kinh tế, trở thành virus chủ yếu trong gạo, và một số virus mới xuất hiện ở một vùng / quốc gia Trong số các loại vi-rút trong cây lúa, vi rút gây bệnh rộp gạo (RRSV) và vi rút gây bệnh cỏ lúa (RGSV) gần đây đã trở thành vấn đề ở một số nước như Trung Quốc, Việt Nam, Philippines và Thái Lan [1, 2, 3, 4] Hai loại vi rút này được

truyền bởi rầy nâu (BPH), Nilaparvata lugens Stal Ở Trung Quốc và Việt Nam, đã xuất hiện một loại bệnh gọi

là virus lùn đen (SRBSDV) được cấy lúa trắng (WBPH) ( Sogatella furcifera ) [5] SRBSDV đã tồn tại từ năm

2001 và lan rộng nhanh chóng từ miền nam Trung Quốc đến miền bắc Việt Nam, và trở thành một tác nhân gây bệnh quan trọng trong cây lúa Năm 2009, bệnh này tấn công 300.000 ha và 15.000 ha lúa ở Trung Quốc và Việt Nam tương ứng Virus này được truyền nhiễm tự nhiên bởi WBPH và cũng có thể lây nhiễm sang cây ngô [6] Cuộc tấn công BPH vào năm 2010 có thể được coi là một sự bùng nổ quốc tế bởi vì tất cả các nước ở Đông Nam Á, Nam Á và một phần Trung Á đều bị BPH tấn công; Cây lúa tấn công BPH có tác dụng trực tiếp bằng cách hút chất lỏng của tế bào thực vật, gây ra tình trạng mất mùa Một tác động gián tiếp của cuộc tấn công BPH

là truyền virus, đặc biệt là RRSV và RGSV; Cuộc tấn công của BPH ở một số nước ở Trung Á và Đông Nam Á

bị trầm trọng thêm bởi một cuộc tấn công của rầy trắng (WBPH), lây lan bệnh SRBSDV.Cuộc tấn công BPH ở Indonesia xảy ra sau khi đạt được chương trình P2BN (Tăng sản lượng gạo quốc gia) [7]

Thiệt hại và mất năng suất do tấn công BPH là khá lớn Bên cạnh vai trò là loài gây hại chính, BPH đã truyền nhiều loại virut sang cây lúa như RRSV và RGSV [8] Từ năm 2005 đến năm 2010, các bệnh RRSV và RGSV luôn được tìm thấy ở Indonesia, nơi tấn công nghiêm trọng nhất trong năm 2005 bao phủ 1.588 ha, 550 ha dẫn đến thất bại mùa màng, trong khi đợt tấn công nghiêm trọng nhất của RRSV năm 2010 đạt 6.094 ha, 20 ha gây mất mùa [9] Nhìn chung, các triệu chứng có thể nhìn thấy của vi rút tấn công mà theo sau sâu bệnh hại trong vài năm qua đã bị còi cọc và vàng Kết quả xác định bằng xét nghiệm huyết thanh cho thấy triệu chứng vàng ở

vụ lúa ở Sukamandi-Subang là một phức hợp của bệnh RRSV và RGSV [10], trong khi triệu chứng vàng ở cây lúa ở Klaten (Trung Java) có một hỗn hợp vi rút sự lây nhiễm giữa vi-rút cầu tungro gạo (RTSV), vi rút trực

khuẩn lúa gạo (RTBV) truyền qua lá màu xanh lá cây (Nephotettix virescens ) và vi rút rệp gạo (RRSV) xuất

hiện sau đợt tấn công BPH kể từ tháng 1 năm 2010 [11]

Nỗ lực kiểm soát bệnh do vi rút truyền qua BPH đã được định hướng để kiểm soát vec tơ của nó Việc kiểm soát RRSV ở những vùng bị bệnh với thuốc trừ sâu chỉ hoạt động tốt nếu nó được tiến hành trong thời gian dân số rầy nâu khan hiếm Nó không hoạt động trong ngưỡng kinh tế hoặc khi có một triệu chứng của RRSV [12] Kiểm soát vector được thực hiện bằng cách sử dụng giống kháng thuốc là một trong những cách hiệu quả nhất trong chương trình kiểm soát BPH [13] Việc xác định một loại vi-rút gây bệnh và đặc trưng của sự đa dạng

di truyền của nó là rất cần thiết để xác định các biện pháp kiểm soát tiếp theo Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định các virus gây bệnh lây truyền qua BPH tấn công cây lúa ở một số vùng trong Java, và để phát hiện sự

đa dạng phân tử của chúng

International Journal of Sciences: Basic and Applied Research (IJSBAR) (2015) Volume 24, No 5, pp 374-386

2 Vật liệu và phương pháp

2.1 Khảo sát và lấy mẫu lấy

Cuộc khảo sát được thực hiện tại các trung tâm sản xuất lúa gạo ở Khu vực đặc biệt Yogyakarta, Trung Java và Tây Java Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2012 - 2014 Cuộc khảo sát đã được tiến hành để lấy mẫu cây bệnh và thông tin về tỷ lệ mắc bệnh và giống lúa do nông dân trồng Các mẫu cây bệnh sau đó được đưa vào nhà kính để được nuôi, nhân lên và được sử dụng để thử nghiệm thêm Các mẫu lá bị bệnh để lấy RNA được giữ trong tủ đông ở -80 ° C

2.2 Phát hiện và nhận biết

Nghiên cứu được tiến hành trong một nhà kính và Phòng thí nghiệm Virology của Khoa Nông nghiệp, Đại học Gadjah Mada, Indonesia Xác định các nguyên nhân gây bệnh do triệu chứng được thực hiện bằng cách quan sát các triệu chứng có thể nhìn thấy trên cây lúa bị tấn công bởi BPH và chúng được phân biệt theo các tiêu chí của các loại có thể dịch bệnh

Việc nuôi BPH được thực hiện trong một lồng côn trùng trong nhà kính BPH trưởng thành thu được từ lĩnh vực Ambarketawang (Gamping – Sleman) Khoảng hai mươi cặp tưởng tượng sau giai đoạn tiền trứng đã được đưa vào một lồng côn trùng có kích thước 50 cm x 50 cm x 80 cm có chứa cây lúa của cây trồng Taichung Native 1 (TN1) trong vòng 45 ngày sau khi cây con (DAS) trong chậu một nguồn thực phẩm Các cặp côn trùng được cho đẻ trứng trong một tuần, sau đó được đưa vào một hộp khác để đẻ trứng tiếp theo Theo cách này, côn trùng

có tuổi đồng đều thu được trong một lồng nuôi [13]

BPH được sử dụng làm vector để truyền bệnh Việc truyền bệnh được thực hiện bằng cách cấy nhân tạo trên giống TN1 sử dụng phương pháp truyền dẫn ống nghiệm Nhiễm trùng nhân tạo được thực hiện bằng cách cho phép instar 2 của BPH để có được một loại virus trong sự xâm nhập của một cây bị bệnh trong 1 - 4 ngày; sau

đó BPH được chuyển đến một cây khỏe mạnh, sau 7 - 10 ngày của thời kỳ ủ bệnh; Virphiverus BPH được cho phép cấy chủng loại TN1 từ 7 - 10 ngày trong 24 giờ với mật độ dân số 3 BPH / ống Inocculation đã được thực hiện trong một ống nghiệm với một cây / ống Sau đó, cây được trồng trong chậu và được nuôi trong nhà kính không có côn trùng

Phát hiện phân tử mẫu của các nhà máy bệnh trên thực địa được thực hiện bằng phương pháp RT-PCR Để xác định nguyên nhân gây bệnh, trình tự đã được thực hiện để xác định phương sai của di truyền virus Để phát hiện virus gây hội chứng vàng trên cây lúa, việc chiết RNA được thực hiện bằng cách sử dụng chất đồng hóa (Easy Blue) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Việc chiết xuất RNA tổng số cần phải được chuyển đổi thành cDNA thông qua một quá trình PCR RT sử dụng thuốc thử tổng hợp cDNA Power từ iNtRon Biotechnology Mẫu RNA được lấy từ tổng kết quả chiết RNA Trong nghiên cứu này, sử dụng thuốc thử PCR dưới dạng Master Mix Royal (MMR) Việc thực hiện phản ứng được thực hiện theo các hướng dẫn từ nhà chế tạo

Hai cặp mồi được sử dụng trong PCR, mỗi cặp cho RRSV và RGSV Đối với RRSV, một cặp mồi được sử dụng,

ví dụ: RRSV F3: 5'-GACTAG GGATGTGCGTTC-3 ', RRSV B3: 5'-TGTAATCGACGTTCGCTC-3' với các mục tiêu khuếch đại là 218 bp (Phân đoạn 8 RRSV) [15], trong khi đối với RGSV, mồi được sử dụng là RGSV NCP- F: 5'-CTATACACTACGCTAAAGGCT-3 'và RGSV NCP-R: 5'-GTGTAAGATGGGT AAAGTGCA-3 ' với mục tiêu khuếch đại 1021 bp [16], nhưng sau đó được rút ngắn xuống 450 bp bằng cách thay thế mồi trước bằng RGSV NCP-F1: 5 'GGCTTATGATAGTCTGTGATTTG-3' được thiết kế theo bộ gen hoàn chỉnh RGSV GQ329710.1 Long nhãn cô lập -Việt Nam PCR được thực hiện bằng cách biến tính trong ba phút ở 95 ° C Chu

kỳ khuếch đại qua sự biến tính kéo dài một phút ở 94 ° C, ủ trong một phút ở 53 ° C và tổng hợp DNA (mở rộng) trong một phút ở 72 ° C Chu trình được lặp lại 35 lần tiếp tục với quá trình tổng hợp trong năm phút ở 72

° C Kết quả PCR được phân tích trên gel agarose với điện di Gel màu được thực hiện bằng cách ngâm trong ethidium bromide trong năm phút Dải băng DNA được hình thành trong gel agarose được quan sát dưới ánh sáng tia cực tím sử dụng bộ dịch UV

2.3 Phân tử sự đa dạng

Việc giải trình tự đã được thực hiện đối với mẫu PCR khuếch đại được tích cực nhiễm virus Mẫu được gửi dưới dạng cDNA đến PT Genetika Science Indonesia Phân tích ADN trình tự được so sánh với ADN trình tự của một loại virus khác đã được đưa vào cơ sở dữ liệu GenBank sử dụng ClustalW với MEGA 6.0 chương trình phần mềm Kết quả của việc tìm kiếm ADN tương đồng và phân tích cây phát sinh đã được sử dụng làm cơ sở để xác định các loài virus và mối quan hệ của nó

3 Các kết quả

3.1 Sự hiện diện của bệnh virus ở một số bệnh nhân bị nhiễm BPH vùng

Một cuộc khảo sát và lấy mẫu thực vật bệnh đã được thực hiện tại một số trung tâm sản xuất lúa gạo ở Java, trong đó BPH tấn công là đặc hữu, đặc biệt ở Yogyakarta (Sleman và Kulon Progo), Trung Java (Klaten, Sukoharjo, Magelang, và Banyumas) và Tây Java (Subang và Cirebon) Kết quả điều tra cho thấy rằng các cuộc tấn công của cây trồng (BPH và WBPH) trên cây lúa được theo sau bởi sự xuất hiện của các triệu chứng của bệnh do vi-rút gây ra được truyền đi

Nó đã được xác định chắc chắn từ các triệu chứng điển hình được tìm thấy trong lĩnh vực có hai loại bệnh do vi rút truyền qua BPH, cụ thể là RRSV và RGSV Bệnh Virus đã phổ biến ở các vùng cao như Gamping - Sleman (Yogyakarta), nơi 70% được tìm thấy trong giống IR64, Banaran – Kulon Progo (Yogyakarta), nơi 45% được tìm thấy trong giống Situ Bagendit, Juwiring - Klaten (Trung Java), 70% được tìm thấy trong giống Pepe, Mungkid - Magelang (Trung Java), trong đó 75% được tìm thấy trong giống Ciherang, và Ciberes – Subang (Tây Java), trong đó 75% được tìm thấy trong giống Inpari 10 và 90% trong giống Ciherang (Bảng 1) ) Không

có nhiều giống lúa được nông dân trồng Các giống thường được trồng là IR64, Ciherang, Situ Bagendit, Inpari

13, Inpari 10, Cisedane, Mekongga, Pepe, Sidenok và các giống địa phương như Menthik Wangi và Ketan

Bảng 1: Các bệnh do vi rút lúa và các giống lúa thường được nông dân trồng tại một số trung tâm sản xuất lúa gạo trong

Java

Tỉnh

Vector

dân số / cụm

Tỷ lệ mắc bệnh

DI

Yogyakarta

70%

50%

Situ Bagendit

20%

IR64

75%

2-10 WBPH

RRSV 15%

90%

1-20 WBPH

RRSV và RGSV 20%

3.2 Virus phát hiện

Kết quả quan sát hiện trường cho thấy sự khác biệt về các loại triệu chứng của hội chứng vàng ở lúa được truyền qua BPH (Bảng 2) Sau khi quan sát chặt chẽ, có hai loại triệu chứng điển hình từ các mẫu thực vật bị bệnh lấy

từ thực địa, tức là các triệu chứng như RRSV và RGSV

C B

A

Các bệnh với các triệu chứng RRSV: các cây còi cọc, lá ngắn màu xanh đậm, lá có răng cưa và đôi khi bị rách

lá, xoắn ở cuối, phần rách rưới có màu vàng và vàng nâu, đôi khi lá hoặc thân bị phồng lên, lá cờ bị xoắn và ngắn, hoa hoặc malai bị suy yếu / xuất hiện một phần từ lá cây và thường rỗng (Hình 1) Các triệu chứng này được tìm thấy trong các mẫu bệnh hại từ Bendosari – Sukoharjo, Juwiring – Klaten, Gamping – Sleman, Pabuaran – Subang, Karanganyar-Subang, Mungkid – Magelang, Cisaat – Cirebon và Ciberes – Subang

Hình 1: Cây lúa có triệu chứng điển hình của bệnh RRSV; (A) còi cọc, lá ngắn; (B) Lá và lá màu xanh đậm,

với các cạnh có răng cưa và đôi khi lá bị rách, xoắn ở cuối, lá bị rách màu vàng và vàng nâu; (C) Lá cờ bị xoắn

và ngắn, những bông hoa bị hư hại xuất hiện một phần từ lá cây và trống rỗng

Hình 2: Cây lúa với các triệu chứng điển hình của RGSV; (A) Stunted với nhiều tillers, dựng lên, giống như cỏ

với nhiều hoa hồng; (B) Lá hẹp, ngắn, màu vàng; (C) Đôi khi có những chỗ rỉ sét ở mép lá, và không có bông

hoa bất chấp tuổi tác

Các triệu chứng của RGSV đã được stunt với nhiều chồi, với sự tăng trưởng thẳng đứng, như cỏ với sự xuất hiện của nhiều hoa hồng, lá hẹp, ngắn và màu vàng đôi khi với các điểm gỉ ở cuối lá, không malai (Hình 2) Các triệu chứng điển hình của RGSV được tìm thấy trong các mẫu từ Juwiring – Klaten, Gamping – Sleman, Pabuaran -Subang, Mungkid – Magelang, Cisaat – Cirebon và Ciberes – Subang

Kết quả truyền từ các mẫu có các triệu chứng RRSV và RGSV trong hiện trường cho thấy không phải tất cả các

vị trí bị BPH tấn công đều bị nhiễm BPH vi rút

Có 8 mẫu cây bị bệnh từ các địa điểm khác nhau có biểu hiện rõ rệt các triệu chứng RRSV, tức là các mẫu từ Gamping – Sleman, Bendosari – Sukoharjo, Juwiring – Klaten, Mungkid – Magelang, Pabuaran - Subang, Ciberes – Subang và Cisaat – Cirebon Đối với các triệu chứng RGSV được truyền đi, chúng chỉ được tìm thấy

ở năm địa điểm, ví dụ Gamping – Sleman, Juwiring – Klaten, Mungkid – Magelang, Ciberes – Subang và Cisaat – Cirebon (Bảng 2)

Bảng 2: Kết quả lây truyền từ cây bệnh với các triệu chứng RRSV và RGSV từ các vị trí khác nhau sử dụng vector BPH

Kết quả truyền TN1 với BPH Không Vị trí

2 Banaran-Kulon Progo -

-3 Kalibawang-Kulon Progo -

-4 Bendosari-Sukoharjo +

6 Mungkid-Magelang + +

7 Purwokerto-Banyumas ns ns

-9 Karanganyar-Subang -

Lưu ý: + = truyền, - = không truyền, ns = không bị truyền

Kết quả của RT-PCR cho thấy cây lúa có triệu chứng được truyền qua TN1 có thể được phát hiện dương tính phân tử, được biểu hiện bằng sự hiện diện của một thành phần DNA theo mục tiêu khuếch đại của mỗi mồi Kết quả của RT-PCR từ các mẫu thực vật có các triệu chứng RRSV cho thấy các mẫu thực vật bệnh từ Pabuaran – Subang, Mungkid – Magelang, Cisaat – Cirebon, Bendosari - Sukoharjo, Ciberes – Subang, Juwiring – Klaten, Gamping – Sleman, và Purwokerjo-Banyumas được phát hiện dương tính với virus RRSV, được chỉ định bởi một thành phần của DNA đo 218 bp (Hình 3) Sự khác biệt về độ dày của thành phần cho thấy sự khác biệt về

độ chuẩn khác nhau của virus Dựa trên trình tự hoàn chỉnh trong sự gia nhập NCBI AF486811.1, mục tiêu khuếch đại mồi là chuỗi cơ sở của nucleotide giữa 504-721 (217 bp) một phần của gen cấu trúc protein P8 (S8) Các mẫu từ các khu vực khác không được phát hiện dương tính trong xét nghiệm phân tử với RT-PCR không được hiển thị Kết quả PCR từ các mẫu thực vật có các triệu chứng RGSV cho thấy các mẫu bệnh hại từ Mungkid – Magelang, Cisaat – Cirebon, Ciberes – Subang, Juwiring – Klaten và Gamping – Sleman được phát hiện dương tính với RGSV, được chỉ định bởi thành phần của DNA đo ± 450 bp

380

M 1 2 3 4 5 6 7 8

200 bp

300 bp

218 bp

400 bp

450 bp

500 bp

Các mẫu từ Pabuaran – Subang và Bendosari – Sukoharjo không được phát hiện là RGSV (Hình 4) Dựa trên trình tự hoàn chỉnh trong số NC2 gia nhập AF290947.1, mục tiêu khuếch đại mồi là chuỗi cơ sở của nucleotide giữa 2071-2521 (450 bp) một phần của phân đoạn RNA5 và gen CP

Hình 3: Điện di phân tích với RT-PCR của RRSV phân lập từ một số vùng có BPH tấn công M = Marker 100

bp DNA ladder; 1 = Pabuaran – Subang; 2 = Mungkid – Magelang; 3 = Gamping – Sleman; 4 =

Cisaat – Cirebon;5 = Bendosari – Sukoharjo;6 = Ciberes – Subang; 7 = Juwiring – Klaten;8 = Purwokerto – Banyumas

Hình 4: Điện di phân tích với RT-PCR của các chủng RGSV từ một số vùng bị BPH tấn công M = Marker

100 bp DNA ladder; 1 = Mungkid – Magelang; 2 = Gamping – Sleman; 3 = Cisaat – Cirebon;

4 = Ciberes – Subang;5 = Juwiring – Klaten

3.3 Đa dạng phân tử của virus

9

Kết quả điều chỉnh một số chuỗi ADN của một số mẫu cho thấy tất cả các chủng phân lập RRSV dương tính trong xét nghiệm phân tử với RT-PCR, sau khi trình tự và blas với NCBI, cho thấy chúng giống hệt với trình tự nucleotide của RRSV

10