NGHIÊN cứu PHÁT TRIỂN bộ SINH PHẨM MULTIPLEX REALTIME PCR PHÁT HIỆN một số tác NHÂN gây NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN và KHẢO sát TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH

Nuôi cấy vi sinh vật là phương pháp phổ biến và là tiêu chuẩn vàng hiện nay để phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong máu và dịch cơ thể, tuy nhiên phương pháp này còn nhiều hạn chế như: 1 đò

H ỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUY ỄN THỊ LOAN

NGHIÊN C ỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM MULTIPLEX REALTIME PCR PHÁT HI ỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHI ỄM KHUẨN BỆNH VIỆN VÀ KHẢO SÁT TÍNH

KHÁNG KHÁNG SINH

LU ẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà N ội, 2022

H ỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý cho phép của đồng tác giả Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin đảm bảo tính khách quan và kết quả xử lý số liệu trong nghiên cứu này

Hà N ội, ngày tháng năm 2022

Nghiên cứu sinh

Nguy ễn Thị Loan

L ỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lã Th ị Huyền, Trưởng

phòng Công nghệ tế bào động vật- Viện CNSH và PGS.TS Nguyễn Minh Hiền,

Trưởng khoa Sinh hoá - Bệnh viện Thanh Nhàn là những người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu Các Cô đã chỉ bảo cho tôi nhiều ý kiến hướng dẫn qúy báu, động viên và giúp đỡ tôi giải quyết những khó khăn vướng mắc trong quá trình thực hiện luận án và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận

án này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới tập thể cán bộ nghiên cứu phòng Công nghệ tế bào động vật - Viện CNSH - Viện Hàn Lâm KH và CN Việt Nam đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các anh chị ở khoa Sinh hoá, khoa Vi sinh, khoa Hồi sức tích cực, bệnh viện Thanh Nhàn, khoa Hồi sức tích cực bệnh viện Đức Giang, đặc biệt là em Nguyễn Trọng Linh đã luôn đồng hành cùng tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô khoa CNSH - Học viện KH và CN, các thầy cô trong hội đồng nghiên cứu sinh đã nhiệt tình dạy bảo và giúp đỡ tôi, cho tôi các ý kiến quí báu để sửa chữa và hoàn thiện luận án này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi chuyên tâm làm việc và hoàn thành luận án

Cuối cùng tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, các đồng nghiệp ở Khoa Lâm trường Đại học Hoa Lư đã luôn động viên và giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và công tác

Nông-Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Tác giả

NCS Nguyễn Thị Loan

M ỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Lời cam đoan ……… i

Lời cảm ơn………

Mục lục ……… …………

ii iii Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt ……… v

Danh mục các bảng ……… ……… vi

Danh mục các hình……… viii

MỞ ĐẦU……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình và căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện … 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện …… 3

1.1.2 Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay ……… 4

1.1.3 Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ……… 7

1.2 M ột số kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện … 10

1.2.1 Cấy máu và xét nghiệm sinh hoá ……… 10

1.2.2 Kỹ thuật xác định sự có mặt của DNA ……… ……… 11

1.3 Tình hình nghiên c ứu ứng dụng multiplex realtime PCR xác định các vi khu ẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ……… 15

1.3.1 Trên thế giới ……… 15

1.3.2 Ở Việt Nam ……… 17

1.4 Kháng sinh và kháng kháng sinh ở vi khuẩn ……….………… 19

1.4.1 Kháng sinh và cơ chế tác động ……… 19

1.4.2 Kháng kháng sinh của vi khuẩn và cơ chế kháng kháng sinh ………… 21

1.4.3 Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn trên thế giới và ở Việt Nam… 28 CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đối tượng nghiên cứu ……… 35

2.1.1 Các mẫu bệnh phẩm…… ……… 35

2.1.2 Cách tính cỡ mẫu nghiên cứu ……… 35

2.2 Nguyên v ật liệu nghiên cứu ……… 36

2.2.1 Nguyên vật liệu ……… 36

2.2.2 Các thiết bị ……… 36

2.2.3 Hoá chất……… 36

2.3 Phương pháp nghiên cứu ……… …… 38

2.3.1 Nhóm phương pháp vi sinh truyền thống ……… 38

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử ……… 39

2.3.3 Phương pháp kiểm tra độ nhậy, độ đặc hiệu, độ ổn định, ngưỡng phát hiện của bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR ……… 46

2.3.4 Phương pháp thống kê ……… 48

2.4 Đạo đức nghiên cứu ……… 48

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……… 50

3.1 K ết quả phân lập các chủng vi sinh vật gây nhiễm khuẩn bệnh viện … 50

3.1.1 Kết quả phân bố xét nghiệm theo loại bệnh phẩm ……… 51

3.1.2 Tỉ lệ các loại vi sinh vật phân lập được ……… 52

3.1.3 Kết quả phân tích gen 16S rARN từ các chủng vi khuẩn phân lập …… 53

3.2 K ết quả phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR xác định đồng thời 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ……… 55

3.2.1 Kết quả lựa chọn, phân tích trình tự gen đích ……… 55

3.2.2 Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò ……… 58

3.2.3 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò với gen đích ……… 60

3.2.4 Kết quả phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn …… 71

3.2.5 Kết quả tối ưu phản ứng realtime PCR ………….……… 75

3.2.6 Kết quả xác định ngưỡng phát hiện ……… 77

3.2.7 Kết quả tạo các đối chứng dương ……….……… 78

3.2.8 Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu ……… 82

3.2.9 Kết quả xác định độ ổn định ……… 87

3.3 K ết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn nghiên cứu và gen mã hoá beta-lactamase mở rộng của vi khuẩn E coli ……… 91

3.3.1 Kết quả kháng sinh đồ ……… 92

3.3.2 Kết quả xác định gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng của E coli …… 98

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……… ……… 105

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ECDC European Centre for Disease Control and Prevention (Trung tâm

kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Châu Âu)

ESBL Extended-Spectrum Beta-lactamase (beta-lactamase phổ rộng)

FN Fall Negative (âm tính giả)

FP Fall Positive (dương tính giả)

GADPH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

MRSA Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus

MSSA Methicillin- Susceptible Staphylococcus aureus

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Tỷ lệ các tác nhân vi khuẩn gây NKBV ……… 4 Bảng 1.2 Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn thường gặp ……… 5 Bảng 1.3 Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn có tỷ lệ cao nhất … 6 Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi, mẫu dò và gen đích của các chủng vi khuẩn ……

37 Bảng 2.2 Trình tự mồi 16S rARN và gen mã hoá ESBL ……… 38 Bảng 2.3 Thành phần và chương trình chạy phản ứng PCR ……… 42 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu của

mồi và mẫu dò với DNA đích ……… 44 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu của

mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn ……… 45 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn … 45 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng realtime PCR trên mẫu chủng chuẩn ………… 46 Bảng 3.1 Tỷ lệ xét nghiệm và tỷ lệ cấy dương tính theo loại bệnh phẩm ……… 51 Bảng 3.2 Tỷ lệ phân lập vi sinh vật theo loại bệnh phẩm ……… 52 Bảng 3.3 Các mồi và mẫu dò cho phản ứng realtime PCR ……… 58 Bảng 3.4 Giá trị chu kì ngưỡng kiểm tra độ đặc hiệu của từng cặp mồi, mẫu dò với

DNA của vi khuẩn A baumannii, K pneumoniae và DNA người ……… 62 Bảng 3.5 Giá trị chu kì ngưỡng kiểm tra độ đặc hiệu của từng cặp mồi, mẫu dò

với DNA của vi khuẩn S aureus, E coli, P aeruginosa……… 64 Bảng 3.6 Giá trị chu kì ngưỡng của phản ứng multiplex realtime PCR kiểm tra

độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn A

baumannii, K pneumoniae và gen GADPH ……… 66 Bảng 3.7 Giá trị chu kì ngưỡng kiểm tra độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dò

với DNA của vi khuẩn E coli, S aureus, P aeruginosa ……… 70 Bảng 3.8 Giá trị chu kì ngưỡng của phản ứng multiplex realtime PCR trên các

chủng chuẩn A baumannii, K pneumoniae và của người (Hu) ……… 73

Bảng 3.9 Giá trị chu kì ngưỡng của phản ứng multiplex realtime PCR trên các

chủng chuẩn E coli, S aureus, P aeruginosa ……… 75

Bảng 3.10 Giá trị chu kì ngưỡng của phản ứng multiplex realtime PCR ở các nhiệt độ khác nhau ……… 76

Bảng 3.11 Giá trị chu kì ngưỡng của phản ứng multiplex realtime PCR với Master mix IDT và HQ ……… 77

Bảng 3.12 Giá trị chu kì ngưỡng của phản ứng multiplex realtime PCR với các nồng độ pha loãng ……… 77

Bảng 3.13 So sánh phương pháp multiplex realtime PCR và nuôi cấy theo mẫu bệnh phẩm ……… 86

Bảng 3.14 Kết quả phát hiện loại vi sinh vật bằng phương pháp multiplex realtime PCR so sánh với phương pháp cấy máu ……… 87

Bảng 3.15 Giá trị chu kì ngưỡng của các mẫu khảo sát thời gian bảo quản 88

Bảng 3.16 Tỷ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa và Acinetobacter sp ……… 93

Bảng 3.17 Tỷ lệ kháng kháng sinh của E coli và K pneumonia ……… 94

Bảng 3.18 Tỷ lệ kháng kháng sinh của S aureus ……… 96

Bảng 3.19 Tính nhạy cảm kháng sinh của 5 chủng E coli ……… 98

Bảng 3.20 Các mẫu E coli có mang gen ESBLs ……… 100

DANH M ỤC CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1 Định nghĩa nhiễm khuẩn bệnh viện ……….……… 3

Hình 1.2 Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn… 22 Hình 1.3 Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa các vi sinh vật……… 23 Hình 1.4 Cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn……… 23 Hình 1.5 Bản đồ về tình trạng kháng kháng sinh trên thế giới đến năm 2050 29 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu ……… 49 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc của các vi khuẩn trên môi trường thạch máu… 50 Hình 3.2 Hình ảnh khuẩn lạc của các vi khuẩn trên môi trường Chapman… 54 Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số của các chủng S aureus,

A baumannii, E coli, K pneumoniae và P aeruginosa ………… 54 Hình 3.4 Hình ảnh nhân bản gen 16S rARN từ DNA tổng số của một số

chủng vi khuẩn A baumannii và P aeruginosa ……… 55

Hình 3.5 Hình ảnh nhân bản gen 16S rARN từ DNA tổng số của một số

chủng vi khuẩn E coli, S aureus, K pneumoniae ……… 55 Hình 3.6 Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các

chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tương ứng ……… 56 Hình 3.7 Kết quả PCR nhân bản gen bla OXA -51 like của A baumannii,

gyrB của P aerruginossa, gen YccT của E coli, gen Nuc của S

aureus và gen Cyt của K pneumoniae ……… 57

Hình 3.8 Biểu đồ khuếch đại DNA của vi khuẩn (A): A baumannii, (B):

Klebsiella pneumoniae và (C): GADPH của người ……… 61 Hình 3.9 Biểu đồ khuếch đại DNA của vi khuẩn (A): S aureus, (B): E coli,

(C): P aeruginosa ……… 63

Hình 3.10 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hốn hợp mồi và mẫu dò với

DNA đích của vi khuẩn: ống đối chứng không có DNA ……… 66 Hình 3.11 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với

DNA đích vi khuẩn (A): A baumannii, (B), K pneumoniae và (C)

Hình 3.12 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với

DNA đích của vi khuẩn: ống có hốn hợp các DNA đích ………… 68 Hình 3.13 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với

DNA đích của vi khuẩn ống không có đối chứng ……… 68 Hình 3.14 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với

DNA đích của vi khuẩn ……… 69 Hình 3.15 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với

DNA đích của vi khuẩn ống có hỗn hợp các DNA đích ……… 70 Hình 3.16 Biểu đồ khuếch đại DNA của các chủng chuẩn (A): A baumannii,

(B): K pneumoniae và (C): GADPH của người … 72

Hình 3.17 Biểu đồ khuếch đại DNA của các chủng (A): E coli, (B): S

aureus và P aeruginosa ……… 74 Hình 3.18 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản gen Cyt của chủng K

Hình 3.24 Biểu đồ khuếch đại DNA của các mẫu đối chứng dương là các chủng

vi khuẩn S aureus, P aeruginosa, E coli sau thời gian bảo quản…… 89 Hình 3.25 Biểu đồ khuếch đại DNA của các mẫu đối chứng dương là các

chủng A baumannii, K pneumoniae, Hu sau thời gian bảo quản… 90 Hình 3.26 Hình ảnh kiểm tra khả năng kháng một số loại kháng sinh của 5 vi

khuẩn A baumannii, K pneumoniae, P aeruginosa, E coli và S

Hình 3.27 Hình ảnh điện di sản phấm PCR xác định gen SHV, TEM …… 99 Hình 3.28 Hình ảnh điện di sản phấm PCR xác định gen CTX-M ………… 99

ra tình trạng kháng thuốc của một số vi khuẩn và làm gia tăng việc xuất hiện những tác nhân gây bệnh mới

Tác nhân gây NKBV đã có nhiều thay đổi trong vài thập kỷ qua Các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện có thể là các vi khuẩn Gram dương và các trực khuẩn Gram âm, nấm, kí sinh trùng Trong đó NKBV do trực khuẩn Gram

âm đa kháng thuốc kháng sinh đã và đang trở thành một tai họa thực sự cho các bệnh viện Nuôi cấy vi sinh vật là phương pháp phổ biến và là tiêu chuẩn vàng hiện nay để phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong máu và dịch cơ thể, tuy nhiên phương pháp này còn nhiều hạn chế như: 1) đòi hỏi nhiều thời gian (1-5 ngày) tùy thuộc vi sinh vật gây bệnh; 2) kết quả cấy máu âm tính cũng không loại trừ được nhiễm khuẩn bệnh viện; 3) có thể không thể hiện đầy đủ cộng đồng vi sinh vật trong vết thương Việc phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân được cho là phương pháp có độ nhạy và chính xác cao, thời gian phát hiện nhanh, có ý nghĩa lớn trong chẩn đoán nhiễm khuẩn Trong

những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu sử dụng bộ sinh phẩm do nước ngoài sản xuất để phát hiện vi sinh vật trong máu và dịch cơ thể đã thu được nhiều thành công, tuy nhiên chế tạo bộ sinh phẩm để có thể chủ động trong chẩn đoán, giảm chi phí, phù hợp với hệ vi khuẩn gây bệnh ở Việt Nam là yêu cầu đối với ngành y tế Với mong muốn phát triển một bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để xác định nhanh chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện, giúp bác sĩ điều trị sớm đưa ra được quyết định phù hợp nhằm tăng cơ hội cứu sống bệnh nhân, giảm chi phí

điều trị cũng như tác dụng phụ chúng tôi thực hiện luận án: “Nghiên c ứu phát tri ển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh” với 3 mục tiêu

N ội dung nghiên cứu:

1 Nuôi cấy, phân lập các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện từ các mẫu bệnh phẩm

2 Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác nhân vi khuẩn thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: A baumannii, K pneumoniae,

E coli, P aeruginosa và S aureus

3 Xác định khả năng kháng kháng sinh của 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E coli

Tính m ới của luận án

1 Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đề xuất quy trình phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR để phát hiện đồng thời 5 vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến: A baumannii, K pneumoniae, E coli, P aeruginosa và S aureus

2 Luận án đã cung cấp các thông tin mới về tỷ lệ phân lập và tỷ lệ kháng một số loại kháng sinh của 5 vi khuẩn: A baumannii, K pneumoniae, E coli, P aeruginosa và

S aureus và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E coli tại bệnh viện

Thanh Nhàn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình và căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện

1.1.1 Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện

Trong thời kỳ trung cổ, các bệnh viện đã được thành lập để điều trị các nạn nhân bệnh dịch hạch và sau đó là các bệnh viện với các nhân viên y tế đang phục vụ

xã hội như hiện nay Năm 1869, Sir James Young Simpon đã thực hiện nghiên cứu dịch tễ học bệnh viện với hơn 4000 bệnh nhân ở Scotlen và Anh, và ông nhận thấy

tỷ lệ tử vong cao hơn ở những bệnh nhân đã được ở lại trong bệnh viện điều trị hậu phẫu Ông đã sử dụng thuật ngữ “hospitalism” cho sự rủi ro liên quan đến chăm sóc tại bệnh viện Sau nhiều năm các công trình nghiên cứu chuyên sâu của các tác giả Oliver Wendell Holmes, Ignaz Philipp Semmelweis, Louis Pasteur, Josheph Lister

và Rober Koch đã xác định được các yếu tố nguy cơ liên quan đến nhiễm khuẩn bệnh viện và giới thiệu các nguyên tắc khắc phục chính như rửa tay và khử trùng các dụng cụ trong phẫu thuật giảm sự lan truyền của bệnh và tử vong [1]

Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), nhiễm khuẩn bệnh viện được định nghĩa

như sau: “Nhiễm khuẩn bệnh viện là những nhiễm khuẩn mắc phải trong thời gian

người bệnh điều trị tại bệnh viện và nhiễm khuẩn này không hiện diện cũng như không n ằm trong giai đoạn ủ bệnh tại thời điểm nhập viện Nhiễm khuẩn thường

xu ất hiện sau 48 giờ kể từ khi người bệnh nhập viện” [2] (Hình 1.1)

Hình 1.1 Thời gian xảy ra nhiễm khuẩn bệnh viện [2]

Để chẩn đoán NKBV người ta thường dựa vào định nghĩa và tiêu chuẩn chẩn đoán cho từng vị trí NKBV Ví dụ nhiễm khuẩn vết mổ sau phẫu thuật, nhiễm khuẩn máu có liên quan đến dụng cụ đặt trong lòng mạch, nhiễm khuẩn đường tiết niệu Dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng và sinh học các nhà khoa học đã xác định có

khoảng 50 loại nhiễm khuẩn bệnh viện khác nhau có thể xảy ra tại bệnh viện

NKBV dẫn đến nhiều hệ luỵ cho người bệnh và hệ thống y tế như tăng biến chứng và tử vong cho người bệnh, kéo dài thời gian nằm viện trung bình từ 7 đến

15 ngày, tăng sử dụng kháng sinh dẫn đến tăng sự kháng thuốc của vi sinh vật và tăng chi phí điều trị [3], [4]

1.1.2 Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay

1.1.2.1 Trên th ế giới

Tại Châu Âu (2016-2017), tỷ lệ NKBV của khu vực là 6,3% trong đó các nhiễm khuẩn (NK) thường gặp nhất là: nhiễm khuẩn hô hấp (41,8%), nhiễm khuẩn tiêu hoá (20,8%), nhiễm khuẩn tiết niệu (18,4%), tiếp đến là nhiễm khuẩn sau khi phẫu thuật, nhiễm khuẩn da và mô mềm và một số nhiễm khuẩn khác [5], [6]

Theo báo cáo của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Châu Âu (ECDC), tỷ lệ các vi khuẩn gây NKBV (2017) tại một số nước Châu Âu và tỷ lệ chung cho cả khu vực [7] thể hiện trên Bảng 1.1

B ảng 1.1 Tỷ lệ các tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện [7]

Vi khuẩn Bỉ (%) Pháp (%) Ý (%) UK (%) Châu Âu (%)

Nghiên cứu tại bệnh viện Đại học Truyễn Nhiễm và bệnh Nhiệt đới Serbia,

(từ 7/2016 đến 7/2018), tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBV K pneumoniae (14%), A

baumannii (13,2%), P aeruginosa (10,8%), E coli (1,2%), S aureus (1,6%) [8]

Các nghiên cứu tại một số quốc gia về tỷ lệ mắc NKBV và loại NK hay gặp:

B ảng 1.2 Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn thường gặp tại một số

NK đường tiết niệu:14,9%

NK máu:12,8%

2016-2018 BV Đại học truyền

nhiễm và bệnh Nhiệt đới Serbia [8]

NK tiết niệu: 36,3%

NK máu: 19,6%

Viêm phổi:15,7%

1.1.2.2 T ại Việt Nam

Tình hình NK tại Việt Nam chưa được xác định đầy đủ, ít có tài liệu và giám sát về NKBV được công bố

Nghiên cứu của bệnh viện (BV) Bệnh Nhiệt đới Trung ương và VINAREX (2013) khảo sát trên 3671 bệnh nhân của 15 khoa Hồi sức tích cực tại 15 BV của 3

miền cho thấy tỷ lệ NKBV là 27,3% và tỷ lệ các loại vi khuẩn thường gặp: A

baumannii (31%), P aeruginosa (18%), K pneumoniae (12%) và S aureus (6%)

[14]

Các nghiên cứu gần đây của các BV về tỷ lệ NKBV và NK có tỷ lệ cao nhất:

B ảng 1.3 Tỷ lệ NKBV và loại nhiễm khuẩn có tỷ lệ cao nhất

2017 BV Đa Khoa Vĩnh Phúc [20] 2,7% NK hô hấp: 42%

Tỷ lệ NKBV ở Việt Nam tương đương với các kết quả nghiên cứu của WHO với qui mô vùng, quốc gia và liên quốc gia, tỉ lệ này dao động từ 2,7% đến 10% người bệnh nhập viện, trong đó các vi khuẩn gây NKBV chủ yếu là các trực khuẩn Gram âm với tỷ lệ gần 70% với các vi khuẩn: A baumannii, P aeruginosa, K

pneumoniae, E coli, các vi khuẩn Gram dương chiếm khoảng 30% chủ yếu là S

aureus

Một số nghiên cứu tại các bệnh viện về tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBV:

B ảng 1.4 Tỷ lệ vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại một số bệnh viện

BV Đa khoa Nông nghiệp (2016-2017) [19] / 13,73 11,13 25,15 24,07

Escherichia coli, Sa: Staphylococcus aureus.

1.1.3 Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện

Các tác nhân gây NKBV biến đổi theo nhóm cộng đồng dân cư, các chuyên khoa điều trị khác nhau và có sự khác nhau giữa các quốc gia

1.1.3.1 T ụ cầu Staphylococcus aureus

S aureus là vi khuẩn Gram dương hàng đầu gây nhiều bệnh khác nhau từ bệnh nhẹ về da, nhiễm trùng đa dạng ở phổi, xương, tim, nhiễm khuẩn huyết và đóng vai trò quan trọng trong NKBV liên quan đến truyền dịch, ống thở, nhiễm khuẩn vết bỏng và nhiễm khuẩn vết mổ S aureus kháng methicillin (MRSA) và S

aureus mẫn cảm với methicillin (MSSA) là nguyên nhân gây NKBV dẫn tới điều trị khó khăn [24]

Trong thập kỷ qua các trường hợp nhiễm MRSA ngày càng gia tăng, MRSA gây NKBV và NK mắc phải từ cộng đồng bao gồm viêm nội mạc tim, viêm tuỷ xương, hội chứng sốc nhiễm độc, viêm phổi, ngộ độc thực phẩm và nhọt độc [25] MRSA kháng methicillin ở tụ cầu qua trung gian PBP2a, đây là một loại protein được gọi là protein liên kết penicillin (78 kDa) Protein này có ái lực thấp với nhóm

kháng sinh β-lactam Gen femA mã hoá cho protein PBP2a kháng methicillin, do đó

gen này được sử dụng như một marker phân tử phát hiện MRSA [26], [27]

1.1.3.2 Vi khu ẩn Acinetobacter baumannii

A baumannii là cầu trực khuẩn, Gram âm, hiếu khí, không lên men glucose,

được tìm thấy phổ biến trong đất, nước và môi trường A baumannii có khả năng

thích ứng với điều kiện và môi trường sống đa dạng, tồn tại lâu trong môi trường bệnh viện, đặc biệt trên những dụng cụ y tế Nhờ khả năng tạo màng sinh học (biofilm) với tính bám dính cao, vi khuẩn A baumannii có thể gắn chặt vào bề mặt Loài này được chỉ ra là nguyên nhân gây các loại nhiễm trùng khác nhau ở bệnh viện bao gồm: nhiễm trùng do viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiết niệu [28]

Theo các công trình công bố gần đây A baumannii đã và đang trở thành vi khuẩn siêu kháng thuốc, nổi lên như tác nhân hàng đầu gây NKBV tại các bệnh viện trên thế giới Trước đây, carbapenem thường được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do A baumannii, đặc biệt đối với các chủng kháng thuốc nhưng hiện nay không còn hiệu quả bởi sự xuất hiện của các chủng đa kháng hoặc đa kháng thuốc phổ rộng Nhiều cơ chế kháng liên quan đến tính kháng carbapenem ở A

baumanniinhư sản xuất carbapenemase, bất hoạt kháng sinh, các protein màng bị biến đổi, tăng biểu hiện các bơm màng hay sự mất các kênh màng, thay đổi tính thấm của màng Tính kháng với carbapenem ở A baumannii liên quan chủ yếu tới

sự biểu hiện của β-lactamase, carbapenemase; trong khi những cơ chế khác chỉ

đóng vai trò thứ yếu Bên cạnh đó, carbapenemase phổ biến nhất ở A baumannii

là β-lactamase mã hoá bởi bla-OXA Trong một nghiên cứu của Gadsby NJ và

cộng sự (2015) đã sử dụng gen bla-OXA-51 like để phát hiện A baumannii gây nhiễm trùng đường hô hấp dưới [29]

1.1.3.3 Vi khu ẩn Klebsiella pneumoniae

K pneumoniae là vi khuẩn Gram âm, bắt màu đậm ở hai cực, vi khuẩn có nhiều hình thể, có khi như cầu khuẩn, có khi lại hình dài, có vỏ, không di động, không sinh nha bào Dễ mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường như thạch dinh dưỡng hay thạch máu, khuẩn lạc lầy nhầy, màu xám

K pneumoniae thường gây bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp, một loại vi khuẩn phát triển rất tốt trong đường hô hấp của người, là mầm “bệnh cơ hội” chiếm 10% tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện, là nguyên nhân phổ biến trong nhiễm khuẩn

đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch đồng thời là tác nhân gây bệnh chủ yếu gây nhiễm khuẩn cộng đồng [30]

Mối nguy hiểm của K pneumoniae trong các cơ sở y tế đang gia tăng do khả năng kháng kháng sinh phổ rộng beta-lactam của chúng Các nghiên cứu chỉ ra rằng

K pneumoniae kháng kháng sinh phổ rộng có xu hướng đa kháng thuốc dẫn đến khả năng thất bại trong điều trị [31] K pneumoniae đã kháng lại tất cả các loại kháng sinh bao gồm cả các kháng sinh mạnh nhất hiện nay như cephalosporin và carbapenem Gadsby NJ và cộng sự (2016) trong một nghiên cứu đã chọn gen

citrate synthase (gtlA) để phát hiện vi khuẩn này do gây nhiễm khuẩn đường hô hấp

dưới [32]

1.1.3.4 Vi khu ẩn Pseudomonas aeruginosa

P aeruginosa (Trực khuẩn mủ xanh) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng riêng

lẻ, thành đôi, có khi xếp thành chuỗi, di động nhờ một lông duy nhất ở một cực, có pili, không có bào tử, là vi khuẩn hiếu khí, phát triển tốt trên các môi trường thông thường, nhiệt độ 30 – 37oC, có thể mọc ở 42oC, pH: 7,0 - 7,2

P aeruginosa phát hiện thấy có mặt ở nhiều nơi trong bệnh viện như: nền nhà, giường, chăn, đệm, tay nhân viên y tế, dụng cụ y tế Loài này được biết thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội thường gây nhiễm khuẩn có mủ ở vết thương, vết

mổ, vết bỏng, từ vết thương vi khuẩn có thể vào máu gây nhiễm khuẩn huyết và các bệnh nhân nhiễm khuẩn do P aeruginosa thường gặp nhiều ở các khoa Hồi sức cấp cứu, khoa Bỏng, khoa Tiết niệu, khoa Chăm sóc bệnh nhân sau phẫu thuật P

aeruginosa cũng là một trong những vi khuẩn kháng kháng sinh mạnh nhất hiện nay, cũng trong cùng một nghiên cứu Gadsby NJ và cộng sự (2016) đã chọn gen mục tiêu là DNA gyrase subunit B (gyrB) để phát hiện P aeruginosa gây nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới, bởi vì gen này có tỷ lệ phát hiện cao hơn và đặc hiệu [32]

1.1.3.5 Vi khu ẩn E coli

E coli là vi khuẩn Gram âm phổ biến nhất gây nhiễm khuẩn bệnh viện và chúng được tìm thấy với tần suất cao ở nhiễm khuẩn đường hô hấp và nhiễm khuẩn

đường tiết niệu Cả hai loài E coli và P aeruginosa đều là các tác nhân gây nhiễm

khuẩn bệnh viện nghiêm trọng ở các đơn vị chăm sóc y tế và nhiễm khuẩn cộng đồng [33]

Nhiều nghiên cứu trong nước và quốc tế đã khẳng định vi khuẩn E coli gây nhiễm khuẩn chủ yếu trên đường tiết niệu, sinh dục của phụ nữ và nhiễm khuẩn vết

mổ [34]

Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) thường cư trú trên đường tiêu hóa của người và động vật đang là mối quan tâm lớn trong NKBV do có khả năng kháng cao với các nhóm kháng sinh amiglycoside, β-lactam và có khả năng truyền tính kháng qua plasmid Gadsby NJ và cộng sự (2016) đã sử dụng gen YccT để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn E coli gây nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới [32]

1.2 M ột số kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện

1.2.1 C ấy máu và xét nghiệm sinh hoá

Phương pháp này dựa vào việc nuôi cấy một mẫu máu trên môi trường giầu dinh dưỡng sau đó nhận diện và kiểm tra tính mẫn cảm của các tác nhân gây bệnh

sử dụng các xét nghiệm hóa sinh tiêu chuẩn Cấy máu hiện đang được cho là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán mầm bệnh trong nhiễm khuẩn bệnh viện Quy trình cấy máu được thực hiện trong các hệ thống khép kín có tích hợp hệ thống đo liên tục các hằng số hoá lý Sự có mặt của vi sinh vật được chỉ thị một cách gián tiếp thông qua các tham số hoá lý như độ đục, sự chuyển màu của chai nuôi cấy, sự thay đổi áp suất trong bình nuôi cấy hay sự biến đổi nồng độ CO2 [35] Theo các hướng dẫn mới nhất của các hiệp hội nghề y quốc tế có uy tín thì lượng máu lấy ra phải đảm bảo đủ cho 2 quy trình cấy máu chẩn đoán vi sinh vật hiếu khí và kị khí với thể tích mẫu bệnh phẩm cho mỗi quy trình cấy máu là 20-30 ml [36] Đây là một khó khăn khi phải tiến hành lấy một lượng máu lớn từ các bệnh nhân sơ sinh Một hạn chế khác của cấy máu đó là phải tiến hành nuôi cấy ngay khi có bệnh phẩm nhằm tránh hiện tượng dương tính giả do tạp nhiễm vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm được lưu giữ lâu Đặc biệt, quy trình thực hiện cấy máu thường kéo dài từ 48-72 giờ mới

có kết quả vì thế để khắc phục tình trạng nhiễm khuẩn bệnh nhân thường được điều

trị trước bằng kháng sinh phổ rộng nên gây ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu quả điều trị cũng như làm tăng tính kháng kháng sinh của vi sinh vật gây bệnh ở người bệnh Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ từ 14,5% đến 25% bệnh nhân được xác định nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết bằng cấy máu [37], [38]

1.2.2 K ỹ thuật xác định sự có mặt của DNA

Việc phát hiện sự có mặt DNA của vi khuẩn trong bệnh phẩm của bệnh nhân được cho là một phương pháp có độ nhậy cao, thực hiện nhanh, có giá trị hỗ trợ cho cấy máu để chẩn đoán nhiễm khuẩn Các quy trình chẩn đoán NKBV dựa trên sự có mặt của DNA vi khuẩn thường hướng tới việc phát hiện các đoạn DNA đặc trưng của loài như các đoạn riboxom 16S, 5S, 23S, các gen đặc hiệu của vi khuẩn [39]

1.2.2.1 K ỹ thuật khuếch đại DNA (Polymerase Chain Reaction -PCR)

PCR là một kỹ thuật cho phép khuếch đại các trình tự DNA đặc hiệu Mặc dù

kỹ thuật được phát minh vào năm 1985 bởi nhà hoá sinh học người Mỹ Karry Mullis và đựơc phát triển bởi Saiki và cộng sự nhưng nguyên lý của phản ứng đã được mô tả trước đó hàng thập kỷ bởi Khorana và đồng nghiệp [40] Kỹ thuật đã được ứng dụng rộng rãi rất nhiều về lĩnh vực hình sự, mô bệnh học, chấn đoán trước sinh và chẩn đoán các mầm bệnh Kỹ thuật thường được áp dụng nhất cho các phát hiện của mầm bệnh từ cấy máu dương tính [41]

Hỗ trợ cho phương pháp nuôi cấy, phương pháp PCR đã được sử dụng để phát hiện vi khuẩn trong máu [42], dịch xương khớp [43], dịch não [44], mô tim [45] và các mẫu sinh thiết mô vết thương [46]

1.2.2.2 K ỹ thuật multiplex PCR

PCR là một trong những kỹ thuật phổ biến hiện nay trong nghiên cứu và được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán Tuy nhiên PCR đơn mồi có nhược điểm là chỉ thực hiện được phản ứng riêng lẻ, chỉ phát hiện được một tác nhân vi khuẩn gây bệnh do đó sẽ mất rất nhiều thời gian để khảo sát nhiều mầm bệnh kéo theo giá thành rất cao Vì vậy để tăng cường khả năng chẩn đoán và bổ sung những hạn chế của PCR, Chamberlain và cộng sự đã mô tả và phát triển kỹ thuật multiplex PCR

vào năm 1988 [47]

Các xét nghiệm multiplex PCR cho phép phát hiện nhanh chóng các tác nhân gây bệnh trực tiếp từ máu Multiplex PCR khuếch đại nhiều DNA đích trong cùng một mẫu tại cùng một thời điểm sử dụng một hỗn hợp mồi Kỹ thuật này thường dựa trên sự khuếch đại DNA trong vùng sao chép của vi sinh vật Đây là vùng không mã hoá của DNA có vị trí giữa các gen và có tính bảo thủ cao giúp phân biệt giữa các loài vi khuẩn, nấm và các sinh vật khác

Multiplex PCR nhắm mục tiêu tới hệ gen của nhiều tác nhân gây bệnh khác nhau liên quan tới nhiễm khuẩn bệnh viện Phương pháp này có độ nhậy cao, chính xác, phát hiện được nhiều tác nhân gây bệnh trong khoảng thời gian ngắn

1.2.2.3 K ỹ thuật multiplex realtime PCR

Kỹ thuật multiplex realtime PCR cho phép phát hiện nhanh và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng

huỳnh quang trong đó sự gia tăng về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ Tuỳ thuộc vào số lượng bản DNA đích ban đầu

có trong ống phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) của các mẫu là khác nhau Dựa vào các đặc điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích có trong mẫu nghiên cứu dựa trên mẫu chuẩn đã biết rõ số lượng DNA đích ban đầu

Phương pháp realtime PCR nhanh hơn so với PCR truyền thống và không cần thao tác sau khuếch đại cho việc xác định vi khuẩn Áp dụng các phương pháp phân tử này đến nay đã được dùng trong việc phát hiện các loài vi khuẩn cụ thể từ các mô nhiễm trùng như viêm màng não do vi khuẩn Đối với các vi khuẩn gây NKBV đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng realtime PCR để xác định các đối tượng này [48], [49]

Trong phản ứng realtime PCR, người ta thường sử dụng các lại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green I) để phát huỳnh quang và các mẫu dò hoặc mồi đặc hiệu trình tự được đánh dấu huỳnh quang (Taqman PCR)

Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát tín

hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ

Các bước tiến hành để phát triển một thí nghiệm multiplex realtime PCR

 Thiết kế trình tự mồi và mẫu dò

Để thiết kế một phản ứng multiplex Taqman, trước hết cần thiết kế từng thí nghiệm Taqman đơn

Nhi ệt độ nóng chảy của mồi (Tm):

Thiết kế tất cả các mồi với nhiệt độ Tm xấp xỉ nhau (55-60oC), và tất cả các mẫu dò với nhiệt độ Tm xấp xỉ nhau (khoảng 5-10oC cao hơn mồi) Điều này quan trọng để đảm bảo rằng các bộ mồi và mẫu dò khác nhau không bổ sung lẫn nhau bởi

vì tất cả chúng đều hiện diện trong cùng một phản ứng

Chi ều dài mồi nên thiết kế để không dài quá 30 nucleotide, tỷ lệ GC trong mẫu

dò khoảng 30%-80% với C nhiều hơn G

Chương trình luân nhiệt realtime PCR dùng mồi Taqman thường chỉ có hai

giai đoạn nhiệt độ là: Biến tính 94-95oC trong 15-30 giây; giai đoạn vừa bắt cặp vừa kéo dài ở 60oC trong 30-60 giây và thiết bị realtime sẽ hoạt động ở giai đoạn này

Ở giai đoạn nhiệt độ 60oC thì mồi Taqman sẽ bắt cặp sợi đích trước vì đây

là nhiệt độ bắt cặp tốt nhất của mồi Taqman (thấp hơn Tm của mồi Taqman là

65oC-70oC, nhưng bằng hay cao hơn Tm của mồi là 55oC-60oC) rồi sau đó mồi mới bắt cặp vào Chính nhờ vậy mà khi mồi Taqman tổng hợp sợi bổ sung, enzyme này mới có cơ hội thủy giải được mồi Taqman cản đầu nó Nếu mồi bắt cặp trước vào sợi đích thì sẽ không có cơ hội để mồi Taqman bắt cặp vào sợi đích và như vậy thì mồi Taqman sẽ không thể bị thủy giải khi enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi bổ sung Do đó nên sử dụng phần mềm thương mại ví

dụ như Beacon Designer để đơn giản hoá việc thiết kế cả bộ mồi và mẫu dò cho phản ứng multiplex [50]

 Lựa chọn chất phát và hấp thụ huỳnh quang cho phản ứng multiplex

Phản ứng multiplex realtime PCR cần sử dụng các chất phát huỳnh quang khác nhau cho từng phản ứng khuếch đại riêng biệt Để phân biệt từng phản ứng,

chọn chất phát huỳnh quang với phổ kích thích cận nhau thấp nhất Chất huỳnh quang được chọn cũng cần tương hợp với đầu lọc phát quang và kích thích của thiết

bị realtime PCR Dựa trên các thông số thiết bị của đơn vị để có một danh sách các chất huỳnh quang tương ứng Ví dụ đối với phản ứng 5 mục tiêu trên hệ thống iQ5 nên sử dụng FAM, HEX, Cy5, TAMRA và Texas Red [51]

Tối ưu hóa từng phản ứng riêng lẻ trước phản ứng multiplex

Bước đầu tiên để tập hợp một phản ứng multiplex là tối ưu hoá các phản ứng riêng lẻ Xác định hiệu qủa từng phản ứng bằng cách dựng một đường chuẩn sử dụng một dãy các mẫu pha loãng Hiệu quả của phản ứng riêng lẻ cần phải từ 90-100%

 Đánh giá tính hiệu quả của phản ứng multiplex

Chạy các phản ứng singleplex và multiplex cho gen mục tiêu trên cùng một bản mẫu và so sánh giá trị chu kì ngưỡng Giá trị thu được từ một mục tiêu cho trước trong thí nghiệm đơn và đa mồi không được quá khác biệt Nếu giá trị chu kì ngưỡng từ các phản ứng đơn và đa quá khác biệt cần tối ưu hoá lại phản ứng Điều này có thể thực hiện bằng các thay đổi nồng độ của các thành phần phản ứng

 Tối ưu hóa phản ứng multiplex

Nếu một phản ứng multiplex không được tối ưu hoá, sự khuếch đại của mục tiêu có hiệu suất thấp hay số lượng ít có thể bị ức chế bởi mục tiêu có hiệu suất cao,

số lượng nhiều Điều này là do các thành phần phản ứng như DNA polymerase và nucleotide trở nên hạn chế trong các chu kỳ cuối và sự khuếch đại của mục tiêu có hiệu suất thấp, số lượng ít sẽ bị ảnh hưởng

Ưu điểm của phương pháp multiplex realtime PCR

Multiplex realtime PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng ta định lượng số bản sao khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao trên một phạm vi động học lớn Các kết quả của realtime có thể là chất lượng (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng (số bản sao DNA) Realtime PCR có thể đánh giá mà không cần điện di gen, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu được đưa vào qui trình tăng lên Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và

số liệu được đánh giá trong một hệ thống kín nên các cơ hội nhiễm bẩn được giảm thiểu

và sự cần thiết của các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ

Các báo cáo kết quả đều thống nhất chung là có thể sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn gây bệnh, các kỹ thuật này có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn so với kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật thông thường từ các 16S rARN, nhân bản, điện di trên gel và giải trình tự [52], [53]

1.3 Tình hình nghiên c ứu ứng dụng multiplex realtime PCR xác định các vi khu ẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện

1.3.1 Trên thế giới

Hiện nay, nhiều các nhà khoa học đã tập trung phát triển kỹ thuật multiplex realtime PCR trong kiểm soát các tác nhân gây nhiễm khuẩn

Kais M và cộng sự (2006) phát hiện định lượng Steptococcus pneumoniae,

Haemophilus influenza và Moaxella catarrhalis trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân

bị bệnh viêm đường hô hấp dưới bằng realtime PCR [54]

Deepa Anbazhagan và cộng sự (2011) đã xây dựng hai phản ứng multiplex

realtime PCR xác định 6 loài vi khuẩn thường gặp trong nhiễm khuẩn bệnh viện: E

coli, S aureus , S pneumoniae, Acinetobacter spp, K pneumoniae và P aeruginosa

Tác giả thiết kế multiplex realtime PCR và multiplex PCR thông thường sử dụng SYBR Green và mồi đặc hiệu với các gen như sau: đối với E coli sản phẩm gen

uidA có kích thước 556 bp, Acinetobacter spp: sản phẩm gen EFP là 422 bp,

Streptococcus pneumonia: sản phẩm gen ply có kích thước 348 bp, S aureus: sản phẩm gen sa442 có kích thước 179 bp, P aeruginosa: sản phẩm gen lasA có kích

thước 125 bp, K pneumoniae: sản phẩm gen NTRA có kích thước 90 bp Thử

nghiệm trên 300 mẫu, kết quả sử dụng phương pháp multiplex realtime PCR đạt 93,7% so với phương pháp nuôi cấy [55]

Tại Iran năm 2011, Nomanpour B và cộng sự sử dụng realtime PCR xác định

tác nhân A baumannii viêm phổi Mục đích của nghiên cứu này là để phát triển một phương pháp nhanh chóng và nhạy để phát hiện trực tiếp A baumannii từ bệnh

phẩm hô hấp Tác giả sử dụng phương pháp realtime Taqman PCR dựa trên trình tự của blaxoxa-51 được thiết kế và sử dụng để phát hiện trực tiếp A baumannii từ 361

bệnh phẩm hô hấp của bệnh nhân viêm phổi Tất cả các mẫu được kiểm tra song song với phương pháp nuôi cấy thông thường Kết quả: realtime PCR có thể phát hiện ít hơn 200 cfu vi khuẩn trong 1ml mẫu vật và kết quả hoàn toàn tương đồng với nuôi cấy (giá trị kappa 1.0, giá trị p< 0,001) Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên

đoán của realtime PCR là 100% Sự phổ biến của A baumannii ở bệnh nhân viêm

phổi là 10,53% (38/361), tỉ lệ nhiễm đa vi khuẩn được phát hiện trong 65,71% mẫu vật Nhóm tác giả nhận thấy A baumannii là tác nhân gây bệnh thứ ba trong viêm phổi bệnh viện sau P aeruginosa (16%) và S aureus (13%) tại các bệnh viện Tahran [56]

Năm 2013 tại Tây Ban Nha, Reyes MP và cộng sự đã sử dụng realtime PCR

định lượng phát hiện nhanh chóng tính kháng kháng sinh của A baumannii Tác giả

sử dụng gen ompA thực hiện trên 48 mẫu bệnh phẩm so sánh với kết quả nuôi cấy, kết quả đạt 95,8% Độ đặc hiệu (97,5%), độ nhạy (92,9%) giá trị tiên đoán dương tính - positive predictive value (95,6%) và giá trị tiên đoán âm tính - negative predictive value (96,0%) cho thấy kết quả realtime PCR là đáng tin cậy có thể phân biệt giữa chủng kháng và không kháng kháng sinh [57]

Hye-young Wang và cộng sự (2014) sử dụng multiplex realtime PCR để phát hiện nhanh các S aureus kháng methicilin từ các mẫu nuôi cấy dương tính Các tác giả đã sử dụng đầu dò TaqMan gen đích 16S rARN cho Staphylococcus spp, gen

nuc cho S aureus, và gen MecA kháng methicillin Giới hạn phát hiện của multiplex

realtime PCR là 103 CFU/ml PCR cho mỗi gen mục tiêu Multiplex realtime PCR được đánh giá trên 118 chủng phân lập từ các mẫu lâm sàng và 350 mẫu nuôi cấy liên tục Kết quả multiplex realtime PCR cho 16S rRNA là 100% (166/166 so với nuôi cấy), gen nuc là 97,2% (35/36 so với nuôi cấy) và gen mecA là 99,2% (117/118

so với nuôi cấy) [58]

Gadsby NJ và cộng sự (2015) đã phát triển hai thử nghiệm multiplex realtime PCR để phát hiện và định lượng tám mầm bệnh vi khuẩn quan trọng trong nhiễm trùng đường hô hấp dưới Các mầm bệnh này bao gồm Streptococcus

pneumoniae: Autolysin (lytA); Haemophilus influenzea: L-Fuculokinaza (fucK);

Staphylococcus aureus: nuclease bền nhiệt (nuc); Moraxella catarrhalis: protein

màng ngoài (copB); E coli: protein bảo thủ, chưa biết chức năng (yccT), K

pneumoniae: Citrate synthase (gltA); P aeruginosa: gyrase tiểu phần B (gyrB); A

baumannii; OXA-51- like β-lactamase (blaOXA- 51-like); mẫu chuẩn kiểm soát chất lượng: Glyceraldehyde-3-photphase dehydrogenase (GAPDH) [29]

Năm 2016, Gadsby NJ và cộng sự thuộc khoa Vi sinh y học, thuộc phòng thí nghiệm Y học, Bệnh viện Hoàng gia Edinburgh, Đại học Edinburgh và Đại học Cambridge Vương Quốc Anh đã sử dụng phương pháp multiplex realtime PCR chẩn đoán các vi sinh vật trong viêm phổi cộng đồng trên mẫu đờm và dịch hút phế quản của 323 bệnh nhân với 26 mầm bệnh khác nhau: Streptococcus pneumoniae;

Autolysin (lytA); Haemophilus infuenzae: L-Fuculokinase (fucK); Moraxella

catarrhalis: protein màng ngoài (copB); S aureus: nuclease bền nhiệt (nuc); E

coli: (protein bảo thủ) chưa biết chức năng (yccT); K pneumoniae: Citrate synthase

(gltA); P aeruginosa: gyrase tiểu phần B (gyrB); A baumannii: OXA-51-like lactamase ( bla OXA-51-like); Mycoplasma pneumoniae; Chlamydophila pneumoniae; Chlamydophila psittaci; Legionella pneumophila; Legionella spp;

ß-influenza A, ß-influenza B; virus hợp bào hô hấp; virus para-ß-influenza type 1-3; virus adeno; virus corona 229E ở người, HKU1, NL63 và OC43; virus metapneumo và virus rhino Kết quả phát hiện được mầm bệnh trong 87% bệnh nhân trong khi đó phương pháp nuôi cấy phát hiện được 39% Trong các mầm bệnh phát hiện được

Haemophilus infuenzae và Streptococcus pneumoniae được phát hiện là chủ yếu cùng với một loạt các tác nhân gây bệnh điển hình và không điển hình khác Virus

đã có mặt 30% trong các trường hợp; 82% trong số này là đồng thời phát hiện với vi khuẩn Trong số các vi khuẩn gây bệnh, 78% vi khuẩn phát hiện bằng realtime nhưng chỉ có 32% là dương tính với nuôi cấy với P<0,0001 [32]

1.3.2 Ở Việt Nam

Hiện tại các dự án phòng chống nhiễm khuẩn bệnh viện đang triển khai và vấn đề NKBV được tập trung nghiên cứu Trước đây đa số các nghiên cứu thực hiện theo phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống, hiện nay, đã có các nghiên cứu ứng dụng

sinh học phân tử trong việc xác định các đối tượng lây nhiễm cũng như khả năng kháng kháng sinh của chúng

Tác giả Phùng Thị Bích Thủy và cộng sự đã sử dụng bộ Kit realtime PCR đa mồi SeptiFast (Roche) trong chẩn đoán căn nguyên gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương: Áp dụng phương pháp realtime PCR đa mồi phát hiện được 43,3% dương tính trong khi phương pháp cấy máu truyền thống chỉ phát hiện

được 3,3% Tác nhân gây nhiễm trùng huyết thường gặp nhất là K pneumonia/oxytoca

có tần số xuất hiện cao nhất ở 7 bệnh nhân (23,3%), tiếp sau là Enterobacter

cloacae/aerogenes với 2 trường hợp (6,6%) thêm vào đó là các vi khuẩn và nấm khác

như: S aureus, P aeruginosa, Candida parapsilosis, Aspegillus fumigatus, Candida

albicans, E coli, Stenotrophomonas maltophilia [59]

Hiện nay phương pháp multiplex realtime PCR đã được triển khai trên nhiều loại bệnh phẩm khác nhau để chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng khác nhau như tác nhân gây viêm phổi (52 tác nhân), nhiễm khuẩn huyết (50 tác nhân), tiêu chảy (28 tác nhân), truyền qua đường tình dục (13 tác nhân), HPV (20 tác nhân), viêm màng não mủ (11 tác nhân) [60]

Gần đây, đề tài “Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm xác định vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp và phát hiện gen kháng kháng sinh”, thuộc chương trình khoa học và công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước giai đoạn 2011-2015 “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng”, chủ nhiệm đề tài là PGS.TS Lê Hữu Song, bệnh viện Trung ương Quân đội

108 với sự phối hợp của bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Nhi Trung ương, bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương Nhóm nghiên cứu đã chế tạo được bộ sinh phẩm xác định các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp: ngưỡng phát hiện trung bình của bộ sản phẩm là 10 CFU/ml máu, sau 4 tháng bảo quản, độ nhạy kỹ thuật và độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm vẫn đảm bảo 10 CFU/ml và 100% Cùng với việc đó, đã chế tạo được bộ sinh phẩm phát hiện gen kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp các họ gen sinh beta lactame phổ rộng (ESBL: CTX-M; TEM, SHV) gen kháng kháng sinh carbapenem (NDM, VIM, CMY), gen kháng methicillin (MecA)

của tụ cầu, gen kháng kháng sinh Quinolone và gen đề kháng Aminoglycosides So với phương pháp cấy máu và bộ kit thương mại trên thị trường, bộ sinh phẩm được tạo ra

có độ nhạy, độ đặc hiệu tương đương Khi kết hợp bộ sinh phẩm mới được tạo ra với cấy máu, độ nhạy đã nâng lên 54% và độ đặc hiệu vẫn đạt 100% Sản phẩm này giúp nâng khả năng chẩn đoán mầm bệnh gây nhiễm khuẩn huyết lên 15% [61]

Ngày 3/3/2020, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam công bố chính thức chế tạo thành công bộ kit chẩn đoán Virus SARS-COV-2 do nhóm nghiên cứu đứng đầu là PGS.TS Đồng Văn Quyền và PGS.TS Đinh Duy Kháng tại Viện Công nghệ sinh học thực hiện Bộ Kit chẩn đoán virus SARS-CoV-2 đã được thử nghiệm tại Viện Công nghệ sinh học Bộ kit được ngoại kiểm, đánh giá

về độ nhạy và độ đặc hiệu bởi Viện Y học dự phòng quân đội- Bộ Quốc phòng Kết quả đánh giá bước đầu cho thấy, bộ kit chẩn đoán virus SARS-CoV-2 của Viện Công nghệ sinh học có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương với bộ kit realtime RT-PCR của Tổ chức Y Tế thế giới, cụ thể: độ đặc hiệu: 100%, độ nhạy: 5 copies/phản ứng, thời gian phát hiện là 80 phút kể từ khi nhận mẫu DNA của bệnh nhân [62]

1.4 Kháng sinh và kháng kháng sinh ở vi khuẩn

1.4.1 Kháng sinh và cơ chế tác động

Kháng sinh (antibiotics) là những chất kháng khuẩn (antibacterial substances) được tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes),

có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác [63]

Hiện nay kháng sinh được mở rộng đến cả những chất kháng khuẩn có nguồn gốc tổng hợp như các sulfonamide và quinolone

Các nhóm kháng sinh được sắp xếp theo cấu trúc hoá học, từ đó chúng có chung một cơ chế tác dụng Theo cách phân loại này kháng sinh được chia thành các nhóm: nhóm beta-lactam (gồm các penicillin, các cephalosporin, các beta-lactam khác, carbapenem, monobactam, các chất ức chế beta-lactamase); nhóm aminoglycosid, macrolid, licosamid, phenicol, tetracylin, peptid, quinolone và các

nhóm kháng sinh khác [63]

Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động vào 4 thành phần cấu tạo cơ bản của tế bào và phát huy tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn, đặc biệt có hiệu quả ở các vi khuẩn đang sinh trưởng và phát triển mạnh, bằng cách:

 Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn

Các kháng sinh nhóm beta-lactam, fosformycin và vancomycin ngăn cản sinh tổng hợp lớp peptidoglycan nên không tạo được khung murein- tức là vách không được hình thành Tế bào con được sinh ra vừa không có vách vừa không sinh sản được vừa

dễ bị tiêu diệt hoặc bị li giải đặc biệt ở vi khuẩn Gram dương Như vậy những kháng sinh này có tác dụng diệt khuẩn chỉ với những tế bào đang phát triển

 Gây rối loạn chức năng màng bào tương

Chức năng đặc biệt quan trọng của màng bào tương là thẩm thấu chọn lọc, khi bị rối loạn các thành phần (ion) bên trong bị thoát ra ngoài và nước từ bên ngoài

ồ ạt vào trong dẫn tới chết, ví dụ polymicin B, colistin Với cơ chế tác động này, polimycin có tác dụng diệt khuẩn tuyệt đối tức là giết cả tế bào đang nhân lên và cả

tế bào đang ở trạng thái nghỉ (không nhân lên)

 Ức chế sinh tổng hợp protein: tham gia sinh tổng hợp protein ngoài ribosom

còn có các ARN thông tin và ARN vận chuyển Điểm tác động là ribosom 70S của vi khuẩn: tại tiểu đơn vị 30S ví dụ như aminoglycosid (nơi ARN thông tin trượt qua), tetracylin (nơi ARN vận chuyển mang axit amin tới) hoặc tiểu phần 50S (nơi axit amin liên kết tạo polypeptid) như erythromycin, cloramphenicol, clindamycin Kết quả là các phân tử protein không được hình thành hoặc được tổng hợp nhưng không có hoạt tính sinh học làm ngừng trệ quá trình sinh trưởng và phát triển

 Ức chế sinh tổng hợp axit nucleic gồm 3 cấp độ

Ngăn cản sự sao chép của DNA mẹ tạo DNA con, ví dụ do kháng sinh gắn vào enzyme gyrase làm DNA không mở được vòng xoắn như nhóm quinolon

Ngăn cản sinh tổng hợp RNA, ví dụ gắn vào enzyme ARN-polymerase như rifampicin

Ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hoá cần thiết cho tế bào: quá trình sinh

tổng hợp axit folic- coenzyme cần cho quá trình tổng hợp các purin và pirimidin (và một số axit amin) bị ngăn cản bởi sulfamid và trimethoprim [63]

Như vậy mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vị trí nhất định trong thành phần cấu tạo, ảnh hưởng đến một khâu nhất định trong các phản ứng sinh học khác nhau của tế bào vi khuẩn, dẫn đến ngừng trệ sinh trưởng và phát triển của tế bào vi khuẩn dẫn đến ngừng trệ sinh trưởng và phát triển của tế bào

1.4.2 Kháng kháng sinh ở vi khuẩn và cơ chế kháng

Kháng sinh đã được con người phát hiện và đưa vào quá trình trị liệu từ giai đoạn sơ khai của loài người Thuốc kháng sinh cơ bản đã được xác nhận bởi cơ quan quản lý của Mỹ như là loại thuốc được sản xuất bởi một loài sinh vật để ức chế sự tăng trưởng hoặc để giết chết một loài vi sinh vật khác Dưới tác dụng của kháng sinh, một số chủng vi khuẩn đã dần thích nghi và kháng lại các kháng sinh

Sự xuất hiện của các mầm bệnh kháng nhiều loại thuốc khác nhau đã làm gia tăng

lo ngại về những hậu quả và tác động của hiện tượng này lên sức khỏe con người và quá trình điều trị bệnh trên người

Sự kháng thuốc được định nghĩa là sức đề kháng của vi khuẩn đối với một tác nhân kháng khuẩn mà mà trước đây chúng chỉ biểu hiện sự nhạy cảm Đầu tiên hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn là quá trình tiến hóa tự nhiên, sau đó hiện tượng kháng thuốc ngày càng gia tăng trong các loài vi sinh vật gây bệnh bởi

sử dụng sai thuốc kháng sinh và sự lây lan toàn cầu của vi khuẩn kháng thuốc, chủ yếu ảnh hưởng đến bệnh nhân có hệ miễn dịch kém hoặc sức khỏe yếu Sự kháng thuốc đã tiêu tốn nhiều chi phí hơn trong quá trình chữa trị và trong hoạt động nghiên cứu về ngăn ngừa tình trạng kháng kháng sinh Một loạt các loại thuốc kháng sinh đã bị kháng bởi các vi sinh vật gây bệnh trong những thập kỷ gần đây,

và nhân tố kháng thuốc có thể được tạo ra và lan truyền từ vi sinh vật này sang vi sinh vật khác, từ loài vi khuẩn này sang loài vi khuẩn khác theo nhiều cách khác nhau [64]

Thông qua hoạt động chuyển gen, ví dụ integrons, nhân tố axit nucleic

(DNA) di động có thể bắt giữ và mang các gen, được vận chuyển bởi các gen nhảy (transposon), cho phép các vi sinh vật gây bệnh trao đổi cơ chế kháng kháng sinh (Hình 1.2) Một trường hợp đề kháng tự nhiên được thấy thường xuyên bởi các tỷ lệ đột biến tự nhiên trong gen nằm trên nhiễm sắc thể mà sau đó nhân tố đột biến được lan truyền bởi sự nhân lên của vi khuẩn Một trong những cơ chế kháng là sự tích hợp của DNA trên hệ gen từ vi khuẩn chết và plasmid của các tế bào sống, mà cũng

có thể xảy ra với integrons đến từ thực khuẩn thể Đột biến xảy ra tất cả các thời điểm, thay đổi nucleotid duy nhất có thể làm thay đổi gen và chuyển gen kháng lên

vi sinh vật Các plasmid từ một loại vi khuẩn, với bất kỳ integron, có thể dễ dàng chuyển sang vi khuẩn khác thông qua chuyển gen ngang bởi sự tiếp hợp [64] Thực khuẩn thể

Hình 1.2. Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn [64]

Vật liệu di truyền được trao đổi giữa các vi sinh vật qua ba tuyến đường chính: (i) Tải nạp DNA, ví dụ: từ Streptococcus mitisto sang Streptococcus

pneumoniae, (ii) Biến nạp, ví dụ kháng Methycillin trong S aureus đã được phân

lập trong các mẫu phân ở các trang trại và cơ sở giết mổ; và (iii) Sự tiếp hợp, ví dụ

là các plamid chịu trách nhiệm cho sự phổ biến toàn cầu của các gen mã hóa enzym carbapenemase hoặc β-lactamase, đặc biệt phổ biến trong các vi khuẩn Gram âm và

Tụ cầu (Hình 1.3) [65]

Hình 1.3.Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa vi sinh vật [65]

1.4.2.1 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm

Có rất nhiều cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn, trong số đó năm cơ chế thường thấy nhất là: enzym ức chế hoạt động của kháng sinh, biến đổi trong protein liên kết penicillin (PBP), đột biến Porin, bơm đẩy kháng sinh ra khỏi tế bào và thay đổi mục tiêu của kháng sinh (thay đổi thành tế bào) (Hình 1.4) [64]

Enzym ức chế hoạt động của kháng sinh

Cơ chế kháng phổ biến nhất của vi khuẩn là enzym ức chế Cơ chế này được dựa trên một số chiến lược để thay đổi cấu trúc của các hợp chất kháng khuẩn: thủy phân, một loại phản ứng xảy ra chủ yếu với các kháng sinh β-lactam; thay đổi các nhóm chức năng (acyl, phosphoryl, thiol, nucleotidil, ADP-ribosyl, glycosyl)

Hình 1.4. Các cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn [64]

Bi ến đổi các protein liên kết penicillin (PBPs)

PBPs là protein quan trọng có liên quan trong việc xây dựng các peptidoglycan, là thành phần chính của thành tế bào vi khuẩn Các enzym này xúc tác các sợi glycan và liên kết ngang giữa các chuỗi glycan Các vị trí hoạt động của sợi glycan là mục tiêu của kháng sinh β-lactam Các hợp chất này bắt chước sợi peptit đôi D-Ala-D-Ala trong peptidoglycan và tạo thành một phức acyl-enzym rất

ổn định, dẫn đến enzym bị bất hoạt Khi các PBPs thay đổi vị trí hoạt động, thì các kháng sinh β-lactam sẽ để mất hoặc làm giảm ái lực của chúng với các protein mục tiêu, dẫn đến sự kháng thuốc

Bi ến đổi Porin

Vi khuẩn Gram âm có một lớp màng bên ngoài vách tế bào, màng ngoài, trong

đó bao gồm một lớp lipid kép Các thành phần chính của lớp đôi này là lipopolysaccharide, là hợp chất kị nước nên các hợp chất ưa nước rất khó khăn để đi qua Do đó, porins hoặc porins màng ngoài (OMP), là các protein hỗ trợ trong việc thông qua các chất hòa tan thấm qua màng lipid kép Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng của thuốc để vượt qua porins, chẳng hạn như hình dạng, kích thước Có một số porins điển hình, chẳng hạn như OmpF, OmpC, và OmpE Mỗi loài vi khuẩn sản xuất các porins cụ thể, và sự mất mát hoặc giảm hoạt động của một hoặc nhiều OMP là một yếu tố góp phần phổ biến trong việc xây dựng sức đề kháng (ví dụ, mất OprD) của P aeruginosa đối với imipenem và meropenem Ở các loài khác, mất OmpF có thể dẫn đến các sinh vật kháng với nhiều loại kháng sinh (đa kháng) Trong một số chủng, sự giảm hoặc mất ái lực của thuốc với các protein (porin), dẫn đến mất khả năng để vượt qua các màng ngoài và không thể xâm nhập vào tế bào

Protein bơm

Một cơ chế hiệu quả cao của kháng kháng sinh là sự sản sinh hệ thống protein bơm kháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn Tất cả các thành viên của họ protein này bao gồm 3 dạng không thay đổi sau: Dạng A, đóng vai trò như cửa của

tế bào chất, kiểm soát sự di chuyển của các chất nền đến và đi từ các tế bào chất;

dạng B, đó là tham gia vào các khớp nối năng lượng; và dạng C, định hướng vị trí

và đề xuất hướng vận chuyển

Sửa đổi phân tử mục tiêu của các kháng sinh

Hầu hết các kháng sinh ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein đều nhằm vào các ribosome mục tiêu, và sự khác biệt giữa cấu trúc của ribosome này cho các hành động chọn lọc của thuốc kháng sinh trong vi khuẩn, vi khuẩn cổ, và các tế bào nhân chuẩn Ngay cả giữa các loài, sự thay đổi nhỏ trong cấu trúc ribosome có thể dẫn đến sự tương tác đặc hiệu mang tính chất của loài lên kháng sinh Do đó các kháng sinh nhắm vào ribosome là chất diệt khuẩn rất mạnh Tuy nhiên, qua nhiều thập kỷ sử dụng, các tác nhân gây bệnh đã trở nên đề kháng với thuốc kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein [64]

1.4.2.2 Kháng sinh nhóm beta-lactam và gen mã hoá enzyme beta-lactamase

Kháng sinh nhóm beta-lactam

Nhóm beta- lactam là một họ kháng sinh rất lớn bao gồm các kháng sinh có cấu trúc hoá học chứa vòng beta-lactam Khi vòng này liên kết với một cấu trúc vòng khác sẽ tạo thành các phân nhóm lớn tiếp theo: nhóm penicillin, nhóm cephalosporin và các beta-lactam khác: carbapenem, monobactam, các chất ức chế beta-lactamase [63]

Phân nhóm penicilin: Nhóm thuốc kháng sinh này là dẫn xuất của acid 6- aminopenicillanic và nó bao gồm kháng sinh tự nhiên (chiết xuất từ môi trường nuôi cấy Penicillium) và các chất bán tổng hợp Dựa vào phổ kháng khuẩn, kháng sinh nhóm penicillin phân loại thành các penicilin phổ kháng khuẩn hẹp, các penicilin phổ kháng khuẩn trung bình và các penicilin phổ kháng khuẩn rộng Các kháng sinh đại diện: penicillin G, methicillin, oxacillin…

Phân nhóm cephalosporin: Nhóm kháng sinh này đều là dẫn xuất của acid aminocephalosporanic Các nhóm cephalosporin được chia thành bốn thế hệ dựa vào phổ kháng khuẩn của kháng sinh Xếp theo thứ tự từ thế hệ 1 - thế hệ 4, hoạt tính trên vi khuẩn Gram âm tăng dần và vi khuẩn Gram dương giảm dần Các kháng

7-sinh đại diện thế hệ 1: cefazolin, cephalothin, cephalexin; thế hệ 2: cefuroxime, cefaclor, cefamadol, cefamycin; thế hệ 3: cefotaxime, ceftriaxone, cefpodoxim, ceftazidim; thế hệ 4: cefepim, cefpirom

Các beta-lactam khác: Gồm nhóm carbapenem có phổ kháng khuẩn rộng, đặc biệt có hoạt tính rất mạnh trên vi khuẩn Gram âm; nhóm kháng sinh monobactam có công thức phân tử chứa betalactam đơn vòng và điển hình là chất aztreonam Tác dụng của nhóm thuốc này chỉ có trên vi khuẩn Gram âm, nên vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn kị khí sẽ không có tác dụng; nhóm kháng sinh các chất ức chế beta-lactamase cũng có cấu trúc beta-lactam nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn, mà chỉ có vai trò ức chế enzym beta-lactamase do vi khuẩn tiết ra Các kháng sinh đại diện: imipenem, meropenem [63]

Gen mã hoá enzyme beta-lactamase

Theo phân loại của Ambler, beta-lactamase được chia thành 4 lớp: A, B, C,

D dựa vào sự tương đồng về trình tự axit amin Lớp A gồm các gen: SHV, TEM, CTX-M Lớp B: IMP, VIM, NDM-1 Lớp C: AmpC, CMY, FOX, MO, Lớp D: OAX [66] Cho đến nay có khoảng trên 400 gen khác nhau thuộc các họ SHV, TEM, CTX-M thể hiện tính chất kháng ß- lactam phổ rộng ngoài ra còn có hơn 300 gen thuộc họ oxacilinase như Oxa- 1, 2, 23,48, 58 mới được mô tả gần đây, nhóm sau này (nhóm oxacilinase) ngoài thể hiện tính ESBL nó còn có một phần hoạt tính carbepenemase như OXA-48, Oxa-58 Tuy nhiên các beta-lactamase được mã hoá bởi các gen blaTEM, blaSHV, blaCTX-M là phổ biến nhất ở vi khuẩn Gram âm [66] Các gen đa kháng thuốc này được truyền chủ yếu qua plasmid, transposons và intergrons Các gen này có thể truyền ngay giữa các họ vi khuẩn Gram âm dẫn đến

sự lan truyền nhanh chóng đặc tính đề kháng kháng sinh [67]

Gen mã hoá enzyme beta-lactamase lo ại TEM

TEM là enzyme beta-lactamase do gen mã hoá nằm trên plasmid đầu tiên được mô tả năm 1960 Nó có đặc tính thuỷ phân kháng sinh nhóm ß- lactam

Enzyme này được tìm thấy ở chủng E coli phân lập được trong máu một bệnh nhân

người Hy Lạp tên là Temoniera nên được gọi là TEM TEM-1 là beta-lactamase

thường gặp nhất trong các chủng trực khuẩn Gram âm TEM-2 là dẫn xuất đầu tiên của TEM-1, có sự thay thế một axit amin so với beta-lactamase nguyên thuỷ Các TEM-1 và TEM-2 gây ra tình trạng kháng với kháng sinh penicillin Các biến thể khác nhau của TEM có nguồn gốc từ TEM-1 và TEM-2 chúng được hình thành do các đột biến điểm và là sản phẩm của sự thay thế từ 1 đến 7 axit amin Các biến thể này có hoạt lực khác nhau với các cephalosporin, TEM-3 có hoạt lực mạnh chống lại cefotaxime và ceftazidim Trong khi đó TEM-10 và TEM-26 ít có hoạt lực chống lại cefotaxime và ceftriaxone Các gen mã hoá cho enzyme này có thể lan truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua trung gian plasmid và transposon Ngày nay có hơn 170 thành viên của loại emzyme này được mô tả [68], [69], [70]

Gen mã hoá enzyme beta-lactamase lo ại SHV

SHV-2 là loại ESBL được phát hiện đầu tiên trên vi khuẩn Klebsiella

ozaenae tại Đức (1983) SHV chịu trách nhiệm cho sự kháng kháng sinh ampicillin qua trung gian plasmid ở K pneumoniae Các SHV đều bắt nguồn từ SHV-1 và

được hình thành do sự đột biến điểm, đột biến mất hoặc đột biến chèn SHV-2 khác SHV-1 bởi thay thế một axit amin tại vị trí 238 (Gly238Ser), có khả năng thuỷ phân hiệu quả cefotaxime và kém hiệu quả với ceftazidim Một số biến thể của SHV-5 do thay thế glutama bằng lysin ở vị trí 240 (Glu230Lys) Ngày nay phần lớn biến thể của SHV có biểu hiện kiểu hình ESBL Tuy nhiên một biến chủng của SHV là SHV-10 lại có kiểu hình kháng chất ức chế Đây là một biến thể của SHV-5 do thay thế serin ở vị trí 130 thành glycin SHV-1 thường được tìm thấy Klebsiella và E

coli Gen mã hoá cho SHV-1 nằm trên plasmid Hiện đã phát hiện được 126 thể đột biến của SHV, trong đó thường gặp là SHV-5 và SHV-12[25,32,35] [68], [69], [70]

Gen mã hoá enzyme beta-lactamase CTX-M

Các enzyme CTX-M là loại ESBL có khả năng thuỷ phân hiệu quả cefotaxime CTX-M có khả năng thuỷ phân cephalosporin tốt hơn so với benzyl-penicillin và cefotaxime tốt hơn ceftazidim Các gen mã hoá cho CTX-M nằm trên plasmid loại IncF, loại có khả năng tiếp hợp cao có kích thước từ 50 kb đến 200 kb Gen blaCTX-M được xác định nằm dưới vùng trình tự gắn chèn ISEcpl, trình tự giúp cho gen có khả

năng chèn vào một đoạn DNA khác dễ dàng Hiện nay đã có 128 loại CTX-M được phát hiện và chia thành 5 phân nhóm, mỗi phân nhóm chứa các enzyme đặc trưng: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9, CTX-M25 CTX-M Một chủng vi khuẩn

có thể mang đồng thời CTX-M, TEM, SHV hoặc CTX-M và AmpC điều này có thể làm biến đổi kiểu hình kháng kháng sinh [69], [71]

Ngoài ra còn có các họ gen mới được mô tả gần đây như Vietnamese Extended- Beta-lactamse (VEB), Belgium Extended Beta-lactamse [72] Pseudomonas Extended Beta-lactamse, Oxacilinase (OXA), GES (Guyana Extended Beta-lactamse) [73] Trong số các họ gen và kiểu gen này thì GES và OXA là nguy hiểm hơn cả vì ngoài thể hiện tính ESBL, 2 gen này còn thể hiện tính

đa kháng và thể hiện một phần hoạt tính carbapenemase [74]

Vậy ESBLs là những beta-lactamase có khả năng tạo cho vi khuẩn kháng các kháng sinh penicillin, các cephalosporin thế hệ 1, 2, 3 và aztreonam (nhưng không kháng cephamicin hoặc carbapenem) đồng thời bị ức chế đặc hiệu bởi các tá dược dạng ức chế beta-lactamase như clavulanic axit [61]

Những nghiên cứu tại các bệnh viện gần đây cho thấy: tại bệnh viện Quân

đội Trung ương 108 (2015-2016), tỷ lệ sinh ESBL của vi khuẩn E coli tăng nhanh

năm 2015 là 26,86% thì năm 2016 là 73,14% [75] Kết quả nghiên cứu về kháng kháng sinh tại 13 bệnh viện của Việt Nam năm 2016-2017 cho thấy tỷ lệ ESBL của chủng E coli là >68%, chủng vi khuẩn này đã kháng với kháng sinh imipenem (10%), gentamycin (48%), cotrimoxazol (70%) và ciproflocaxin (68%) [76] Vì vậy việc xác định vi khuẩn E coli mang gen kháng kháng sinh ESBL nào là rất quan trọng trong quá trình điều trị bệnh nhân tại các bệnh viện, từ đó giúp bác sĩ lựa chọn kháng sinh điều trị cho phù hợp với từng bệnh nhân

1.4.3 Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn trên thế giới và ở Việt Nam

Thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu, đặc biệt là ở các nước đang phát triển với các bệnh truyền nhiễm còn chiếm tỷ lệ cao trong cơ cấu bệnh tật, là gánh

nặng thực sự vì sự gia tăng chi phí do phải bắt buộc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới đắt tiền Hiện nay tình hình gây bệnh của các vi khuẩn Gram âm

đang chiếm ưu thế (A baumannii, P aeruginosa, E coli, K pneumoniae), các vi khuẩn

này có thể sinh lactamase phổ rộng đề kháng tất cả các kháng sinh nhóm lactam trừ carbapenem nhưng đến nay một số chủng đã có khả năng tiết ra

beta-carbapenemase đề kháng carbapenem, ví dụ NDM1-New Deli Metalo-β-lactamase,

nhiều chủng là đa kháng, thậm trí một số chủng A baumannii, P aeruginosa là kháng

mở rộng hoặc toàn kháng [63]

Hình 1.5 B ản đồ về tình trạng kháng kháng sinh trên thế giới đến năm 2050 [77]

Tại Mexico (2007-2011), khi nghiên cứu về NKBV do vi khuẩn đa kháng kháng sinh cho thấy trong 266 chủng được phân lập có 105 chủng là đa kháng (39,5%) Các vi khuẩn này được phân bố như sau: Gram âm (55,6%), Gram dương (32,3%) và nấm men (12,1%) Các sinh vật thường gặp nhất là E coli (20%), S

aureus (12%), E faecium (12%), P aeruginosa (11%) và A baumannii (6%) [78]

Samuel A và cộng sự (2017) khi tiến hành giải trình tự toàn bộ hệ gen để xác định vi khuẩn Gram âm sinh ESBL ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết, cho thấy các tác nhân chính gồm: E coli (38%), P aeruginosa (19%), K pneumoniae (14%) Tỷ lệ