Các kết quả khảo sát tạo vết thương mẫu cho thấy sử dụng phương pháp tạo vết thương mẫu thích hợp giúp tăng đáng kể hiệu quả chuyển gen, cụ thể với khả năng biến nạp cấu trúc gen tạo as
TỔ NG QUAN TÀI LI Ệ U
Chuy ể n hóa t ạ o carotenoid ở th ự c v ậ t
Carotenoid là một loại sắc tố hữu cơ tự nhiên phổ biến trong thực vật, đóng vai trò bảo vệ và tăng cường sức khỏe nhờ khả năng chống oxy hóa, ngăn ngừa ung thư và hỗ trợ sức khỏe tim mạch, đồng thời là tiền chất của vitamin Tuy nhiên con người không tự tổng hợp carotenoid mà phải hấp thu từ thực phẩm Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm điều chỉnh chu trình chuyển hóa carotenoid ở thực vật để tăng cường các sản phẩm mong muốn, tiêu biểu là β-carotene Bên cạnh đó, astaxanthin là một carotenoid nằm ở cuối chu trình chuyển hóa của một số loài thực vật thuộc chi Adonis, đang thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu do giá trị thị trường rất cao và có công dụng nổi bật trong bảo vệ và tăng cường sức khỏe Sau đây là chu trình chuyển hóa tổng hợp carotenoid ở thực vật và một số cải biến chính đã được thực hiện.
1.1.1 Sinh t ổ ng h ợ p và tích tr ữ carotenoid
Quá trình tổng hợp carotenoid bắt nguồn từ các tiền chất được hình thành từ con đường MEP (methylerythritol 4-phosphate pathway) diễn ra trong lạp thể Các cơ chất ban đầu, gồm glyceraldehyde-3-phosphate và pyruvate, được sử dụng để tổng hợp geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) — tiền chất chung cho tổng hợp carotenoid và nhiều hợp chất terpenoid khác (những hình minh họa ở Hình 1.1).
Trong quá trình tổng hợp carotenoid, bước đầu là sự kết hợp hai phân tử GGPP để tạo thành 15-cis-phytoene, được xúc tác bởi enzyme phytoene synthase (PSY) Phytoene sau đó được chuyển đổi thành lycopene thông qua hai phản ứng desaturation, do phytoene desaturase (PDS) và zeta-carotene desaturase (ZDS) xúc tác.
Lycopene là điểm phân nhánh của con đường tổng hợp carotenoid và là chất nền cho hai enzyme cyclase cạnh tranh nhau là β-LCY và ε-LCY Khi β-LCY và ε-LCY cùng hoạt động ở hai đầu của phân tử lycopene, α-carotene được hình thành; ngược lại khi chỉ β-LCY hoạt động, β-carotene được sản xuất Cả α-carotene và β-carotene sau đó được hydroxyl hóa bởi ε-ring carotene hydroxylase và β-ring carotene hydroxylase để tạo ra lutein và zeaxanthin.
Lutein là sản phẩm cuối cùng của nhánh β,ε trong đường tổng hợp carotenoid, còn zeaxanthin được oxy hóa bởi zeaxanthin epoxidase (ZEP) qua hai bước để tạo violaxanthin thông qua antheraxanthin Các phản ứng này có thể đảo ngược bởi violaxanthin deepoxidase (VDE), tạo thành vòng xanthophyll giúp thực vật thích nghi với stress ánh sáng cường độ cao Violaxanthin được chuyển thành neoxanthin bởi neoxanthin synthase (NXS), carotenoid cuối cùng của nhánh β,β.
Hình 1.1 Sơ đồcon đường sinh tổng hợp carotenoid [19]
Carotenoid được tổng hợp ở hầu hết các lạp thể của thực vật, bao gồm lục lạp (chloroplasts), sắc lạp (chromoplasts), bột lạp và dầu lạp, nhưng lượng tích lũy lớn nhất lại ở lục lạp và sắc lạp Trong lục lạp, phần lớn carotenoid tích lũy ở dạng phức hợp protein–diệp lục (màng thylakoid) Carotenoid của hạt được tích trữ trong elaioplasts (lipidoplasts), các lạp thể dự trữ lipid có cấu trúc đặc biệt để chứa số lượng lớn carotenoid Ở sắc lạp, phần lớn carotenoid được lưu trữ trong màng sắc lạp, ở thể dầu hoặc ở dạng tinh thể trong stroma.
1.1.2 T hay đổ i chuy ể n hóa sinh t ổ ng h ợ p carotenoid
Những thay đổi được thực hiện trên một số gen mã hóa các enzyme quan trọng trong con đường sinh tổng hợp carotenoid nhằm tăng cường sự tích lũy carotenoid hoặc điều chỉnh tỉ lệ các loại carotenoid được tạo thành Các biến đổi này ảnh hưởng đến hoạt động của chu trình tổng hợp, giúp tối ưu hóa lượng carotenoid tích lũy và thay đổi thành phần carotenoid theo mục tiêu mong muốn Dưới đây là một số gen mã hóa enzyme đã được sử dụng trong các chiến lược cải thiện carotenoid.
Phytoene synthase (PSY) là enzyme xúc tác bước đầu quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp carotenoid, chịu trách nhiệm kết hợp hai phân tử GGPP để hình thành phytoene, do đó biểu hiện của gen psy đóng vai trò then chốt trong tích lũy carotenoid ở thực vật Nhiều nghiên cứu cho thấy khi psy được tăng biểu hiện, sự phối hợp với tăng biểu hiện của các gen ở các bước sau như pds và β-LCY có thể làm tăng đáng kể hàm lượng carotenoid ở nhiều loại cây trồng, ví dụ cà chua, cà rốt, canola, gạo Golden Rice, khoai tây vàng, khoai tây và ngô Tổng carotenoid ở các loài cây trồng biến đổi gen có thể tăng từ 2 đến 50 lần, tùy loài.
- 3600 lần ở mức độβ-carotene và dẫn đến màu sắc thay đổi sang vàng hoặc cam
Các nghiên cứu chuyển gen ghi nhận rằng nguồn gốc của gen psy từ nhiều loài khác nhau (ngô, lúa gạo, Arabidopsis, hoa thủy tiên, v.v.) sẽ ảnh hưởng lớn đến mức độ tổng hợp carotenoid ở mức độ khác nhau Paine và cộng sự (2005) cho thấy psy có nguồn gốc từ ngô giúp tăng cường tổng hợp và tích lũy carotenoid cao hơn nhiều so với psy từ Arabidopsis, cà chua, cà rốt, ớt hay lúa Để nâng cao khả năng tích lũy carotenoid ở gạo Golden Rice thế hệ đầu, nhóm tác giả đã thay psy từ hoa thủy tiên bằng psy từ ngô, kết quả làm tăng hàm lượng carotenoid ở gạo Golden Rice thế hệ 2 lên tới 23 lần, tối đa đạt được là 23 lần.
Ở mức 37 μg/g, so với Golden Rice thế hệ đầu, thành phần β-carotene chiếm phần lớn và chiếm tới 84% tổng carotenoid Các nghiên cứu tổng hợp astaxanthin ở lúa gạo và ngô cho thấy gen psy từ ngô có khả năng tăng cường đường tổng hợp carotenoid, từ đó nâng cao tổng hợp astaxanthin Do đó, nhiều nghiên cứu cho thấy gen psy từ ngô có thể được sử dụng để tăng đáng kể khả năng tổng hợp carotenoid ở cây chuyển gen, và sẽ được áp dụng trong nghiên cứu này nhằm nâng cao đường tổng hợp carotenoid ở cây đậu tương, qua đó tăng cường tổng hợp astaxanthin.
Elevating the expression of genes involved in the phytoene-to-lycopene conversion—such as PDS (phytoene desaturase), ZDS (zeta-carotene desaturase), CRTISO (carotenoid isomerase), and Z-ISO (15-cis-ζ-carotene isomerase)—further enhances carotenoid biosynthesis in plants.
Việc cạnh tranh hoạt động giữa β-LCY và ε-LCY quyết định tỉ lệ lycopene được định hướng vào hai nhánh của con đường carotenoid để tổng hợp β-carotene hoặc α-carotene Ở Arabidopsis, lá mang đột biến bất hoạt gen mã hóa ε-LCY dẫn tới thiếu lutein và tăng tổng hợp β-carotene Ở khoai tây, bất hoạt gen ε-LCY ở thân cũng làm tăng hàm lượng β-carotene lên tới 14 lần.
Danh pháp: 3,3′-dihydroxy-β, β-carotene-4,4′-dione
Trọng lƣợng phân tử: 596,84 g/mol
Astaxanthin là một carotenoid màu đỏ, có 40 nguyên tử cacbon và liên kết đôi và đơn xen kẽ Cấu trúc đặc biệt của astaxanthin so với các ketocarotenoid khác là ở hai đầu vòng có nhóm hydroxyl (OH) và nhóm keto (CO), giúp tăng khả năng chống oxy hóa, độ phân cực, khả năng ester hóa và tính ổn định của phân tử [37] Astaxanthin tồn tại ở ba đồng phân dựa vào hướng không gian của nhóm OH tại vị trí cacbon số 3 và 3′: (3R,3′R), (3R,3′S) và (3S,3′S) [38].
1.1.3.2 Công dụng và giá trị của astaxanthin
Astaxanthin có khả năng chống oxy hóa mạnh hơn vitamin C, vitamin E và các carotenoid khác như β-carotene, lycopene, zeaxanthin, nên được dùng làm chất chống gốc tự do có hại cho cơ thể (hình 1.3) Ngoài ra, phân tử astaxanthin có đặc tính hòa tan trong lipid và liên kết với màng tế bào ở cả hai mặt, nhờ đó tăng hiệu quả chống oxy hóa so với các chất chỉ có một tính chất (hình 1.4) [39][40][41][42].
Hình 1.3 So sánh khả năng chống gốc oxy tự do có hại cho cơ thể của một số chất chống oxy hóa [43]
Nhiều nghiên cứu cho thấy astaxanthin có tác dụng bảo vệ DNA, tăng cường hệ miễn dịch và làm giảm sự phát triển của khối u ung thư trên mô hình động vật; nó còn được ghi nhận hiệu quả trong hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường, chống stress oxy hóa, giảm viêm, bảo vệ tim mạch và hỗ trợ một số chức năng thần kinh Với những công dụng này, hiện nay astaxanthin đã được bán trên thị trường ở nhiều dạng sản phẩm khác nhau như viên, syrup, dầu, gel, kem, sinh khối và bột.
Hình 1.4 Vị trí của phân tử astaxanthin trong màng tế bào [40]
Bi ến đổ i gen th ự c v ậ t
Có hai nhóm hệ thống chuyển gen vào thực vật: hệ thống sinh học (gián tiếp) sử dụng vi khuẩn Agrobacterium hoặc vector virus để đưa DNA vào tế bào thực vật, và hệ thống phi sinh học (trực tiếp) gồm vi tiêm, xung điện, siêu âm và bắn gen để chuyển gen vào thực vật Trong đó, phương pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium (gián tiếp) và công nghệ bắn gen (trực tiếp) được áp dụng phổ biến và hiệu quả nhất trên nhiều loài thực vật khác nhau [64][65].
Phương pháp bắn gen được mô tả lần đầu tiên bởi Sanford và cộng sự (1987)
Trong phương pháp này, vector biểu hiện mang các gen đích được cố định trên các hạt vàng hoặc tungsten và được đẩy về phía tế bào đích bằng áp lực từ khí hydro hoặc nitơ Một số hạt mang vector có thể xuyên qua màng tế bào, khởi phát quá trình ghép chèn gen ngoại lai vào bộ gen tế bào Những tế bào có khả năng sinh phôi được sử dụng hiệu quả nhờ độ đồng nhất, khả năng tái sinh cao và có thể được trải đều trên bề mặt để phân bố gen Ưu điểm của phương pháp là có thể áp dụng với nhiều loài và giống, đồng thời cho hiệu quả chuyển gen cao trên nhiều loại cây trồng quan trọng Tuy nhiên, nhược điểm gồm chi phí cao, hiệu quả chuyển gen có thể thấp hơn khi so với Agrobacterium; thêm vào đó, phân tử DNA chuyển vào tế bào dễ bị đứt gãy, thường tạo nhiều bản sao của gen chuyển và dẫn tới các dòng biểu hiện gen không ổn định.
1.2.1 Chuy ể n gen vào th ự c v ậ t s ử d ụ ng Agrobacterium tumefaciens
Trong tự nhiên, A tumefaciens là một vi khuẩn đất gram âm gây bệnh trên thực vật, đặc biệt ở cây hai lá mầm, với triệu chứng điển hình là hình thành khối u ở thân và rễ Trong quá trình gây bệnh, A tumefaciens chuyển một đoạn DNA của mình vào bộ gen cây Nhờ khả năng này, hiện nay A tumefaciens được dùng phổ biến để chuyển các gen ngoại lai quy định các đặc tính khác nhau vào thực vật, như tính kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ, khả năng khử độc môi trường, tăng cường chất dinh dưỡng và tổng hợp dược phẩm.
Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens (Tumour inducing plasmid) có khả năng chuyển gen nằm trên Ti-plasmid với các đặc tính điển hình: kích thước khoảng 200–800 kb và ở dạng vòng xoắn kép [55] Trong Ti-plasmid có hai vùng quan trọng là vùng T-DNA (transferred DNA) và vùng gây độc (virulence - vir gen) Vùng vir gồm các gen mã hóa cho các protein cần thiết cho sự tổng hợp, vận chuyển và hợp nhất của vùng T-DNA vào tế bào chủ Vùng vir có kích thước khoảng 30–40 kb, gồm 6 operon quan trọng là: VirA, VirB, VirC, VirD, VirE, VirG và 2 operon khác ít quan trọng hơn là VirF và VirH [73][74].
Vùng T-DNA trên Ti-plasmid đóng vai trò then chốt trong kỹ thuật chuyển gen ở thực vật sử dụng A tumefaciens, là vùng DNA được đưa vào tế bào thực vật So với T-DNA tự nhiên, T-DNA dùng trong kỹ thuật biến đổi gen được chỉnh sửa bằng cách loại bỏ các gen tổng hợp auxin, cytokinin và opine, và thay thế bằng các gen mong muốn thể hiện trong thực vật, như gen kháng sâu bệnh hay điều khiển chín trái chậm Đồng thời, khi biến nạp với A tumefaciens, chỉ một số ít tế bào nhận được sự hòa nhập bền vững của gen mong muốn vào bộ gen nhân Do đó cần thiết bổ sung các gen chọn lọc (selectable marker genes) và gen chỉ thị (reporter genes) trong cấu trúc đồng chuyển với gen mong muốn trên T-DNA để tăng khả năng đánh giá và chọn lọc các dòng biến đổi.
Gen chọn lọc được dùng để chọn lọc thể chuyển gen, bởi nó mã hóa một protein cho phép các tế bào chuyển gen có khả năng phát triển trên môi trường chứa các hợp chất độc hại với tế bào không chuyển gen Vì vậy, gen chọn lọc có thể mã hóa một enzyme tham gia vào cơ chế giúp tế bào đã biến đổi tồn tại trong điều kiện đó.
Hình 1.9 Vi khuẩn A tumefaciens bám trên bề mặt tế bào thực vật [71]
Hình 1.10 mô tả A tumefaciens gây khối u trên thực vật Trong hệ chuyển gen thực vật, các gen chọn lọc như nptII, hpt và bar thường được dùng để nhận diện và duy trì các dòng mang gene biến đổi Quá trình giải độc có thể giúp phân hủy tác nhân chọn lọc hoặc mã hóa cho một enzyme không nhạy cảm với sự ức chế của tác nhân chọn lọc, enzyme này sẽ thay thế enzyme đã bị biến đổi trong thể chuyển gen.
Hình 1.11 Sựức chế của phosphinothricin lên hoạt động của enzyme glutamine synthetase (GS)
Gen bar được cô lập từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus, mã hóa enzyme phosphinothricin acetyltransferase có khả năng acetyl hóa và vô hiệu hóa phosphinothricin, một loại thuốc diệt cỏ được bổ sung vào môi trường để sàng lọc thể chuyển gen Phosphinothricin ức chế enzyme glutamine synthetase (GS) trong tế bào thực vật, làm gián đoạn quá trình tổng hợp glutamine và chuyển hóa NH4+, dẫn đến sự tích lũy NH4+, làm phát sinh amoniac và gây độc tế bào thực vật Chỉ các tế bào được chuyển gen bar mới có khả năng bất hoạt phosphinothricin và tồn tại trên môi trường chọn lọc.
Gen chỉ thị là các đoạn mã hóa sản phẩm có thể nhận diện được và dùng để phát hiện thể chuyển gen, với các ví dụ điển hình như gus, luc và gfp; trong đó gus là gen được sử dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật chuyển gen thực vật Gen gus do Jelferson phân lập từ E coli năm 1986, mã hóa protein β-glucuronidase, là một hydrolase xúc tác sự phân giải β-glucuronide, tạo ra sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng, bền và dễ nhận biết (hình minh họa).
1.12) β-glucuronide thường dùng nhất để nhận biết sự tồn tại của gen gus là X-
Gluc (5-bromo-4-clo-3-indolyl--D-glucoronide)
Phương pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens được xem là kỹ thuật tương đối đơn giản và hiệu quả, không đòi hỏi thiết bị phức tạp và cho phép chuyển các đoạn DNA có kích thước tương đối lớn; nó ít xảy ra đứt gãy hoặc tái sắp xếp trình tự, nhờ đó các gen được chuyển có tính toàn vẹn và biểu hiện ổn định trong tế bào chủ Thêm vào đó, số lượng bản sao của gen biến nạp trong tế bào chủ thường ở mức thấp, giúp giảm ảnh hưởng lên bộ gen cây chủ và tăng cường ổn định của biểu hiện gen được chuyển.
Nhược điểm ban đầu của Agrobacterium tumefaciens là phạm vi ký chủ tương đối hẹp, chủ yếu ở cây hai lá mầm và một số cây một lá mầm Tuy nhiên, dựa trên hiểu biết về cơ chế chuyển gene vào tế bào thực vật của A tumefaciens và nhờ quá trình chọn lọc, cải thiện các dòng A tumefaciens tự nhiên, phạm vi ký chủ của loài này ngày càng được mở rộng.
1.2.2 S ử d ụ ng promoter trong công ngh ệ chuy ể n gen th ự c v ậ t
Promoter là một phần trong cấu trúc của gen, nằm ở phía thượng nguồn và đóng vai trò điều hòa quá trình khởi đầu phiên mã để tạo RNA Cấu trúc promoter gồm ba vùng chính: lõi, cận biên và ngoại biên; vùng lõi thường nằm khoảng 40 bp upstream từ vị trí bắt đầu phiên mã và chứa các trình tự như TATA box và Initiator element, là nơi gắn của các nhân tố phiên mã chung và RNA polymerase để hình thành phức hợp khởi đầu phiên mã (PIC) Những biến đổi ở vùng lõi có thể ảnh hưởng lớn đến khả năng phiên mã và sự thể hiện của gen Vùng promoter cận biên và ngoại biên nằm ở phía thượng nguồn của vùng lõi và chứa các trình tự nucleotide điều hòa phiên mã khác nhau, cho phép tăng cường, ức chế hoặc hoạt hóa phiên mã tùy theo loại yếu tố và trạng thái tế bào Trong quá trình khởi đầu phiên mã, các nhân tố phiên mã gắn với các trình tự DNA đặc thù và tương tác với PIC, hình thành một phức hợp DNA–protein giúp hoạt hóa, tăng cường hoặc ức chế sự phiên mã Có thể thấy điều hòa phiên mã phụ thuộc nhiều yếu tố như hoạt động, loại, số lượng, vị trí và sự kết hợp của các yếu tố điều hòa trên promoter.
Hình 1.13 Mô hình cơ bản về cấu trúc và điều hòa phiên mã của gen mã hóa protein [79]
Các loại promoter đƣợc sử dụng trong công nghệ gen thực vật
Promoter đóng vai trò then chốt quyết định sự biểu hiện của gen biến nạp trong thực vật chuyển gen, vì vậy tùy theo mục tiêu và yêu cầu nghiên cứu cụ thể mà cần lựa chọn promoter phù hợp Hiện nay, promoter được sử dụng trong công nghệ gen thực vật có nguồn gốc từ nhiều sinh vật khác nhau như thực vật, vi khuẩn và vi rút, và được phân thành bốn nhóm chính: promoter liên tục (constitutive promoter), promoter cảm ứng (inducible promoter), promoter chuyên biệt (spatiotemporal promoter) và promoter tổng hợp (synthetic promoter).
Promoter liên tục (constitutive promoter) là những promoter luôn hoạt động, dẫn đến biểu hiện gen liên tục bất kể loại mô, tế bào, điều kiện môi trường hay giai đoạn phát triển Với đặc tính này, biểu hiện gen được ổn định và không phụ thuộc vào ngữ cảnh sinh học, giúp dự đoán và kiểm soát mức độ biểu hiện một cách đáng tin cậy Trong thiết kế hệ gene, promoter liên tục thường được dùng khi mục tiêu là duy trì mức biểu hiện gene ở mức cố định cho các ứng dụng thí nghiệm hoặc sản xuất sinh học Tuy nhiên, ưu điểm này có thể đi kèm với rủi ro làm mất cân bằng sinh học hoặc gây tác động không mong muốn nếu mức biểu hiện quá cao hoặc quá dư thừa.
Trong công nghệ sinh học thực vật, promoter đóng vai trò khởi động phiên mã cho gene mục tiêu và có thể hoạt động trên nhiều giống, loài và cả giới sinh vật khác nhau Điển hình cho sự tương thích rộng này là promoter CaMV35S của virus khảm súp lơ, promoter opine, promoter ubiquitin thực vật (Ubi) và promoter actin1 của gạo (Act-1), những promoter được ứng dụng phổ biến để điều chỉnh mức biểu hiện gene và thiết kế hệ gene cho nhiều mục đích nghiên cứu và nông nghiệp.
Nghiên c ứ u phát sinh hình thái và bi ến đổi gen đậu tương
Đậu tương là cây trồng bị ảnh hưởng lớn bởi mầm bệnh, sâu hại và stress môi trường, nên cải tạo giống nhằm nâng cao năng suất và chất lượng hạt đậu là nhu cầu thiết yếu Tuy nhiên, cải tạo giống bằng các phương pháp truyền thống gặp nhiều khó khăn do đậu tương là cây tự thụ phấn và nguồn gen hiện nay không phong phú vì hầu hết có cùng nguồn gốc chung Việc ứng dụng các kỹ thuật hiện đại như chuyển gen và lai giống được hỗ trợ bởi marker phân tử đã giúp tạo ra nhiều giống mới có đặc tính ưu việt Thực tế, phần lớn diện tích trồng đậu tương hiện nay sử dụng cây biến đổi gen.
1.3.1 Gi ớ i thi ệ u chung v ề cây đậu tương
Tên khoa học: Glycine max (L.) Merrill
Đậu tương bắt nguồn từ Trung Quốc và được trồng từ khoảng năm 1700 trước Công nguyên Ở Việt Nam, đậu tương cũng đã trồng từ hàng ngàn năm nay Do khả năng thích nghi rộng, đậu tương được trồng ở khắp nơi trên thế giới.
Hình 1.14 Cây đậu tương cung cấp chính cho toàn thế giới là Mỹ, Brazil, Argentina, Trung Quốc (hình 1.15) [94][95]
Hình 1.15 mô tả sản lượng của sáu nước có sản xuất đậu tương lớn nhất (theo tham khảo [94]) Đậu tương là cây thảo, ít phân nhánh, thân có hình trụ và nhiều lông, mang nhiều đốt, thường mọc đứng nhưng có thể bò hoặc bò nghiêng tùy điều kiện Những đặc điểm hình thái này ảnh hưởng đến phương thức canh tác và chăm sóc nhằm tối ưu hóa năng suất đậu tương.
Đậu tương có 8–14 đốt tùy theo loại hình sinh trưởng hữu hạn hoặc vô hạn Lá kép có một lá kép với 3 lá chét, đôi khi có 4–5 lá chét; lá dài và hẹp hình mác hoặc hình thoi Hoa rất nhỏ, dài khoảng 0,6–0,7 cm, màu tím, tím nhạt hoặc trắng Đậu tương là cây có hoa hoàn toàn tự thụ phấn Quả đậu tương là loại quả giáp, có nhiều lông; khi chín biến màu vàng hoặc xám Mỗi quả có từ 1–4 hạt, và khối lượng hạt rất đa dạng, từ 20–400 mg/hạt Thời gian sinh trưởng có 3 loại: chín sớm (75–85 ngày), trung bình (80–100 ngày) và muộn (110–120 ngày).
Đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, với hàm lượng protein trung bình 35–40%, lipids 15–20% và carbohydrate 15–16% tính theo trọng lượng khô Protein của đậu tương có chất lượng tốt nhất trong các protein thực vật, đầy đủ và cân đối các axit amin thiết yếu Ngoài ra, hạt đậu tương còn chứa nhiều vitamin (B1, B2, PP, A, E, K, D, C…) và khoáng chất (Ca, P, Fe…), cùng các chất chuyển hóa hoạt động sinh học như isoflavone, lecithin, tocopherol và saponin Hàm lượng dầu của đậu tương cao hơn các loại đậu khác nên được coi là nguồn dầu thực vật quan trọng Ở nước ta, đậu tương được xem là nguồn đạm và dầu thực vật chủ lực phục vụ cho dinh dưỡng và công nghiệp chế biến thực phẩm.
Đậu tương đóng vai trò cung cấp một phần nguồn đạm cho người và gia súc, góp phần cân bằng dinh dưỡng cho khẩu phần ăn Đậu tương được xem là cây lấy hạt quan trọng hàng đầu trên thế giới sau lúa mì, lúa nước và ngô, và các sản phẩm từ đậu tương được sử dụng rộng rãi ở mọi nơi trên thế giới Hiện nay, đậu tương là nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp chế biến như thực phẩm, cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo và dầu bôi trơn Mức sản xuất đậu tương trên toàn cầu đã tăng lên nhiều nhất trong số các cây trồng chính để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng Ở Việt Nam, nhu cầu về đậu tương luôn ở mức cao, do đó trong Kế hoạch phát triển nông nghiệp và nông thôn giai đoạn 2016-2020 của Chính phủ đã đặt mục tiêu đến năm 2020 đạt qui mô sản xuất với diện tích canh tác 166 nghìn ha.
265 nghìn tấn Tuy nhiên, diện tích canh tác và tổng sản lượng đậu tương đến năm
Năm 2020, diện tích và sản lượng đậu tương của Việt Nam đạt lần lượt 41,6 nghìn ha và 65,4 nghìn tấn (theo FAO) Theo số liệu của Tổng cục Hải quan năm 2017, nước ta nhập khẩu đậu tương khoảng 918,72 nghìn tấn, trị giá 391,93 triệu USD từ Mỹ, Brazil và Canada, Mỹ là thị trường cung cấp chính Như vậy quy mô sản xuất đậu tương trong nước còn thấp so với nhu cầu và mục tiêu đặt ra Việt Nam có điều kiện thuận lợi để canh tác đậu tương phục vụ nhu cầu nội địa Để phát triển bền vững sản xuất đậu tương, cần không chỉ mở rộng diện tích trong cơ cấu luân canh và cải thiện kỹ thuật canh tác, mà còn tập trung vào nâng cao hiệu quả thương mại và đặc biệt là phát triển nguồn giống mới như một nhiệm vụ hàng đầu.
1.3.2 Nghiên c ứ u phát sinh hình thái ở đậu tương
Nghiên c ứ u phát sinh hình thái ch ồ i và r ễ
Nhiều nghiên cứu về tạo chồi bất định ở đậu tương đã được thực hiện trên nhiều giống khác nhau, cho thấy nhiều loại mẫu có thể được sử dụng để cảm ứng chồi như đốt lá mầm, một nửa hạt, và các mẫu từ vùng trên và dưới lá mầm; mẫu mô phân sinh ở vùng đốt lá mầm được ghi nhận có khả năng tạo chồi tốt nhất trên hầu hết các giống Mức độ tạo chồi phụ thuộc vào nhiều yếu tố như môi trường (khoáng), chất điều hòa sinh trưởng, nồng độ chất điều hòa và đặc điểm giống đậu tương Để tạo chồi bất định, mẫu cần được kích thích bởi một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng, chủ yếu cytokinin, với các nghiên cứu so sánh hiệu quả của các loại kích thích khác nhau, dùng riêng lẻ hoặc kết hợp và điều chỉnh nồng độ để tối ưu hóa cảm ứng chồi Hầu hết các loại cytokinin như BA, TDZ, kinetin và zeatin đã được sử dụng, và đồng thời các nghiên cứu về nuôi cấy in vitro để phát triển rễ và tạo cây con hoàn chỉnh cũng được tiến hành trên môi trường có hoặc không bổ sung auxin.
Nghiên cứu tạo chồi in vitro đầu tiên ở đậu tương được thực hiện bởi Cheng và cộng sự vào năm 1980, sử dụng BA với nồng độ 5–50 μM để cảm ứng chồi từ đốt lỏ mầm của giống đậu tương, đánh dấu bước ngoặt quan trọng trong công nghệ nuôi cấy mô và nhân giống đậu tương thông qua phát triển chồi từ mô thực nghiệm.
Nghiên cứu cho thấy cách thu nhận mẫu đốt lá mầm và sự cảm ứng của BA có thể làm mẫu đốt lá mầm tạo ra nhiều chồi bất định Các nghiên cứu tạo chồi in vitro sau này hầu hết sử dụng mẫu đốt lá mầm được thu nhận theo các mô tả này Tác giả ghi nhận khả năng hình thành rễ của chồi trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng; các cây in vitro này sau đó có thể thích nghi và phát triển trong điều kiện vườn ươm.
Franklin và cộng sự (2004) nghiên cứu khả năng cảm ứng tạo chồi của BA và TDZ trên đốt lá mầm của một số giống đậu tương ở Mỹ (PNP, Dekalb, Sandusky, CNRR 279, CB 277) Ở giống PNP, kết quả cho thấy BA và TDZ khi được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp đều có khả năng cảm ứng tạo chồi khá tốt, với nồng độ được thử nghiệm khác nhau.
Trong hệ thống nuôi cấy mô, BA cố định ở 13,3 µM cho tỉ lệ mẫu tạo chồi 50%, với 3,2 chồi mỗi mẫu; nồng độ TDZ tối ưu 4,54 µM cho hiệu quả tạo chồi 68% và 7,3 chồi/mẫu Sự kết hợp 4,54 µM TDZ và 13,3 µM BA tăng khả năng cảm ứng chồi so với việc dùng riêng lẻ từng chất (84% và 19,2 chồi/mẫu) Khi áp dụng môi trường tối ưu cho các giống khác, có sự thay đổi về khả năng tái sinh nhưng hiệu quả vẫn ở mức cao (>69%) Ngoài ra, bổ sung NAA vào môi trường làm tăng đáng kể khả năng tạo rễ của chồi in vitro, với tỷ lệ chồi tạo rễ cao nhất 88,3% ở nồng độ 2,69 µM so với đối chứng không bổ sung NAA là 12,5%.
Nghiên cứu của Janani và Kumari (2013) trên giống đậu nành JS335 của Ấn Độ cho thấy TDZ và BA được dùng để cảm ứng chồi từ đốt lá mầm, với các nồng độ 5–25 µM nhằm xác định mức tối ưu Kết quả cho thấy cả BA và TDZ đều có khả năng gây cảm ứng chồi, ở nồng độ tối ưu TDZ (15 µM) cho tỉ lệ chồi 80% và 8,33 chồi/mẫu, so với BA tối ưu (15 µM) 53,3% và 4,7 chồi/mẫu; tăng nồng độ vượt mức tối ưu dẫn đến giảm khả năng cảm ứng chồi Các nghiên cứu trên các giống đậu tương Ấn Độ và Mỹ cho thấy TDZ và BA có khả năng cảm ứng chồi tốt từ đốt lá mầm, trong đó TDZ có phần hiệu quả hơn về tỉ lệ mẫu tạo chồi và số chồi/mẫu Sự khác biệt về nồng độ tối ưu TDZ giữa các giống cho thấy Mỹ (PNP) tối ưu ở khoảng 4,45 µM, trong khi giống Ấn Độ JS335 cần 15 µM; đối với BA, nồng độ tối ưu của giống Ấn Độ gần với Mỹ (13,3 và 15 µM) Các chồi từ giống JS335 Ấn Độ được nuôi trên môi trường MS bổ sung IBA ở các nồng độ 5–25 µM để cảm ứng rễ; kết quả cho thấy ở 20 µM IBA cho số rễ/chồi tốt nhất với 41,6 rễ, còn ở 25 µM IBA số rễ giảm còn 36,3 rễ/chồi.
Ma và Wu (2008) khảo sát khả năng tạo chồi từ đốt lá mầm nguyên (giữ nguyên hai lá mầm, không chẻ đôi) của một số giống đậu tương Trung Quốc (Jilin
35, Dongnong 42, Hefeng 25, Hefeng 41) cho thấy 3 mg/l BA có khả năng cảm ứng tạo chồi cao với tỉ lệ mẫu tạo chồi trung bình 97,2%, 13 chồi/mẫu Tỉ lệ mẫu tạo chồi không có nhiều khác biệt giữa các giống, tuy nhiên số chồi/mẫu thay đổi từ
Cách ti ế p c ậ n c ủa đề tài
Nghiên cứu dựa trên các thành tựu nuôi cấy mô và chuyển gen ở cây đậu tương do các tác giả trong nước và nước ngoài công bố, nhằm khai thác tiềm năng của công nghệ sinh học để cải thiện năng suất và chất lượng nông sản Đồng thời, tổng hợp astaxanthin được ứng dụng từ con đường chuyển hoá tự nhiên của cây Adonis aestivalis, mở ra cơ hội sản xuất astaxanthin từ nguồn thực vật bền vững và thân thiện với môi trường.
The proposed gene transfer strategy involves introducing three genes associated with the astaxanthin biosynthesis pathway: Zm-psy, cbfd2, and hbfd1 Zm-psy encodes the enzyme phytoene synthase, a pivotal catalyst in the early step of carotenoid biosynthesis; cbfd2 encodes carotenoid β-ring 4-dehydrogenase from Adonis aestivalis, contributing to essential ring modifications in the pathway; hbfd1 is another gene implicated in the astaxanthin production route Together, these genes are intended to enhance astaxanthin synthesis by reinforcing key enzymatic steps across the pathway.
Gen Zm-psy biểu hiện enzyme phytoene synthase, tăng cường tổng hợp phytoene và thúc đẩy tổng hợp β-carotene trong hạt đậu nành; các gen cbfd2 và hbfd1 biểu hiện các enzyme có thể sử dụng cơ chất β-carotene trong hạt đậu nành để tổng hợp astaxanthin, được tổng hợp theo trình tự công bố tại GenBank với số truy cập AY644758 và ABK41045; gen bar quy định tính kháng phosphinothricin (glufosinate) và được sử dụng như yếu tố chọn lọc mô và cây chuyển gen.
Plasmid pITB-AST là binary plasmid trong hệ thống binary của
Agrobacterium tumefaciens được sử dụng để chuyển gen vào thực vật (hình 1.16) Plasmid này có khả năng sao chép và nhân lên trong cả E coli và A tumefaciens; vùng T-DNA mang các gen tham gia quá trình chuyển gene vào cây trồng, trong khi vùng ngoài T-DNA chứa gen kháng kanamycin nptII được biểu hiện ở vi khuẩn.
Plasmid pITB-AST, kích thước khoảng 15,5 kb, T-DNA mang tổ hợp gen
P glycinin-cbfd2- T glycinin/ P glycinin-hbfd1- T glycinin/ P glycinin - ZmPsy -T glycinin và gen chọn lọc P nos-bar -T nos biểu hiện ở thực vật
P glycinin : promoter của gen mã hoá glycinin ởđậu tương.
T glycinin : terminator của gen mã hoá glycinin ởđậu tương. bar : gen quy định tính kháng phosphinothricin cbfd2 : gen mã hoá enzyme carotenoid β-ring 4-dehydrogenase ở
Adonis aestivalis hbfd1 : gen mã hoá enzyme carotenoid 4-hydroxy-β-ring
Zm-psy : gen mã hoá enzyme phytoene synthase
P nos : promoter của gen mã hoá enzyme nopalin synthase
T nos : terminator của gen mã hoá enzyme nopalin synthase
Hình 1.16 Cấu trúc plasmid pITB-AST