LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHẢO SÁT MỨC ĐỘ THUỶ PHÂN PHOSPHORUS CỦA DỊCH CHIẾT ENZYME TIÊU HOÁ CÁ TRA KẾT HỢP VỚI ENZYME PHYTASE LÊN THỨC ĂN NUÔI CÁ TRA

TÓM TẮT NỘI DUNG ĐỒ ÁN- Tìm hiểu dịch chiết enzyme tiêu hóa của cá Tra. -Khảo sát mức độ thuỷ phân Phosphorus của dịch chiết enzyme lên nguyên liệu (bột cá 55% đạm, bột mì, bã đậu nành, cám gạo) và thức ăn nuôi cá tra (22% protein thô, 24% protein thô, 32% protein thô).-Đánh giá mức độ thuỷ phân Phosphorus của enzyme phytase thương mại với các nồng độ 0,015U, 0,03U, 0,06U, 0,09U, 0,12U lên nguyên liệu (bột cá 55% đạm, bột mì, bã đậu nành, cám gạo) và thức ăn nuôi cá tra (22% protein thô, 24% protein thô, 32% protein thô).-Đánh giá mức độ thuỷ phân Phosphorus của enzyme phytase thương mại kết hợp với dịch chiết enzyme lên nguyên liệu (bột cá 55% đạm, bột mì, bã đậu nành, cám gạo) và thức ăn nuôi cá tra (22% protein thô, 24% protein thô, 32% protein thô).-Đánh giá hiệu quả quá trình thuỷ phân phosphorus của dịch chiết enzyme kết hợp với enzyme phytase thương mại.-Xác định nồng độ enzyme phytase thương mại để bổ sung vào thức ăn nuôi cá tra

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

Phosphorus là khoáng chất đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng thức ăn vật nuôi.Phosphorus và cũng như các nguyên tố khoáng cần thiết khác được cung cấp chủ yếu qua conđường thức ăn Đa số thức ăn cho gia súc có nguồn gốc từ các hạt thực vật đặc biệt là ngũ cốc

và các loại hạt đều có chứa sẵn Phosphorus Tuy nhiên, Phosphorus có chứa trong nguyên liệuhạt này có tới 80% nằm dưới dạng phân tử phytate hoặc axit phytic Phosphorus tồn tại ởdạng này rất khó tiêu hoá đối với các loài động vật có dạ dày đơn như gia cầm, lợn, cá …

Axit phytic khi kết hợp với các ion kim loại như Fe3+, Mg2+, Ca2+, Zn2+… sẽ ngăn cảnkhả năng kết hợp của các ion kim loại này với các axit béo không no làm giảm khả năng tiêuhoá thức ăn của động vật, gây ra hiệu ứng kháng dinh dưỡng

Ngoài ra do không hấp thu được lượng Phosphorus có sẵn trong axit phytic nên thức

ăn cho động vật dạ dày đơn (ví dụ: cá, gia cầm, heo…) thường phải bổ sung thêm Phosphorusdẫn đến lượng Phosphorus thừa không được tiêu hoá bị thải ra ngoài theo phân của chúng đãlàm ô nhiễm môi trường gây nên hiện tượng tảo nở hoa bùng phát, ảnh hưởng đến sự pháttriển của các loài thuỷ sản…

Chính vì vậy, để tận dụng nguồn Phosphorus có sẵn trong thành phần của các nguyênliệu thực vật, tăng hệ số sử dụng thức ăn của vật nuôi, giảm lượng axit phytic thải ra ngoàimôi trường thì việc các hợp chất Phosphorus ở dạng khó phân giải thành này thành các chấtđơn giản và dễ phân giải hơn là rất quan trọng Để đạt được điều này, người ta đã sử dụngphytase để thuỷ phân axit phytic

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành khảo sát mức độ thuỷ phân của dịchchiết enzyme tiêu hoá cá tra kết hợp với enzyme phytase trên thức ăn nuôi cá tra để nâng cao

hiệu quả sử dụng thức ăn nuôi cá tra Bằng cách ứng dựng phương pháp nghiên cứu in vitro –

là phương pháp phân tích hiện nay đang được quan tâm đề xuất đánh giá khả năng tiêu hoá

của thức ăn thủy sản là kỹ thuật enzym tiêu hoá in vitro bởi vì kỹ thuật đưa ra ý nghĩa làm

giảm yêu cầu về chi phí và thời gian nhằm đánh giá khả năng tiêu hoá của thức ăn

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

2.1 Vai trò của enzym khi bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi [3, 30]

2.1.1 Cơ chế tác động của enzyme

Enzyme được sử dụng như là thức ăn bổ sung được gọi là enzyme ngoại sinh để phânbiệt với enzyme nội sinh - là những enzyme sinh ra trong cơ thể Enzyme ngoại sinh làm tăng

tỷ lệ tiêu hoá thức ăn theo hai cơ chế:

- Một là, kết hợp với enzyme nội sinh phân giải các hợp chất thành những chất có kíchthước đủ nhỏ để hấp thụ Như vậy việc lựa chọn enzyme thức ăn sao cho có tác dụng hỗ trợcho enzyme nội sinh trong việc phân giải chất dinh dưỡng của thức ăn là cần thiết

- Hai là, enzyme thức ăn phải giảm được độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hoá thức

ăn, vì chính độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hoá cản trở sự hấp thu thức ăn Một vài hợpchất khi giải phóng khỏi vách tế bào đã hình thành các gel làm tăng độ nhớt trong ruột.Thường các khẩu phần chứa nhiều polysaccharide không phải tinh bột (non – starchpolysaccharides – NSP) gây ra hiện tượng này Động vật mới sinh ra, đặc biệt là gia cầm rấtnhạy cảm với sự biến đổi độ nhớt vốn được sinh ra trong quá trình tiêu hoá

Để tăng cường hai cơ chế trên, enzyme thức ăn thường được sản xuất dưới dạngnhững chế phẩm đa enzyme để phân giải đồng thời nhiều hợp chất Ví dụ: nếu dùng β –glucanase thì chỉ phá vỡ được vách nội nhũ của hạt đại mạch mà không phân giải đượcprotein chứa trong tế bào chất, vì vậy để phân giải protein trong lớp tế bào chất này phải cầnthêm cả enzyme cellulase và pentosanase

2.1.2 Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn của lợn, cá, gia cầm

2.1.2.1 Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn của gia cầm [30]

Gà broiler nhạy cảm đối với các chất kháng dinh dưỡng, do vậy để đáp ứng tốt đối vớiviệc bổ sung enzyme phù hợp vào khẩu phần (β – glucanase đối với khẩu phần lúa mạch,pentosanase đối với khẩu phần lúa mì, phytase đối với phytate) Bổ sung đa enzyme có lợihơn bổ sung enzyme đơn

Hàm lượng enzyme bổ sung tuỳ thuộc vào tuổi và thành phần khẩu phần TheoSchoner et al., (1993), gà broiler 44 ngày tuổi yêu cầu 570 U phytase để giải phóng 1g

Gà mái đẻ có nhu cầu bổ sung phytase kém hơn gà broiler tuy nhiên cũng có nhữngtác dụng như tăng sản lượng trứng và hiệu quả chuyển hoá thức ăn thì cũng thấy rõ ở gà mái

đẻ [3]

2.1.2.2 Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn lợn

So với gia cầm, hiệu quả của enzyme thức ăn trong khẩu phần lợn giữa các nghiên cứukhông thống nhất [3]

Một tổng kết tập hợp kết quả 23 thí nghiệm bổ sung enzyme cho lợn tiến hành từ 1978đến 1993 đã thấy rằng chỉ có 4 thí nghiệm trên lợn con là có kết quả rõ rệt (Officer, 1995);còn đối với lợn sinh trưởng- vỗ béo thì kết quả không rõ rệt (Chu et al., 1998) NSP hoà tankhông làm giảm khả năng tiêu hoá thức ăn của lợn như ở gia cầm Thacker et al (1998) chobiết rằng sự chuyển hoá thức ăn và tăng trọng của lợn 20 kg ăn khẩu phần đại mạch giàuglucan không có sự khác nhau đáng kể nào khi bổ sung β- glucanase vào khẩu phần thức ăn.Không giống như gia cầm, pentosanase không làm tăng khả năng hấp thụ thức ăn của lợn con

Bổ sung pentosanase vào khẩu phần lúa mạch không cải thiện được sự tăng trưởng của lợn20-25kg (Thacker et al 1991) Bổ sung β-glucanase cho lợn 80kg làm tăng tỷ lệ tiêu hoá chấtkhô và protein nhưng sự cải thiện này quá nhỏ để nâng cao hiệu quả chuyển hoá thức ăn vàtăng trọng

Tuy nhiên, đối với lợn việc bổ sung phytase thì có hiệu quả rõ rệt, phytase đã làm tăngtích luỹ khoáng và khả năng hấp thụ thức ăn của lợn, giảm được chi phí thức ăn

Cần chú ý rằng không có mức tiêu chuẩn bổ sung phytase cho tất cả các khẩu phần,mức phytase bổ sung phụ thuộc vào loài lợn và loại khẩu phần Yi et al (1996) cho thấy rằng

số lượng phytase để giải phóng 1g Phosphorus khác nhau từ 785 U (đối với khẩu phần ngô-đỗtương) đến 1146 U (đối với khẩu phần đỗ tương tinh chế) Mặt khác đối với Hoppe et al.(1993) cũng cho rằng với khẩu phần ngô- lúa mạch-đỗ tương cho lợn con thì để giải phóng 1gPhosphorus chỉ cần 380U Ngoài ra các nguồn phytase khác nhau thì hoạt tính enzyme cũngkhác nhau (hoạt tính enzyme phytase vi sinh vật lớn hơn phytase lúa mì và làm tăng khả nănghấp thụ Phosphorus, sự tích luỹ Canxi, Nitơ và giảm Phosphorus thải tiết ở phân) Hiệu quảcủa phytase còn chịu sự chi phối của khẩu phần, số bữa ăn, lượng thức ăn cho ăn cũng nhưchức năng sinh lý của lợn (bổ sung cùng một lượng phytase vào một khẩu phần thì hiệu quảnhất là đối với lợn nái tiết sữa sau đến lợn sinh trưởng-vỗ béo, lợn con và thấp nhất là lợnchửa giữa kỳ) [3]

2.1.2.3 Bổ sung enzyme vào thức ăn của cá

Trong những năm gần đây nguồn protein động vật như bột cá ngày càng đắt đỏ chonên protein thực vật đã được bổ sung vào trong các khẩu phần của cá Tuy nhiên các nguồnprotein thực vật thì nhiều xơ và chất kháng dinh dưỡng như axit phytic, chất ức chế trypsin,lecitins Vì vậy vai trò của enzyme ngoại sinh trong khẩu phần các loài thuỷ sản nuôi ngàycàng quan trọng

Tuy nhiên nhu cầu bổ sung enzyme của cá khác nhau thì khác nhau Nghiên cứu củaCarter et al 1992 với α-amylase trên cá hồi Atlantic (Salmon salar) không thấy có ảnh hưởngđến hiệu quả chuyển hoá thức ăn Tương tự Renitz (1983) cũng thấy rằng bổ sung enzymephân giải protein trong khẩu phần cá hồi rainbow trout không cải thiện được sự tăng trưởng

và hiệu quả chuyển hoá thức ăn Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu trên cá hồi củaGorskova và Yu- Dvinen (1984) và của Carter et al (1994) thì lại thấy có những cải thiện vềkhả năng tiêu hoá thức ăn của cá khi bổ sung enzyme Nghiên cứu của Ye et al: bổ sung vàokhẩu phần cá chép một hỗn hợp đa enzyme với liều 5 - 10g/kg đã làm cho tốc độ tăng trưởngcủa cá tăng hơn 12,3 - 27,5% so với đối chứng

Đối với cá cũng như các loài động vật dạ dày đơn, phytate là một chất kháng dinhdưỡng Enzyme phytase có tác dụng giải phóng Phosphorus, cải thiện tỷ lệ tiêu hoá củaPhosphorus (1000 U phytase/kg thức ăn của cá hồi rainbow trout làm tăng tỷ lệ tiêu hoáPhosphorus từ 58,6 lên 68,1% Lunari et al 1998) Nhu cầu bổ sung phytase cũng phụ thuộcvào loài cá, khối lượng cá và khẩu phần

2.1.3 Giảm mùi hôi và cải thiện môi trường chăn nuôi [29]

Chất thải chăn nuôi có khả năng gây ô nhiễm môi trường không khí, đất, nước và đặcbiệt là tầng mặt nước Ở nước ta, tình trạng này có phần nghiêm trọng do nơi chăn nuôithường nằm gần hoặc trong khu dân cư, đặc biệt là khi phần lớn các giếng cung cấp nước sinhhoạt lại khai thác nước ở tầng nước mặt bị ô nhiễm

Phosphorus thải ra trong phân của vật nuôi là chất gây ô nhiễm đất và nước ngầm.Phytase có khả năng làm giảm 30 – 50% lượng phosphorus thải ra môi trường do nó giúp làmgiảm lượng Phosphorus bổ sung và hấp thu tối đa lượng Phosphorus sẵn có trong nguyên liệu.Phytase cũng giúp giải phóng đạm và axit amin, khiến chúng được tiêu hoá và hấp thu tốt

2.2 Sơ lược về axit phytic và enzym phytase

2.2.1 Sơ lược về axit phytic

2.2.1.1 Định nghĩa

Axit phytic là axit hữu cơ, phân tử của nó có chứa các gốc phosphate, tồn tại chủ yếutrong hạt của các hạt ngũ cốc, đậu đỗ, hạt có dầu Người ta đã xác định được rằng axit phyticgiữ vai trò nhất định và có những tác động ảnh hưởng đến tính chất dinh dưỡng của các loạihạt trên

Axit phytic công thức phân tử C6H18O24P6 và phân tử lượng là 660,04 Danh pháp quốc

tế của axit phytic được gọi là myo – inositol 1,2,3,4,5,6 – hexakisdihydrogen phosphate.

Thực tế, axit phytic thường tồn tại dưới dạng muối của các kim loại có hoá trị I, II (thường là

K, Mg, Ca) Các muối kim loại này gọi là phytate và chúng được xem như là kho dự trữPhosphorus lớn trong các hạt thực vật

2.2.1.2 Cấu trúc hoá học của axit phytic

Có nhiều nghiên cứu về mô hình cấu trúc phân tử của axit phytic nhưng các nghiêncứu này lại đưa đến những kết luận rất khác nhau Trong số các nghiên cứu đó có hai nghiêncứu tiêu biểu của hai nhóm chuyên gia khác nhau được biết đến nhiều hơn cả Đó là nhómcủa Johnson & đtg nghiên cứu cấu trúc axit phytic bằng phương pháp cộng hưởng điện từ từhạt nhân 31P (31P – NMR) và nhóm của Blank nghiên cứu bằng phương pháp nhiễu xạ tia X.Tuy nhiên hai nhóm nghiên cứu này lại đưa ra hai kết luận trái ngược nhau Theo Jonhson thìtrong cấu trúc của phân tử axit phytic có một gốc phosphate ở vị trí số 2 (gốc phosphate gắnvới nguyên tử C số 2 nằm theo hướng trục thẳng đứng còn các gốc phosphate ở vị trí khác thì

có hướng nghiêng một góc so với phương thẳng đứng) Ngược lại, kết luận của tác giả Blanklại cho rằng các gốc phosphate 1,3,4,5 và 6 nằm theo hướng trục thẳng đứng còn gốcphosphate nằm ở vị trí số 2 lại nghiêng theo gốc 1/4 Tuy nhiên, kết luận về cấu trúc phân tửcủa axit phytic theo phương pháp Johnson được sự tán đồng hơn

Hình 2.1: Mô hình cấu trúc axit phytic Hình 2.2: Công thức cấu tạo của phytate

2.2.1.3 Nguồn gốc và sự phân bố của axit phytic trong tự nhiên

Axit phytic thường tồn tại ở dạng muối của các ion kim loại có hoá trị một hay nhiềuhoặc có thể là hỗn hợp của chúng Chẳng hạn như hỗn hợp muối Kali – Magiê trong gạo, hỗnhợp Canxi – Magiê – Kali trong các hạt đậu tương Các muối này thường tập trung ở một sốvùng nhất định trong các hạt thực vật như ngũ cốc, đậu đỗ Axít phytic được tích luỹ dầntrong hạt từ khi hạt còn non đến khi hạt trưởng thành, trong suốt quá trình chín cùng với cácchất dự trữ khác trong hạt như tinh bột, lipid… Tuy nhiên, mức độ tập trung của axit phytic ởcác hạt thực vật khác nhau là không giống nhau Ví dụ như trong các loại ngũ cốc, axitphytic được tích luỹ nhiều trong hạt phấn còn đối với các loại đậu thì axit phytic được tíchluỹ nhiều trong các hạt tinh thể của chúng Nghiên cứu cho thấy rằng, ở cây một lá mầm nhưlúa, lúa mì… thì trong nội nhũ và nhân của hạt hầu như không chứa phytate mà lượngphytate lại được tìm thấy chủ yếu ở phôi và lớp tế bào hạt phấn Ngược lại, như Ferguson đãchứng minh ở cây hai lá mầm thì lượng phytate chủ yếu lại nằm trong thành phần nội nhũchiếm 99% và chỉ có khoảng 1% là ở trong phôi hay mầm của hạt Hàm lượng phytate caonhất ở hạt ngũ cốc được tìm thấy ở ngô (0,83-2,22%) và các hạt đậu là (5,92-9,1%)

2.2.1.4 Chức năng sinh lý của axit phytic

Phosphorus là một thành phần cấu tạo nên phân tử axit phytic chính vì vậy axit phytic

và các muối của chúng trong các hạt thực vật là một nguồn dự trữ Phosphorus khá dồi dào cóthể tận dụng nhằm cung cấp khoáng chất cho cơ thể Ngoài ra axit phytic còn là một nguồn

dự trữ năng lượng, nguồn myo-inositol (thành phần cấu tạo nền vỏ ngoài của thành tế bào).

Đối với các hạt thực vật, axit phytic cũng có những ảnh hưởng nhất định đến đặc tính sinh lý

(chống lại sự hô hấp) trong quá trình ngủ nghỉ của các hạt thực vật, vì vậy làm chậm sự pháttriển và có thể làm mất khả năng nảy mầm của các hạt này.

Vào cuối thập kỷ 80, đầu thập kỷ 90 người ta đã chứng minh được vai trò gián tiếp củainositol phosphate trong quá trình vận chuyển vật chất trong tế bào, đặc biệt là vai trò củainositol-triphosphate Chúng là dấu hiệu của sự di truyền tính trạng và có liên quan rất lớnđến sự biến đổi chức năng của tế bào đối với cả tế bào động vật và thực vật Bên cạnh nhữngtác động sinh lý nêu trên, người ta dự đoán rằng axit phytic còn có thể có những chức năngchưa biết khác

2.2.1.5 Hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic

Một đặc tính bất lợi nổi bật nhất của axit phytic đối với cơ thể động vật là hiệu ứngkháng dinh dưỡng Hiệu ứng này tạo nên do cấu trúc bất thường của axit phytic Khi phân tửaxit phytic ở dạng phân ly hoàn toàn, 6 nhóm phosphate của chúng sẽ mang tổng điện tích

âm 12 Vì vậy, chúng có nhiều khả năng thích hợp với các ion dương hoá trị I, II, III hoặchỗn hợp của các ion đó, hình thành nên các hợp chất không hoà tan, rất khó tiêu hoá Sự hìnhthành các hợp chất vô cơ không tan trong đường ruột đã ngăn cản sự hấp thụ các khoáng chấtcủa cơ thể động vật Bởi vì axit phytic khi kết hợp với các ion kim loại như: Fe3+, Mg2+, Ca2+,

Zn2+… sẽ ngăn cản khả năng kết hợp của các ion kim loại này với các axit béo không no làmgiảm khả năng tiêu hoá thức ăn của động vật Như vậy, yếu tố này làm giảm lượng khoángcần thiết được đưa vào cơ thể động vật qua con đường thức ăn mà lẽ ra cơ thể động vật cóthể hấp thu được, do đó làm giảm giá trị dinh dưỡng của nguồn thức ăn

Chính vì những nguyên nhân trên mà axit phytic được coi là yếu tố kháng dinh dưỡng

ở động vật, đặc biệt là các động vật có dạ dày đơn ngăn như gia cầm, lợn, và cá Với một sốnguyên tố vi lượng, ví dụ như Zn thì giá trị dinh dưỡng của nó chịu ảnh hưởng rất lớn bởiaxit phytic Một vài thí nghiệm đã cho thấy việc bổ sung dần dần axit phytic vào trong khẩuphần thức ăn của vật nuôi đã gây ảnh hưởng đến sự hấp thụ Zn2+ của cơ thể (cơ thể khônghấp thụ Zn2+) và tốc độ tăng trưởng trọng lượng của động vật thí nghiệm một cách rõ rệt.Axit phytic có khả năng kết hợp với protein tạo thành phức chất phytate – proteintrong một khoảng pH rất rộng Ở pH rất thấp, axit phytic mang điện tích âm lớn do sự phân

ly của toàn bộ các gốc phosphate trong phân tử Trong điều kiện này, axit phytic có thể làmhạn chế khả năng hoà tan của các protein bởi vì có sự liên kết ion giữa các gốc phosphate cơbản với các gốc tự do của amino axit (lysine, histidine, arginine) Trong môi trường có tính

axit, axit phytic liên kết chặt chẽ với các protein thực vật do đó điểm đẳng điện (pI) của cácprotein thực vật lúc này nằm trong khoảng pH = 4 – 5, khoảng pH= 6 – 8 cả axit phytic vàprotein thực vật đều mang điện tích âm Tuy nhiên, ở điều kiện này vẫn có thể hình thànhphức chất giữa axit phytic và protein Cơ chế xảy ra có thể là sự liên kết trực tiếp của axitphytic với proton của các nhóm cuối cùng α – NH2 và ε – NH2 của gốc lysine tự do hoặc liênkết qua nhân tố trung gian là một cation đa hoá trị Cũng bởi liên kết với protein thực vật nênaxit phytic làm giảm khả năng hoà tan và khả năng tiêu hoá của các protein này do đó làmgiảm giá trị dinh dưỡng của chúng.

Ngoài việc tạo phức chất với các khoáng chất và các protein, axit phytic còn tác độngđến các enzyme như trypsine, pepsine, α – amylase, β – galactosidase và kết quả là làm giảmhoạt tính của các enzyme tiêu hoá quan trọng này

2.2.2 Sơ lược về enzyme phytase [24, 25, 26]

2.2.2.1 Định nghĩa

Phytase là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân axit phytic (myo – inositolhexakisphosphate) thành các myo – inositol phosphate phân tử thấp và các monophosphate vô

cơ Khi phản ứng thuỷ phân xảy ra hoàn toàn sẽ giải phóng toàn bộ các gốc phosphate trong

phân tử axit phytic và tạo thành các myo – inositol tự do.

Phytase có tên gọi đầy đủ, theo quy ước quốc tế là: myo – inositol hexakisphosphat

phosphohydrolase Uỷ ban danh pháp enzyme thuộc Hội hoá sinh Quốc tế đã chia phytasethành hai loại là 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26) Các định tên này dựa trên

cơ sở nhóm phosphat đầu tiên được giải phóng khi axit phytic (hay hợp chất phytate) bị tấncông bởi enzyme

2.2.2.2 Đặc điểm cấu tạo của phytase [26]

Hình 2.3: Cấu trúc toàn bộ của phytase từ vi khuẩn B.amyloliquefacience.

Phytase cũng giống như mọi enzyme khác có bản chất là protein Chúng là những phân

tử có khối lượng 20kDa đến 100kDa Kích thước phân tử protein của enzyme phytase sảnsinh từ các nguồn khác nhau cũng khác nhau

Ba ion Canxi Ca1, Ca2 và Ca3 quyết định tính bền nhiệt của enzyme có màu sáng Baion Caxi Ca4, Ca5 và Ca6 nằm ở phía trên của phân tử có màu đậm Thêm một ion Canxi Ca7

cò màu đen nằm cạnh Ca4 và Ca6 không có mặt khi vắng mặt ion phosphat

Các nghiên cứu đã cho thấy rằng hầu hết các phytase thu được từ các chủng nấm mốc và

vi khuẩn như E.coli, K.terrigena, B.subtilis (natto) cho đến nay đều là các enzyme được cấu

tạo chỉ gồm một phần tử Nhưng phytase ở một số động vật và thực vật thì protein của chúnglại được cấu tạo bởi nhiều phần nhỏ, các phần đó được gọi là các tiểu đơn vị Ví dụ phytasetích luỹ trong các hạt ngô đang nảy mầm là enzyme mà phân tử protein của chúng bao gồm 2tiểu đơn vị có trọng lượng phân tử bằng nhau là 38 kDa Còn phytase được tách chiết từ ruộtcủa một loài chuột lại được cấu tạo bởi 2 tiểu đơn vị là 2 băng protein có khối lượng được xácđịnh bằng phương pháp điện ly trên gel polyacrylamid (SDS – PAGE) ước tính khoảng 70 và

90 kDa Tuy nhiên người ta đã xác định được rằng chỉ có tiểu đơn vị có kích thước 90 kDa là

có khả năng thuỷ phân axit phytic vì 2 băng protein này biểu hiện cho 2 loại enzyme khácnhau tương ứng là phosphatase kiềm và phytase

Theo tác giả Tambe, có một trường hợp đặc biệt đó là phytase thu được từ chủng vi

khuẩn K.aerogenes lại gồm 2 dạng khác nhau Dạng thứ nhất có thể coi là dạng enzyme gốc,

có kích thước lớn một cách khác thường (700 kDa) Dạng thứ 2 có thể là một phân tử nhỏ của

enzyme gốc, có khối lượng phân tử rất thấp chỉ khoảng 10 – 13 kDa nhưng nó lại mang đầy

đủ hoạt tính của enzyme

Phytase của vi khuẩn nhìn chung có kích thước nhỏ hơn so với phytase của nấm mốc.Phân tử lượng của phytase từ nấm theo dự đoán khoảng 50 kDa và theo kết quả thí nghiệmxác định được là 65 – 70 kDa, điều này cho thấy có sự glycosyl hoá rất mạnh mẽ Phytase

được sinh ra từ chủng nấm mốc A.niger NRRL 3135 có 27% hàm lượng glycosyl, chúng bao

gồm một tỷ lệ nhất định giữa đầu N của chuỗi manose và galactose Các nghiên cứu đều chothấy rằng sự glycosyl hoá của phytase tái tổ hợp rất cao Ngược với sự glycosyl hoá một

lượng vừa phải trong nấm mốc A.niger, chúng lại xảy ra rất đa dạng và với một lượng rất lớn trong nấm men Hansenula polymorpha và Saccharomyces cerevisiae Điều đáng ngạc nhiên

là hàm lượng glycosyl khác nhau không chỉ giữa các hệ được biểu hiện khác nhau mà còngiữa các nhóm phytase trong cùng một hệ biểu hiện Khi phân tích mô hình glycosyl của

phytase từ nấm mốc A.niger thì thấy rằng tính không đồng nhất của chúng đã dẫn đến sự thiếu

hụt 2 trong 10 vị trí N-glycosyl

Nhìn chung hàm lượng glycosyl có thể có một vài tác động đến tính chất của enzyme.Thứ nhất, nó có thể ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác hoặc tác động đến tính bền củaenzyme.Thứ hai, nó có thể ảnh hưởng đến tính đẳng điện (pI) của protein enzyme Thứ ba, sựtổng hợp năng lượng trao đổi chất có thể thấp hơn mức biểu hiện của protein Nhưng theoWyss & đtg, có một điều đáng ngạc nhiên là glycosyl ở các mức độ khác nhau không ảnhhưởng đến hoạt tính xúc tác, khả năng chịu nhiệt hay khả năng phục hồi của phytase ở loài

A.niger Từ sự glycosyl hoá cấu trúc và chức năng của phytase đã dẫn đến câu hỏi liệu chỉ có

2 vị trí N-glycosyl hoá là bảo thủ ở phytase của nấm mốc hay còn ở vị trí nào khác Han &đtg đã nghiên cứu vai trò của glycosyl trong việc biểu hiện phytase chức năng của nấm mốc

A.niger trong nấm men Pichia pastoris Các kết quả nghiên cứu trên đã cho thấy sự giống

nhau trong việc thuỷ phân axit phytic và khả năng chịu nhiệt được cải thiện nhưng không

đáng kể ở enzyme được glycosyl khi biểu hiện trong nấm men P pastoris so với cùng với enzyme đó nhưng biểu hiện trong nấm mốc A.niger Việc khử glycosyl của phytase có thể

làm giảm 34 % khả năng chịu nhiệt của enzyme Sự khử glycosyl bằng tunicamycin trong quátrình biểu hiện đã dẫn tới kết quả làm giảm đáng kể sự sản sinh phytase, điều này cho thấy

rằng sự glycosyl hoá rất cần cho quá trình sinh tổng hợp của PhyA tái tổ hợp trong nấm P pastoris Tuy nhiên tunicamycin cũng có thể làm hỏng quá trình sản xuất vì chúng không tích

không tác động hoặc chỉ có một tác động nhỏ đến pI của phytase từ nấm mốc được kiểm tra.

Ngoại trừ một trường hợp là phytase được biểu hiện trong nấm men H polymorpha có sự

thay đổi giá trị pI axit rất rõ rệt Tất cả các phytase của nấm mốc, vi khuẩn và thực vật đã

được nghiên cứu cho đến nay đều có giá trị pI axit, trừ phytase của nấm A fumigatus có pI là

bazơ Phytase của vi khuẩn dường như có tính axít yếu hơn phytase từ nấm mốc, pI của chúngthường lớn hơn 6 trong khi đó phytase của nấm mốc lại có giá trị pI dưới 5,5

Phytase của các loại nấm mốc A fumigatus, emericella Nidulans, A terrus, và Mycelicophthora thermophila có xu hướng bị giảm hoạt tính khi được biểu hiện trong A niger và được bảo quản ở 40C dưới dạng dịch nuôi cấy Theo Powar & đtg hoạt tính của

phytase từ B subtilis không bị ảnh hưởng bởi các protease như trypsin, papain và elastase

điều đó chứng tỏ sự kháng lại các protease của phytase từ vi khuẩn mạnh hơn các phytaseđược sinh ra từ nấm mốc

2.2.2.3 Sự phân bố của phytase trong tự nhiên [24, 25]

2.3.1 Phytase từ nguồn thực vật

Phytase có mặt phổ biến trong giới thực vật, đặc biệt chúng có thể tách chiết và tinh

chế từ các loại ngũ cốc như lúa (Oryza sativa), lúa mì (Triticum aestivum), ngô (Zea mays) và

các loại đậu xanh, đậu tương, đậu trắng California Ngoài ra hoạt tính phytase cũng tìm thấytrong cây mù tạc trắng, khoai tây, củ cải, rau diếp, phấn hoa loa kèn

2.3.2 Phytase từ nguồn động vật

Phytase được phát hiện ở một số loại chủng vi sinh vật trong dạ cỏ của động vật nhai

lại Schwanniomyces castellii, một chủng nấm men có khả năng thuỷ phân từ 90% đến 95%

phytate trong cám mì và bột hạt bông

Yanke & đtg đã quan sát hoạt tính phytase của một số chủng vi sinh vật trong dạ cỏ

như là Selenomonas ruminantium, Megasphaera elsdenii, Prevotella ruminicola, Mitsuokella multiaccidus, và Treponema spp Trong đó chủng Selenomonas ruminantium có hoạt tính cao

nhất Yanke cũng thông báo hoạt tính phytase tăng lên khi lượng thức ăn hạt của bò đực nontăng Hầu hết vi sinh vật dạ cỏ sản xuất phytase ở dạng ngoại bào

Đối với các động vật có dạ dày đơn ngăn như lợn và gia cầm, phytase đã được tìmthấy trong ruột và dạ dày của chúng Tuy nhiên theo Williams & đtg, các phytase này gần nhưkhông có ý nghĩa gì đối với việc phân giải phytate có trong thức ăn được đưa vào dạ dày củađộng vật

Năm 1997, Craxton đã tách dòng và biểu hiện inositol polyphosphat phosphatase(MIPP) từ gan chuột thấy có hoạt tính phytase Dạng ARN thông tin của MIPP có mặt trongtất cả các mô của các con chuột đem làm thí nghiệm nhưng chủ yếu tập trung nhiều ở thận vàgan của loài động vật này Một loại enzyme giống phytase cũng được tìm thấy ở loài động vật

nguyên sinh Paramecium.

2.3.3 Phytase từ nguồn vi sinh vật

Chúng ta đã biết rằng enzyme nói chung và phytase nói riêng đều có mặt trong tất cảcác cơ quan, mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật Nguồn vi sinh vậtlại vô cùng phong phú và đa dạng nên phytase cũng như các loại enzyme khác có thể đượcsinh ra từ rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau

Những nghiên cứu gần đây của một số tác giả đã chỉ ra rằng phytase của vi sinh vật rấthứa hẹn cho ứng dụng trong công nghệ sinh học Shich & đtg đã phân lập được trên 2000 loài

vi sinh vật từ đất có khả năng sinh tổng hợp phytase Người ta đã phát hiện và tách được

phytase ở một số loài vi khuẩn khác nhau như Aerobacter aerogenes, Pseudomonas sp, Bacillus subtilis Escherichia coli, Citrobacter braakii, Enterobacter sp 4, Raoultella sp., vi khuẩn dạ cỏ kị khí Mitsuokella jalaludinii

Các vi khuẩn lactic cũng có khả năng sinh phytase, nhưng hầu hết trong chúng đều có

hoạt tính thấp Ngoại trừ một chủng Lactobacillus sanfranciscensis phân lập từ bột ủ chua

được xem như chủng có khả năng sản xuất phytase tốt nhất

Phytase của vi khuẩn hầu hết được tổng hợp nội bào, ngoại trừ B subtilis, Lactobacillus amylovorus và Enterobacter sp 4 là những vi khuẩn sinh tổng hợp phytase

ngoại bào Hầu hết các chủng sản sinh phytase ngoại bào thuộc nấm sợi Trong 28 chủng

thuộc chi Aspergillus có khả năng sinh tổng hợp phytase ngoại bào phân lập được có 21 chủng thuộc loài Aspergillus niger Các nghiên cứu khác của các tác giả Howson và Volfova còn khẳng định rằng chủng A niger là nguồn thu phytase ngoại bào tốt nhất Còn với nấm men, các chủng là Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida … cũng

có khả năng sinh phytase Phytase ngoại bào được tìm thấy ở các chủng Schwanniomyces castellii và Aexula adeninivorans Nakamura & đtg đã sàng lọc được một số loài nấm men có

hoạt tính phytase ngoại bào

Bảng 2.1: Tóm tắt các phytase thu được từ một số nguồn khác nhau

Nấm mốc

Aspergillus niger NRRL 3135 Ngoại bào

Penicillium caseoicolum Ngoại bào

Rhizopus oligosporus Ngoại bào và nội bào

Nấm men

Saccharomyces cerevisiae Ngoại bào

Schwanniomyces castelii Ngoại bào

Khyveromyces fragilis Ngoại bào

Vi khuẩn

Thực vật

Hạt đậu tương và các loại đậu Nội bào

Động vật

2.2.2.4 Các tính chất ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase [22,24,25,26]

2.2.2.4.1 Nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của phytase

Khi thuỷ phân axit phytic, phytase có tác dụng cắt đứt các liên kết trong phân tử axitphytic Quá trình cắt đứt này xảy ra nhanh hay chậm và hoàn toàn hay không hoàn toàn phụthuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ phản ứng, pH phản ứng, lượng cơ chất và lượng enzyme.Nhìn chung, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác thường tăng lên theo nhiệt độ nhưngchỉ tăng lên trong một giới hạn xác định, mà ở đó phân tử enzyme vẫn còn bền và chưa bịbiến tính Nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của mỗi enzyme thường tương đối rộng.Nhưng nhiệt độ mà ứng với hoạt độ enzyme cao nhất thường chỉ tồn tại một điểm và nhiệt độ

đó gọi là nhiệt độ tối ưu của enzyme Nhiệt độ tối ưu của phytase thu được từ các nguồn khácnhau thì cũng rất khác nhau, dải nhiệt độ này rất rộng, từ 45 – 77 0C Tuy nhiên nhiệt độ tối

ưu của một enzyme thường không cố định mà thay đổi tuỳ theo cơ chất, pH môi trường, thờigian phản ứng … Khi nhiệt độ nằm ngoài khoảng thích nghi, enzyme có thể bị vô hoạt tạmthời hoặc vô hoạt hoàn toàn Nhiệt độ mà ở đó enzyme bị mất hoạt tính xúc tác hoàn toàn gọi

là nhiệt độ tới hạn Nhiệt độ này thường vào khoảng trên 700C Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bịbiến tính, ít có khả năng phục hồi lại hoạt tính Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 00C, hoạt độ củaenzyme tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường

Tính chịu nhiệt của các phytase khác nhau thường khác nhau Phytase của một số vi

khuẩn như là B subtilis, E coli, K.aerogenes, Enterobacter sp.4, K oxytoca MO-3 và S ruminantium hoạt động tối ưu ở nhiệt độ từ 50 – 600C, trong khi phytase của Aerobacter aerogenes có nhiệt độ tối ưu chỉ là 250C Bên cạnh đó vẫn có những phytase có tính chịu nhiệt

cao như là phytase của chủng S castellii hoạt động tối ưu ở 770C, nó có thể ổn định hoạt tínhtrong 1 giờ ở 740C và phytase của chủng A adeninivoans có hoạt tính phytase tối ưu ở 750C

Theo tác giả Nakamura, phytase của nấm men P spartinae có tính chịu nhiệt cao từ 75

– 800C, ngược lại phytase của chủng P rhodanensis chỉ chịu nhiệt từ 70 – 750C Phytase của

P anomala có nhiệt độ tối ưu là 600C Enzyme này có tính chịu nhiệt và bền với axit Trong

số các nấm chịu nhiệt, phytase của nấm mốc Thermomycess lanuginosus có hoạt tính tối ưu ở

650C Ngoài ra người ta còn phân lập được phytase từ chủng nấm mốc Rhizopus oligosporus,

enzyme này có khả năng chịu được nhiệt độ 650C và duy trì được 20% hoạt tính sau khi để ở

800C trong 5 phút

Năm 1998, Wyss & đtg đã nghiên cứu về tính bền nhiệt của phytase bằng phương phápquang phổ huỳnh quang và thiết bị xác định hoạt tính của enzyme, họ đã kết luận rằng

phytase từ nấm mốc A niger không có tính bền nhiệt và cũng không có khả năng phục hồi

hoạt tính trở lại Khi nhiệt độ mới chỉ ở 50 – 550C, enzyme đã bị biến tính và chúng khôngphục hồi lại được cấu hình, do đó enzyme bị mất tới 70 – 80% hoạt tính Phytase từ nấm mốc

A fumigatus tuy cũng không có khả năng chịu được nhiệt độ cao nhưng chúng lại có khả

năng phục hồi hoàn toàn hoạt tính khi đưa trở lại nhiệt độ tối ưu Chúng có thể phục hồi hoàntoàn hoạt tính sau 20 phút biến tính ở 900C Còn phytase của nấm A niger van Teighem lại

hoạt động tốt ở nhiệt độ 500C, và chúng có thể duy trì 90% hoạt tính sau 24 giờ ở 550C Nhưvậy, khi cấu hình của phytase bị thay đổi dưới tác dụng của nhiệt độ cao hay bất kỳ một tácnhân biến tính mạnh nào thì đều có thể bị vô hoạt hoàn toàn

Độ bền nhiệt của mỗi enzyme thường tăng lên khi cơ chất, coenzyme, Ca2+ … Qua

nghiên cứu, người ta thấy phytase từ B subtilis DS11 có nhiệt độ tối ưu là 700C, cao hơnnhiệt độ tối ưu của các phytase khác Chúng có khả năng chịu nhiệt rất tốt khi môi trường cómặt CaCl2 (ion Ca2+), 100% hoạt tính của enzyme vẫn được bảo toàn sau 10 phút để ở 700C.Khi không có mặt ion Ca2+ hoạt tính enzyme bị giảm đi ở nhiệt độ 500C, ngược lại ở nhiệt độ

900C khi có mặt ion Ca2+ trong 10 phút, hoạt tính phytase vẫn còn khoảng 50% so với hoạttính ban đầu Điều này chứng tỏ ion Ca2+ có tác dụng bảo vệ enzyme, chống lại sự biến tính

do tác nhân nhiệt độ và làm tăng tính bền của enzyme

Ngoài ra, muối cũng đã được sử dụng để làm tăng tính chịu nhiệt của enzyme Rượu làm

từ lúa miến khi bổ sung vào tinh bột cũng làm tăng khả năng chịu nhiệt của phytase Ứngdụng kỹ thuật protein để làm tăng tính chịu nhiệt của phytase như là thay thế axit amin prolin

và tạo cầu disulfit Phytate cũng được báo cáo là tác nhân nâng cao hoạt tính của phytase từ

nấm A adeninivorans Sự cố định phytase của E coli và sự đường hoá của phytase của nấm

A niger biểu hiện trong nấm men S cerevisiae đã giúp nâng cao tính chịu nhiệt của sản phẩm

enzyme

2.2.2.4.2 pH tối ưu cho sự hoạt động của phytase

pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme vì nó ảnh hưởng đến mức độion hoá cơ chất, enzyme và độ bền của protein enzyme Đa số các enzyme bền trong giới hạn

pH từ 5 – 9 Độ bền cả enzyme đối với pH môi trường cũng có thể tăng lên khi có cơ chất,coenzyme và Ca2+ … pH tối ưu cho hoạt động của phytase thu được từ các nguồn khác nhaurất khác nhau pH thích hợp cho hoạt động của chúng thường vào khoảng 2,2 đến 8 Hầu hết

các phytase từ vi sinh vật, đặc biệt của nấm mốc thường có pH tối ưu nằm trong khoảng từ

4,5 đến 5,6 Tuy nhiên trái ngược với phytase từ nấm mốc, phytase của nấm A fumigatus lại

có khoảng pH tối ưu rộng đạt 80% hoạt tính khi ở pH giữa 4 và 7,3 Phytase của một vài vi

khuẩn, đặc biệt của Bacillus có pH tối ưu ở 6,5 đến 7,5, pH tối ưu của phytase từ hạt thực vật

ở phạm vi từ 4,0 đến 7,5 và hầu hết trong số chúng có pH tối ưu giữa 4,0 và 5,6

Bảng 2.2: Các đặc tính sinh lý, sinh hoá của phytase từ các phytase từ các nguồn khác nhau

Vi sinh v t ậ Nhi t t i ệ độ ố

u ư

Thường thì giá trị pH tối ưu của một enzyme cũng không cố định mà phụ thuộc nhiềuvào nhiều yếu tố khác nhau như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ… Qua các nghiêncứu cho thấy, trong cùng một điều kiện nhất định thì pH tối ưu của phytase ở các chủng được

tìm thấy hầu như chỉ ở một giá trị nhất định, riêng có 2 loại phytase từ A niger NRRL 3135

và Citrobacter freundii khác với các phytase khác ở điểm là chúng có hai giá trị pH tối ưu khác nhau Phytase từ một số vi khuẩn thuộc chi Bacillus có pH tối ưu vào khoảng pH trung

tính (6,5 – 7,5) Còn phytase thu được từ thực vật như hạt đậu và phấn hoa (Hoa Huệ tây) lại

có pH tối ưu cao hơn thường khoảng 8,0

2.2.2.4.3 Các yếu tố khác ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase [24,25]

Các ion kim loại được coi là các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase Tuy nhiênrất khó để xác định được liệu khả năng ức chế của các kim loại này do bám trực tiếp vàoenzyme hay là các ion kim loại tạo phức ít hoà tan với axit phytic và điều này đã làm giảm

nồng độ cơ chất hoạt động Phytase từ Enterobacter sp.4 bị ức chế bởi các ion kim loại Zn2+,

Cd2+, Ba2+

, Cu2+ và Al3+ Tương tự như vậy phytase của B subtilis (natto) N-77 cũng bị ức chế

mạnh bởi các ion kim loại như là Zn2+, Cd2+, Ba2+, Cu2+, Fe2+ và Al3+ Cả hai enzyme này cũng

như 2 phytase từ Bacillus đều bị ức chế bởi EDTA và ion Canxi rất cần cho hoạt tính của

tính phytase đã chỉ ra rằng phytase của nấm mốc không bị ảnh hưởng bởi các chất này Kết

luận này đã được chứng minh là do trong cấu trúc tinh thể của phytase từ nấm A niger thiếu

ion kim loại Điều này khác biệt rõ ràng với sự phụ thuộc vào ion Ca2+ và dễ bị ức chế bởi

EDTA của phytase từ Bacillus.

Trong trung tâm hoạt động của phytase C từ Bacillus có 6 ion Canxi, 3 ion Canxi cần

cho sự ổn định của enzyme và 3 ion Canxi tác động đến hoạt tính xúc tác của enzyme.Enzyme này bị kìm hãm bởi EDTA hoặc các nhân tố kìm hãm khác nhưng có khả năng phụchồi bởi 42% hoạt tính khi có mặt của ion Canxi Đặc biệt khả năng chịu nhiệt của phytase phụthuộc rất lớn vào sự có mặt của ion Canxi Phytase C vẫn còn trên 90% hoạt tính khi ủ ở 600C

trong 10 phút khi bổ sung thêm 5mM CaCl2 Hoạt tính của enzyme không thể phục hồi khi

trong môi trường phản ứng không có mặt của ion Canxi Tóm lại, phytase của Bacillus và

phytase của một số loại thực vật khác đều cần ion Ca2+ cho hoạt tính tối ưu của mình

Các chất khử như là 2-mercaptoethanol, dithiotreitol và glutathione không ảnh hưởnglớn đến phytase của vi sinh vật Người ta cho rằng, các enzyme này hoặc là không có cácnhóm sulhydryl tự do, hoặc các nhóm sulhydryl tự do không đóng vai trò đáng kể trong hoạttính và cấu trúc của enzyme Giả thiết này đã được Kostrewa làm sáng tỏ bằng sự thật là hầunhư các phytase hoàn thiện có một số lượng gốc cystein, các gốc này liên kết với nhau bằng

các cầu nối disulfua như trong trường hợp của phytase từ nấm A niger Chức năng của liên kết disulfua trong phytase của nấm A ficuum được làm sáng tỏ bằng các nghiên cứu duỗi

xoẵn được thực hiện bởi Ullah và Mullaney Các tác giả này kết luận rằng cầu disulfua rất cầnthiết cho cấu trúc và hoạt tính của enzyme và đóng một vai trò quan trọng trong việc gấp khúc

protein Phytase hoàn thiện từ Bacillus dường như không có gốc cystein.

Một cấu trúc đồng đẳng của cơ chất là myo-inositol hexasulfate đã được xem như là một chất ức chế cạnh tranh có hiệu quả của cả hai enzyme PhyA và Phy B từ nấm A.ficuum Trị số

ức chế Ki đối với các enzyme PhyA và PhyB được ước lượng khoảng 4,6 và 0,2 M, lần lượttheo thứ tự Floride cũng được biết như là một chất ức chế của các phytase và phosphatasekhác Phytase từ nấm đậu tương bị ức chế mạnh mẽ bởi floride, vanadate và phosphate vô cơ.Còn đối với phytase của vi khuẩn và nấm mốc, phosphat vô cơ lại là nguyên nhân ức chế cạnhtranh của phytate Florua cũng ức chế phytase kiềm từ phấn hoa loa kèn và ức chế cạnh tranh

phytase từ K terrigena Phytase của K terrigena cũng bị ức chế bởi phosphate, molybdate và

vanadate Molybdate và vanadate cũng được biết là chất ức chế phosphatase

Nồng độ cơ chất khoảng 300µM đã ức chế một enzyme giống phytase tách chiết từ

Paramecium Phytase của Klebsiella sp.và Rhizopus oligosporus cũng bị ức chế bởi cơ chất

nhưng ở nồng độ cao hơn Hoạt tính phytase của nấm mốc cũng bị ức chế bởi nồng độ cơ chấtvượt quá 1mM Theo một số tác giả khác phytase từ rễ ngô và hạt đậu tương bị ức chế ở cácnồng độ cơ chất 300µM và 200mM lần lượt theo thứ tự

2.2.2.5 Tính đặc hiệu cơ chất và các thông số động học

Phytase có phổ đặc hiệu cơ chất rộng ADP, ATP, p-nitrophenyl phosphate, phenylphosphate, fructoza 1,6-bisphosphate, glucoza 6-phosphate, α -, β- glycerophosphate và 3-

khả năng bị thuỷ phân bởi phytase Chỉ một vài phytase mới có tính đặc hiệu cơ chất cao đối

với axit phytic như là phytase của B.subtilis và phytase kiềm được phân lập từ phấn hoa lily.

Hầu hết các phytase đã nghiên cứu đều theo phương trình của Michaelis-Menten, ngoại trừ

phytase của M thermophila và E nidulans không theo phương trình của Michaelis-Menten.

Điều này đã được chứng minh dưới điều kiện phân tích chuẩn (ví dụ 2mM axit phytic) chỉ tỉ

lệ của phản ứng chuyển hoá myo-inositol hexakisphosphate thành pentakisphosphate mới đo được Ullah và Phillippy đã xác định được thông số động học của phytase từ nấm A ficuum

và 2 axit photphataza đối với myo-inositol hexa-, penta-, tetra và triphosphates Phytase có giátrị Km thấp nhất trong 3 enzyme Họ kết luận rằng cả 2 phytase và phosphatase axit ở pH tối

ưu 2,5 đã thuỷ phân có hiệu quả myo-inositol phosphat thử nghiệm Sự thuỷ phân yếu cácdạng myoinositol phosphat thử nghiệm bằng axit phosphatase ở pH 6,5 cũng đã được chứngminh bởi giá trị Vmax và Vcat thấp Hiệu quả động học của enzyme được xác định bằng giátrị Kcat/Km của một cơ chất Giá trị Kcat/Km cao nhất của phytase và phosphatase axit ở pHtối ưu 2,5 đo được khi cơ chất là axit phytic

Phytase của E coli có giá trị Kcat/Km là 4,78 × 107M-1S-1 Giá trị này là giá trị cao nhất

đã được đưa ra của phytase Tính đặc hiệu của phytase từ nấm mốc đối với cơ chất là axit

phytic thay đổi gần 10 lần từ 23U/mg đến 198 U/mg đối với nấm A fumigatus và A terrus lần

lượt Theo Wyss &đtg, khuôn mẫu và phạm vi khác của sự glycosil hoá không có ảnh hưởngđáng kể đến tính đặc hiệu của phytase nấm mốc Tính đặc hiệu của phytase từ vi khuẩn thay

đổi gần 100 lần từ 8,7 U/mg đến 811 U/mg đối với (B subtilis và E.coli, lần lượt) Dựa vào

tính đặc hiệu cơ chất, phytase có thể phân chia thành hai lớp: lớp phytase có phổ đặc hiệu cơ

chất rộng như phytase của A fumigatus, E nidulans và M thermophila và lớp phytase với

tính đặc hiệu cơ chất cao hơn đối với axit phytic Phytase với tính đặc hiệu cơ chất rộng,nhưng đối với axit phytic lại thể hiện tính đặc hiệu cơ chất thấp (23 đến 43 U/mg) Ngược lại,phytase với tính đặc hiệu cơ chất hẹp nhưng lại thể hiện tính đặc hiệu cơ chất cao đối với axit

phytic (103 – 811 U/mg) Phytase của Bacillus không nằm trong phân lớp này Loại phytase

từ vi khuẩn này dường như có tính đặc hiệu thấp đối với axit phytic Tính đặc hiệu thấp này

đã gây trở ngại cho ứng dụng chúng trong công nghiệp

2.2.2.6 Trung tâm hoạt động và cơ chế tác dụng

Phosphatase axit thuộc enzyme dạng khác mà có khả năng thuỷ phân ester photphate vàhoạt động tối ưu ở pH thấp Một số photphatase axit từ tế bào eukaryot và prokaryot đều cóchung 2 vùng trình tự tương đồng, mỗi trình tự quay xung quanh một gốc histidin bảo thủ

Khuôn mẫu thống nhất của 2 vùng được chỉ ra trong cơ sở dữ liệu protein SWISS-PROT là[LIVM]-X(2)-[LIVMA]-X(2)-[LIVM]-X-R-H-[GN]-X-R-X-[PAS] và [LIVMF]-X-[LIVMFFAG]-X(2)-[STAGI]-H-D-[STANQ]-X-[LIVM]-X(2)-[LIVMFY]-X(2)-[STA].Khi

so sánh trình tự các sản phẩm của gen pho3 và pho5 trong nấm men, tuyến tiền liệt của người

và phosphatase axit trong lysosom với PhyA và PhyB của nấm mốc A niger NRRL 3135 cho

thấy vùng 7 axit amin có trình tự RHGXRXP là bảo thủ gần với tận cùng đầu N Phosphataseaxít chứa trung tâm hoạt động trên được phân vào nhóm histidine axit phosphatase Trung tâmhoạt động này được bảo thủ hoàn toàn ở tất cả phytase của nấm mốc và nó cũng có mặt trong

phytase của E coli So sánh trình phytase của nấm mốc và phytase từ vi khuẩn E coli đã

khám phá ra một trình tự HD bảo thủ gần đầu C Dựa trên dữ liệu protein đã khám phá ra 2trình tự RHG và HD cũng có mặt trong một số phosphatase axit Tóm lại, hai phân lớpphosphatase axit có khả năng nhận dạng bằng trọng lượng phân tử: dạng trong phân tử thấpthiếu cả hai trình tự trên và dạng có trọng lượng phân tử cao được phân chia thành 2 dướiphân lớp; một phân lớp chứa trình RHG hoặc HD và phân lớp kia chứa cả hai trình tự trên.Ullah & đtg đã sử dụng tác nhân biến đổi gốc axit amin đặc hiệu để tìm ra trung tâm hoạtđộng của nấm mốc Các kết quả đưa ra đã chứng minh rõ ràng vai trò quan trọng của gốchistidine và arginin đối với sự hoạt động của phytase Ullah và Dischinger đã chỉ ra rằng một

số gốc triptophan cũng có thể liên quan đến sự thuỷ phân axit phytic

2.2.2.7 Động học và sản phẩm cuối cùng của quá trình thuỷ phân axit phytic

Axit phytic chứa 6 nhóm phosphate có thể bị giải phóng bởi phytase ở các tỷ lệ và các vịtrí khác nhau Wyss & đtg đã khảo sát động học của quá trình giải phóng phosphate và độnghọc của quá trình tích luỹ của phản ứng trung gian cũng như sản phẩm cuối cùng của quátrình thuỷ phân axit phytic bằng các phytase khác nhau Họ đã kết luận rằng tất cả các phytasecủa nguồn gốc từ nấm mốc đều giải phóng năm trong sáu phosphate và sản phẩm cuối cùng là

myo-inositol 2 monophosphate trong trường hợp lượng phytase thừa Điều này chỉ ra rằng tất

cả các enzyme nói trên đều có tính đặc hiệu và ưu tiên cao cho nhóm phosphate tương đương.Ngược lại chúng có khả năng cắt nhóm phosphate nằm trên trục đối xứng Phytase của nấm

A fumigatus có dễ dàng thuỷ phân axit phytic thành inositol 2-monophosphate và

myo-inositol bisphosphate (chất đồng phân chưa được biết rõ) được tích luỹ trong một vài trường

hợp Ngược lại phytase cả nấm A niger và A terrus phải cần một lượng lớn hơn để có thể thuỷ phân axit phytic thành myo-inositol 2 monophosphate và tạo ra một lượng đáng kể myo-

dụng ở mức độ cao, sản phẩm được tạo thành trong quá trình thuỷ phân axit phytic là inositol tetrakisphosphate Myo-inositol bis- và triphosphate chiếm hơn 90% sản phẩm cuối cùng sau 90 phút phản ứng ở điều kiện thừa phytase và hầu như không có lượng myo-inositol

myo-monophosphate nào được tạo thành

Trên thực tế, sản phẩm cuối cùng của quá trình thuỷ phân axit phytic bởi các phytasekhác nhau không nhất thiết phải giống nhau mặc dù con đường thuỷ phân axit phytic là giốngnhau Nhóm 3 – phytase bắt đầu thuỷ phân liên kết phosphate ở vị trí D-3 giải phóng ra D-Ins-(1,2,4,5,6)P5 như là sản phẩm trung gian đầu tiên Nhóm 6-phytase bắt đầu thuỷ phân ở vịtrí l-6 hoặc D-4 và sản phẩm trung gian đầu tiên tạo ra là L-Ins(1,2,3,4,5)P5 Powar &đtg đã

cho biết myo-inositol monophosphate (vị trí của phosphat chưa được xác định) là sản phẩm cuối cùng của phản ứng thuỷ phân axit phytic bằng phytase của B subtilis Động lực học, phản ứng trung gian và con đường khử axit phytic bởi phytase từ B subtilis chưa được biết và

cũng chưa xác định được chúng thuộc nhóm 3-phytase hay 6-phytase Theo Barrientos, mộtloại phytase kiềm được tách từ phấn hoa lily đã thuỷ phân axit phytic ở vị trí D5 bằng 2 bướcloại bỏ phosphat để tạo thành sản phẩm cuối cùng là Ins(1,2,3) P3 Inositol triphosphat cũng là

sản phẩm của quá trình thuỷ phân axit phytic bằng phytase của phấn hoa Typha latifolia.

Kerovue đã chứng minh rằng PhyC giải phóng 3 trong 6 nhóm phosphat của axit phytic.Axit phytic (InsP6) bị thuỷ phân theo kiểu bậc thang bởi Phytase C để nhanh chóng bị thuỷ

phân thành myo-inositol pentaphosphate (InsP5) và sau đó thành myo-inositol tetraphosphate

(InsP4) cuối cùng thành myo-inositol triphosphate (InsP3) Quá trình chuyển dần dần từ InsP5

thành InsP4 rồi sau đó thành InsP3 chỉ ra rằng các myo-inositol phosphate thấp hơn này là cơ

chất kém đặc hiệu đối với enzyme so với axit phytic Sau 30 phút phản ứng, hơn 50% sảnphẩm của phản ứng là dạng InsP4, ngược lại chỉ có 10% ở dạng InsP3 Nhưng sau 60 phút tất

cả các cơ chất được tiêu thụ hết và phản ứng trung gian được chuyển hết thành InsP3 Sau đótiếp tục kéo dài thời gian phản ứng với lượng enzyme dư thừa không thấy xuất hiện inositolphosphate thấp hơn Vì vậy, có thể kết luận rằng InsP3 là sản phẩm cuối cùng của quá trìnhthuỷ phân axit phytic bằng Phytase C Điều này cũng giống với trường hợp của Wyss khinghiên cứu thuỷ phân axit phytic bằng phytase A

2.2.2.8 Ứng dụng của enzym phytase [9]

2.2.2.8.1 Trong cụng nghiệp thức ăn gia sỳc

Thức ăn gia sỳc thường cú nguồn gốc thực vật Khoảng 2/3 hàm lượng phospho trongthức ăn gia sỳc cú nguồn gốc thực vật là axit phytic hiện diện dưới dạng phytate Do đú,phospho trong phytate hầu như khụng cú giỏ trị dinh dưỡng trong thức ăn gia sỳc Hơn nữa,phytate bắt giữ cỏc ion cú giỏ trị dinh dưỡng cao vỡ thế hạn chế giỏ trị dinh dưỡng của cỏc ionnày Động vật nhai lại tiờu hoỏ phytate thụng qua hoạt động của enzym phytase tiết ra từ hệ visinh vật trong dạ cỏ Phosphate vụ cơ được giải phúng từ phytate bởi phytase được cả hệ visinh vật dạ cỏ và động vật chủ sử dụng Tuy nhiờn, cỏc hoạt động cú dạ dày một ngăn nhưlợn, gia cầm và cỏ lại khụng thể biến dưỡng axit phytic và chỳng thiếu phytase ở hệ ruột và dạdày Do đú, người ta thờm phosphate vụ cơ, bột đậu nành và cỏc loại bột cú hàm lượngphospho tổng cao vào thức ăn gia sỳc để đỏp ứng yờu cầu phosphate của cơ thể động vật Việcnày làm tăng chi phớ cho cỏc nhà chăn nuụi gia sỳc và tăng ụ nhiễm phospho cho mụi trường.Cỏc vấn đề này cú thể được giải quyết bằng cỏch bổ sung phytase vi sinh vật vào thức ăn gia

OH OH

OH HO

HO

HO HO

HO HO

Con đừờng thứ nhất

Con đừờng thứ hai

1 phosphat đựợc loại bỏ, sản phẩm trung gian là IP5

2 phosphat đựợc loại bỏ, sản phẩm trung gian là IP4

3 phosphat đựợc loại bỏ, sản phẩm cuối cùng là IP3

Hỡnh 2.4: Cỏc con đường thuỷ phõn axit phytic bởi phytase

2.2.2.8.2 Trong công nghiệp thực phẩm

Ngũ cốc, hạt có dầu và các loại đậu là các loại nguyên liệu phổ biến trong chế biến thựcphẩm Điều này dẫn đến một lượng phytate lớn được tiêu thụ vào trong cơ thể con người.Phytate trong hệ ruột không được tiêu hoá sẽ tác động xấu đến sự hấp thụ Kẽm, Canxi,Magiê, Sắt Hơn nữa, nó còn ức chế hoạt động của các enzym tiêu hoá Do đó, việc bổ sungphytase vào nguyên liệu trước khi chế biến có ý nghiã lớn Phytase đã được bổ sung vào quátrình chế biến bột mì để làm giảm lượng axit phytic trong các loại bánh dùng bột mì (trongbánh mì , axit phytic chiếm 0,29 – 1,05%) phytase thích hợp cho quá trình này cần có pH tối

ưu ở 4,5 – 5, nhiệt độ tối ưu 300C và không phụ thuộc vào ion Ca2+

2.2.2.8.3 Trong tổng hợp myo – inositol phosphate

Các dẫn xuất myo – inositol phosphate dùng trong sản xuất inositol phosphate và

phospholipid cần cho quá trình vận chuyển các tín hiệu qua màng tế bào và vận chuyển Canxi

từ các nguồn dự trữ nội bào Phytase chuyển đổi axit phytic thành các dẫn xuất myo – inositol phosphate nhỏ hơn myo – inositol tự do và phosphate vô cơ, do đó có thể dùng phytase trong

công nghiệp sản xuất inositol hoặc inositol phosphate

2.2.2.8.4 Trong nghành nuôi trồng thuỷ sản [9]

Trong nuôi trồng thuỷ sản, protein thức ăn đóng vai trò quyết định cho sự tăng trưởng vàphát triển vật nuôi Thông thường, nguồn protein thức ăn dựa vào vào nguồn cá tạp hay bột cásẵn có Tuy nhiên, ngày nay khuynh hướng giảm tỉ lệ sử dụng bột cá trong thức ăn thuỷ sản

và chăn nuôi ngày càng mạnh mẽ Ngoài tác động do giá cả còn do tiến độ khoa học trongdinh dưỡng cho phép thay thế bột cá bằng các protein thực vật sẵn có, rẻ tiền nhưng khônglàm thay đổi sức tăng trưởng của vật nuôi Tuy nhiên bên cạnh sự phát trưởng protein thực vậttrong thức ăn thuỷ sản, vấn đề trở ngại lớn nhất là khả năng tiêu hoá và hấp thụ các chất dinhdưỡng trong thức ăn chứa nhiều protein thực vật

Các protein thực vật như bã đậu nành, bã đậu phộng có chứa một số chất kháng dinhdưỡng ức chế enzyme trypsin…ngăn cản hoạt động tiêu hoá của động vật Đặc biệt làPhosphorus ở dạng phytic acid có nhiều trong thực vật liên kết chặt chẽ với Zn2+ tạo phức hợpphytinate-Zn gây bệnh lý thiếu kẽm trên vật nuôi Ngoài kẽm, phytic acid còn liên kết với cácion hoá trị II như Fe2+ hay liên kết với các amino acid và các chuỗi carbon trongcarbohydrates tạo ra một phức hệ phytate khó tiêu hoá và hấp thụ cho động vật