Xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế 03 hợp chất tự nhiên đặc trưng từ dược liệu là Conessin, Kaempferol và Nuciferin đạt độ tinh khiết trên 95% để sử dụng làm nguyên liệu t
Tổng quan về các đối tượng nghiên cứu 7
Về hợp chất Conessin và cây Mức hoa trắng 7
Conessin được phân bố trong một số loài thuộc chi Holarrhena, họ Trúc đào
Trong nghiên cứu này, vỏ thân cây Mức hoa trắng (còn gọi là cây Mộc hoa trắng, Sừng trâu hoặc Thừng mực lá to) được lựa chọn để chiết xuất Conessin nhờ vào các đặc điểm sinh học và tiềm năng dược liệu của cây Mức hoa trắng được biết đến là một nguồn tự nhiên phong phú chứa các hợp chất có lợi cho sức khỏe, phù hợp cho các nghiên cứu về thành phần hoạt tính sinh học Việc sử dụng vỏ thân cây Mức hoa trắng trong quá trình chiết xuất Conessin giúp nâng cao hiệu quả của hoạt chất và mở rộng ứng dụng trong lĩnh vực y học cổ truyền và dược phẩm tự nhiên.
Mức hoa trắng là loài cây phân bố rộng rãi tại Việt Nam, với vỏ thân chứa nhiều alcaloid quan trọng, trong đó Conessin là thành phần chính Các nghiên cứu trong nước và quốc tế đã xác định thành phần hóa học của vỏ thân cây, phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất, cũng như kỹ thuật sắc ký để định lượng hợp chất Conessin trong dịch chiết dược liệu.
Các nghiên cứu sơ bộ đã chỉ ra tiềm năng của cây Mức hoa trắng trong lĩnh vực dược phẩm Một số nhà sản xuất trong nước đã sản xuất các chế phẩm dạng viên nén và viên nang chứa cao vỏ thân cây Mức hoa trắng để điều trị bệnh lỵ, đã được phân phối rộng rãi trên thị trường Tuy nhiên, do chưa có đủ chứng nhận hợp chuẩn (CCĐC), tiêu chuẩn thành phẩm của các thuốc này vẫn chưa xác định được phương pháp định lượng đặc hiệu cho hoạt chất trong chế phẩm, khiến việc đảm bảo chất lượng gặp nhiều hạn chế.
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Conessin [48]
▪ Danh pháp (IUPAC): (3β)-N,N- dimethylcon-5-enin-3-amine.
▪ Tính chất lí – hóa: Conessin là tinh thể hình lăng trụ (kết tinh trong aceton) điểm chảy 125 o C,
Conessin salts, including hydrochloride, hydrobromide, and oxalate forms, exist as crystalline solids The compound exhibits specific optical rotation values of 1.9° in chloroform (CHCl₃) and +21.6° in ethanol (C₂H₅OH) Its water solubility is moderate, with a solubility ratio of 1/5, while it is more soluble in 90° ethanol at a ratio of 1/11, and only slightly soluble in ether.
Tác dụng dược lí: Conessin có tác dụng diệt lị amip, thí nghiệm ngoài cơ thể nồng độ có hiệu quả đối với Entamoeba histolytica của Conessin là 1 : 71 000 –
45 000, còn của emetin là 1 : 300 000 – 1 : 2 000 000 Kết quả cho thấy tác dụng diệt amíp của Conessin kém hơn emetin Conessin còn có tác dụng diệt
Trichomonas vaginalis và Trichomonas intestinalis là hai loại ký sinh trùng quan trọng trong y học Một số tài liệu đã ghi nhận tác dụng của Conessin đối kháng thụ thể H3 histamin, đặc biệt ở liều cao, tác dụng của Conessin giống như morphin, gây liệt trung tâm hô hấp Khi tiêm, Conessin có khả năng gây tê tại chỗ nhưng đi kèm với nguy cơ hoại tử mô, do đó không được sử dụng để gây tê trong thực tế.
1.2.1.2 Ph ươ ng pháp chi ế t xu ấ t, phân l ậ p, tinh ch ế Conessin t ừ d ượ c li ệ u
Chiết xuất alcaloid toàn phần từ vỏ thân cây Mức hoa trắng
Conessin là một alcaloid, về nguyên tắc có thể được chiết xuất bằng một trong các phương pháp sau: i) Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm
[8], [120], ii) chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước [8]
Phí Tùng Lâm đã chiết xuất toàn phần alcaloid từ vỏ thân cây bằng phương pháp chuẩn xác, bắt đầu bằng việc cân khoảng 50g bột dược liệu ẩm ướt với NH4OH trong 12 giờ để chuẩn bị cho quá trình chiết xuất Sau đó, dược liệu được chiết bằng dung môi cloroform trong thiết bị Soxhlet cho đến khi loại hết alcaloid, đảm bảo tinh khiết Quá trình cất thu và cô đặc giúp thu hồi alcaloid dạng base một cách hiệu quả, góp phần nghiên cứu và ứng dụng trong y học và dược phẩm.
▪ Chakraborty A và cộng sự [61] chiết alcaloid toàn phần trong vỏ thân cây
Holarrhena pubescens bằng MeOH, qui trình không được nêu cụ thể
502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared
502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared
Phân lập Conessin từ alcaloid toàn phần
502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared
502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared
85 – 98 được xác định là Norconessin
Kumar N đã phân lập Conessin từ cắn alcaloid toàn phần bằng phương pháp sắc ký cột, sử dụng alumina làm pha tĩnh và benzen dầu hỏa (60-80°C) pha động, theo tỷ lệ tăng dần của EtOAc Quá trình kiểm tra các phân đoạn bằng TLC chỉ ra rằng phân đoạn từ ống 19 đến 23, sử dụng dung môi benzen dầu hỏa và EtOAc theo tỷ lệ 95:5, chứa vết sắc ký đặc trưng của Conessin.
1.2.1.3 M ộ t s ố ph ươ ng pháp đị nh tính, đị nh l ượ ng Conessin ƥ Định tính và định lượng Conessin trong dịch chiết dược liệu bằng GC [88]: Máy sắc kí Shimadzu GC-8A, detector FID, cột nhồi silica gel WHP 100-120 mesh, pha động là khí N2 30 mL/phút, phân tách ở 250 o C, thời gian lưu Rt = 11,5 phút, khoảng tuyến tính 0,08 – 0,2% kl/tt (trong MeOH) ƥĐịnh tính và định lượng Conessin trong dịch chiết dược liệu bằng HPTLC
[88]: Máy sắc kí Chromoscan 200, pha động ethyl acetat : hexan : diethylamin (75: 25: 5), phát hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff, sau đó phun dung dịch NaNO2
Để đạt độ nhạy tốt nhất, sử dụng 10% kl/tt với Rf = 0,66, khoảng tuyến tính từ 0,01 đến 0,1% kl/tt, pha trong dung dịch chuẩn nội và đo độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm Định tính và định lượng Conessin trong dịch chiết dược liệu và chế phẩm bằng HPTLC sử dụng máy sắc ký Camag TLC Scanner III, pha động gồm Toluene, ethyl acetat và diethylamine theo tỉ lệ (6,5: 2,5: 1), trong điều kiện nhiệt độ phòng (25 ± 2°C), với phát hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff có Rf = 0,82 và khoảng tuyến tính từ 1 đến 10 μg/vết, đo độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm Ngoài ra, định tính và định lượng Conessin trong dịch chiết dược liệu bằng HPTLC còn sử dụng máy sắc ký Camag Linomat IV với pha động gồm benzen, ethyl acetate và diethylamin.
Trong nghiên cứu phân tích thành phần, phương pháp sắc ký cao hiệu quả được sử dụng để định lượng Conessin trong chế phẩm Quá trình phân tích bao gồm việc khai triển ở tỷ lệ 6:3:1, với khoảng cách khai triển 90 mm và thời gian khai triển 20 phút tại nhiệt độ phòng (25 ± 2°C) Các vết phân tích được phát hiện bằng thuốc thử Dragendorff và xác định qua sóng UV ở bước sóng 254 nm, giúp xác định chính xác hàm lượng hoạt chất Để đo lường chính xác hơn, phương pháp HPLC sử dụng máy Waters (Milford, MA, USA) với cột C18 kích thước 250 x 4,6 mm, pha động methanol và nước theo tỷ lệ 95:5, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, detector chỉ số khúc xạ Ngoài ra, phương pháp HPLC-MS cũng được ứng dụng với pha động acetonitril và nước chứa acid acetic 0,1%, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, sử dụng detector ZQ và máy khối phổ LCQ để định lượng chính xác hàm lượng Conessin trong chế phẩm.
1.2.1.4 Cây M ứ c hoa tr ắ ng và m ộ t s ố ch ế ph ẩ m t ừ v ỏ thân cây
▪ Tên khoa học: Holarrhena antidysenterica Wall., họ Trúc đào (Apocynaceae)
▪ Tên khác: Mức lông, Sừng trâu, Thừng mực lá to, Mực hoa trắng
▪ Phân bố: Trên thế giới, Mức hoa trắng được phân bố ở n Độ, Myanma, Thái
Lan, Malaysia Việt Nam, cây phân bố chủ yếu ở Bắc Giang, Yên Bái, Cao
Bằng, Lạng Sơn… nhiều nhất ở Đắc Lắc và Nghệ An [5], [32], [40], [48]
Hình 1.3 nh cây Mức hoa trắng [3]
Cây nhỡ hay cây to cao từ 10 đến 15 mét, thân có đường kính lên đến 40 cm, nổi bật với cành non hơi dẹt, nhẵn hoặc có lông màu nâu đỏ Các cành già thường tròn nhẵn, màu nâu nhạt, đặc trưng bởi những nốt sần nhỏ màu trắng và sẹo lá còn sót lại Toàn bộ cây đều chứa nhựa mủ, góp phần tạo nên đặc điểm nhận biết rõ ràng của loại cây này.
Về hợp chất Kaempferol và cây Đơn lá đỏ 12
Kaempferol là hợp chất phân bố rộng rãi trong nhiều loài thực vật như Bạch quả, Bạch thược, Bát giác liên, Bòng bong, Bóng nước, Bông, Cây cứt lợn, Chàm lá nhỏ và Chè Các loại cây này chứa hàm lượng kaempferol phong phú, góp phần mang lại lợi ích sức khỏe và ứng dụng trong y học cổ truyền Việc tìm hiểu về phân bố của kaempferol trong các loài thực vật giúp mở rộng kiến thức về dinh dưỡng và tác dụng sinh học của hợp chất này.
Cây cỏ lào, Dầu giun, Đại táo và Đào đều được sử dụng trong y học cổ truyền để hỗ trợ sức khỏe Đậu tây, Đơn lá đỏ, Địa liền và Gai chống là những loại thảo dược tự nhiên mang lại nhiều công dụng trị liệu Hành tây và Hoa ban có tính kháng viêm, giúp giảm sưng tấy trong các tình trạng viêm nhiễm Hòe, Khoai lang và Khoai tây không chỉ là thực phẩm giàu dinh dưỡng mà còn có tác dụng cải thiện hệ tiêu hóa Lão quan thảo, Mạch ba góc, Màn màn trắng và Màn màn vàng là các thảo dược quý giá trong y học cổ truyền để hỗ trợ điều trị các bệnh lý về gan, thận và máu Măng tây, Me rừng, Mỏ quạ, Móng rồng, Mơ, Muồng hôi và Muồng trâu đều đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao hệ miễn dịch và cân bằng hoạt động nội tiết Các loại thảo dược như Nghể răm, Nhãn, Nho, Phan tả diệp và Phù dung được ứng dụng rộng rãi trong việc điều trị các bệnh về huyết áp, tim mạch và tiêu hóa Rau đắng, Rau má, Riềng, Riềng nếp, Sài hồ bắc, Sắn, Sắn thuyền, Sen cạn, Thanh cao hoa vàng cùng với Thảo quyết minh, Thầu dầu, Thiên môn, Thổ phục linh, Thông nước và Thông thiên đều góp phần trong việc hỗ trợ điều trị các bệnh về gan, thận, hô hấp và tiêu hóa, mang lại lợi ích sức khỏe toàn diện.
Thục quỳ, Thuốc lá, Trà tiên, Tràm, Vối rừng, Xoan, Xoan trà là các loại dược liệu quý có giá trị sử dụng cao, thường được sử dụng trực tiếp qua thuốc thang hoặc chế biến thành cao dược liệu để khai thác các hoạt chất có lợi Nhiều trong số these loài cây có tiềm năng ứng dụng lớn trong y học cổ truyền và nghiên cứu dược liệu hiện đại Việc tận dụng các dược liệu này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả điều trị mà còn góp phần bảo tồn nguồn nguyên liệu tự nhiên phong phú của khu vực.
Trong nghiên cứu này, lá cây Đơn lá đỏ được chọn để chiết xuất Kaempferol do cây này phân bố rộng rãi tại Việt Nam và đã được nhiều tác giả trong nước như [1], [22], [23] nghiên cứu về hình thái thực vật, thành phần hóa học cùng với sơ bộ các phương pháp chiết xuất và phân lập Các dạng bào chế hiện đại cũng được đề cập trong các nghiên cứu như [5], [11], [12], [13], [14], [46], góp phần nâng cao hiệu quả và ứng dụng của các hoạt chất sinh học từ tự nhiên Một số công trình nghiên cứu của tác giả nước ngoài cũng đã chỉ ra tiềm năng của cây Đơn lá đỏ trong y học và dược phẩm, mở ra hướng phát triển mới cho các sản phẩm từ tự nhiên.
Các phương pháp chiết xuất và phân lập Kaempferol từ nhiều loại dược liệu khác nhau đã được nghiên cứu kỹ lưỡng [71], [111] Ngoài ra, các phương pháp định tính và định lượng Kaempferol trong dịch chiết dược liệu và chế phẩm cũng đã được xác định rõ ràng [82], [117], [125], [131], đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong phân tích thành phần hoạt chất này.
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Kaempferol [1]
▪ Danh pháp (IUPAC): 3,5,7- trihydroxy -2-(4-hydroxyphenyl)- 4H-1-benzopyran-4-on
Kaempferol là hợp chất có dạng tinh thể hình kim hoặc vi tinh thể, màu vàng rất nhạt Nó tan tốt trong methanol (MeOH), ethanol (EtOH), diethyl ether, và dung dịch kiềm, nhưng hầu như không tan trong nước lạnh cũng như các dung môi như benzen và chloroform Nhiệt độ nóng chảy của Kaempferol ở dạng tinh thể hình kim từ 276 đến 278°C, còn ở dạng vi tinh thể là khoảng 278 đến 280°C Hợp chất này có đặc điểm hấp thụ cực đại ở bước sóng 266 nm và 362 nm trong methanol, hoặc 265 nm và 365 nm trong ethanol, giúp xác định đặc tính quang học của nó.
Kaempferol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp dập tắt các gốc tự do như HO., ROO., từ đó giảm thiệt hại tế bào và ngăn ngừa lão hóa Nó còn thúc đẩy tăng cường tuần hoàn máu trong các mạch máu, đồng thời có tác dụng chống viêm và dị ứng hiệu quả Ngoài ra, Kaempferol còn ức chế sự hình thành và phát triển của các khối u trên da chuột nhắt trắng gây ra bởi benzo-α-pyren và dầu đậu Không những thế, hợp chất này còn hoạt động như một chất ức chế enzyme cyclooxygenase (COX-1 và COX-2) và quá trình peroxyd hóa lipid, góp phần giảm viêm và bảo vệ tế bào khỏi tổn thương.
1.2.2.2 Ph ươ ng pháp chi ế t xu ấ t, phân l ậ p, tinh ch ế Kaempferol t ừ d ượ c li ệ u
Chiết xuất flavonoid toàn phần:
Nguyễn Thái An (2023) đã chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá cây Đơn lá đỏ bằng phương pháp chiết bằng methanol (MeOH) ở nhiệt độ phòng Quá trình này bao gồm nghiền 500 gram bột dược liệu Đơn lá đỏ, sau đó ngâm trong dung môi MeOH để hòa tan các hợp chất hoạt tính Dịch chiết được tách ra và bay hơi dưới áp suất giảm đến khi thu được phần khô chứa flavonoid Phương pháp này giúp tối ưu hóa việc chiết xuất các hợp chất sinh học có lợi từ lá cây Đơn lá đỏ, góp phần nghiên cứu các hoạt tính sinh học của flavonoid trong y học cổ truyền.
Hỗn hợp gồm 120 g, được pha vào 250 ml nước và lắc lần lượt với các dung môi như cloroform, ethyl axetat (EtOAc), và hỗn hợp aceton : nước theo tỷ lệ 6 : 1 Quá trình chưng cất giúp tách riêng các phân đoạn dựa trên sự bay hơi của từng dung môi, gồm cloroform, ethyl axetat và hỗn hợp aceton : nước, đảm bảo phân lập hiệu quả các thành phần mong muốn.
Ding Z [71] đã nghiên cứu quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá cây Ginkgo, bắt đầu bằng việc rửa sạch và phơi khô dược liệu, sau đó nghiền mịn và ngâm với ethanol 50% hoặc 70% ở nhiệt độ 50°C trong 6 giờ, thỉnh thoảng khuấy trộn để tối ưu hóa hiệu suất chiết Tiếp theo, dịch chiết thu được lần 1 và bã dược liệu được lặp lại quy trình chiết tiếp 2 lần nữa để lấy tối đa flavonoid và terpenoid từ lá Ginkgo Toàn bộ dịch chiết gộp lại, sau đó được làm bay hơi dưới áp suất giảm, rồi qua quá trình ly tâm để thu phần dịch chiết đậm đặc chứa các hợp chất hoạt tính sinh học này, đảm bảo hiệu quả cao trong nghiên cứu và ứng dụng y học, thực phẩm chức năng.
Phân lập Kaempferol từ dịch chiết flavonoid toàn phần
Nguyễn Thái An đã phân lập Kaempferol từ dịch chiết toàn phần lá cây Đơn lá đỏ bằng quy trình chiết xuất phức tạp Quá trình bắt đầu bằng việc phân đoạn ethyl acetate từ dịch chiết, sau đó cất loại dung môi để thu được 12 g dung dịch có màu vàng nâu Tiếp theo, 5 g dịch này được đưa qua cột silica gel G60 (cỡ hạt 100 – 160 àm của Merck) để phân lập và rửa giải bằng hệ thống dung môi CHCl3 : MeOH với tỉ lệ giảm dần, giúp tinh chỉnh quá trình chiết xuất Cuối cùng, các phân đoạn đều được làm bay hơi dung môi nhằm thu hồi tinh thể Kaempferol tinh khiết để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
Trong quá trình nghiên cứu, các phân đoạn đã được phân lập và tinh chế lại bằng kỹ thuật sắc ký cột Sephadex LH-20, sử dụng methanol (MeOH) với các tỉ lệ khác nhau để rửa giải Các phân đoạn II’ và III’ cho màu vàng đậm sau khi tinh chế, từ đó thu được hai hợp chất chính là FAD8 và FAD7, trong đó FAD7 được xác định là Kaempferol – một hợp chất có giá trị sinh học cao và tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực y học và dược phẩm Quá trình này giúp làm rõ thành phần hóa học của mẫu, đồng thời nâng cao độ chính xác trong phân tích hóa học ban đầu.
Ding Z [71] đã phân lập flavonoid từ dịch chiết đậm đặc lá cây Ginkgo thông qua phương pháp sắc ký cột ái lực, sử dụng dung môi ethanol có chứa các nồng độ thay đổi theo chương trình gradient Quá trình này cho thấy lượng flavonoid tối đa được thu nhận khi sử dụng dung môi ethanol 20% và 40% để rửa giải, nâng cao hiệu quả cô đặc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ lá Ginkgo.
1.2.2.3 M ộ t s ố ph ươ ng pháp đị nh tính, đị nh l ượ ng Kaempferol
Kaemperol có thể tạo thành hợp chất có màu với cyanidin và AlCl3, do đó có thể được định lượng bằng phương pháp đo màu Ngoài ra, Kaempferol có cực đại hấp thụ trong vùng tử ngoại, nên phương pháp đo phổ tử ngoại được sử dụng để định lượng Hiện nay, các thiết bị hiện đại như HPLC, GC-MS, CE đã được ứng dụng để xây dựng phương pháp xác định và định lượng Kaempferol chính xác hơn Các phương pháp sắc ký như HPLC-UV đã được dùng để đồng thời định lượng Kaempferol, Quercetin, Myricetin trong bột khoai tây và chế phẩm từ khoai tây với cột Hypersil-Ods, pha động ACN và đệm phosphat pH 2,4, tốc độ dòng 1,2 mL/phút, nhiệt độ cột 30°C, phát hiện tại bước sóng 266 nm Ngoài ra, phương pháp RP-HPLC cũng được sử dụng để xác định đồng thời Kaempferol cùng các hợp chất như catechin, rutin, quercetin, và isorhamnetin trong dịch chiết lá cây Hippophae rhamnoides L., sử dụng cột HIQ SIL C18V và pha động gồm methanol.
Hỗn hợp ACN : H2O (40 : 15 : 45, v/v/v) chứa 1% axit acetic, được pha động qua màng lọc Millipore 0,45 µm để loại khô trước khi phân tích Quá trình phân tích diễn ra với tốc độ dòng chảy 1 mL/phút và thể tích mẫu thử là 10 µL, sử dụng detector DAD Catechin được định lượng tại bước sóng 279 nm, Rutin tại 257 nm, còn Quercetin, Kaempferol và Isorhamnetin được đo ở bước sóng 368 nm để đảm bảo độ chính xác trong phân tích các hợp chất phenolic.
Hình 1.5 nh cây Đơn lá đỏ [3]
▪ Tên khoa học: Excoecaria cochinchinensis Lour , họ thầu dầu –
▪ Phân bố: Cây mọc hoang hay được trồng ở nhiều nơi như Long An, Tiền
Giang, Hậu Giang, Đồng Tháp, An Giang, Thái Bình, Nam Định Cây được trồng nhiều ở làng hoa Ngọc Hà,
Hà Nội để làm thuốc Ngoài ra, cây còn được trồng nhiều ở Quảng Tây, Vân Nam (Trung Quốc.) [1]
Về hợp chất Nuciferin và cây Sen 16
Nuciferin có mặt trong một số loài thuộc chi Nelumbo, họ Sen, và được nghiên cứu lựa chọn chiết xuất từ lá cây Sen do đây là loài cây phân bố rộng rãi tại Việt Nam Lá cây Sen chứa nhiều alcaloid, trong đó Nuciferin là thành phần chính, đóng vai trò quan trọng trong thành phần hóa học của dược liệu Các nghiên cứu đã xác định phương pháp chiết xuất, phân lập hợp chất từ lá Sen cũng như các kỹ thuật định tính và định lượng Nuciferin trong dịch chiết dược liệu bằng phương pháp sắc ký Những công trình này góp phần phát triển các sản phẩm từ lá Sen dựa trên hàm lượng Nuciferin, đáp ứng các tiêu chuẩn chuẩn xác trong y học cổ truyền và dược học hiện đại.
[21], [33], [34] và nước ngoài [108] nghiên cứu
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Nuciferin [5]
▪ Công thức phân tử: C19H21NO2
▪ Danh pháp (IUPAC): 5,5a,7,8 tetrahydro-1,2-dimethoxy-6-methyl- Diabenzoquinolin.
Nuciferin là chất kết tinh dạng tinh thể hình khối, màu vàng nhạt, không có mùi và vị Nó tan tốt trong các dung môi như CHCl₃, MeOH, EtOH nóng, nhưng hầu như không hòa tan trong nước Nhiệt độ nóng chảy của Nuciferin nằm trong khoảng 164-165°C Phổ UV của hợp chất này đo trong môi trường MeOH cho λmax tại các bước sóng 210 nm, 228 nm và 270 nm, giúp xác định đặc tính quang học của Nuciferin.
Nuciferin chiết xuất từ lá Sen có tác dụng giải thắt cơ trơn, ức chế thần kinh trung ương, chống viêm yếu, giảm đau, chống ho, kháng serotonin và phong bế thụ thể adrenergic, mang lại nhiều lợi ích trong điều trị các bệnh lý liên quan đến hệ thần kinh và viêm nhiễm Nước sắc của Nuciferin ít độc, phù hợp sử dụng trong các liệu trình điều trị dài hạn, mang lại hiệu quả an toàn và khả năng dung nạp tốt Các nghiên cứu cho thấy hoạt chất này có tiềm năng ứng dụng trong y học cổ truyền và hiện đại để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý khác nhau.
LD50 của Nuciferin là 330 mg/kg thể trọng chuột, cho thấy mức độ độc tính an toàn ở liều cao Nghiên cứu cho thấy Nuciferin giúp tăng cường quá trình ức chế các tế bào thần kinh vùng vỏ não cảm giác – vận động và thể dưới thân não trên thỏ thí nghiệm Ngoài ra, Nuciferin còn có tác dụng an thần rõ rệt, kéo dài thời gian giấc ngủ của pentobarbital trên chuột thí nghiệm.
1.2.3.2 Ph ươ ng pháp chi ế t xu ấ t, phân l ậ p, tinh ch ế Nuciferin t ừ d ượ c li ệ u
Nguyễn Thị Nhung (34) đã chiết xuất alcaloid toàn phần từ lá Sen, tâm Sen, và gương Sen theo quy trình khoa học chính xác Quá trình bắt đầu bằng việc làm ẩm bột dược liệu bằng dung dịch NH4OH 10%, sau đó chiết bằng cồn 70 độ Dịch chiết cồn sau đó được cất dưới áp suất giảm để thu hồi cồn Tiếp theo, dịch chiết được hòa tan trong nước, acid hóa bằng HCl 5% đến pH = 2 để loại bỏ tạp chất Dịch lọc acid sau đó được chiết bằng ether và dầu hỏa để loại trừ tạp Cuối cùng, dịch chiết acid được thêm dung dịch NH4OH nhằm điều chỉnh pH và hoàn thiện quy trình chiết alcaloid từ các loại lá Sen.
10% đến pH = 10 – 11 rồi chiết bằng CHCl3 Dịch chiết CHCl3 được cất thu hồi dung môi, còn lại cắn alcaloid toàn phần
Phân lập Nuciferin từ cắn alcaloid toàn phần ở trên theo qui trình sau:
Phân lập alcaloid bằng sắc kí cột sử dụng silica gel 60 GF254 (Merck) bắt đầu bằng việc hoạt hóa silica gel ở 110°C trong 1 giờ, sau đó trộn silica gel với hệ dung môi đã chọn thành hỗn dịch và rót từ từ vào cột để ổn định trong 5 giờ Alcaloid toàn phần được hòa vào dung môi đặc, trộn với silica gel rồi đưa vào cột sắc ký, rửa giải bằng hệ dung môi tăng dần độ phân cực với tốc độ khoảng 30 giọt/phút, thu khoảng 5 ml mỗi lần vào ống nghiệm riêng Các phân đoạn chứa alcaloid được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, lựa chọn những phân đoạn chỉ có một vết, sau đó bốc hơi dung môi để thu alcaloid tinh khiết sau nhiều lần tinh chế Các phân đoạn có 2 hoặc 3 vết sẽ tiếp tục phân lập bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế.
Phân lập alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng điều chế bắt đầu bằng việc chấm dung dịch chứa 2 hoặc 3 vết lên các bản mỏng kích thước 20 x 20 cm đã tráng chất hấp phụ silica gel G đã hoạt hóa ở 110°C trong 1 giờ Hệ dung môi khai triển gồm CHCl3 : MeOH : NH4OH (50 : 9 : 1), sau khi bản mỏng khô ở nhiệt độ phòng, phun thuốc thử Dragendorff để phát hiện và đánh dấu vết alcaloid Silica gel chứa chất cần tách được cạo ra, phản hấp phụ bằng CHCl3, sau đó lọc và để CHCl3 bốc hơi tự nhiên Tiếp theo, hòa tan lại bằng cồn ethanol, để tủ lạnh để cho kết tinh nhiều lần, thu được 2 alcaloid tinh khiết là KN1 và KN2 Qua phân tích cấu trúc, KN1 được nhận diện là Nuciferin.
Quy trình phân lập Nuciferin vẫn chưa rõ sử dụng hệ dung môi nào phù hợp trong giai đoạn sắc ký cột, gây khó khăn trong việc tối ưu hóa quá trình tách chiết Hiện tại, Nuciferin đã được phân lập từ sắc ký lớp mỏng, tuy nhiên độ tinh khiết của sản phẩm chưa được xác định rõ ràng Ngoài ra, chưa có tài liệu tham khảo đầy đủ về quy trình tinh chế Nuciferin từ dược liệu nhằm đạt được độ tinh khiết trên 95%, gây trở ngại cho nghiên cứu và ứng dụng sản phẩm.
1.2.3.3 Ph ươ ng pháp đị nh tính, đị nh l ượ ng Nuciferin
▪ Nuciferin trong lá cây Sen được định lượng đồng thời với N-nornuciferin,
O-nornuciferin và roemerin bằng HPLC-DAD-ESI-MS [108], chương trình sắc kí như sau: máy sắc kí Waters-2695 Alliance, detector DAD, được ghép với máy khối phổ Micromass ZQ 2000, cột sắc kí Shimadzu VP-ODS (4,6 mm × 150 mm, 5 àm), đo độ hấp thụ ở bước súng 280 nm, pha động gồm A (dung dịch triethylamin 0,1%) và B (CH 3 CN), chương trình rửa giải gradient: 0 – 15 phút, 40 – 80% B; 15 – 20 phút, 80 – 95% B; 20 – 21 phút, 95 – 40% B; 21 – 25 phút, 40% B, tốc độ dòng 1 mL/phút, nhiệt độ cột 30 o C 20% dịch rửa giải được dẫn qua máy khối phổ Khối phổ +ESI-MS, chương trình HPLC-MS như sau: khí cản solvat hóa N2 300 L/giờ, nhiệt độ cản solvat hóa 250 o C, nhiệt độ nguồn 105 o C, điện áp mao quản
1.2.3.4 Cây Sen và m ộ t s ố ch ế ph ẩ m t ừ lá cây
▪ Tên khoa học: Nelumbo nucifera
▪ Phân bố: Vùng nhiệt đới châu Á, Châu Mĩ và ở Việt Nam
Cây sen là loại thực vật thuộc dạng thân rễ hình trụ, mọc bò lan trong bùn và có thể sống nhiều năm Lá hình tròn, mọc nổi trên mặt nước, với cuống dài có gai và đính chính giữa phiến lá, mép lá uốn lượn mềm mại Hoa sen lớn, màu hồng hoặc trắng, tỏa mùi thơm dễ chịu, thu hút nhiều ong và côn trùng thụ phấn Quả sen chứa nhiều lá noãn trong một đế hoa chung hình nón ngược, sau đó phát triển thành quả có vỏ cứng màu nâu đen Cây sen phổ biến trồng ở các ao hồ khắp Việt Nam, và mùa thu hoạch chính từ tháng 7 đến tháng 9, mang lại giá trị Both kinh tế và cảnh quan đặc trưng cho miền quê Việt Nam.
Lotus leaf contains a variety of chemical components, including alkaloids such as nuciferin (the primary alkaloid), nor-nuciferin, roemerin, anonain, liriodenin, pronuciferin, O-norciferin, armepavin, N-nor-armepavin, methyl-corlaurin, nepherin, dehydroemerin, dehydronuciferin, dehydroanonain, and N-methylisocorlaurin In addition to alkaloids, lotus leaves also contain flavonoids, tannins, and organic acids, contributing to their medicinal properties.
20 tâm Sen có nhiều alcaloid (0,85 – 0,96%), trong đó có liensinin, isoliensinin, neferin, lotusin, nuciferin, pronuciferin, methylcorypallin, demetylcorlaurin [32],
[48] Hàm lượng alcaloid trong lá Sen thay đổi theo tuổi và thời vụ thu lá [15]
Lá Sen chứa alcaloid toàn phần có tác dụng an thần và giúp hạ huyết áp nhẹ, phù hợp để sắc uống chữa mất ngủ với liều 15-20g mỗi ngày Ngoài ra, Lá Sen còn được kết hợp với các dược liệu khác để bào chế thành thuốc an thần, giúp giảm triệu chứng mất ngủ, di mộng tinh và an thần hiệu quả Tâm Sen, phần của lá Sen, thường được sử dụng từ 4-10g mỗi ngày dưới dạng thuốc hãm hoặc sắc uống nhằm hỗ trợ điều trị mất ngủ và cải thiện giấc ngủ tự nhiên.
Các sản phẩm chứa cao lá Sen như Sen vông của xí nghiệp Dược phẩm Trung ương 2, được sử dụng rộng rãi tại thị trường Việt Nam và xuất khẩu, giúp hỗ trợ an thần và giảm căng thẳng Chế phẩm Sevona của xí nghiệp Dược phẩm Trung ương 25 cũng chứa cao lá Sen cùng các dược liệu khác, lưu hành tại Việt Nam và xuất khẩu sang Nhật Bản, Cuba, Châu Âu, mở rộng khả năng điều trị các bệnh liên quan đến thần kinh Trà thuốc Seivo của Trường Đại học Dược Hà Nội kết hợp cao tâm Sen, cao Củ bình vôi và Ích mẫu, phù hợp với nhu cầu chăm sóc sức khỏe và giảm stress Ngoài ra, thuốc an thần Seroga của xí nghiệp Dược phẩm Trung ương 25 kết hợp cao tâm Sen, cao Củ bình vôi, Táo nhân và Thiên ma, giúp giảm căng thẳng và cải thiện giấc ngủ một cách hiệu quả.
Từ các tài liệu tổng quan về đối tượng nghiên cứu, nhận thấy:
Trong các tài liệu tham khảo liên quan đến các hợp chất nghiên cứu, chưa xác định rõ quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế để sử dụng làm nguyên liệu chuẩn đề lập CCĐC Các nghiên cứu chủ yếu mô tả phương pháp chiết xuất và phân lập nhằm thu được hợp chất tinh khiết phục vụ phân tích phổ IR, NMR, nhưng chưa đánh giá rõ độ tinh khiết sau phân lập bằng các phương pháp định lượng hoặc kiểm tra bằng TLC Không có tài liệu nào xác định các tạp chất liên quan tồn tại sau quá trình phân lập, mặc dù tạp chất vết có thể không ảnh hưởng đến các nghiên cứu về tác dụng dược lý hoặc phân tích phổ, nhưng lại ảnh hưởng lớn đến chất lượng và độ ổn định của nguyên liệu chuẩn Vì vậy, luận án sẽ tiến hành khảo sát các phương pháp chiết xuất, phân lập phù hợp để đảm bảo chất lượng và độ ổn định của CCĐC.
Trong quá trình lập và tinh chế các hợp chất, yêu cầu độ tinh khiết trên 95% được đặt ra để sử dụng làm nguyên liệu thiết lập Cơ sở Công Nghệ Chế Biến (CCĐC) Đồng thời, nghiên cứu lựa chọn phương pháp sắc ký phù hợp nhằm phân tích tạp chất liên quan trong sản phẩm tinh chế, đảm bảo chất lượng và độ thuần khiết của sản phẩm cuối cùng Để đảm bảo tính khả thi của quy trình, độ ổn định của CCĐC được nghiên cứu trong 15 tháng ở điều kiện nhiệt độ từ 2 đến 25 độ C, góp phần xác định tính ổn định lâu dài của sản phẩm.
8 0 C, độ ẩm 40% để làm rõ ảnh hưởng của tạp chất liên quan đến chất lượng của
Ph ươ ng pháp thi ế t l ậ p ch ấ t chu ẩ n đố i chi ế u t ừ d ượ c li ệ u 22
Phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu 22
1.3.1.1 Đạ i c ươ ng v ề nguyên li ệ u đố i chi ế u
Khái niệm về nguyên liệu đối chiếu (NLĐC)
NLĐC là nguyên liệu có đặc điểm đồng nhất và ổn định về một hoặc nhiều tính chất, được thiết lập để phù hợp với quá trình sử dụng hoặc đo lường đã xác định, đảm bảo độ chính xác trong phân tích [91], [118] Các loại NLĐC được phân loại thành ba nhóm chính dựa trên thành phần hóa học, tính chất vật lý và đặc điểm kỹ thuật [94] Trong lĩnh vực phân tích, NLĐC gồm năm nhóm cơ bản: dung dịch chuẩn, hỗn hợp khí chuẩn, nguyên liệu đối chiếu trong chất nền, nguyên liệu đối chiếu hóa – lý, mẫu đối chiếu hoặc mẫu tự tạo, và các chất tinh khiết, giúp đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong các phương pháp phân tích [77] Theo WHO, chất chuẩn đối chiếu (CCĐC) là các NLĐC thuốc gồm các chất tinh khiết được sử dụng làm tiêu chuẩn trong phân tích hóa học.
Chất chuẩn đối chiếu hóa học (CCĐC) là nguyên liệu đồng nhất và xác thực, được sử dụng trong các phép thử vật lý và hóa học để so sánh các tính chất của sản phẩm kiểm tra với tính chất của chuẩn mẫu, đảm bảo độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng Theo định nghĩa này, CCĐC được phân loại theo các mức độ khác nhau để phù hợp với từng yêu cầu kiểm nghiệm và mục đích nghiên cứu.
Chất chuẩn đối chiếu hóa học sơ cấp (PCRS) là một loại chất được công nhận rộng rãi, có các chỉ tiêu chất lượng phù hợp với tài liệu công bố và hàm lượng được chấp nhận để làm chuẩn định lượng mà không cần so sánh với chất hóa học khác Các PCRS có thể được tìm thấy từ các nguồn như trung tâm hợp tác về CCĐC của WHO, Hội đồng Định mức Châu Âu (HĐDĐ Châu Âu), các phòng thí nghiệm thuộc HĐDĐ của Anh, và Hội đồng Định mức Mỹ (HĐDĐ Mĩ).
Chất chuẩn đối chiếu hóa học quốc tế (ICRS) là một PCRS do ủy ban chuyên gia của WHO thiết lập nhằm đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng cho các chế phẩm dược ICRS được sử dụng chủ yếu trong các phép thử vật lý, hóa học và định lượng trong các chuyên luận dược phẩm công bố trong IP, giúp xác định độ chính xác và độ tin cậy của các phương pháp phân tích Đây là công cụ quan trọng để duy trì tiêu chuẩn quốc tế trong ngành dược phẩm, hỗ trợ các nhà nghiên cứu và nhà sản xuất trong việc kiểm soát chất lượng sản phẩm.
Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp (SCRS) là một chất đối chiếu hóa học được xác định dựa trên tiêu chuẩn so sánh với PCRS, giúp đảm bảo tính chính xác của các chỉ tiêu chất lượng SCRS bao gồm hai loại chính: SCRS “chính thức”, do các cơ quan quốc gia hoặc khu vực thiết lập, và SCRS làm việc, do các nhà sản xuất hoặc phòng thí nghiệm cung cấp để sử dụng tạm thời hoặc trong quy trình nội bộ Trong bối cảnh ASEAN, các SCRS được thiết lập bởi các phòng thí nghiệm của Hội đồng Dược điển hoặc viện kiểm nghiệm quốc gia, nếu quá trình chuẩn hóa sử dụng PCRS để so sánh, thì được xếp vào nhóm SCRS “chính thức” Quá trình thiết lập và phân phối chất đối chiếu hóa học dược điển tuân thủ các hướng dẫn của ISO nhằm đảm bảo độ chính xác và nhất quán trong kiểm nghiệm chất lượng dược phẩm.
Việc phân loại không mang ý nghĩa tuyệt đối, ví dụ, một SCRS được xem là chuẩn quốc gia hoặc chuẩn ASEAN có thể dùng làm PCRS để thiết lập các tiêu chuẩn PTN hoặc chuẩn NSX.
Mục đích sử dụng của chất chuẩn đối chiếu
Theo ISO Guide 32, 33, CCĐC được sử dụng trong bốn mục đích chính: thẩm định phương pháp và độ không chắc chắn của phép đo, xác minh khả năng ứng dụng đúng đắn của phương pháp, hiệu chuẩn, và kiểm tra cùng đảm bảo chất lượng Trong lĩnh vực kiểm tra chất lượng ngành Dược, các phương pháp phân tích trong dược điển hiện hành yêu cầu sử dụng chất chuẩn đối chiếu để định tính và định lượng, như đo phổ IR để xác định thành phần, đo phổ UV để định lượng, phương pháp so màu, các kỹ thuật sắc ký và tách để phân tích thành phần, phương pháp chuẩn độ không hợp thức, kiểm tra vi sinh, các xét nghiệm hóa học - miễn dịch, và hiệu chuẩn thiết bị phân tích.
Trong Dược điển, còn có các phương pháp phân tích không dựa vào các CCĐC, như thử nghiệm độ vô khuẩn và kiểm tra nội độc tố vi khuẩn, giúp đảm bảo chất lượng và an toàn của sản phẩm dược phẩm.
PCRS được sử dụng để đánh giá thử nghiệm thành thạo cho các kiểm nghiệm viên tại các phòng thử nghiệm (PTN) muốn đăng ký tham gia làm PTN thành viên trong các chương trình hợp tác thiết lập chuẩn chất của Trung tâm hợp tác về các chuẩn chất của WHO, Hội đồng Dược điển Mỹ, ASEAN, và Hội đồng Dược điển Châu Âu.
1.3.1.2 Thi ế t l ậ p, b ả o qu ả n và phân ph ố i ch ấ t chu ẩ n đố i chi ế u s ơ c ấ p
PCRS được công nhận rộng rãi, do đó quy trình thiết lập PCRS cần được ban hành bởi các tổ chức có thẩm quyền và tuân thủ chặt chẽ các bước Quá trình này bắt đầu bằng việc đánh giá nhu cầu PCRS để đảm bảo việc triển khai phù hợp và hiệu quả.
Trước khi thiết lập một hệ thống PCRS, cần đánh giá xem việc phát triển một hệ thống kiểm nghiệm trung tâm (CCĐC) có thực sự cần thiết hay không Việc này bắt đầu ngay từ quá trình xây dựng tiêu chuẩn và phương pháp kiểm nghiệm cho các chất mới, nhằm xác định liệu có thể thay thế quy trình hiện tại bằng một quy trình khác đáp ứng yêu cầu chất lượng mà không cần đến CCĐC.
Lựa chọn nguồn nguyên liệu dùng để thiết lập CCĐC từ nhà cung cấp
Nguyên liệu để thiết lập CCĐC thường được lựa chọn từ các lô sản xuất nguyên liệu có chất lượng tốt nhất, do các nhà sản xuất dược phẩm cung cấp Chất đối chiếu dự kiến sử dụng cho phép thử định tính bằng phương pháp IR hoặc TLC không yêu cầu độ tinh khiết quá cao, trong khi các nguyên liệu dùng làm chuẩn để định lượng cần có độ tinh khiết ít nhất 99,5% hoặc cao hơn Để đáp ứng yêu cầu của chất đối chiếu, cần xem xét ảnh hưởng của tạp chất đến phép đo trong quá trình định lượng Nhiều nghiên cứu cho thấy tạp chất có tính chất lí - hóa học tương tự chất chính có thể không ảnh hưởng đến giá trị của CCĐC, nhưng hàm lượng vết tạp chất có đặc điểm khác biệt với hợp chất chính có thể khiến việc sử dụng CCĐC đó không còn phù hợp.
25 Đánh giá mục đích sử dụng của PCRS:
▪ CCĐC dùng cho phép thửđịnh tính: Thông thường chỉ cần kết quả đánh giá từ một PTN đủ tiêu chuẩn
CCĐC dùng để phép thử độ tinh khiết có yêu cầu mô tả đặc tính rộng hơn so với phép thử định tính, đặc biệt trong các phép thử giới hạn Khi sử dụng kỹ thuật TLC, thường đề nghị độ tinh khiết tối thiểu đạt ≥ 90%, trong khi đối với kỹ thuật HPLC hoặc GC, yêu cầu độ tinh khiết cao hơn là ≥ 95% Thông thường, chỉ cần một phòng thí nghiệm tham gia đánh giá CCĐC dùng cho phép thử độ tinh khiết đảm bảo độ chính xác và phù hợp với tiêu chuẩn.
CCĐC được phân lập hoặc điều chế lần đầu tiên cần tiến hành các phép thử hóa lý quan trọng như phổ NMR, phổ MS và phân tích nguyên tố để mô tả đầy đủ đặc tính của hợp chất Các phương pháp này giúp xác định cấu trúc phân tử, thành phần hóa học chính và tính chất vật lý của CCĐC, đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của nghiên cứu Thực hiện các phép thử này đóng vai trò crucial trong quá trình nghiên cứu và phát triển các hợp chất mới, góp phần xác định tiềm năng ứng dụng của CCĐC trong các lĩnh vực khác nhau.
Các CCĐC dùng để định lượng có phạm vi thử nghiệm rộng, sử dụng nhiều kỹ thuật đã được thiết lập và thẩm định, bao gồm phương pháp được sử dụng trong dược điển để đánh giá TCCL Khi xác định hàm lượng các CCĐC bằng phương pháp không đặc hiệu như quang phổ UV hoặc so màu, cần thiết phải đo lượng nước và dung môi còn lại Đối với phương pháp đặc hiệu, việc xác định hàm lượng tạp chất là quan trọng để đảm bảo độ chính xác của kết quả Trong những trường hợp này, việc sử dụng thêm các phương pháp tuyệt đối để định lượng chất chính được khuyến khích nhằm nâng cao độ tin cậy của phân tích.
▪ Các CCĐC dùng để hiệu chuẩn thiết bị: Yêu cầu phạm vi các test đánh giá nhưđối với định lượng
Lựa chọn phương pháp phân tích để đánh giá PCRS
Các phương pháp lựa chọn để đánh giá các CCĐC chia thành 2 nhóm: nhóm các phương pháp định tính và nhóm các phương pháp định lượng
Hoạt động thiết lập chất chuẩn đối chiếu của các Hội đồng Dược điển, của khu vực ASEAN và Việt Nam 29
của khu vực ASEAN và Việt Nam
1.3.2.1 Ho ạ t độ ng thi ế t l ậ p ch ấ t chu ẩ n đố i chi ế u c ủ a H ộ i đồ ng D ượ c đ i ể n Anh
Hội đồng Dược điển Anh có các phòng thí nghiệm trực thuộc chịu trách nhiệm xây dựng các chuyên luận trong Dược điển Anh và đánh giá các phương pháp phân tích trước khi được xem xét đưa vào tiêu chuẩn Các phòng thí nghiệm này còn đóng vai trò tư vấn cho nhóm chuyên gia của Hội đồng Dược điển và tham gia vào việc thiết lập Các chuẩn quốc tế của Dược điển Anh Các phòng thí nghiệm này đặt tại Teddington, London, đảm bảo tính chính xác và cập nhật của các tiêu chuẩn dược phẩm Giá của Các chuẩn quốc tế Dược điển Anh dao động từ ₤108-110 cho chuẩn định lượng và ₤94-97 cho chuẩn tạp, phản ánh giá trị và chất lượng của các tiêu chuẩn này trong ngành dược.
1.3.2.2 Ho ạ t độ ng thi ế t l ậ p ch ấ t chu ẩ n đố i chi ế u c ủ a H ộ i đồ ng D ượ c đ i ể n Châu Âu
Hội đồng Dược điển Châu Âu (trực thuộc EDQM) cung cấp chất đối chiếu cho các phép thử và phép định lượng trong Dược điển Châu Âu, đảm bảo tính chính xác và tiêu chuẩn cao cho các chuyên luận trong EP Ngoài ra, Hội đồng còn tham gia vào các chương trình hợp tác phát triển, góp phần nâng cao chất lượng và cập nhật các tiêu chuẩn dược phẩm trên toàn châu Âu.
CCĐC của Trung tâm hợp tác về CCĐC của WHO [78], [113]
Năm 2010, EDQM thiết lập được 223 CCĐC hóa dược và 3 CCĐC dược liệu, trong đó có 36 CCĐC dùng cho định lượng, 3 CCĐC dược liệu và 48 hỗn hợp
112 CCĐC được thiết lập mới và 96 lô được thay thế, 461 mẻ được sản xuất
Tổng cộng danh mục CCĐC của
EDQM hiện nay gồm 2.300 chất
Sự phát triển qua mấy năm gần đây được tóm tắt bởi Hình 1.8 [78]
EPCRS đang ngày càng phổ biến rộng rãi không chỉ trong phạm vi Châu Âu mà còn mở rộng ra các khu vực khác trên thế giới Nhu cầu sử dụng EPCRS theo từng khu vực địa lý được thể hiện rõ qua sơ đồ trong Hình 1.9, cho thấy sự gia tăng đáng kể về sự ứng dụng của công nghệ này trên toàn cầu Giá của một lọ EPCRS cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến việc phân phối và tiếp cận sản phẩm trên thị trường quốc tế.
Hình 1.8 Sự phát triển số lượng EPCRS [78]
Hình 1.9 Phân bố nhu cầu sử dụng EPCRS theo khu vực địa lí [78]
1.3.2.3 Ho ạ t độ ng thi ế t l ậ p ch ấ t chu ẩ n đố i chi ế u c ủ a H ộ i đồ ng D ượ c đ i ể n M ĩ
Hội đồng Dược điển Mĩ cung cấp chất chuẩn đối chiếu Dược điển Mĩ
USPRS áp dụng cho tất cả các dược chất, tá dược, tạp chất, sản phẩm phân hủy và thực phẩm bổ sung được đề cập trong các chuyên luận của USP, đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng và an toàn Nội dung này bao gồm cả các chất đối chiếu dùng trong ngành thực phẩm, giúp kiểm soát chất lượng hiệu quả Việc áp dụng USPRS nhằm đảm bảo sự nhất quán và tin cậy trong các thành phần hoạt chất và phụ gia, nâng cao độ tin cậy cho các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm bổ sung.
Chemical Codex Hình 1.10 Hình ảnh USPRS [10]
USPRS được sử dụng ở trên 130 quốc gia trên toàn thế giới Việc thiết lập USPRS được thực hiện bởi ít nhất 3 PTN thành viên đáp ứng tiêu chuẩn
1.3.2.4 Ho ạ t độ ng thi ế t l ậ p ch ấ t chu ẩ n đố i chi ế u c ủ a khu v ự c ASEAN
Dự án Chất chuẩn đối chiếu hóa học của ASEAN được hỗ trợ kĩ thuật bởi
WHO, được tài trợ bởi UNDP và JPMA, với Thái Lan đảm nhận vai trò nước điều phối viên, đóng vai trò trung tâm trong việc thúc đẩy các hoạt động y tế toàn cầu ACRS được thành lập bởi các phòng thí nghiệm quốc gia của nhiều nước thành viên, nhằm tăng cường hợp tác nghiên cứu và chia sẻ dữ liệu y học nhằm nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh tật.
Thái Lan, Singapore, Indonexia, Malaysia,
Philippines và Việt Nam đều sử dụng ACRS trong các nghiên cứu phân tích hóa học và sinh học Sản phẩm ACRS được đóng gói với dung tích 200 mg mỗi lọ dành cho chất đối chiếu hóa học và 100 mg mỗi lọ dành cho chất đối chiếu sinh học Giá của một lọ chất đối chiếu là 2,000 đồng, phù hợp với tiêu chuẩn sử dụng trong các phòng thí nghiệm và phân tích chất lượng.
1.3.2.5 Ho ạ t độ ng thi ế t l ậ p ch ấ t chu ẩ n đố i chi ế u c ủ a Vi ệ t Nam
Năm 2004 - 2006, VKNTT đã thực hiện đề tài cấp bộ thiết lập được 14
CCĐC quốc gia đáp ứng một phần nhu cầu về CCĐC ngày càng tăng của hệ thống kiểm nghiệm ở Việt Nam, đưa số lượng
CCĐC của Quĩ chuẩn Quốc gia tại Viện lên 93 hoạt chất (trong thời điểm đó Quĩ chất chuẩn ASEAN có 125 hoạt chất) [9]
Trong giai đoạn 2006-2008, Viện đã thực hiện thành công đề tài cấp bộ nghiên cứu và thiết lập được 8 cấu trúc chống nhiều kháng sinh thế hệ mới, góp phần nâng cao khả năng điều trị nhiễm khuẩn Trong đó, có 2 chất kháng sinh mới đã được cung cấp cho 8 quốc gia trong khu vực, thúc đẩy hợp tác nghiên cứu và phát triển y tế giữa các nước.
ASEAN Qui trình thiết lập CCĐC của
Viện và các CCĐC do Viện thiết lập là cơ sở để các trung tâm kiểm nghiệm khu vực và các nhà sản xuất áp dụng để tiến hành
Hình 1.12 Chất chuẩn đối chiếu hóa học Cefuroxim acetil [9]
Trong giai đoạn 2008-2010, VKNTT đã hợp tác với các cơ sở nghiên cứu trong nước như Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Dược liệu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu hóa học Acid Chlorogenic theo quy định của đơn vị Hình 1.13 mô tả hình ảnh của chất chuẩn này, là yếu tố quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng phân tích hóa học Việc thiết lập CCĐC giúp nâng cao độ chính xác và độ tin cậy của các phân tích liên quan đến Acid Chlorogenic, góp phần phát triển các phương pháp kiểm nghiệm đạt chuẩn quốc tế.
Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên đã thực hiện đề tài nghiên cứu cấp Nhà nước nhằm thiết lập 10 Cơ sở Dược liệu Khép kín (CCĐC) có nguồn gốc từ dược liệu và thành phẩm thuốc." Trong số này, một số CCĐC đã có trong danh mục Dược điển Mĩ, trong khi các CCĐC còn lại chưa có mặt trong bất kỳ danh mục CCĐC nào của các Dược điển quốc tế phổ biến." Các hoạt động này góp phần nâng cao chất lượng và mở rộng nguồn nguyên liệu cho ngành dược phẩm Việt Nam, đảm bảo tính cạnh tranh và an toàn của các sản phẩm thuốc.
Nguyên liệu nghiên cứu 33
Nguyên liệu 33
Nguyên liệu dùng để chiết xuất các đối tượng nghiên cứu của đề tài: Vỏ thân cây
Mức hoa trắng dùng để chiết xuất Conessin, lá cây Đơn lá đỏ dùng để chiết xuất Kaempferol, lá cây Sen dùng để chiết xuất Nuciferin
- V ỏ thân cây M ứ c hoa tr ắ ng (Cortex Hollarenae antidysentericae): Vỏ thân của cây Mức hoa trắng, Hollarena antidysenterica Wall., họ Trúc đào
Cây thuộc họ Apocynaceae đã được Công ty dược phẩm và thiết bị y tế Hà Tĩnh thu mua đáp ứng tiêu chuẩn cơ sở về nguyên liệu sử dụng trong sản xuất dược phẩm Nguyên liệu phục vụ nghiên cứu sau khi thu mua được thái lát và sấy khô ở nhiệt độ dưới 60°C để đảm bảo chất lượng tốt nhất Đây là bước quan trọng trong quy trình sản xuất viên nén bao phim Mộc Hoa Trắng HT, nhằm đảm bảo tính ổn định và hiệu quả của sản phẩm cuối cùng.
Lá cây Đơ n lá đỏ (Folium Excoecariae cochinchinesis) thuộc họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae), được thu hái tại Thái Bình vào tháng 5/2008 Nguyên liệu sau khi thu mua được sấy ở 65°C trong 24 giờ để bảo quản và chuẩn bị cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
- Lá Sen (Folium Nelumbinis nuciferae): Lá của cây Sen, Nelumbo nucifera
Gaert, họ Sen (Nelumbonaceae), thu mua tại Hưng Yên và Hải Dương (tháng 2, 3 và tháng 4/2008) Nguyên liệu nghiên cứu sau khi thu mua được phơi khô
Các dược liệu được bảo quản nơi khô ráo để duy trì chất lượng tốt nhất Trước khi sử dụng, dược liệu được định tính về mặt hóa học và kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam (DĐVN) Đặc biệt, dược liệu sau khi sơ chế sẽ được nghiền thành bột thô hoặc bột nửa mịn phù hợp với quy định trong DĐVN III, đảm bảo sự đồng nhất và hiệu quả trong quá trình chế biến.
Nguyên liệu dùng để nghiên cứu ứng dụng chất chuẩn đối chiếu:
Lá cây Chè vằng, còn gọi là Jasminum subtriplinerve Blume, thuộc họ Nhài (Oleaceae), là nguyên liệu chủ yếu được thu mua tại phố Lãn Ông Sau khi được thu hái, lá Chè vằng được phơi khô để chuẩn bị sử dụng trong các bài thuốc và sản phẩm chăm sóc sức khỏe.
- Viên nén bao phim M ộ c hoa tr ắ ng HT của Công ty dược phẩm và thiết bị y tế Hà Tĩnh, số kiểm soát: 270611, hạn dùng: 26/6/2013, mỗi viên chứa:
Cao đặc Mộc hoa trắng (Tiêu chuẩn cơ sở): 136 mg
Berberin clorid (DĐVN III): 5 mg
Cao mộc hương (Tiêu chuẩn cơ sở): 10 mg
Tá dược vừa đủ 1 viên
Hóa ch ấ t, thu ố c th ử 34
Các hóa chất thuốc thử tinh khiết phân tích (PA):
- Dung môi hữu cơ: ether dầu hoả (nhiệt độ sôi 30 – 60 o C), n-hexan, cloroform, ethyl acetat, methanol, toluen, aceton;
- Bản mỏng silica gel G và GF254, silica gel dùng cho sắc kí cột (0,02 –
- Các thuốc thử Mayer, Dragendorff, Bouchardat, acid picric 1%;
- Dung dịch đệm phosphat pH 7,4: Hòa tan 5,44 g KH2PO4 trong 800 ml nước cất Điều chỉnh đến pH 7,4 bằng NaOH 1M, thêm nước vừa đủ 1000 ml
Các chất chuẩn liên kết:
- Conessin: Chuẩn PTN, nguồn gốc: Viện Kiểm nghiệm dược và sinh phẩm Trung Quốc, số kiểm soát: 110853 - 200605 Hàm lượng 100,0% (nguyên trạng)
- Kaempferol: Chuẩn PTN, nguồn gốc: Sigma - Aldrich Chem Company, số kiểm soát: 018K1225 Hàm lượng 94,4% (nguyên trạng)
- Nuciferin: Chuẩn PTN, nguồn gốc: Viện Kiểm nghiệm dược và sinh phẩm
Trung Quốc, số kiểm soát: 111566 - 200402 Hàm lượng 99,7% (nguyên trạng).
Thiết bị, dụng cụ 34
Các thiết bị dụng cụ tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (được hiệu chuẩn theo ISO/IEC 17025 và GLP), Viện Hóa học, Viện Hóa học các hợp chất
Phương pháp nghiên cứu 35
Sơ đồ nghiên cứu 36
Sơ đồ nghiên cứu được trình bày ở Hình 2.1
Xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế Conessin,
Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất và xác định độ tinh khiết
Thiết lập chất chuẩn đối chiếu ng dụng chất chuẩn đối chiếu
3 hợp chất đặc trưng từ dược liệu đạt yêu c ầ u độ tinh khi ế t trên 95%; kh ố i l ượ ng 2g
B ộ d ữ li ệ u nh ậ n d ạ ng ch ấ t: Đ i ể m ch ả y, ph ổ
IR, MS, NMR Độ tinh khi ế t b ằ ng k ĩ thu ậ t quét nhi ệ t vi sai
- Các chỉ tiêu chất lượng của chất chuẩn đối chi ế u
- Ph ươ ng pháp phân tích
- K ế t qu ả đ ánh giá ch ấ t l ượ ng ch ấ t chu ẩ n đối chiếu
- Hàm l ượ ng h ợ p ch ấ t chính và t ạ p ch ấ t liên quan t ạ i th ờ i đ i ể m 9 tháng
- Hàm l ượ ng t ạ p ch ấ t liên quan t ạ i th ờ i đ i ể m 15 tháng
- Ph ươ ng pháp phân tích
- Th ẩ m đị nh ph ươ ng pháp
- Hàm l ượ ng h ợ p ch ấ t trong d ượ c li ệ u và ch ế ph ẩ m đ ông d ượ c
Nghiên cứu độ ổn định của 3 chất chuẩn đối chiếu trong điều kiện 2 – 8 o C, độ ẩm 40%
Thiết kế thí nghiệm 37
Cỡ mẫu dược liệu được xác định dựa trên hàm lượng hợp chất đặc trưng, đảm bảo đủ lượng để chiết xuất nhiều mẻ và thu được ít nhất 2,0 g hợp chất Hàm lượng nước trong dược liệu được xác định bằng phương pháp xác định mất khối lượng do làm khô theo tiêu chuẩn DĐVN III, Phụ lục 5.16, hoặc bằng máy đo hàm ẩm Sartorius MA45 để đảm bảo độ chính xác trong phân tích.
Quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế được thực hiện tại các phòng thí nghiệm đạt chuẩn, như Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, nhằm đảm bảo chất lượng và độ chính xác của các thí nghiệm.
Các phân tích và kiểm nghiệm phải được thực hiện tại các phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn quốc tế và có thẩm quyền, nhằm đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy của kết quả Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương là địa điểm lý tưởng để tiến hành các nghiên cứu này, vì đã được WHO công nhận là Trung tâm thiết lập và đánh giá tiêu chuẩn khu vực, đồng thời sở hữu hệ thống phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP theo WHO và tiêu chuẩn quốc tế ISO IEC 17025 Các thiết bị trong quá trình phân tích được hiệu chuẩn theo quy định để đảm bảo kết quả chính xác Trong giai đoạn thiết lập chất chuẩn, Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh tham gia đánh giá liên phòng thí nghiệm nhằm đảm bảo tính khách quan và đồng bộ của kết quả phân tích.
2.2.3 Chiết xuất, phân lập và tinh chế
2.2.3.1 Chi ế t xu ấ t, phân l ậ p, tinh ch ế
Để chiết xuất nhóm chất chứa đối tượng nghiên cứu, cần xây dựng các quy trình chiết xuất thích hợp dựa trên tính chất của từng chất và lựa chọn dung môi phù hợp với độ phân cực Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất, bao gồm các phương pháp chiết nguội và chiết nóng, giúp đảm bảo hai yếu tố chính: tối đa hóa lượng chất chiết xuất và giảm thiểu tạp chất, góp phần thuận tiện cho quá trình phân lập và tinh chế sau đó.
Alcaloid, như Conessin và Nuciferin, là các hợp chất có đặc tính base yếu thường tồn tại trong cây dưới dạng muối của các axit hữu cơ và vô cơ Chúng đóng vai trò quan trọng trong thực vật và có giá trị dược liệu cao Alcaloid thường tồn tại dưới dạng muối để đảm bảo độ bền vững và hòa tan, giúp chúng dễ dàng hấp thu và tác dụng sinh học Các hợp chất này hiện đang được nghiên cứu rộng rãi về công dụng y học và ứng dụng trong dược phẩm.
Bạn có thể sử dụng các dung dịch kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh để giải phóng hợp chất ra khỏi muối Sau đó, áp dụng một trong những kỹ thuật phù hợp để xử lý, nhằm tối ưu hóa hiệu quả phản ứng và đảm bảo quy trình diễn ra thuận lợi Các phương pháp này giúp nâng cao hiệu suất tách hợp chất, đồng thời phù hợp với các tiêu chuẩn SEO liên quan đến xử lý kiềm và kỹ thuật hóa học.
- Chiết bằng dung môi hữu cơ ở môi trường kiềm
- Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc nước
Để chiết xuất hợp chất flavonoid, phương pháp phổ biến là ngâm lạnh hoặc chiết nóng bằng ethanol ở các nồng độ cồn khác nhau Quá trình này được thực hiện theo hai phương pháp: có hoặc không pha acid để thu nhận flavonoid toàn phần hiệu quả nhất Sau khi chiết, tạp chất được loại bỏ bằng dung môi cloroform, sau đó tiến hành chiết nhóm chất chứa flavonoid bằng ethyl acetate để thu hoạch tối ưu.
Sử dụng sắc ký cột với các loại pha tĩnh hấp phụ như silica gel, phân bố pha đảo (C18) và thấm qua gel Sephadex LH-20 là phương pháp hiệu quả trong quá trình phân lập và tinh chế hợp chất Tùy thuộc vào đặc tính của từng chất cần tách, cần chọn loại pha tĩnh phù hợp hoặc kết hợp các loại pha tĩnh khác nhau để tối ưu hiệu quả phân tách Quá trình khảo sát và lựa chọn dung môi rửa giải phù hợp được thực hiện qua phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) để đảm bảo độ tinh khiết và hiệu quả của quá trình phân lập.
Kết tinh trong dung môi là quá trình hòa tan bão hòa tinh thể ở nhiệt độ cao, sau đó làm lạnh hoặc bay hơi dung dịch để tạo ra hiện tượng quá bão hòa, khiến hợp chất chính kết tinh trong khi tạp chất vẫn còn trong dung dịch Quá trình lọc lấy tinh thể sau đó được lặp đi lặp lại nhiều lần để nâng cao độ tinh khiết của hợp chất theo yêu cầu.
Quá trình sắc ký cột cần được lặp lại như giai đoạn phân lập ban đầu để lựa chọn phân đoạn tinh khiết hơn, đảm bảo chất lượng cao của sản phẩm cuối cùng Việc điều chỉnh dung môi rửa giải hoặc thay đổi tỷ lệ thành phần của dung môi rửa giải giúp tối ưu hóa quá trình phân tách, nâng cao hiệu quả của phương pháp sắc ký cột Điều này đảm bảo phân lập chính xác và hiệu quả hơn trong quá trình nghiên cứu hoặc sản xuất.
Trong quá trình phân lập, cần tiến hành sắc ký cột giống như giai đoạn phân lập ban đầu, nhưng thay đổi kiểu sắc ký để phù hợp với mục đích tinh chế Ví dụ, giai đoạn phân lập sử dụng sắc ký hấp phụ pha thuận trên silica gel, còn giai đoạn tinh chế có thể áp dụng sắc ký phân bố pha đảo trên C18 hoặc sắc ký thấm qua gel để đạt được hiệu quả tối ưu.
2.2.3.2 Đị nh tính đố i t ượ ng nghiên c ứ u trong s ả n ph ẩ m chi ế t xu ấ t, phân l ậ p, tinh ch ế Định tính bằng sắc kí lớp mỏng
Sử dụng phương pháp TLC để xác định sự có mặt của đối tượng nghiên cứu trong dịch chiết là bước quan trọng trong quá trình phân lập, giúp kiểm tra vết trên tấm bản để xác định phân đoạn chứa hợp chất mục tiêu Phương pháp này còn hỗ trợ trong việc lựa chọn hệ dung môi phù hợp để tối ưu quá trình phân lập hợp chất nghiên cứu.
Để tiến hành phân tích, dược liệu sau khi xử lý sơ bộ sẽ được chiết bằng dung môi phù hợp và xử lý sao cho dung dịch thử chứa hợp chất đặc trưng với nồng độ khoảng 1 mg/ml Phương pháp TLC trên bản mỏng silica gel tráng sẵn sẽ được sử dụng để phát hiện các hợp chất bằng kỹ thuật phun hiện màu với các thuốc thử đặc trưng Dung dịch chất đối chiếu có nồng độ 1 mg/ml dùng để so sánh và xác định hợp chất Các hệ dung môi triển khai khác nhau sẽ được khảo sát để chọn ra hệ có khả năng phân tách tốt nhất cho từng hợp chất Ngoài ra, phương pháp định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sẽ được sử dụng để xác định chính xác thành phần của mẫu.
HPLC được sử dụng phối hợp với TLC để xác định sự có mặt của hợp chất trong quá trình nghiên cứu, từ giai đoạn định tính dược liệu đến quá trình chiết xuất Phương pháp này giúp so sánh thời gian lưu T_R và phổ PDA của mẫu thử với mẫu đối chiếu, đảm bảo độ chính xác trong phân tích hợp chất Sự kết hợp giữa HPLC và TLC nâng cao khả năng kiểm tra chất lượng và xác định thành phần hoạt chất trong dược liệu một cách hiệu quả.
2.2.3.3 Đị nh l ượ ng đố i t ượ ng nghiên c ứ u trong s ả n ph ẩ m chi ế t xu ấ t, phân l ậ p, tinh ch ế Định lượng bằng phương pháp cân
Phương pháp cân là kỹ thuật sơ bộ xác định lượng hợp chất toàn phần hoặc lượng sản phẩm chiết được, giúp đánh giá hiệu quả quá trình chiết và phân lập Đây là phương pháp đơn giản, thường được sử dụng để đánh giá hiệu suất của các bước trong quá trình chiết và phân lập hợp chất Việc đo khối lượng chính xác giúp tính toán hiệu quả của từng quá trình, đảm bảo kết quả phân tích chính xác và tin cậy.
Hàm lượng hợp chất toàn phần chiết được từ dược liệu theo công thức:
X : hàm lượng hợp chất toàn phần trong mẫu dược liệu n : khối lượng hợp chất toàn phần chiết xuất được
M : khối lượng dược liệu đem chiết
Ha : hàm ẩm của dược liệu Định lượng các hợp chất đặc trưng trong các sản phẩm bằng HPTLC
Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất 40
Các hợp chất được nghiên cứu trong đề tài đều đã có cấu trúc rõ ràng và được biết đến Dữ liệu chuẩn đóng vai trò quan trọng trong việc nhận dạng các chất, giúp thiết lập hồ sơ nhận dạng chính xác Quá trình nhận dạng chất dựa trên việc phân tích dữ liệu chuẩn để xác định đặc điểm phân tử và cấu trúc của từng hợp chất, từ đó đảm bảo quá trình xác định chính xác và tin cậy.
- So sánh phổ của chất phân tích với phổ chất chuẩn trong cùng điều kiện
Việc so sánh thông tin phổ, dữ liệu hóa lí và các hằng số vật lí của chất với các tài liệu khoa học hoặc thông tin đã được công bố là bước quan trọng để xác định tính chính xác của dữ liệu Tập hợp các dữ liệu chuẩn này giúp đảm bảo rằng hợp chất đang nghiên cứu đúng với đối tượng đã xác định Điều này đảm bảo tính khách quan, chính xác và phù hợp của dữ liệu trong quá trình phân tích và nghiên cứu hợp chất.
Các phương pháp xây dựng bộ dữ liệu bao gồm đo điểm chảy, đo phổ tử ngoại khả kiến trong dung môi MeOH, và đo phổ hồng ngoại trong KBr Ngoài ra, còn sử dụng kỹ thuật đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (H 1 NMR, C 13 NMR, DEPT) và 2 chiều (COSY, HMBC, HSQC) để phân tích cấu trúc, cùng với đo phổ khối lượng (MS) để xác định khối lượng phân tử.
Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất 40
Sắc kí lớp mỏng (TLC) là phương pháp được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết của mẫu, dựa trên việc phát hiện sự có mặt của một vết duy nhất hoặc vết chính liên quan đến đối tượng phân tích Chất càng tinh khiết sẽ cho kết quả với ít hoặc không có vết phụ, hoặc vết phụ càng nhỏ, phản ánh mức độ tinh khiết cao của mẫu.
Quét nhiệt vi sai là phương pháp sử dụng thiết bị DSC (Differential Scanning Calorimetry) để đo lường các thông số nhiệt lượng của mẫu thử Công nghệ này giúp xác định chính xác mức độ tinh khiết của chất chuẩn bằng cách phân tích các điểm biến đổi nhiệt trên đồ thị nhiệt độ Nhờ đó, quá trình kiểm tra chất lượng và hiệu chuẩn các mẫu chuẩn trở nên chính xác và tin cậy hơn.Quét nhiệt vi sai bằng thiết bị DSC là phương pháp hiệu quả để xác định mức độ tinh khiết của chất chuẩn thông qua đo lường các thông số nhiệt lượng, giúp đảm bảo độ chính xác trong phân tích hóa học.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng để xác định chính xác lượng tạp chất trong mẫu Phương pháp này giúp tính gần đúng tỷ lệ tạp chất dựa trên tỷ lệ phần trăm diện tích của phổ HPLC, đảm bảo độ chính xác và tin cậy cao trong phân tích thành phần Công nghệ HPLC là công cụ quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng và đảm bảo an toàn sản phẩm.
Thiết lập chất chuẩn và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn 41
2.2.6.1 Xây d ự ng tiêu chu ẩ n ch ấ t l ượ ng
Xây dựng chỉ tiêu chất lượng:
Dựa trên tính chất lý – hóa của nguyên liệu, xác định các chuẩn và công thức chuẩn chung của quá trình chế biến sơ cấp Việc này nhằm xây dựng các công thức chế biến cần thiết để đảm bảo chất lượng nguyên liệu đầu vào, phù hợp với các tiêu chuẩn an toàn và hiệu quả Áp dụng các quy trình chuẩn này giúp tối ưu hóa quá trình sản xuất, đảm bảo sự đồng bộ và ổn định của sản phẩm cuối cùng.
Xây dựng phương pháp đánh giá:
▪ Tham khảo DĐVN và các dược điển quốc tế để lựa chọn phương pháp phù hợp đánh giá các CTCL
▪ Khảo sát lựa chọn chương trình sắc kí thích hợp để định lượng và xác định tạp chất
Dựa trên công thức phân tử và cấu trúc hóa học của các hợp chất chiết xuất từ dược liệu, các điều kiện sắc ký phù hợp như bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng của pha động, thể tích tiêm mẫu, nồng độ dung dịch thử, và dung môi pha mẫu được xác định chính xác Việc tối ưu các yếu tố này giúp nâng cao hiệu quả phân tích, đảm bảo độ chính xác và độ nhạy của phương pháp sắc ký trong nghiên cứu dược liệu.
▪ Thẩm định phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu:
- Độ tuyến tính và khoảng nồng độ tuyến tính (Linearity and range)
- Độ đúng (Accuracy): Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn và tính thông qua tỷ lệ thu hồi:
Tỷ lệ thu hồi (%) = x 100 (2) Hàm lượng thực cho vào
- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
- Sự phù hợp của hệ thống sắc kí (System suitability)
2.2.6.2 Qui trình thi ế t l ậ p và phân tích đ ánh giá ch ấ t chu ẩ n Đánh giá nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
Nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn phải là các hợp chất đặc trưng chiết xuất từ dược liệu với độ tinh khiết trên 95,0% Phương pháp phân tích đã được thẩm định sẽ được áp dụng để đánh giá mức độ đáp ứng yêu cầu chất lượng của nguyên liệu, đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy trong quá trình kiểm nghiệm.
- Định tính: Tiến hành phương pháp đo phổ IR, NMR hoặc phối hợp thêm phương pháp HPLC
- Xác định độ tinh khiết: Sử dụng một trong các phương pháp HPLC, DSC, đo điểm chảy hoặc phối hợp
Công thức tính hàm lượng tạp chất gần đúng theo tỉ lệ diện tích pic khi áp dụng phương pháp HPLC:
C S pic pic tap = ∑ (3) trong đó:
C tap : tỉ lệ phần trăm tạp chất trong mẫu phân tích
S pic : diện tích pic tạp chất
∑S pi c : tổng diện tích pic
- Xác định hàm lượng: Sử dụng phương pháp HPLC đã được thẩm định, tiến hành song song với chất chuẩn liên kết
Công thức tính hàm lượng hợp chất chính (theo nguyên trạng):
C m thu thu chuan thu chuan chuan
C : hàm lượng hoạt chất tính theo phần trăm
43 m chuan : khối lượng chất chuẩn liên kết m thu : khối lượng mẫu thử
S chuan : diện tích pic của mẫu chuẩn liên kết
S thu : diện tích pic của mẫu thử
V chuan : thể tích pha mẫu chuẩn
V thu : thể tích pha mẫu thử Đóng gói
Nguyên liệu sau khi được kiểm tra theo quy trình và đạt tiêu chuẩn chất lượng sẽ được đóng lọ theo các bước quy định trong VKN/TT/21.20 [50] Quá trình đóng gói sử dụng lọ thủy tinh màu nâu, nút xoáy có đệm Teflon đạt tiêu chuẩn chất lượng Để đảm bảo chất lượng của chất đối chiếu trong thời gian bảo quản và sử dụng, việc đóng gói được thực hiện trong Glove-Box có kiểm soát độ ẩm, nạp khí nitơ tinh khiết 99,99% với độ ẩm tương đối khoảng 40% Mỗi lọ có khối lượng 20 mg.
Dán nhãn có ghi tên hoạt chất và đánh số thứ tự cho từng lọ [65], [66], [148] Đánh giá độđồng nhất của quá trình đóng gói
Sử dụng cách lấy mẫu ngẫu nhiên, số lượng lọđược lấy để tiến hành kiểm tra + 1
Trong quá trình phân tích, xác định hàm lượng của hoạt chất trong từng lọ, với tổng số lọ N (ít nhất 5 lọ), sử dụng phương pháp phân tích phù hợp để đánh giá sơ bộ Kết quả được xử lý và đánh giá theo các kỹ thuật thống kê chuẩn, đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy trong quá trình kiểm tra chất lượng sản phẩm.
Lô sản xuất được coi là đồng nhất khi giá trị RSD của kết quả hàm lượng giữa các lọ nhỏ hơn 1,0% Điều này cho thấy điều kiện đóng gói đã ổn định và mẫu nguyên liệu đóng trong các lọ đảm bảo tính đồng nhất Việc kiểm tra RSD giúp xác định độ nhất quán của kết quả hàm lượng, đảm bảo chất lượng sản phẩm Khi RSD dưới 1,0%, có thể kết luận rằng các mẫu trong lô sản xuất có sự đồng đều cao, đáp ứng các yêu cầu tiêu chuẩn trong quá trình kiểm nghiệm.
2.2.6.3 Đ ánh giá liên phòng thí nghi ệ m ch ấ t l ượ ng ch ấ t chu ẩ n đố i chi ế u
Sau khi đóng gói, thành phẩm được lấy ngẫu nhiên theo quy định N + 1, trong đó N là tổng số lọ đóng, để gửi đến ít nhất 2 phòng thí nghiệm (PTN) nhằm đánh giá lại chỉ tiêu định lượng Mỗi PTN sẽ nhận 5 lọ mẫu kèm theo chất chuẩn liên kết theo quy trình phân tích chuẩn để đảm bảo độ chính xác và đáng tin cậy của kết quả kiểm nghiệm Quá trình này nhằm đảm bảo chất lượng và an toàn của sản phẩm trước khi đưa ra thị trường.
44 và các tài liệu có liên quan khác [65], [66], [148]
2.2.6.4 Ph ươ ng pháp x ử lí s ố li ệ u
Xử lí kết quả phân tích trong từng phòng thí nghiệm
Tập hợp kết quả và loại giá trị thô theo qui tắc của test – Dixon
- Tính giá trị trung bình:
- Tính độ lệch chuẩn tương đối: x 100 %
RSD = S (7) trong các công thức (5), (6), (7):
Giá trị trung bình của hàm lượng hợp chất chính được tính dựa trên các mẫu thử, với ký hiệu X thể hiện giá trị trung bình, trong khi x_i là hàm lượng hợp chất chính của mẫu thứ i Số lượng thử nghiệm n đóng vai trò quan trọng trong việc xác định độ chính xác của kết quả, giúp đảm bảo tính khách quan và độ tin cậy của phép tính trung bình về hàm lượng hợp chất chính trong các mẫu thử nghiệm.
RSD : độ lệch chuẩn tương đối
Xử lý kết quả phân tích liên phòng thí nghiệm được thực hiện bằng phương pháp thống kê phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA - one way) theo tiêu chuẩn ISO 13528, đảm bảo độ chính xác và đáng tin cậy của kết quả Quá trình này giúp đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích, từ đó nâng cao năng lực kiểm soát chất lượng và cải thiện quy trình phân tích trong các phòng thí nghiệm Việc áp dụng phương pháp thống kê phù hợp theo tiêu chuẩn quốc tế giúp đảm bảo tính khách quan, chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích liên phòng thí nghiệm.
Phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA) là phương pháp thống kê dùng để đánh giá ảnh hưởng của một yếu tố duy nhất lên các giá trị quan sát xi (i = 1, 2, …, k) Phương pháp này giúp xác định xem sự thay đổi của yếu tố đó có tác động đáng kể tới kết quả hay không, qua đó đánh giá mức độ ảnh hưởng của các biến độc lập trên các biến phụ thuộc Áp dụng ANOVA cho các kết quả phân tích của các phòng thí nghiệm tham gia nghiên cứu giúp đưa ra kết luận chính xác về ảnh hưởng của việc thay đổi các yếu tố phòng thí nghiệm Kết quả phân tích sẽ chỉ ra xem các khác biệt giữa các nhóm có ý nghĩa thống kê hay không, từ đó hỗ trợ xây dựng các quyết định phù hợp dựa trên dữ liệu thực tế.
45 phương pháp phân tích lựa chọn có độ tái lặp hay không
Bảng 2.1 Mô hình phòng thử nghiệm
Trung bình X (i ) Độ lệch chuẩn S (i )
Tổng số bình phương (SS)
Bình phương trung bình (MS)
Giữa các nhóm (B) SS B = SS TOTAL − SS W A = ( E − 1 ) ( ) − [ p n − 1 ] MS B = SS A B W
SS = − E – 1 trong đó: p: Số phòng thử nghiệm tham gia đánh giá hợp tác
E: Tổng số kết quả của p phòng thử nghiệm n: Tổng số kết quả của một phòng thử nghiệm
- Nếu Ftn < Ftc (p - 1; E - p): Phương pháp phân tích có độ lặp lại trong từng PTN và có độ tái lặp giữa các PTN
- Nếu Ftn > Ftc ( p -1; E - p): Phương pháp phân tích có độ lặp lại trong từng PTN nhưng không có độ tái lặp giữa các PTN
Xác định giá trị công bố trên COA: Được tiến hành khi F tn ≤ F tc
Do khối lượng các hợp chất tinh chế đều quá nhỏ để xác định độ ẩm chính xác, nên các kết quả định lượng đều được tính theo trạng thái nguyên liệu ban đầu để đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả phân tích.
Xác định giá trịấn định
GTAĐ được xử lý dựa trên thống kê từ tập hợp kết quả của các phòng thí nghiệm độc lập tham gia đánh giá hợp tác, yêu cầu số phép thử tối thiểu là n ≥ 11 để đảm bảo tính khách quan và độ chính xác Quá trình tính GTAĐ sử dụng phương pháp phân tích theo quy định trong quy trình thiết lập chất chuẩn, giúp đảm bảo tính đồng bộ và tin cậy của kết quả phân tích Việc áp dụng các phương pháp phân tích phù hợp đảm bảo tính chính xác của GTAĐ, đáp ứng các tiêu chuẩn về quản lý chất lượng và tiêu chuẩn quốc tế trong lĩnh vực này.
Nhập số liệu x i là tập hợp kết quả của các PTN tham gia, sắp xếp theo thứ tự tăng dần: x1, x2, …… xi, …… xp
Qui ước: Giá trị trung bình thực (robust average) x * (n ) Độ lệch chuẩn thực (robust standard deviation) s (n * )
Tính giá trị trung bình thực (robust average)x * (n ) và độ lệch chuẩn thực
(robust standard deviation) s * (n ) c ủ a dãy k ế t qu ả :
0 x ( : Giá tr ị trung v ị c ủ a dãy k ế t qu ả s ắ p x ế p t ă ng d ầ n
Cách tính: x ( 0 ) là giá tr ị chính gi ữ a dãy n ế u p là s ố l ẻ
= x p x p x nếu p là số chẵn (8) s ( 0 ) = 1,483 x trung vị của dãy │xi − x ( 0 ) │, (với i = 1, 2,… p)
Cập nhật giá trị x i * ( 1 ) như sau:
Với mỗi giá trị xi trong dãy kết, tính giá trị ( 1 )
Tính giá trị x * ( 1 ) và s ( * 1 ) theo công thức: p x x p i
Tiến hành tính toán lặp lại bước 2 cho đến khi giá trị s * (n ) không thay đổi ở số thứ 3 sau dấu phẩy và giá trị x * (n ) không thay đổi thì dừng lại
Chọn giá trị x * (n ) cuối cùng là GTAĐ sử dụng để tính giá trị Z – Score p x x p i i n n
Xác định giá trị công bố của chất chuẩn
Tính giá trị⏐Z⏐- Score: Đánh giá độ lệch giữa từng giá trị riêng so với
Z = x i − n (15) trong đó: x i : Giá trị riêng của từng phòng thử nghiệm x * ( ) n : Giá trị trung bình của các phòng thử nghiệm
Kết quả phân tích tương ứng với giá trị ⏐Z⏐≤ 2: Đạt
Kết quả phân tích tương ứng với giá trị ⏐Z⏐ > 2: Loại bỏ
Chọn các kết quả có giá trị│Z│≤ 2,0 để tính giá trị trung bình
Tính độ không đảm bảo đo của kết quả công bố trên chứng chỉ:
Kết quả công bố trên chứng chỉ phân tích thể hiện giá trị trung bình từ tập hợp các kết quả phân tích có giá trị │Z│≤ 2,0, được tính toán theo phương pháp thống kê với số phép thử n ≥ 11 Độ không đảm bảo đo của giá trị này được phân loại loại A và tính theo hệ số phủ k = 2 với mức tin cậy 95%, đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong kết quả phân tích.