Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học.

Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học.Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học.Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học.Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học.Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học.Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học.Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học.Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học.Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

………

NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI RONG

SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Ở VÙNG BIỂN NHA TRANG,

KHÁNH HÒA, ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG TRONG Y DƯỢC HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

………

NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI RONG

SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Ở VÙNG BIỂN NHA TRANG,

KHÁNH HÒA, ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG TRONG Y DƯỢC HỌC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS.TS Lê Mai Hương

2 PGS TS Phan Văn Kiệm

Hà Nội - 2022

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của

GS.TS Lê Mai Hương và PGS.TS Phan Văn Kiệm Các số liệu và kết quả thu

được trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ côngtrình nào khác

Tác giả luận án

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và trân trọng nhất của

mình đến GS.TS Lê Mai Hương Viện hóa học các hợp chất Thiên nhiên và

PGS.TS Phan Văn Kiệm Viện Hóa sinh biển- những người Thầy đã luôn tận tình

giúp đỡ, hướng dẫn khoa học và định hướng nghiên cứu trong suốt quá trình tôi

thực hiện và hoàn thành luận án.

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài NĐT11.GER/16.

-Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, cùng các đồng nghiệp và các anh chị phòng sinh học thực nghiệm đã luôn ủng hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em tập trung nghiên cứu và hoàn thành luận án Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa học

và Công nghệ cùng các Thầy, Cô và các anh, chị chuyên viên ở Học Viện đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tạo những điều kiện tốt nhất cho em trong thời gian học tập

và nghiên cứu.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy, Cô ở Viện Công nghệ sinh học đã giảng dạy, cung cấp các kiến thức mới để em hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo.

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm,

hỗ trợ và động viên trong suốt thời gian qua để em có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập và công tác chuyên môn.

Em xin trân trọng cảm ơn!

Nghiên cứu sinh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

MỞ ĐẦU

1

1.1 Tổng quan về rong biển trên thế giới 4

1.2 Tình hình rong biển ở Việt nam 5

1.3 Giới thiệu về Rong Sụn 6

2.1 Vi sinh vật biển cộng sinh và các chất có hoạt tính sinh học 8

2.2 Vi sinh vật cộng sinh với rong 10

2.3.Khoa học metagenomics trong nghiên cứu khu hệ VSV liên kết 13

2.4.Sự đa dạng vi sinh vật cộng sinh với rong biển 18

2.5 Các chất có hoạt tính từ vi sinh vật liên kết với rong biển 22

2.5.1 Các chất có hoạt tính từ vi khuẩn cộng sinh trên rong 22

2.5.2 Các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm cộng sinh trên rong 27

2.6 Tiềm năng và triển vọng từ vi sinh vật liên kết với rong 32

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2 1 Vật liệu và môi trường nghiên cứu 35

2.1.1 Thu thập mẫu, các chủng vi sinh vật kiểm định và các dòng tế bào 35

2.1.2 Môi trường nghiên cứu 35

2.1.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 36

2.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 37

2.2.2 Phân lập vi khuẩn và nấm liên kết với rong biển 37

2.2.3 Định danh các chủng vi khuẩn và vi nấm tiêu biểu 38

2.2.3.1 Định danh các chủng vi khuẩn dựa vào trình tự gen 16S rARN 38

2.2.3.2 Định danh các chủng nấm dựa vào trình tự gen vùng ITS/28S rDNA 39

2.2.4 Phân tích sự đa dạng của vi khuẩn và vi nấm 40

2.2.4.1 Tách chiết DNA tổng số 40

2.2.4.2 Phân tích meta(taxo)genomic đối với quần thể vi khuẩn 40

2.2.4.3 Phân tích meta(taxo)genomic đối với quần thể Nấm 41

2.2.5 Hoạt tính đối kháng VSVKĐ của các chủng vi khuẩn và nấm phân lập 42

2.2.6.Lên men, thu nhận cao chiết dịch lên men từ các chủng lựa chọn 43

2.2.6.1 Thử hoạt tính đối kháng vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 giếng 43

2.2.6.2 Hoạt tính gây độc tế bào 45

2.2.6.3 Hoạt tính chống oxy hoá 47

2.2.7 Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng Aspergillus micronesiensis 48

2.2.7.1 Khảo sát động học của thời gian lên men 48

2.2.7.2 Khảo sát động học của nồng độ muối 49

2.2.7.3 Khảo sát động học của pH môi trường 49

2.2.8 Quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình lên men 50

2.2.9 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ 51

2.2.9.1 Phương pháp phân lập các hợp chất 51

2.2.9.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 52

PH

ẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54

3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn và vi nấm 54

3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn 54

3.1.2 Phân lập các chủng vi nấm 55

3.2 Sàng lọc hoạt tính đối kháng VSV của các chủng phân lập 56

3.2.1 Hoạt tính đối kháng VSV của các chủng vi khuẩn 56

3.2.2 Hoạt tính đối kháng VSVKĐ của các chủng vi nấm 58

3.2.3 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn và vi nấm tuyển chọn 61

3.2.3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn 61

3.2.3.2 Hình thái của chủng vi nấm lựa chọn 64

3.2.4 Phân loại các chủng vi khuẩn và vi nấm lựa chọn dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử 65

3.2.5 Đánh giá sự đa dạng và cấu trúc của quần thể vi sinh vật trên rong sụn Kappaphycus alvarezii 68

3.2.5.1 Quần thể vi khuẩn 68

3.2.5.2 Quần thể nấm 72

3.2.6 Hoạt tính sinh học từ cặn chiết thô của các chủng 75

3.2.6.1 Hoạt tính đối kháng VSV của các cặn chiết ethylacetate 75

3.2.6.2 Hoạt tính chống oxy hóa của của các cặn chiết ethylacetate 80

3.2.6.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các cặn chiết ethylaxetat 81

3.2.7 Nghiên cứu điều kiện nuôi tối ưu cho hoạt tính kháng VSVKĐ của chủng vi

nấm Aspergillus micronesiensis 84

3.2.7.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men 85

3.2.7.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối 86

3.2.7.3 Ảnh hưởng của pH môi trường 87

3.2.8 Quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình lên men 88

3.2.8.1 Phần thực nghiệm 88

3.2.8.2 Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm 88

3.2.8.3 dựng Xây mô hình kế hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quy trình 89

3.2.8.4 Tối ưu hóa các thông số công nghệ quá trình 92

3.3 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ chủng nấm

As

pergillus micronesiensis 94

3.3.1 Phân tách các hợp chất từ chủng Aspergillus micronesiensis 94

3.3.2 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân tách được từ chủng Aspergillus micronesiensis VPN1.11 96

3.3.2.1 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới) 96

3.3.2.2 Hợp chất AM8B1: Aspersiensis B (hợp chất mới) 96

3.3.2.3 Hợp chất AM8B2: Aspersiensis C (hợp chất mới) 96

Epicoccone B (5,6,7-trihydroxy-4-methyl-1(3H)isobenzofuranone) 97

epicoccolides B 97

epicoccolide A 97

3.4 Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được từ chủng Aspergillus micronesiensis 98

3.4.1 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới) 98

3.4.2. Hợp chất AM8B1: Aspersiensis B (hợp chất mới) 104

3.4.3 Hợp chất AM8B2: Aspersiensis C (hợp chất mới) 110

3.4.4 Hợp chất AM3A1: 4-hydroxybenzaldehyde 117

3.4.5 Hợp chất AM3D: (22E,24R)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22-dien-3β-ol) 118

3.4.6 Hợp chất AM4F1: 2-O-methylbutyrolactone II 122

3.4.7 Hợp chất AM6E1: 1,3-dihydro-4,5,6-trihydroxy-7 methylisobenzofuran 124

3.4.9 Hợp chất AM7H: epicoccolides B 127

3.4.10 Hợp chất AM8D: epicoccolide A 129

3.5.1 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các hợp chất 132

3.5.2.Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất 136

3.5.3 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập 138

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 141

KẾT LUẬN 141

KIẾN NGHỊ 143

CÁ

C CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 144

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

RYE

Rice yeast extract medium Môi trường gạo và dịch

chiết nấm men

ITS Internal transcribed spacer Vùng được phiên mã nội bộ

COSY

Correlation spectroscopy Phổ tương tác hai chiều

đồng hạt nhânDPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

13C-NRM 13C-Nuclear magnetic

resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhâncarbon 13

Hep-G2 Human hepatocellular

MEME Minineal essential medium with

MCF-7 Human breast carcinoma cell Tế bào ung thư vú ở người

Minimum Essential Medium Môi trường nuôi cấy tế bào

1H-NRM 1H- Nuclear magnetic

resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhânproton

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarisation TransferSpectroscopy

OTU Operational taxonomic units Đơn vị phân loại loài

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1 1 Thành phần hóa học của rong sụn[11] 8

Bảng 3 1 Đường kính vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn và vi nấm lựa chọn 61

Bảng 3 2.Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn 62

Bảng 3 3 Đặc điểm hình thái hai chủng nấm lựa chọn 64

Bảng 3 4 Chỉ số đa dạng sinh học và số OTU quan sát được thông qua phân tích metagenomic 69

Bảng 3 5 Chỉ số đa dạng sinh học và số OTU quan sát được thông qua phân tích metagenomic 72

Bảng 3 6 Hoạt tính đối kháng VSV của cặn chiết ethylacetate từ các chủng vi khuẩn và vi nấm 79

Bảng 3 7 Hoạt tính chống oxy hóa của các cặn chiết ethylacetate từ các chủng vi khuẩn và vi nấm lựa chọn 80

Bảng 3 8 Hoạt tính gây độc tế bào của cặn chiết ethylacetate từ các chủng vi khuẩn và vi nấm lựa chọn 82

Bảng 3 9 Biến mã hóa và các mức thí nghiệm 90

Bảng 3 10 Ma trận kế hoạch thực nghiệm 90

Bảng 3 11 Bảng kết quả phân tích phương sai của mô hình 91

Bảng 3 12 Phương trình hàm hồi quy 92

Bảng 3 13 Giá trị tối ưu của các yếu tố công nghệ 93

Bảng 3 14 Giá trị dự đoán và giá trị thực nghiệm của hàm mục tiêu tại điều kiện tối ưu 93

Bảng 3 15 Kết quả tối ưu hóa quá trình sử dụng phần mềm design expert 7.0 93

Bảng 3 16 Thông số vật lý và dữ liệu của 7 hợp chất từ chủng nấm Aspergillus micronesiensis 97

Bảng 3 17 Số liệu phổ NMR của AM8A1 và hợp chất tham khảo 100

Bảng 3 18 Số liệu phổ NMR của AM8B1 và hợp chất tham khảo 105

Bảng 3 19 Số liệu phổ NMR của AM8B2 và hợp chất tham khảo 111

Bảng 3 20 Số liệu phổ NMR của AM3A1 118

Bảng 3 21 Số liệu phổ NMR của AM3D và hợp chất tham khảo 121

Bảng 3 22 Số liệu phổ NMR của AM4F1 và hợp chất tham khảo 123

Bảng 3 23 Số liệu phổ NMR của AM6E1 và hợp chất tham khảo 125

Bảng 3 24 Số liệu phổ NMR của AM6E2 và hợp chất tham khảo 126

Bảng 3 25 Số liệu phổ NMR của AM7H và hợp chất tham khảo 129

Bảng 3 26 Số liệu phổ NMR của AM8D và hợp chất tham khảo 131

Bảng 3 27 Kết quả kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập được từ chủng Aspergillus micronesiensis 135

Bảng 3 28 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ chủng Aspergillus micronesiensis 137

Bảng 3 29 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập chủng Aspergillus micronesiensis 138

Bảng 3 30 Kết quả giá trị IC 50 của một số hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào .139

MỤC LỤC HÌNH

Hình 1 1: Hình ảnh hai loài rong sụn chính ở nước ta 7

Hình 1 2: Mối tương tác giữa vi khuẩn và rong biển nói riêng và vi sinh vật cộng sinh với rong biển nói chung [35] 11

Hình 1 3: Sự đa dạng vi sinh vật trên bề mặt rong biển [41] 20

Hình 1 4: Các yếu tố ảnh hưởng đến sự xâm nhập của vi khuẩn trên bề mặt rong [65] 23

Hình 1 5: Tỷ lệ các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm liên kết với các loại rong khác nhau [89] 28

Hình 1 6: Một vài hợp chất tiêu biểu có hoạt tính sinh học phân lập từ chủng nấm Aspergillus cộng sinh với rong[96, 97] 30

Hình 3 1: Đặc điểm các chủng vi khuẩn phân lập được từ rong Kappaphycus alvarezii 54

Hình 3 2: Các nhóm màu sắc khuẩn ty của chủng vi nấm phân lập từ 3 mẫu rong 55

Hình 3 3: Tỷ lệ phần trăm các chủng sinh chất có hoạt tính đối kháng các VSVKĐ 57

Hình 3 4 Số lượng vi khuẩn phân lập được có khả năng đối kháng với từng chủng VSVKĐ 57

Hình 3 5 Số lượng các chủng vi nấm sinh chất có hoạt tính đối kháng các VSVKĐ 59

Hình 3 6 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự 16S rRNA của các chủng VP02.3, VP02.11 thuộc chi Bacillus (a ) và chủng VP03.12 thuộc chi Brevibacillus và chủng VP03.6 thuộc chi Pseudomonas (b), dựa trên ITS neighbor-Joining tree 67

Hình 3 7 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự ITS của chủng VPN1.11 và VPN1.5 dựa trên cây phân loại ITS Neighbor – Joining tree 68

Hình 3 8 Phân tích thành phần chính (PCA) thực hiện trên tỉ lệ tương đối các chủng vi khuẩn 70

Hình 3 9 Cấu trúc quần thể vi khuẩn ở mức độ ngành 70

Hình 3 10 Tỉ lệ tương đối của một số chi vi khuẩn tiêu biểu ở các mẫu rong 71

Hình 3 11 Phân tích thành phần chính (PCA) 73

Hình 3 12 Cấu trúc quần thể nấm ở mức độ ngành 74

Hình 3 13 Tỉ lệ tương đối của một số chi tiêu biểu ở các mẫu rong Vân phong, Việt Nam qua phân tích metabarcoding 75

Hình 3 14 Ảnh hưởng của thời gian lên men chủng Aspergillus micronesiensis đến hàm lượng cao chiết ethylacetate thu được 86

Hình 3 15 Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường đến hàm lượng cao chiết ethylacetate thu được 87

Hình 3 16 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hàm lượng cao chiết ethylacetate thu được từ chủng Aspergillus micronesiensis 88

Hình 3 17 Bề mặt đáp ứng thể hiện tương tác đôi của các yếu tố công nghệ lên hàm mục tiêu Y 92

Hình 4 1 Cấu trúc hóa học của hợp chất AM8A1 và hợp chất tham khảo Eleganketal A 98

Hình 4 2 Các tương tác HMBC chính của hợp chất Aspersiensis A 99

Hình 4 3 Phổ CD và ECD của Aspersiensis A với các cấu hình tuyệt đối Aspersiensis A a, Aspersiensis A b, Aspersiensis A c, Aspersiensis A d . 101

Hình 4 4 Phổ HR-ESI-MS (negative) của hợp chất Aspersiensis A 102

Hình 4 5 Phổ 13 C-NMR của hợp chất Aspersiensis A 103

Hình 4 6 Phổ HMBC của hợp chất Aspersiensis A 103

Hình 4 7 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM8B1

104

Hình 4 8 Phổ ECD của hợp chất Aspersiensis B và TD-DFT của Aspersiensis B . 106

Hình 4 9 Phổ HR-ESI-MS (negative) của hợp chất Aspersiensis B 107

Hình 4 10 Phổ 1 H-NMR của hợp chất Aspersiensis B 108

Hình 4 11 Phổ 13 C-NMR của hợp chất Aspersiensis B 108

Hình 4 12 Phổ HSQC của hợp chất Aspersiensis B 109

Hình 4 13 Phổ HMBC của hợp chất Aspersiensis B 109

Hình 4 14 Phổ NOESY của hợp chất Aspersiensis B 110

Hình 4 15 Các tương tác HMBC chính của hợp chất AM8B2 110

Hình 4 16 Phổ ECD của hợp chất Aspersiensis C và TD-DFT của Aspersiensis B với các cấu hình tuyệt đối Aspersiensis B a, Aspersiensis B b, Aspersiensis B c, Aspersiensis B d 113

Hình 4 17 Phổ HR-ESI-MS (negative) của hợp chất Aspersiensis C . 114

Hình 4 18 Phổ 1 H-NMR của hợp chất Aspersiensis C 115

Hình 4 19 Phổ 13 C-NMR của hợp chất Aspersiensis C 115

Hình 4 20 Phổ HSQC của hợp chất Aspersiensis C 116

Hình 4 21 Phổ HMBC của hợp chất Aspersiensis C 116

Hình 4 22 Phổ NOESY của hợp chất Aspersiensis C 117

Hình 4 23 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM3A1 117

Hình 4 24 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM3D. 118

Hình 4 25 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM4F1 122

Hình 4 26 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM6E1. 124

Hình 4 27 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM6E2 126

Hình 4 28 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM7H 127

Hình 4 29 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất AM8D 130

MỞ ĐẦU

Rong biển là nơi cư trú của nhiều loài sinh vật như vi khuẩn, vi nấm, vi tảo,

ấu trùng giáp xác, virus, trong đó vi khuẩn chiếm chủ yếu, với mật độ 102-107

CFU/cm2 mẫu, với vi nấm khoảng 104 CFU/cm2 Vi sinh vật có thể sống trên bề mặtrong (vsv bám), hoặc sống trong các mô rong (VSV nội sinh) Các vi sinh vật đó cóvai trò khác nhau và có liên quan đến sức khỏe cây rong Chúng có thể hỗ sinh, hoạisinh, gây bệnh hoặc ôn hòa Bề mặt rong là nơi có tính cạnh tranh cao (không gian,thức ăn), khắc nghiệt (do vsv tiết chất kháng lại vi sinh hoặc do cây chủ tự sản xuấtchất tiêu diệt vsv có hại) nên các vi sinh trên rong có tính đặc thù nhất định và có cơchế đặc biệt mới tồn tại được Sự đa dạng vsv trên một loài rong nhất định phụ thuộcvào nhiều yếu tố (mùa trong năm, nhiệt độ, môi trường biển ) Như vậy có thể thấyrong là nguồn để phân lập nhiều vi sinh vật mới

Mối quan hệ giữa vi sinh vật và cây rong chủ đã được xác định Một loạt cácđặc điểm vật lý, hóa học, sinh học trên bề mặt rong được cho là có vai trò quantrọng đến số lượng cũng như thành phần vi sinh vật trên rong Các tác nhân nhưdịch tiết của rong, oxi từ rong, CO2, dịch tiết vi sinh vật, có tính chất quyết định đến

số lượng quần thể sống trên rong Rong cung cấp oxi và các chất hữu cơ, cho vi sinhvật sinh sống Trong khi đó, vi sinh vật cung cấp trở lại CO2, chất khoáng và cácchất trao đổi thứ cấp có khả năng bảo vệ rong khỏi các sinh vật gây thối, gây bệnhcho rong, các chất kích thích sinh trưởng (auxin ) Như một số vi sinh vật cố định

đạm (Agrobacterium và Rhizobium) cung cấp nguồn nitơ cho rong chủ Vi sinh vật sản

xuất chất xua đuổi các động vật ăn rong và các enzyme (peroxidase, catalase) làmtrung hòa các gốc tự do (ROS) do rong tạo ra, làm giảm thiệt hại cho rong Các chấthữu cơ, chất trao đổi thứ cấp ở rong cũng có tác dụng lựa chọn các loài vsv nhất địnhsống trên chúng, đảm bảo lợi ích cho rong Một số vi khuẩn oxi hóa amonium đượcphát hiện trên rong với số lượng tương đối nhiều, có vai trò giải độc nitrat cho rong.Như vậy có thể thấy mối quan hệ hỗ sinh giữa rong và vi sinh vật thể hiện ở chỗrong cung cấp các chất dinh dưỡng hữu cơ cho vi khuẩn có lợi, mặt khác, vi khuẩnsản xuất chất kháng sinh tiêu diệt hoặc làm giảm sự cố định của các vi khuẩn có hại,gây bệnh cho rong chủ Theo nhiều công bố, có từ 30-50% vi khuẩn trên rong cókhả năng sản xuất chất đối kháng vi sinh vật, tỷ lệ này cao hơn rất nhiều so với tỉ lệ

vi sinh vật sống tự do trong nước biển hoặc bùn đáy (<10%)

2Ngoài vi khuẩn sống trên rong, nấm men và nấm mốc cũng thường đượcphân lập và nghiên cứu Tuy mật độ nấm được cho là thấp hơn so với vi khuẩn,nhưng chúng cũng thể hiện sự đa dạng cao về loài.

Việt Nam là nước nhiệt đới, có nguồn tài nguyên sinh vật, đặc biệt vi sinh vậtrất phong phú và đa dạng Để sinh tồn, vi sinh vật có nhiều cơ chế sinh lý, sinh hóakhác nhau nhằm thích nghi với môi trường sống đặc biệt và khắc nghiệt Sự cạnhtranh bằng việc sản xuất các chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt hợp chất đối kháng lạihoặc xua đuổi các vi sinh vật khác được coi là phổ biến và hiệu quả Ở nước ta,chưa có nhiều các báo cáo, công bố nghiên cứu về hệ sinh thái vi sinh vật vùngtrồng rong, trên cây rong Việc nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá các chủng visinh vật sống bám trên rong, từ đó đưa ra các biện pháp cần thiết và hữu ích nhằmbảo tồn phát triển hệ sinh thái rong biển bền vững, hiệu quả… Xuất phát từ thựctiễn trên, nhằm khảo sát đặc điểm, sự đa dạng các vi sinh vật và hoạt tính sinh học

từ các vi sinh vật sống bám trên rong, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha trang, Khánh hòa, định hướng sử dụng trong y dược học”.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài:

Mục tiêu nghiên cứu:

Đánh giá sự đa dạng của vi sinh vật liên kết với rong Kappaphycus alvarezii

theo phương pháp nuôi cấy được và không thông qua nuôi cấy metagennomic (nấm

và vi khuẩn), phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất có hoạttính sinh học (kháng sinh, gây độc tế bào, chống oxy hóa) từ chủng có hoạt tính sinhhọc cao

Nội dung nghiên cứu.

1 Phân lập, sàng lọc một số chủng vi khuẩn và vi nấm có hoạt tính kháng

sinh liên kết với rong Kappaphycus alvarezii ở vịnh Vân Phong Khánh Hòa.

2 Nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn và vi nấm trên rong biển bằng phương pháp sinh học phân tử (16S với vi khuẩn 18S với vi nấm) trên các mẫu thu thập

3 Lên men, đánh giá hoạt tính sinh học các chủng vi khuẩn và vi nấm sống liên kết với rong có hoạt tính sinh học tiêu biểu ở vịnh Vân Phong, Khánh Hòa

4 Nghiên cứu điều kiện lên men rắn thích hợp cho chủng vi nấm tiêu biểu tạo ra các chất có hoạt tính sinh học cao, tối ưu hóa quá trình lên men

5 Phân lập, tinh sạch, xác định cấu trúc hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học

3của các hợp chất phân lập.

Những đóng góp mới của luận án:

1 Đây là công trình đầu tiên kết hợp sinh học phân tử hiện đại metagenomicvới phương pháp nuôi cấy truyền thống để phân tích, so sánh và đánh giá sự đa

dạng cũng như chức năng của VSV lên cây rong chủ (Kappaphycus alvarezii) ở

Việt Nam

2 Đã đánh giá được sự đa dạng của quần thể vi khuẩn và vi nấm trên loài

rong Kappaphycus alvarezii dựa vào phương pháp giải trình tự gen và phân tích

metagenomics

3 Đã tách chiết và xác định được công thức hóa học của 10 hợp chất từ chủng

vi nấm Aspergillus micronesiensis, có hoạt tính kháng sinh, hoạt tính gây độc tế bào,

chống oxy hóa Trong 10 hợp chất phân lập được có 3 hợp chất mới là; Aspersiensis

A (AM8A1): Aspersiensis B (AM8B1): Aspersiensis C (AM8B2) và 07 hợp chất AM3A1 (4-hydroxybenzaldehyde), AM3D: (22E,24R)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-

cholesta-6,22- dien-3β-ol), AM4F1: 2-O-methylbutyrolactone II, AM6E1: 4,5,6- trihydroxy-7-methylisobenzofuran, AM6E2: Epicoccone B (5,6,7-trihydroxy-4- methyl- 1(3H)-isobenzofuranone), AM7H: epicoccolides B, AM8D: epicoccolide A.

1,3-dihydro-Các hợp chất này là lần đầu tiên được phân lập từ chủng nấm Aspergillus micronesiensis liên kết với rong Kapapphycus alvarezii.

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về rong biển trên thế giới.

Rong biển là đối tượng nuôi trồng thủy sản quan trọng được trồng rộng rãi trênthế giới Theo tài liệu của FAO (2014), rong biển được trồng ở 33 quốc gia và lục địatrên thế giới Các quốc gia trồng rong biển trọng điểm của thế giới chủ yếu tập trung ởchâu Á bao gồm Trung Quốc, Indonesia, Philippine, Malaysia, Hàn Quốc, Nhật Bản,Tanzania và Solomon Đặc biệt làTrung Quốc và Indonesia là hai quốc gia trồng rongbiển nhiều nhất, chiếm 81,4% tổng sản lượng rong biển thế giới [2]

Sản lượng rong biển nuôi trồng thế giới trên liên tục tăng, đặc biệt là nhữngthập kỷ gần đây Năm 1990, sản lượng rong biển nuôi trồng cả thế giới khoảng 3,76triệu tấn tươi Đến năm 2000, sản lượng này là 9,3 triệu tấn tươi và tăng lên 19 triệutấn vào năm 2010 Như vậy, chỉ trong vòng 2 thập kỷ (1990-2010), sản lượng rongbiển nuôi trồng trên thế giới đã tăng khoảng 5 lần Gần đây, năm 2012, sản lượngrong biển trồng trên thế giới là 23,8 triệu tấn tươi Rong biển khai thác tự nhiên cósản lượng là 1,1 triệu tấn tươi tương đương 4,6% sản lượng rong trồng thương phẩm(FAO, 2014) Trong những năm tới, sản lượng rong biển nuôi trồng dự báo sẽ tiếptục tăng lên để đáp ứng nhu cầu nguyên liệu cho phát triển công nghiệp sản xuấthàng hóa và cả thiện chất lượng môi trường [3, 4]

Bên cạnh các nước có nghề trồng rong phát triển như Trung Quốc, Nhật Bản,Philippin, Hàn quốc, Triều Tiên, Chile, Malaysia, Tanzania, Indonesia, Kiribati,hiện nay nghề trồng rong đã phát triển tại hơn 20 nước khác Sản lượng rong hàng

năm trên thế giới là hơn 140.000 tấn khô (trong đó rong sụn Kappaphycus và rong câu Gracilaria là chủ yếu) [5].

Mặc dù rong biển thế giới rất đa dạng (có tới 10.000 loài đã được phân loại(www.algaebase.org), nhưng số rong biển có thể nuôi trồng khá khiêm tốn TheoTitlyanov và Titlyanova (2010), có 17 chi rong biển đang được nuôi trồng trên thế giới

bao gồm: Agardhiella, Eucheuma, Gelidium, Gigartina, Gracilaria, Hydropuntia, Hypnea, Kappaphycus, Meristotheca, Porphyra (ngành rong đỏ- Rhodophyta); Saccharina, Laminaria, Undaria, Cladosiphon (ngành rong nâu- Phaeophyta), Monostroma, Ulva, và Caulerpa (ngành rong lục- Chlorophyta) Trong đó, các chi Agardhiella, Gelidium, Gigartina, Porphyra, Saccharina, Laminaria, Undaria, Monostroma, và Ulva được trồng chủ yếu ở vùng ôn đới, Eucheuma, Gracilaria,

Hydropuntia, Hypnea, Kappaphycus, Cladosiphon, và Caulerpa được trồng chủ yếu ở

vùng nhiệt đới và á nhiệt đới

Theo thống kê của FAO (2014), năm nhóm rong biển trồng phổ biến nhất

hiện nay là rong sụn Kappaphycus alvarezii và Eucheuma spp., rong bẹ Nhật Bản (Laminaria japonica), rong câu (Gracillaria spp.), rong bẹ Udaria pinatifida và rong mứt (Porphyra spp.) Trong các nhóm này, nhóm rong sụn có sản lượng trồng

nhiều nhất (khoảng 8,2 triệu tấn tươi chiếm 34,5% tổng sản lượng rong biển toàncầu) sau đó là rong bẹ Nhật Bản và rong câu với sản lượng lần lượt là 5,8 và 2,85triệu tấn tương đương 24,4% và 12% tổng sản lượng rong biển toàn cầu

1.2 Tình hình rong biển ở Việt nam

Với chiều dài hơn 3.260 km, diện tích hơn một triệu km2, vùng biển nước tađược đánh giá là một trong 16 trung tâm đa dạng sinh học cao của thế giới Vì vậy,công tác điều tra, nghiên cứu môi trường và tài nguyên sinh vật biển là vấn đề cầnđược quan tâm nhiều

Việt Nam có lợi thế và tiềm năng to lớn (gần 100 loài rong kinh tế phân bố

và diện tích trồng rong tiềm năng khoảng 900.000 ha) để phát triển rong biển thànhngành sản xuất chủ lực trong tương lai Hiện nay, 07 loài rong kinh tế (Rong nho

- Caulerpa lentillifera, Rong câu chỉ vàng - Gracilaria tenuistipitata, Rong câu thắt

Gracilaria firma, Rong câu cước Gracilariopsis bailinae, Rong sụn Kappaphycus alvarezii, Rong bắp sú - Kappaphycus striatus, Rong sụn gai - Eucheuma denticulatum) đang được trồng phổ biến ở Việt Nam [6, 7, 8].

-Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản năm 2022, hiện diện tích tiềm năng trồngrong sụn cả nước khoảng 900 nghìn ha (tương đương 600 - 700 nghìn tấn rongkhô/năm) Trong số hơn 800 loài rong biển, 90 loài có giá trị kinh tế Năm 2020,diện tích trồng rong biển đạt khoảng 15.000 ha, sản lượng 135.000 tấn Trong đó,lợi nhuận rong nho khoảng 150 triệu/ha và rong sụn khoảng 60 triệu/ha

Rong biển được nuôi trồng tập trung ở các vùng ven biển gồm Bắc Bộ gần6.600 ha, Bắc Trung Bộ hơn 2.000, Nam Trung Bộ 1.400ha, Đồng bằng sông CửuLong 100ha Tại Việt Nam đã xác định được 833 loài rong biển với trữ lượng tựnhiên 80 - 100 tỷ tấn, thuộc 4 ngành, gồm ngành rong Đỏ (415 loài và biến loài),ngành rong Nâu (147 loài và biến loài), ngành rong Lục (183 loài và biến loài) vàngành rong Lam (88 loài và biến loài) [9]

1.3 Giới thiệu về Rong Sụn

Rong Sụn tên thương mại là Cottonii, bao gồm hai loài chính là:

Kappaphycus alvarezii và Kappaphycus striatum, nguyên liệu chính cho chế biến

kappa- carrageenan được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực kinh tế như chế biếnthực phẩm, y dược, mỹ phẩm, đệt may, [10]

Đặc điểm sinh học của Rong Sụn

Rong Sụn là loại rong biển nhiệt đới có một số đặc điểm sinh học chính nhưSau: Hình thái cấu tạo Rong Sụn có thân dạng trụ tròn đường kính có thể đạt 20

mm, nhiều trục chính, mọc lên từ bàn bám dạng đĩa Những trục chính mới có thểmọc từ cùng gốc với trục chính ban đầu hay ngay từ trên trục chính, ở dưới phầngốc của trục chính ban đầu Nhánh dạng trụ tròn hình thành ngay gần gốc thân, lúcđầu chia không quy luật hoặc một bên, sau đó mọc và uốn cong theo hướng ánhsáng và thân chia nhánh phát triển thành bụi rậm, thể chất trơn nhớt keo sụn, có màunâu xanh [11]

Loài Kappaphycus alvarezii.

Rong thô, đòn như sụn Thân rong hình trụ, có màu xanh đến màu nâu đỏ, mọc đứng, cao 20-60cm, với đường kính của thân chính và nhánh 1-2cm Phân nhánh thưa Khoảng cách giữa hai lần phân nhánh từ 4-10cm Nhánh chót hơi cong, dài 5- 15cm, thon dần về ngọn Khi mọc ở vùng nước có đòng chảy tốt cây rong phát triển dài có thể tới 2m/cá thê, trọng lượng cá thẻ từ 20-56 kg/cá thể Nhánh thường có đường kính lớn (trung bình 2,5mm), thon dần về phía đỉnh nhánh

Thường không có hoặc ít nhánh thú cấp Nhánh cong, phình rộng, thon dần và kéo

dài (hình 1A) [11] Loài Kappaphycus striatum.

Rong thô, sằn sùi, cao 20-25cm, màu nâu đen đến nâu đỏ Phân nhánhdày,the kiêu đối nhau, mọc vòng, chạc hai không đều Khoảng cách giữa hai lầnphân nhắn ngắn từ 1-3cm, nhánh chót ngắn, đầu cùn hoặc tròn (hình 1B) Nhìn trên

bề mặt cắt ngang thân: Kích thước tế bào từ lớp vỏ vào lớp lõi tăng Lớp vỏ baogồm 2-3 lớp tế bào chứa sắc tố, hình bầu dục, đường kính 7-10um Lớp nhu môngoài gồm 7-10 lớp tế bào hình bầu dục hoặc hình cầu đường kính 124 250um, váchdày 10-15uùm Lớp nhụ mô lõi bao gồm những tế bào lớn xen kế với những sợitrục, đường kính 25- 30um, với vách dày 10-15pnm [11]

Phân bố, sinh

học

Hình 1 1: Hình ảnh hai loài rong sụn chính ở nước ta

Trong tự nhiên Rong sụn mọc bám trên các vật bám cứng có chất vôi (trênrạn san hô chết hoặc trên đá), phân bố chủ yếu ở phần trên của vùng dưới triều(ngay bên dưới của mực chiều thấp), nơi nước chảy nhẹ đến vừa phải

Phân bố: Rong Sụn là loại rong biển nhiệt đới, trong tự nhiên nó phân bố chủyếu ở vùng biển nhiệt đới trong khu vực Châu Á và Tây Thái Bình Dương, đặc biệt

phô biến ở vùng biên một số nước Đông Nam Á (Philippines, Indonesia,Maylaysia ) Là loại rong hẹp muối, chỉ sinh trưởng và phát triển tốt ở độ mặn

Kể từ khi du nhập vào Việt Nam năm 1993, rong sụn Kappaphycus alvarezii

thích hợp với khí hậu nhiệt đới Việt Nam, đặc biệt là ở các tỉnh miền Trung và hiệnnay được nuôi trồng tại Đà Nẵng, Quang Nam, Ninh Binh, Phú Yên, Khanh HòaKiên Giang …Rong có thể được trồng quanh năm

Thành phần hóa học cúa Rong Sụn

Thành phần hoá học của Rong Sụn luôn thay đôi phụ thuộc trạng thái sinh lý,thị gian sinh trưởng, điều kiện sống (cường độ bức xạ, thành phần hoá học của môi

trường) Trong Rong Sụn hàm lượng nước chiếm 77-91% còn lại vài phần trăm chấtkhô Trong chất khô chứa chủ yếu là gluxit, protein, chất khoáng, lipit, sắc tố, cácenzyme [12, 13].

Bảng 1 1 Thành phần hóa học của rong sụn[11]

Thành phần hóa học Tỉ trọng khối lượng (% chất khô)

ồn định các tinh thể để ngăn chặn đường hoặc nước đá khỏi kết tỉnh lại Do vậy màcarrageenan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, dượcphẩm, công nghệ sữa, y dược học, trong xử lý môi trường nuôi tôm cá và trong một

số ngành công nghiệp thực phẩm khác [15, 16, 17, 18, 19, 20]

2.1 Vi sinh vật biển cộng sinh và các chất có hoạt tính sinh học

Nghiên cứu về các vi sinh vật cộng sinh là một lĩnh vực phát triển nhanhchóng như theo một số báo cáo gần đây cho thấy rằng, một số chất chuyển hóa thuđược từ rong, san hô, bọt biển và động vật không xương sống có thể được sản xuấtbởi các vi sinh vật cộng sinh với chúng [21, 22, 23] Các vi khuẩn cộng sinh đượcbiết đến với rất nhiều các hoạt tính sinh học đa dạng bao gồm cả những yếu tố chứcnăng [23] Gần đây, Baker và cộng sự (2009) đã thực hiện một nghiên cứu nhằm

phân lập và xác định sự đa dạng của chủng nấm từ loài bọt biển H simulans Họ đã

sử dụng kết hợp phương pháp nuôi cấy truyền thống và kỹ thuật hiện đại để địnhdanh và xác định các hoạt tính kháng sinh, kết quả họ đã được phân lập được 19

kiểu gen khác nhau thuộc về các chi Agaricomycotina, Mucoromycotina, Saccharomycotina, và Pezizomycotina; một số chủng này cho thấy sự ức chế một số

vi khuẩn là Escherichia coli, Bacillus sp, Staphylococcus aureus, và Candida glabrata [24] Vi khuẩn liên kết

với bọt biển là một hình thức tương tác hóa học và là nguồn tài nguyên sinh tháitiềm năng cung cấp các hợp chất tự nhiên một cách bền vững để phát triển nguồndược phẩm mới [25, 26].

Theo đánh giá Rateb và cộng sự (2011), các chất thứ cấp từ nấm biển cónguồn gốc rong/tảo biển là chiếm đa số (21%), tiếp sau là bọt biển (19%), cây đướcbiển (16%) v.v… Chính vì vậy, nguồn chất có hoạt tính sinh học từ các vi sinh vật

có liên quan tới rong/tảo biển được cho là rất có tiềm năng Trong đầm nuôi rong

sụn Kappaphylus alvarezii bị nhiễm bệnh Theo như Masuda (1997a; 1998) thấy rằng loài tảo đỏ sống cộng sinh Laurencia majuscule vẫn phát triển tốt bởi chúng

sản sinh 4 chất kháng sinh chống lại vi sinh vật gây bệnh trắng nhũn ở rong Cáckháng sinh là elatol (1), iso-obtusol (2), 10,15-dibromo-9-hydroxy-chamigra-1,3(15),7(14)-triene

(3) và (E)-10-15-dibromo-9-hydroxy-chamigra-1,3(15),7(14)-triene (4) [27]

Một chủng nấm có nguồn gốc từ biển M-3, phân lập từ rong đỏ Porphyra yezoensis được sàng lọc hoạt tính kháng nấm (MIC-0.36 µM) với chủng Pyricularia oryzae theo Byun et al (2003) Kết quả là, đã phân lập được một Diketopiperazine mới

từ chiết xuất môi trường lên men của chúng nấm [28] Một nghiên cứu năm 2004, báo

cáo chỉ ra bằng cách chiết xuất butanolic từ dịch nuôi cấy chủng Pseudoalteromonas issachenkonii liên kết trên một số loài rong biển cho hoạt tính tan huyết và ức chế sự phát triển của nấm Candida albicans Phân tích hóa học sâu hơn với chiết xuất etyl

axetat cho thấy cấu trúc hóa học cho hoạt tính kháng nấm là Isatin (indole-2,3-dione)[28]

Ngoài giá trị sinh thái lớn từ môi trường sống, các rạn san hô là môi trường

cư trú cho nhiều loài nhất trong các đại dương, chứa một lượng lớn các loài vi sinhvật và là một nguồn giàu hợp chất sinh học mới chưa được khám phá [28] Vi khuẩnliên kết với các loài san hô biển cũng được biết đến với rất nhiều hoạt tính sinh họctiềm năng [30] Hơn 20 năm trước, Tapiolas và đồng nghiệp (1991) đã phân lập và

phân tích đặc tính hai hợp chất mới đó là Octalactin A và B từ Streptomyces sp ở

biển,

được phân lập từ bề mặt của một loài san hô sừng không xác định thuộc chi

Pacifigorgia Báo cáo của họ cho thấy hợp chất Octalactin – cho kết quả gây độc tế

bào mạnh đối với u ác tính B-16-FlO và các dòng tế bào khối u HCT-116 có giá trịIC50 là 0,0072 và 0,5 µg / mL tương ứng [31]

Theo một số nghiên cứu gần đây đã báo cáo từ canh trường nuôi cấy của

chủng Bacillus amyloliquefaciens SCSIO 00856 cộng sinh với loài san hô sừng từ

miền Nam Trung Quốc có biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với

Escherichia coli, Bacillus subtilis, và Staphyloccocus aureus và hoạt tính kháng ấu trùng bryozoan Bugula neritina Họ đã xác định được cấu trúc của hợp chất mới 24

vòng lacton là Macrolactin V từ môi trường nuôi cấy [32]

Một số loài vi khuẩn biển được biết đến như là loài di cư của các sinh vật biểncũng đã được báo cáo có tiềm năng kháng khuẩn Trong một báo cáo, 42 chủng vi

khuẩn biển phân lập cho thấy hoạt tính kháng khuẩn ở các chi Alteromonas, Pseudomonas, Bacillus và Flavobacterium [33] Một nghiên cứu tiến hành tại Hoa Kỳ

vào năm 2002 đã công bố 5 hợp chất tự nhiên mới, Phomadecalins A, B, C và D, và

Phomapentenone A, được phân lập từ dịch chiết môi trường của chủng Phoma sp (NRRL 25697) là một loại nấm dạng bào tử được phân lập từ Hypoxylon sp Các hợp

chất này có cấu trúc đặc trưng và bốn hợp chất (phomadecalins A – D) được tìm thấy

có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram dương, Bacillus subtilis (ATCC 6051) và Staphylococcus aureus (ATCC 29213) [34].

2.2.Vi sinh vật cộng sinh với rong

Mối quan hệ mật thiết giữa vi khuẩn và rong biển trong đó rong biển cungcấp chất dinh dưỡng, trong khi cộng đồng vi khuẩn thúc đẩy sự phát triển của rong

và bảo vệ vật chủ chống lại mầm bệnh, mối quan hệ này đã được xây dựng vàchứng minh hơn 20 năm qua Hình 2.1 mô tả sự tương tác và chuyển hóa các chấthóa học, trong đó bao gồm mối quan hệ có lợi, bất lợi tồn tại giữa rong và vi sinhvật sống cộng sinh Sự đa dạng và bản chất hóa học của sự tương tác đã đượcGoecke và đồng nghiệp

chứng minh [35].

Hình 1 2: Mối tương tác giữa vi khuẩn và rong biển nói riêng và vi sinh vật cộng sinh với rong

biển nói chung [35]

Từ vật chủ là rong các nghiên cứu cũng đã chỉ ra sự tương tác giữa vi khuẩn vàrong biển có mối quan hệ mật thiết Bề mặt Rong biển cung cấp rất nhiều chất dinhdưỡng hữu cơ cho các loài vi khuẩn cơ hội và nó là điểm nóng của sự canh tranh visinh vật cộng sinh trên rong Trong hầu hết các nghiên cứu ở mức độ phân tử đãchứng minh bề mặt rong thu hút rất nhiều vi khuẩn có tính đặc hiệu rất cao Trong khithành phần của khu hệ vi sinh vật này có thể thay đổi theo mùa, theo tuổi của các bộphận khác nhau trên cây chủ, nguyên nhân có thể do yếu tố sinh học và phi sinh học[36] Rong biển thường liên kết với một cộng đồng vi sinh vật mang tính đặc hiệu vớitừng loại rong khác nhau và khác biệt so với hệ vi sinh vật trong nước biển

Gần đây, dựa vào kỹ thuật phân tử sàng lọc 16S rRNA, Burke và cộng sự

(2011b), đã phát hiện được trên cùng một loài rong Ulva australis tại một vùng, có

những thành phần loài vi khuẩn rất khác nhau Bên cạnh đó bằng cách sử dụng kỹthuật metagenomic các nhà khoa học đã chỉ ra rằng thành phần quần xã vi sinh vật

trên loài rong Ulva australis được điều khiển bởi các gen chức năng hơn là chỉ dựa

vào thành phần phân loại hoặc phát sinh loài [36] Điều đó cho thấy rằng nhómchức năng của vi sinh vật cộng sinh với rong biển không nhất thiết liên quan đếnphát sinh loài Thành phần trên cá thể rong biển có ảnh hưởng đến những gen chứcnăng của hệ vi sinh vật cộng sinh với rong đó và cũng cho chúng ta biết dựa vào đặctính sinh lý sinh hóa của vật chủ rong họ cũng xác định được phần nào đó thànhphần của các quần xã vi sinh vật cộng sinh với nó [36]

Rong biển cũng có những hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật, giúp bảo

vệ bề mặt rong khỏi các vi khuẩn gây bệnh, và ngăn cản quá trình tích tụ của các visinh vật trên bề mặt rong dưới dạng màng sinh học [37] Ngoài ra các chất có hoạttính từ rong biển có thể kiểm soát quần xã vi khuẩn bằng cách can thiệp vào hệthống liên lạc giữa các tế bào vi khuẩn Qs (Quorum sensing)

Vi khuẩn trên bề mặt rong

Nhiều vi khuẩn sinh trưởng phát triển trên bề mặt rong biển có thể sử dụngenzyme để phân hủy thành tế bào của rong đó là một trong những yếu tố chínhtrong quá trình chuyển hóa dinh dưỡng trong đại dương Vi khuẩn liên kết trên rong

có thể hoạt hóa các chất hữu cơ của rong và sau đó cung cấp cacbon dioxide,khoáng chất, vitamin và các yếu tố tăng trưởng khác [35, 38] Một số nghiên cứucũng công bố rằng vi khuẩn liên kết với rong biển là nguồn cung cấp nitơ cố định vàmột số hợp chất có khả năng khử độc quan trọng [35]

Bên cạnh việc chuyển hóa cung cấp dinh dưỡng và tác dụng thúc đẩy tăngtrưởng, vi khuẩn có thể định hình hình thái và ảnh hưởng đến vòng đời của rongbiển Matsuo 2005; Goecke 2010 và cộng sự đã báo rằng các chất chuyển hóa từ vikhuẩn bao gồm cả phân tử (QS) cũng đóng một vai trò trong vòng đời của rong biểnnhư là quá trình giải phóng và nảy mầm bào tử rong [35]

Hơn nữa các hợp chất ức chế (QS) và các hợp chất kháng khuẩn được tạo rabởi nhiều vi khuẩn kết hợp cùng với các chất chuyển hóa có hoạt tính từ rong biển,giúp bảo vệ rong khỏi mầm bệnh, động vật ăn cỏ và các sinh vật bám khác

Vi khuẩn gây bệnh có thể tác động vào màng tế bào của rong biển, làm chorong bị chết gây hậu quả rất lớn đối với ngành nuôi trồng rong và hệ sinh thái rong[35] Ngoài ra màng sinh học cũng là mối đe dọa thường trực đối với các loại rongbiển, tăng sự tác động của ái lực lên rong, tăng sự gắn kết của sinh vật bám và cácđộng vật ăn cỏ khác Màng sinh học, cạnh tranh chất dinh dưỡng, ức chế trao đổikhí, cản ánh sáng cho quá trình quang hợp của rong

Do đó các hợp chất có hoạt tính sinh học của vi khuẩn và rong đều là nhữnghợp chất thiết yếu trong mối quan hệ vi khuẩn và rong, chúng giúp kiểm soát thànhphần và cấu trúc màng sinh học, do đó bảo vệ bề mặt rong chống lại quá trình tạomàng sinh học [35] Ngoài ra các hợp chất có hoạt tính từ vi khuẩn này có thể lànguồn cung cấp các chất có hoạt tính hứa hẹn hơn, dễ xử lý và có những ứng dụng

rộng dãi hơn so với các hợp chất có nguồn gốc từ rong [39].

Vi khuẩn nội sinh liên kết với rong

Bên cạnh các vi khuẩn liên kết bên ngoài rong, một số vi khuẩn cũng sốngbên trong lớp tế bào của rong, nó có khả năng phân hủy thành tế bào, tạo ra cáckhoảng trống cho vi khuẩn cơ hội và gây bệnh cho rong, những vi khuẩn này trở lênbất lợi nếu xâm nhập được vào mô của rong, gây bệnh cho rong và làm chết rong

Tuy nhiên những vi khuẩn nội sinh có những mối quan hệ tích cực với sự

hình thành và phát triển của một số loại rong Như rong biển đỏ Prionitis, vi khuẩn

nội sinh đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành và sản sinh ra một sốphytohormone indole-3-acetic acid (IAA) [35] Singh và cộng sự 2011b thì vi khuẩn

nội sinh trong loài rong biển Gracilaria dura có khả năng tăng cường khả năng nảy

chồi, bằng cách sản xuất ra IAA và khả năng cố định nitơ, một vài công bố kháccũng được báo cáo vi khuẩn nội sinh này liên quan đến chức năng giải độc, cố địnhnitơ và quang hợp trên một số loại rong biển xanh [40] Bên cạnh đó có rất nhiềunhững lợi ích mà vi khuẩn nội sinh có tương tác đối với rong biển nhưng chưa đượcnghiên cứu cụ thể và hiểu rõ hơn [41]

2.3 Khoa học metagenomics trong nghiên cứu khu hệ VSV liên kết

Metagenomics là ngành khoa học nghiên cứu về đa hệ gen (metagenome)của tất cả các mẫu vi sinh vật thu nhận trực tiếp từ môi trường tự nhiên [42].Metagenomics là thuật ngữ được sử dụng để mô tả một lĩnh vực nghiên cứu khoahọc và các kỹ thuật cho phép phân tích toàn thể vi sinh vật sống trong bất kỳ môitrường tự nhiên nào Metagenomics nổi lên như một vũ khí mạnh mẽ được sử dụng

để nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bất kể chúng có thể nuôi cấy được hay khôngtrong điều kiện phòng thí nghiệm và cũng cung cấp cơ hội để mô tả sự đa dạng visinh vật trong môi trường vì rất nhiều loài hiện chưa nuôi cấy được Metagenomicsdựa vào việc tách DNA từ một cộng đồng vi sinh vật và như vậy tất cả genome của

vi sinh vật trong cộng đồng đó đều được gộp lại Chính vì thế mà chúng ta có thểthu nhận và phân tích được tất cả hệ gen của vi sinh vật rất là phong phú và đa dạng,đặc biệt là vi sinh vật không thông qua nuôi cấy chiếm 99% mà metagenomics đãtrở thành công cụ giúp các nhà nghiên cứu khai thác nguồn gen và phát hiện ra cácgen mới trong cộng đồng vi sinh vật đó

Những ưu việt của phương pháp metagenomics so với phương pháp phântích truyền thống trong nghiên cứu vi sinh vật:

Vi sinh vật truyền thống – Nuôi cấy Metagenomics

Nhiều VSV môi trường không nuôi

cấy được do:

+ Không phù hợp với môi trường nuôi

cấy đã có

+ Thiếu các chất chuyển hóa hoặc phân

tử tín hiện do các thành viên trong cộng

đồng tiết ra

Phân tích bộ gen của mọi VSV trong môi trường không qua nuôicấy Phát hiện những VSV/ gen hoàn toàn mới

Nghiên cứu từng đối tượng riêng rẽ

trong điều kiện phòng thí nghiệm

Không nhìn tổng thể mức độ phức

tạp về phân loài trong cộng đồng

Nghiên cứu các VSV trong chính môi trường sống bình thường của chúng, nhận diện những đặc tính tựnhiên của các VSV đó

Không nhận diện được các tương

tác phức tạp giữa các thành viên

trong cộng đồng

Phân tích các con đường chuyển hóa

tế bào và tương tác qua lại giữa các thành viên trong cộng đồng sống

Kỹ thuật metagenomics là sự kết hợp giữa sinh học phân tử với tin sinh học

để nghiên cứu một cách có hệ thống quần xã vi sinh vật cũng như toàn bộ vật liệu ditruyền có trong mẫu môi trường nghiên cứu Bằng các công cụ tin sinh học chuyêndụng, sự đa dạng vi sinh vật tới mức loài, đa dạng hệ gen chức năng tham gia vàocác quá trình trao đổi chất và các con đường trao đổi chất giả định đã được làm sáng

tỏ [147] Công cụ chủ chốt của metagenomics là công nghệ giải trình tự gen DNAthế hệ mới NGS kết hợp với các phân tích tin sinh học Hai cách tiếp cận chính củametagenomics là metabarcoding và shotgunmetagenomics [147]

Kỹ thuật metagenomics bao gồm những bước cơ bản sau: (1) Tách tinh sạchAND tổng số; (2): Xây dựng thư viện gen; (3) giải trình tự AND ; (4) sử dụng phầnmềm chuyên dụng và cơ sở dữ liệu chủng để xác định OTUs và (5) phân tích đadạng theo các taxon và so sánh mức độ đa dạng giữa các mẫu khác nhau Dựa vàoquy trình phân tích các dữ liệu thu được, sau đó các trình tự được so sánh vớitrình tự đã có

trong cơ sở dữ liệu để xác định loài dựa trên đơn vị phân loại (OTU) Cuối cùng làcác bước phân tích dữ liệu thứ cấp dựa trên các OTU [43].

Đơn vị phân loài OTU và các phân tích dựa trên đơn vị phân loài OTU(Operational Taxonomic Unit): là đơn vị phân loài, thông thường các trình tự có độtương đồng với nhau từ 97% trở lên sẽ được phân loại vào cùng 1 loài (species), cáctrình tự có độ tương đồng nhau từ 95% sẽ được xếp vào cùng 1 chi (genus) và cáctrình tự có độ tương đồng 90% sẽ được xếp vào cùng một họ (family) OTU là dữliệu đầu ra cho hầu hết các quy trình phân tích dữ liệu với phần mềm QIIME hoặcMothur và là dữ liệu cho bước phân tích các chỉ số đa dạng sinh học tiếp theo Dựatrên các OTU, phân tích thành phần loài sẽ được hiển thị dưới 29 dạng biểu đồ nhiệt

và biểu đồ dạng bar, và các phân tích thống kê khác Trong phân tích thống kê, tính

đa dạng có thể được tính theo hai chỉ số: Các chỉ số đa dạng alpha (alpha-diversity):các chỉ số này đánh giá các mẫu thu tại 1 địa điểm với nhau Bao gồm các chỉ sốnhư Shannon, Simpson, Chao-1 và biểu đồ tương quan giữa số lượng trình tự và sốlượng OTU Trong đó, chỉ số Simpson… Các chỉ số Shannon và Simpson phản ánh

sự đa dạng của OTU trong các mẫu Các chỉ số này dùng để xem xét số loài và mức

độ đồng đều của các loài cũng như khả năng xuất hiện những loài độc đáo Khi chỉ

số Shannon càng lớn hoặc chỉ số Simpson càng nhỏ thì độ đa dạng của cộng đồng visinh vật càng cao Chỉ số Chao1 phản ánh sự phong phú của OTU trong các mẫu.Chỉ số Chao1 hoặc ACE càng lớn thì mức độ phong phú loài dự kiến của khu hệ visinh vật càng cao Các chỉ số đa dạng beta (beta diversity): các chỉ số này so sánhmức độ đa dạng giữa các địa điểm thu mẫu khác nhau và mức độ tương đồng vềthành phần loài giữa các địa điểm thu mẫu Việc phân lập gen từ metagenome đượcthực hiện tương tự như các nghiên cứu phân lập gen trong một hệ gen (genome)

Mục tiêu của metagenomics là để tìm hiểu thành phần và hoạt động của tậpđoàn vi sinh vật phức tạp trong các mẫu môi trường thông qua phân tích trình tựDNA của chúng [45] Mặt khác, khi có số liệu về đa hệ gen, chúng ta có thể thựchiện hàng loạt dự án phân lập gen tùy theo mục đích nghiên cứu Số liệu đó được sửdụng để theo dõi và dự đoán các biến đổi môi trường; xác định gen hay operon mãhóa cho các enzyme cần thiết, có đặc tính mới (như cellulases, chitinases, lipases,thuốc kháng sinh, các sản phẩm tự nhiên khác…) Những enzyme này có thể đượcứng dụng trong

công nghiệp hoặc dược phẩm; xác định biến thể hoặc đa dạng trong gen cho cácenzyme quan trọng và thiết kế tối ưu các điều kiện xúc tác của enzyme; xác địnhcác cơ chế điều hòa và truyền tín hiệu của các gen quan tâm; xác định vi khuẩn hoặccác trình tự plasmid, đánh giá ảnh hưởng của chúng đến cấu trúc và sự đa dạng củacác cộng đồng vi sinh vật.

Năm 2012 Viện Công nghệ sinh học thực hiện Nghị định Thư của Bộ khoahọc và công nghệ với Nhật bản và PGS TS Đỗ Thị Huyền chủ nhiệm để tài nghiên

cứu: “Phân lập hệ gen mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose từ khu hệ vi sinh vật

ruột mối Việt Nam bằng kỹ thuật metagenomics” Đề tài đã ứng dụng thành công

công cụ metagenomics trong đánh giá đa dạng và khai thác nguồn gen mã hóa cácenzyme thủy phân lignocellulose từ hệ vi khuẩn trong ruột mối Việt Nam Kết quả

là đánh giá được sự đa dạng vi sinh vật và đa đạng gene cellulase của vi khuẩn sống

trong ruột mối C gestroi Đây là công trình đầu tiên ứng dụng công nghệ

metagenomics để khai thác các gen quí từ vi sinh vật không thông qua nuôi cấy vàtrong năm 2014, PGS TS Đỗ Thị Huyền, Trần thanh Thủy và cộng sự, thực hiện đề

tài: “Nghiên cứu metagenome của một số hệ sinh thái mini tiềm năng nhằm khai thác các gen mới mã hóa hệ enzyme chuyển hóa hiệu quả lignocellulose”, đề tài đã

thực hiện được giải trình tự DNA metgenome của vi khuẩn trong dạ cỏ dê, đất xungquanh khu nấm mục trắng phân hủy gỗ và suối nước nóng Bình Châu và thu được

bộ dữ liệu của 4725 khung đọc mở (ORFs) được ước đoán mã hóa enzyme tham giathủy phân lignocellulose Ngoài gen mã hóa lignocellulase ra, có rất nhiều gen mãhóa cho các enzyme có giá trị trong làm sạch môi trường, trong công nghiệp đãđược nhìn thấy nhưng chưa được khai thác Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam

và trên thế giới đã đánh giá được vai trò của vi khuẩn dạ cỏ dê chăn thả của ViệtNam trong việc chuyển hóa lignocellulose trong đó khẳng định vai trò củaBacteroidetes:Firmicutes trong việc chuyển hóa hemicellulose và tiền xử lý sinhkhối Bên cạnh đó, đã xây dựng được bộ dữ liệu DNA metagenome của vi khuẩn và

cổ khuẩn suối nước nóng Bình Châu với kích thước 9,4 Gb độ bao phủ trên 60%.Qua phân tích đã xác định được đa dạng vi sinh vật và gen mã hóa enzyme thủyphân cellulose, lựa chọn được hai gen mới (có độ tương đồng thấp 50,35% và53,94%) mã hóa cho hai enzyme tương ứng là endoglucanase và beta-glucosidase

Năm 2014-2018 GS.TS Lê Mai Hương cùng nhóm nghiên cứu tại Viện hóa

học các hợp chất thiên nhiên đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật đất vùng rễ một số cây trồng ở Việt Nam: Cây thuốc có củ (cây nghệ), cây công nghiệp (cà phê) nhằm tăng năng suất và chất lượng cây trồng” Từ dữ liệu

metagenome của VSV đất vùng rễ cây cà phê đã được xác định được sự có mặt của

155 loài trong đó có một số loài dự đoán có thể tham gia vào quá trình chuyển hóa

tự nhiên của nhiều hợp chất trong đất, sản sinh kháng sinh như một số loài thuộc chiStreptomyces, Sphingomonas, Bacillus, và Trichoderma Đề tài đã xác định 6 loài

có thể gây bệnh trên cà phê như Mycobacterium celatum, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas garcae, Rhizoctonia solani và Fusarium oxysporum Đã xác định

được một số loài tiềm năng có thể liên quan đến khả năng chuyển hóa dinh dưỡng

nitơ trong đất vùng rễ cây nghệ, bao gồm Glomus cubense, Rhizophagus sp., Nitrospira sp., Candidatus Nitrososphaera gargensis và Candidatus Nitrosopumilus sediminis Cũng trong năm 2014-2018, PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc, Viện Hóa sinh Biển đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu Metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên tại biển miền Trung Việt Nam nhằm phát hiện và sàng lọc các chất hoạt tính sinh học mới” Đã xác định được sự đa dạng của vi sinh vật liên kết hải

miên thu thập từ Đà Nẵng, Nha Trang và Quảng Trị dựa trên phân tích trình tự vùngsiêu biến V4 gene 16S rRNA Đã phát hiện được ngành đặc hiệu cho hải miên DN9

là Cyanobacteria và NT16 là các ngành Fimicutes, Planctomycetes vàVerrucomicrobia Đã xác định được 8 gen đại diện có hoạt tính sinh học mới (so với

ở Việt Nam) và 10 OTU phân loại vi sinh vật mới Xây dựng được cơ sở dữ liệumetagenome cho 3 mẫu hải miên Tổng kích thước hệ gen của mẫu DN9 là 321 Mb;NT16 là 311 Mb và QT2 là 418 Mb Phát hiện các gen mã hóa cho các sản phẩm tựnhiên có hoạt tính sinh học và tìm hiểu khả năng khai thác các gen này, đồng thờithu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học và xác định tính chất của chúng kếtquả thu được rất khả quan

Gần đây nhất năm 2021, PGS.TS Chu Hoàng Hà và Cộng sự Viện công

nghệ sinh học, đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật trong các đầm nuôi tôm, góp phần tạo cơ sở khoa học để phát triển nghề nuôi

tôm ở Việt Nam”, với mục tiêu chính là ứng dụng công nghệ metagenomics để

nghiên cứu một cách tổng thể nguồn tài nguyên, vật liệu di truyền của vi sinh vậttrong các đầm nuôi tôm, ký sinh trên tôm (đặc biệt là các vi sinh vật chưa đượcnuôi cấy) và khai thác

nguồn vật liệu di truyền phục vụ cho việc phát triển nuôi tôm bền vững Đề tài đãđánh giá được sự đa dạng vi sinh vật trong các đầm nuôi tôm và xác định được mốiliên quan giữa mức độ đa dạng vi sinh vật ở mức độ gen với năng suất, chất lượngnuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng Xác định được danh mục các OTU một số vi

sinh vật thuộc các nhóm Actinomycetales, Fusobacteriales, Ricketsiales, Sphingobacteriales, và Vibrionales có khả năng gây bệnh cho tôm từ cơ sở dữ liệu

16S rRNA metagenome và Xây dựng sữ liệu metagenome của vi sinh vật trong cácđầm nuôi tôm ồm 12 bộ cơ sở dữ liệu giải trình tự 16S rRNA, 3 bộ cơ sở dữ liệushotgun DNA metagenome, 3 bộ cơ sở dữ liệu shotgun RNA metagenome

Ứng dụng của metagenomics là có thể cung cấp một nguồn tài nguyên khônggiới hạn cho sự phát triển các gen mới, enzyme, các sản phẩm tự nhiên, các hợpchất hoạt tính sinh học và các chế phẩm sinh học có thể ảnh hưởng đáng kể đến cácứng dụng công nghiệp và công nghệ sinh học [44] Ngoài ra, một số nhà khoa họccũng cho rằng có thể khai thác các chất kháng sinh mới nhờ ứng dụng kỹ thuậtmetagenomics

2.4 Sự đa dạng vi sinh vật cộng sinh với rong biển

Rong biển (tảo lớn) gồm nhóm các thực vật đa dạng, phổ biến và có khả năngquang hợp và đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái dưới nước Hệ sinh thái nàygóp phần quan trọng đối với quá trình sản xuất sơ cấp (là quá trình chuyển hóa vô

cơ gồm CO2 và H2O thành hữu cơ C, H, O, N) trên toàn cầu và sự tạo thành môitrường sống trên các bờ đá tại vùng nhiệt ôn đới, cung cấp thức ăn và nơi trú chosinh vật biển Giống như các sinh vật nhân chuẩn khác, rong biển chứa đựng sự đadạng về các vi sinh vật cộng sinh trong chúng, có liên quan tới sức khỏe của rong và

hệ sinh thái Cụ thể, cộng đồng vi khuẩn bám được cho là góp phần tạo nên sự pháttriển bình thường của rong chủ, và vi khuẩn với đặc tính chống thối sẽ bảo vệ vậtchủ khỏi các đe dọa bởi các vi sinh vật và tảo bám khác Mối quan hệ chặt chẽ nàygiữa rong và vi khuẩn là một thực thể thống nhất chức năng hoặc sự cộng sinh,giống như mối quan hệ miêu tả trước đây với san hô [48]

Như ta đã biết rong biển là nơi cư trú của nhiều loài vi sinh vật như vi khuẩn,nấm, vi tảo, ấu trùng giáp xác, virus, trong đó vi khuẩn chiếm chủ yếu là từ 102-107

CFU/cm2 , Armstrong và cộng sự 2001, đã đưa ra báo cáo đó là, tùy thuộc vào loàirong biển khác nhau, các vị trí khác nhau trên cùng một loài rong, biến động theocác

mùa trong năm mà mật độ tế bào vi sinh vật biến đổi khác nhau [38, 48].

Ngay từ những năm 1970, các nghiên cứu dựa trên nuôi cấy và kết hợp vớidùng kính hiển vi soi, đã chỉ ra sự khác biệt rõ ràng giữa thành phần vi sinh vật cóliên kết với rong biển và thành phần nước biển xung quanh Những điểm đặc trưngcủa vật chủ là rong biển cũng như sự biến đổi theo thời gian, không gian đã đượchoàn thiện bởi những nghiên cứu, gần đây các nhà khoa học đã tìm ra phương phápđánh giá sự đa dạng của cộng đồng vi sinh vật sống liên kết với rong không phụthuộc quá trình nuôi cấy Tính đặc hiệu của vật chủ dẫn đến sự xuất hiện của mộttập hợp các vi sinh vật liên kết với rong khác biệt với các vật chủ khác trong môitrường biển Để nghiên cứu tính đặc hiệu của cộng đồng vi sinh vật này các nhà

khoa học sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như 16S rDNA, T-RFLP, điện

di biến tính DGGE… Burke và cộng sự 2011b cho rằng, sự khác biệt về tính đặchiệu của các cộng đồng vi sinh vật trên các loài rong biển chủ khác nhau có thể dođặc điểm môi trường sống hơn là do sự phát sinh từ loài Tuy nhiên, hiện tại các

phương pháp phân tử như 16S rDNA, T-RFLP, điện di biến tính DGGE, định lượng

PCR và lai huỳnh quang tại chỗ cũng có những hạn chế trong việc đánh giá toàn bộ

sự đa dạng của một cộng đồng vi sinh vật, ngay cả trong cùng một mẫu, bởi chúngchỉ có giá trị trong thời gian nhất định, và chỉ phát hiện cộng đồng vi sinh vật ở thờiđiểm đó chiến ưu thế Thông qua việc xác định trình tự metagenome của cộng đồng

vi sinh vật, người ta có thể xác định được các gen chức năng quy định cũng nhưnhững đặc điểm khác biết trong cộng đồng vi sinh vật [41]

Hình 1 3: Sự đa dạng vi sinh vật trên bề mặt rong biển [41]

Vi sinh vật trong môi trường biển là rất đa dạng Tuy nhiên, chỉ 0,1-2% trong

số chúng có thể được phân lập, nuôi cấy mục đích nghiên cứu các đặc tính lý hóahọc và đặc tính sinh học v.v Theo Fernandes và cộng sự (2011), thì các vi sinh vậtphân lập chưa phản ánh được sự đa dạng, cấu trúc vi sinh vật trong một môi

trường nhất định, khi nghiên cứu về bệnh ở rong D pulchra, tác giả Fernandes

(2011) sử dụng kỹ thuật T-RFLP, PCR-DGGE và giải trình tự thư viện 16S rDNA,tác giả thấy rằng ở rong khỏe mạnh có sự phân bố các nhóm vi khuẩn

chi Parvulcula và Haliscomenobacter và trong họ Rhodobacteracea Trong khi đó, ở rong bị bệnh mất

mầu, thì các vi khuẩn trên ít đi, và thay vào đó là các vi khuẩn thuộc chi

Thalassomonas, Cellulophaga, Colwelliaceae và Pseudoruegeria Tác giả cho rằng,

các vi khuẩn mới xuất hiện ở rong bệnh bạc mầu là do các vi khuẩn này có khả năngtiết enzyme phân hủy thành tế bào rong (agar, alginate, carrageenan, fucoidan) [49]

Vì vậy, việc nghiên cứu quần thể vi sinh vật ở rong biển không qua nuôi cấy,

sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử là rất quan trọng và hữu hiệu Đó là việc ứngdụng kỹ thuật trong nghiên cứu sinh học phân tử như PCR- DGGE, T-RFLP,pyrosequencing và giải trình tự gen thế hệ mới (next generation sequencing – NGS)

[47] Trong một nghiên cứu vi khuẩn ở rong Delisea pulchra, Fernandes và cs.

(2012) sử dụng phương pháp sinh học phân tử (thư viện 16S rDNA) để mô tả sự thayđổi thành phần vi sinh vật ở rong bệnh và rong khỏe Tác giả thấy rằng có sự thay đổi

ở taxa Colwelliaceae, Rhodobacteraceae, Thalassomonas, và Parvularcula Số lượng

các OTU

vi khuẩn ở rong bệnh là 364, nhiều hơn so với ở rong khỏe 133 Có tới 19 họ/chi đượcphát hiện với hàng trăm OTU khác nhau, chứng tỏ sự đa dạng vi sinh vật trên rong là

rất cao [44] Ở rong lục Ulva australis, các nhóm vi khuẩn Alphaproteobacteria và Bacteroideteschiếm ưu thế, đặc biệt là các họ Rhodobacteriaceae, Sphingomonadaceae, Flavobacteriaceaeand, Sapropiraceae [51] Các nhóm vi khuẩn

khác nhau sẽ thực hiện các quá trình trao đổi chất tương tự nhưng với chức năng khác

và chúng sẽ cạnh tranh với nhau để sống trên bề mặt rong lục Rong đỏ Delisea pulchra mọc ở bờ biển Sydney cũng có các vi khuẩn thuộc Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Planctomycetia và Bacteroidetes, đặc biệt thuộc các họ Rhodobacteriaceae, Sphingomonadaceae Flavobacteriaceae và Planctomycetaceae

mùa Các vi sinh vật có thể đặc hiệu này có thể thay đổi theo thời gian hoặc vị trí địa

lý vùng rong biển Thành phần vi sinh vật là khác nhau ở các loài rong khác nhau, dùrong sống cùng trong một môi trường Trong khi đó, cùng một loài rong sẽ chứa thànhphần vi sinh vật tương đối giống nhau, cho dù rong sống ở các vùng địa lý khác nhau[53]

Sự liên quan về sinh thái học giữa cộng đồng vi sinh vật sống trên rong hiệnnay vẫn chưa được hiểu chi tiết Trước đây, nghiên cứu mối tương tác giũa vikhuẩn- rong gặp khó khăn trong vấn đề phân lập, nuôi cấy và xác định mối quan hệ[47, 52] Việc phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử như phương pháp nhận dạng

vi sinh qua giải mã gen 16S rRNA, kỹ thuật fingerprinting DNA, bao gồm điện dibiến tính DNA (PCR-DGGE, denaturing gradient gel electrophoresis), đa dạngchiều dài đoạn gen cắt (T-RFLP, terminal restriction fragmen lengthpolymorphism), pyrosequencing đã giúp việc phân tích phân loại và sự đa dạng các

vi sinh vật sống trên rong [ 52, 53, 54]

Đáng chú ý, gần đây Bùi Đình Lãm và cộng sự (2011) đã thực hiện “Nghiên cứu phân lập, định tên khoa học một số vi sinh vật gây bệnh trắng nhũn thân (Ice- Ice disease) Ở rong sụn (Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus striaum) bị bệnh ở Việt Nam” Đã phân lập được 119 chủng vi khuẩn khác nhau từ các mẫu rong bị

bệnh, đã phân loại bằng kit chuẩn sinh hóa API được xếp vào 19 loài thuộc 7 chi là

Burkholderia, Vibrio, Pasteurella, Shewanella Aeromonas, Ochorobactrum và bacillus Trong đó xác định được hai loài xuất hiện phổ biến nhất trên rong sun là Vibrio parahaemolyticus và Burkholderiacepacia với tần suất xuất hiện tương ứng

là 21,7% và 17,4%

Theo TS Lê Hữu Cường và cộng sự (2021) đã tiến hành nghiên cứu về đadạng vi sinh vật trên cây rong sụn và nguyên nhân gây ra bệnh thối nhũn Phươngpháp mà nhóm sử dụng là giải trình tự gen thế hệ mới (NGS), rDNA amplicon kếthợp với phương pháp sinh học phân tử truyền thống tạo thư viện gen, DGGE (điện

di biến tính DNA) – để phân tích DNA hệ gen của tất cả các vi sinh vật từ rong sụnkhỏe mạnh và rong bệnh thu mẫu tại các 3 vịnh ở Khánh Hoà cũng như một số vùng

ở Ninh Thuận Đã đưa ra những dữ liệu về đa dạng vi sinh vật sống trên rong Sụn

và Hồng vân tại vùng biển Khánh Hòa Bằng việc giải trình tự gen, các vi sinh vật

sống trên rong thuộc chủ yếu chi Cobetia, Pseudoalteromonas, Alteromonas, nhóm Flavobacterium, Vibrio Vi khuẩn sống trong nước biển đa dạng hơn và đồng đều

hơn so với vi khuẩn sống trên rong Năm 2010 TS Đào Thị Lương đã sử dụng genrRNA 16S để nghiên cứu phát sinh chủng loại, phân loại vi khuẩn và từ đó phântích mối quan hệ họ hàng trên cây phả hệ của 43 chủng vi khuẩn phân lập từ rong

sun Kappaphycus alvarezii ở Việt Nam.

2.5 Các chất có hoạt tính từ vi sinh vật liên kết với rong biển

2.5.1 Các chất có hoạt tính từ vi khuẩn cộng sinh trên rong

Môi trường biển có sự đa dạng cao về vi sinh vật, chủ yếu là bao gồm vikhuẩn, nấm, virus, bào tử và xạ khuẩn [59] Những sinh vật này cũng định cư trêncác động vật biển và thực vật, ngoài việc ở trên bề mặt và hình thành các tổ chứcliên kết đặc biệt với từng loài chủ của chúng [60, 61] Các vi sinh vật cộng sinh

sử dụng các chất dinh dưỡng được sản xuất bởi loài chủ và bảo vệ chúng khỏinhững thực thể nguy hại xung quanh bằng cách tiết ra các hợp chất có cấu trúcđặc trưng được gọi là "chất có hoạt tính sinh học"[ 62] Rong biển là một phầncủa hệ sinh thái có năng suất cao và là môi trường sống của rất nhiều các vi sinhvật, môi trường sống ở trên cây rong là rất khắc nghiệt, các vi sinh vật phải cạnhtranh lẫn nhau về không gian, dinh dưỡng, oxi Vì vậy, chúng có cơ chế tổng hợpcác chất trao đổi thứ cấp, đó là các hợp chất có hoạt tính sinh học Các hợp chấtthu được từ các vi sinh vật liên kết được biết đến có các tác dụng sinh học nhưkháng khuẩn,

kháng lại sự xâm nhiễm của vi sinh vật có hại, các sinh vật đơn bào, ký sinh trùng

và khối u [63, 64]

Các chất có hoạt tính sinh học này là các chất chuyển hóa thứ cấp và cócấu trúc phân tử đặc biệt so với những sản phẩm do vi sinh vật trên mặt đất tạo

ra Các chất có hoạt tính sinh học của quá trình chuyển hóa thứ cấp từ vi sinh vật

là những sản phẩm tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm, công nghiệp,nông nghiệp và công nghệ sinh học [38] Việc tìm các kháng sinh thế hệ mới là rất

có ý nghĩa, bởi vì hiện nay, tình trạng vi sinh vật kháng thuốc ngày càng trở nên phổbiến, gây khó khăn trong điều trị bệnh truyền nhiễm

Hình 1 4: Các yếu tố ảnh hưởng đến sự xâm nhập của vi khuẩn trên bề mặt rong [65]

Rong biển cũng có thể được coi là nguồn cung cấp giàu chất dinh dưỡng cho visinh vật dẫn đến sự cạnh tranh cao giữa các cộng đồng vi sinh vật khác nhau [38, 65].Trường hợp như vậy buộc các vi sinh vật phát triển theo cách mà chúng có thể sản xuấtcác hợp chất chống khuẩn để duy trì sự cạnh tranh về mặt dinh dưỡng, nơi sống với cácloài khác Năm 2008, Manmadhan và cộng sự đã phân lập 92 chủng vi khuẩn trên 9loài rong biển Trong đó có tới 31 loài có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh ở

người 10 loài có hoạt tính mạnh thuộc chi Bacillus, Microbacterium, Vibrio, Psychrobacter

, các vi khuẩn sống trên rong sinh kháng sinh thuộc về các chi sau: Pseudomonas, Pseudoalteromonas, Vibrio, Alteromonas, Shewanella, Streptomyces, Bacillus, Stenotrophomonas Các chất kháng vi sinh vật từ vi khuẩn cộng sinh với rong này

sản xuất nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm haliangicin, violacein,pelagiomicin

A, korormicin, macrolactines và chất diệp lục lần lượt thể hiện hoạt tính kháng nấm,kháng nguyên sinh động vật, ngăn chặn sự xâm nhập, hoạt tính kháng sinh chống lại vikhuẩn gram âm, gram dương và các hoạt động quang hợp [66, 67, 68].

Các hợp chất có hoạt tính được chiết xuất từ các vi sinh vật cộng sinh rong biển

đã tăng lên đáng kể trong những thập kỷ qua với gần 600% so với thế kỷ trước [69]

Sự gia tăng các báo cáo mới về vi sinh vật biển đã chứng minh được rằng các vi khuẩnbiển cộng sinh sản xuất các hợp chất mới có giá trị là tiềm năng lớn phát triển chongành dược phẩm Lemos và cộng sự (1985) đã chứng minh rằng 17% trong số 224chủng vi sinh vật biểu thị hoạt tính kháng khuẩn liên kết với năm loài rong lục và rongnâu Tương tự như vậy, Penesyan và cộng sự (2009) đã phân lập 325 chủng vi khuẩn từ

Delisea pulchra và U australis và 12% trong số đó cho thấy hoạt tính kháng khuẩn

[70]

Hơn nữa, tỷ lệ của vi khuẩn phân lập có khả năng sản xuất kháng sinh cao cũng

đã được báo cáo Burgess và cộng sự (1999) tìm thấy 35% các vi khuẩn cộng sinh trên

bề mặt có hoạt tính kháng khuẩn [71] Wiese và cộng sự (2009) nghiên cứu vi khuẩn

cộng sinh với tảo nâu Saccharina latissima có hoạt tính kháng sinh và thấy rằng 50%

các dòng vi khuẩn liên kết ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram âm hoặc Gramdương hoặc nấm men Ma và cộng sự (2009) phân lập 192 chủng vi khuẩn và có 63chủng (32,81%) cho thấy hiệu quả chống sự xâm nhập của các vi sinh vật khác lên bề

mặt của loài rong Ulva lactuca cũng như hoạt tính chống ấu trùng [72] Janaki Devi và

cộng sự (2013) đã phân lập được 126 loại vi khuẩn từ 05 loài tảo biển khác nhau

(Gracillaria corticata, Geledium pussilum, Hypnea musiformis, Padina gymnosphora và Valoniopsis pachynema) cho thấy hoạt tính kháng khuẩn (vùng ức chế 2,6 đến 16 mm) chống lại Escherichia coli, Staphylococcus, Klebshilla, Pseudomonas aeroginosa, Micrococcus, Salmonella, Vibrio cholera, Shigella dysenteriae, và Serratia Các nghiên

cứu gần đây cho thấy các cộng đồng vi khuẩn cộng sinh với rong biển khác biệt đáng

kể so với sinh vật biển [73]

Bề mặt rong biển chiếm ưu thế bởi đa số các nhóm thuộc Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes, và Planctomycetes Gammaproteobacteria là nhóm vi khuẩn phổ biến nhất cộng sinh với rong biển ( chiếm 37%nhóm vi sinh bề mặt), tiếp theo là nhóm CFB bao gồm Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes (20%), Alphaproteobacteria (13%), Firmicutes (10%), và Actinobacteria (9%) Trên một phân loại thấp hơn, thứ tự là Flavobacteriales (14% sự phong phú), Alteromonadales (12%), Vibrionales (10%),

Pseudomonadales (9%),

Bacillales (9%), Actinomycetales (8%) và Rhodobacterales (7%) có nhiều nhất

trong các cộng đồng vi khuẩn cộng sinh rong biển [74, 75] Do đó, các hợp chấtkháng sinh được chiết xuất từ các cộng đồng vi khuẩn cộng sinh thuộc về các chi khác

nhau như Pseudomonas, Pseudoalteromonas, Stenotrophomonas, Vibrio, Alteromonas,

Shewanella, Streptomyces, và các loài Bacillus [72] Burgess và cộng sự (2003) đã xác

định hầu hết các chủng Bacilluss liên quan đến hoạt tính chống cặn bám Nhóm vi khuẩn Bacillus xuất hiện thường xuyên trên rong, và nhiều loài sản xuất chất kháng sinh Một loạt chất mới thuộc macrolactin G, H, I, J, K, L và M từ Bacillus sp PP19- H3 từ rong Schizymenia dubyi Điều thú vị là chất diệt vi khuẩn, lichenicidin - một loại thuộc lentibiotics từ loài vi khuẩn B licheniformias Điều này cho thấy Bacillus

là nguồn sản xuất chất diệt khuẩn [76].

Loài vi khuẩn ký sinh Vibrio hiện có trên rong Ulva reticulata ức chế đáng kể

việc định cư và biến thái của ấu trùng polychaete và có thể bảo vệ loài rong chủ chống

lại tác nhân xâm nhiễm [77].

Tương tự như vậy, chi Pseudomonas được biết là sản xuất một vài chất

kháng vi sinh vật nhằm bảo vệ rong chủ khỏi vi sinh có hại, vi khuẩn cộng sinh

Pseudoalteromonas tunicata và Roseobacter gallaeciensis được phân lập từ rong U australis các nhà khoa học đã tìm ra một loạt các chất ức chế chống lại nấm biển, vi

khuẩn, ấu trùng, động vật không xương sống [78] Một loại thuốc quan trọng,

tetrodotoxin (TTX) sản xuất bởi Pseudomonas sp cộng sinh tảo Jania sp Loài Pseudomonas magnesiorubra cộng sinh rong Caulerpa peltala sản xuất chất kháng

sinh mới Magnesidin có chứa Mg,là hợp chất có cấu trúc phức tạp của muối Mg và

2 tetramic acid, acid acety3-n-hexanoy5-ethylidene tetramic (n = 4) và acid acetyl-3-n- octanoyl-5-ethylidene tetramic (n = 6) Hợp chất này có hoạt tính kháng

l-khuẩn mạnh chống lại Staphylococcus và Bacillus Bốn hợp chất quan trọng khác là massetolide A, B, C, D từ chủng Pseudomonas sp ở rong đỏ Các chất này ức chế

vi khuẩn Mycobacterium tuberrculosis và M avium-intracellulare Hợp chất kháng

vi sinh quan trọng diketopiperazines và 2,4-dibromo-6-chlorophenol được phân lập

từ Pseudoalteromonas luteoviolacea cộng sinh với rong Padina australis Một chất mới đã sử dụng làm thuốc là korormicin từ vi khuẩn Pseudoalteromonas spF-240 cộng sinh tảo Halimeda sp.

Gần đây, Tebben và cs (2014) đã xác định 13 hợp chất từ chủng

Pseudoalteromonas J010 cộng sinh với tảo Neogoniolithon fossliei Trong đó, chất

mới là bromopyrrole và 5 chất korrormicin G-K kháng vi khuẩn [79] Hoạt tính đốikháng được sinh ra từ các vi khuẩn liên kết với rong biển có thể giúp ngăn ngừa ưu thếcủa bất kỳ loài vi khuẩn cụ thể nào và hỗ trợ trong việc duy trì sự đa dạng vi khuẩn trênloài chủ Một số vi khuẩn gram dương và gram âm tạo ra hợp chất autolysin, từquá trìnhthủy phân từ peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn và dẫn đến sự giải phóng các chất

nội bào [80] Kết quả của họ chỉ ra rằng chi Pseudoalteromonas có hoạt tính kháng sinh với phổ rộng trong khi đó Bacillus, Vibrio và Shewanella chủ yếu cho thấy hoạt tính

antidiatom Các hợp chất kháng khuẩn được tạo ra bởi liên kết rong biển với vi khuẩn

Alteromonas aurantia, Alteromonas rubra và Alteromonas luteoviolacea tạo ra các cao

phân tử, được dự đoán ức chế sự hô hấp của vi khuẩn và giảm thiểu ô nhiễm bề mặt

[81].Bên cạnh các chất trao đổi thứ cấp, vi khuẩn sống trên rong biển là nguồn sảnxuất các enzyme thủy phân vách tế bào rong như carrageenan, agarase, fucoidanse,alginate hydrolase… Các loại enzyme này không được sản xuất bởi vi khuẩn đấtliền và chỉ phổ biến ở các loài vi khuẩn sống trên rong và ở một số loài động vậtthân mềm ở biển (trai, bào ngư v.v ) Theo số liệu thống kê bởi Goecke và cs

(2010), các vi sinh vật thuộc Bacillus, Flavobacterium, Cytophaga, Vibrio, Thalassomonas, Alteromonas … sản xuất agarase; Microbulbifer, Cytophaga, Pseudoalteromonas, Zobellia … sản xuất carageenase; Alcaligenes, Alginomonas, Glaciecola, Ochrobactrum, Flavobacterium… sản xuất alginases; Arenibacter, Gramella, Maribacter, Mesonia, Vibrio, Zobellia sản xuất fucoidanse [81]

Theo TS Lê Hữu Cường (2021), đã phân lập được 125 chủng vi khuẩn từ 30mẫu rong thu tại Khánh Hòa, Phú Yên và Ninh Thuận, trong đó có 7 chủng phângiải tốt carrageenan với đường kính 0,4-1,2cm, và 8 chủng phân giải fucoidan, vớivòng phân giải đường kính 0,35-0,75cm Sàng lọc và định tên được 3 chủng vi

khuẩn có hoạt tính là: Pseudoalteromonas B108 có hoạt tính fucoidanase (20,55U/mg), Marinobacter B-101 có hoạt tính kappa-carrageenanse (20,01 U/mg)

và Bacillus amolyliquefaciens có hoạt tính iota-carrageenanse (21,2U/mg mỗi loại).

Bên cạnh đó, 125 chủng vi khuẩn được thử hoạt tính sinh học gồm hoạt tínhkháng sinh, hoạt tính oxi hóa, hoạt tính gây độc tế bào ung thư người Kết quả thuđược như sau: hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định có 13 chủng có hoạt tính kháng

từ 1 đến 4 chủng vi sinh vật kiểm định với giá trị MIC là từ 100-200 g/ml, hoạttính