Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây Khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Tây Nguyên

Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây Khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Tây Nguyên.Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây Khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Tây Nguyên.Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây Khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Tây Nguyên.Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây Khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Tây Nguyên.Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây Khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Tây Nguyên.Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây Khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Tây Nguyên.Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây Khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Tây Nguyên.Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây Khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Tây Nguyên.

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

CAO NGỌC MINH TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT CHỨA ALKALOID VÀ FLAVONOID

CHIẾT TÁCH TỪ RỄ CÂY KHỔ SÂM (SOPHORA FLAVESCENS AIT.)

TRỒNG TẠI TÂY NGUYÊN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2022

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

CAO NGỌC MINH TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT CHỨA ALKALOID VÀ FLAVONOID

CHIẾT TÁCH TỪ RỄ CÂY KHỔ SÂM (SOPHORA FLAVESCENS AIT.)

TRỒNG TẠI TÂY NGUYÊN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Ngô Đại Nghiệp

2 GS.TS Hoàng Nghĩa Sơn

Thành phố Hồ Chí Minh – 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Luận n n y l công tr nh nghi n cứu của tôi ƣ i s hƣ ng ẫn khoa học của PGS TS Ngô Đại Nghiệp v GS TS Ho ng Nghĩa Sơn

C c số liệu kết quả trong luận n l trung th c v m t phần đƣ c công ố trong c c tạp chí chuy n ngành

Những trích ẫn v t i liệu tham khảo trong luận n có nguồn gốc x c th c

Th nh phố Hồ Chí Minh ng y 05 tháng 5 năm 2022

T c giả luận n,

Cao Ngọc Minh Trang

MỤC LỤC

Trang TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1.Tổng quan về th c vật học Khổ Sâm 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái 3

1.1.3 Phân bố sinh thái, thu hái và chế biến 4

1.1.4 Thành phần hóa học 4

1.1.5 Tác dụng ư c lý của Khổ Sâm 7

1.2 Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa 10

1.2.1 Gốc t do và stress oxy hóa 10

1.2.2 Chất kháng oxy hóa 12

1.2.3 Hoạt tính kháng oxi hóa của flavonoid trong rễ cây Khổ sâm 14

1.3 Tổng quan về hoạt tính kháng tế o ung thư: 15

1.3.1 Quá trình Apoptosis 15

1.3.2 Quá trình Necrosis 15

1.3.3 Hoạt tính kháng ung thư từ rễ Khổ sâm 17

1.3.4 Dòng tế o ung thư gan 18

1.3.5 Dòng tế bào ung thu vú 19

1.4 Phương ph p x c định matrine và oxymatrine trong Khổ sâm 21

1.4.1 Định tính v định lư ng matrine 21

1.4.2 Phân lập matrine và oxymatrine làm chất đối chiếu 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Đối tư ng nghiên cứu 23

2.1.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 23

2.1.2 Vật Liệu 23

2.1.3 Thiết bị sử dụng 24

2.2 Phương ph p nghi n cứu 25

2.2.1 Định anh v đ nh gi chất lư ng ư c liệu 25

2.2.2 Chiết xuất ư c liệu Khổ sâm định hư ng phân lập alkaloid matrine và oxymatrine 29

2.2.3 Định lư ng polyphenol và flavonoid tổng số 32

2.2.4 Phương ph p x c định hoạt tính kháng oxy hóa 33

2.2.5 Nuôi cấy tế bào 34

2.2.6 Hoạt tính kháng tế o ung thư HepG2 v BT474 của các cao chiết phân đoạn từ rễ Khổ sâm 35

2.2.7 Phương ph p thống kê 39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 40

3.1 Định anh v đánh giá chất lư ng ư c liệu 40

3.1.1 Định danh loài cây Khổ sâm trồng tại Tây Nguyên 40

3.1.2 Đ nh gi chất lư ng ư c liệu 42

3.2 Kết quả tách chiết m t số hoạt chất chính trong rễ Khổ sâm 49

3.2.1 Phân lập Matrine và Oxymatrine bằng phương ph p sắc ký điều chế 49

3.2.2 X c định tổng polyphenol và tổng flavonoi trong ư c liệu 56

3.2.2.1 Định tính thành phần flavonoi trong ư c liệu 56

3.2.2.2 Định lư ng h p chất polyphenol tổng số (TPC) 58

3.2.2.3 Định lư ng flavonoid tổng số 59

3.3 Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết rễ Khổ sâm 61

3.4 Kết quả ức chế các tế o ung thư 63

3.4.1 Ảnh hưởng cao chiết phân đoạn t i s tăng sinh của tế bào HepG2 và BT474 63

3.4.2 Ảnh hưởng của cao CHCl3 lên mật đ tế bào, hình thái tế bào và nhân 66

3.4.3 Ảnh hưởng của cao CHCl3 lên chu kì tế bào 71

3.4.4 Ảnh hưởng của cao CHCl3 lên quá trình Apoptosis 73

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 81

1 Kết luận 81

2 Kiến nghị 81

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 82

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 83

PHỤ LỤC 95

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… ……….……… 83

PHỤ LỤC……… 95

AR : Analytical Reagent (thuốc thử dùng cho phân tích)

ATCC : American Type Culture Collection (B sưu tập giống của Mỹ) BT474 : Breast Tumor 474 (Dòng tế o ung thư vú BT474)

DĐTQ : Dư c điển Trung Quốc

DĐVN : Dư c điển Việt Nam

DMEM : Môi trường Dulbecco's Modified Eagle

FCR : Folin–Ciocalteu Reagent (thuốc thử Folin-Ciocalteu)

FRAP : Ferric Re ucing Antioxi ant Power (năng l c khử sắt)

FV : FRAP Value (chỉ số FRAP)

GAE : Gallic acid Equivalent (đương lư ng gallic acid)

GSH : Glutathione

HepG2 : Hepatoma G2 (Dòng tế o ung thư gan HepG2)

HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu

năng cao) HRMS : High Resolution Mass Spectrometry (Khối phổ phân giải cao)

IC50 : Inhibition concentration at 50 % (nồng đ ức chế 50 %)

LOD : Loss On Drying (Mất khối lư ng do làm khô)

OD : Optical Density (Mật đ quang)

PBS : Phosphate-buffered saline

QE : Quercetin Equivalent (đương lư ng quercetin)

RT- PCR: Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction

Rf : Retention factor (chỉ số lưu giữ)

RNS : Reactive Nitrogen Species (Các gốc t do chứa Ni tơ)

ROS : Reactive Oxygen Species (Các gốc t do chứa Oxy)

SFNP : Sophora Flavescens Nanoparticles

SPE : Solid phase extraction (Chiết pha rắn)

TFC : Total Flavonoid Content (hàm lư ng flavonoid tổng số)

TLC : Thin layer Chromatography (Sắc ký l p mỏng)

TPC : Total Phenolic Content (h m lư ng h p chất polyphenol tổng số)

DANH MỤC BẢNG

B ng 1.1: M t số dạng gốc t do 11

B ng 1.2: Tính chất hóa lý của matrine và oxymatrine 21

B ng 2.1: Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu 24

B ng 2.2: Chương tr nh pha đ ng phân tách matrine và oxymatrine 27

B ng 2.3: Chương tr nh pha đ ng hệ sắc ký điều chế 31

B ng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime RT- PCR cho các gene liên quan t i s chết theo chương tr nh 37

B ng 2.5: Trình t cặp mồi đặc hiệu sử dụng cho phản ứng định lư ng Realtime RT- PCR 37

B ng 3.1: Kết quả search last NCBI 41

B ng 3.2: Kết quả đ ẩm, tro toàn phần và tổng chất chiết của nguyên liệu 44

B ng 3.3: Chương tr nh pha đ ng HPLC-UV phân tách matrine và oxymatrine 46

B ng 3.4: Khảo sát tỉ lệ dung môi EtOH chiết matrine và oxymatrine từ rễ Khổ sâm 48

B ng 3.5: Các thông số thẩm định phương ph p HPLC-UV x c định matrine và oxymatrine 48

B ng 3.6: H m lư ng matrine và oxymatrine trong cao phân đoạn EtOH 80 %, EA, CHCl3 v cao nư c 49

B ng 3.7: Tối ưu l m sạch dịch chiết ư c liệu trên c t OASIC MCX, sử dụng 200 mg cao CHCl3 cho ư c khảo sát này 50

B ng 3.8: Nhận danh flavonoid trong cao EA bằng HPLC-HRMS 57

B ng 3.9: Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết rễ Khổ sâm 61

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: B phận trên mặt đất (A) và rễ (B) của Khổ sâm 4

Hình 1.2: M t số thành phần alkaloid của Khổ sâm 5

Hình 1.3: Khung cấu trúc chung của flavonoid 6

Hình 1.4: Phân iệt s kh c nhau giữa Apoptosis v Necrosis 16

Hình 1.5: Dòng tế bào ung thư gan HepG2 18

Hình 1.6: Dòng tế o ung thư vú BT474 20

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất khảo sát 30

Hình 3.1: (A), (B) hình thái cây Khổ sâm 2 năm tuổi đư c trồng tại Đắk Nông và thu hái vào tháng 3/2016, (C) hoa Khổ sâm, (D) rễ Khổ sâm tươi (E) rễ Khổ sâm phơi khô, (F) mặt cắt ngang của rễ Khổ sâm khô, (G), rễ Khổ sâm khô chặt nhỏ, (H) b t rễ Khổ sâm 40

Hình 3.2: (A) Tinh b t vi phẫu và (B) vi phẫu mặt cắt ngang rễ Khổ sâm 42

Hình 3.3: M t số thành phần b t rễ Khổ sâm quan s t ư i kính hiển vi quang học (X10) 43

Hình 3.4: Phản ứng v i NaOH của rễ Khổ sâm phơi khô 44

Hình 3.5: Kết quả định tính alkaloi trong ư c liệu 46

Hình 3.6: Phương tr nh đường chuẩn matrine và oxymatrine 47

Hình 3.7: Cấu trúc pha tĩnh c t OASIS MCX 51

Hình 3.8: Sắc ký đồ điều chế matrine và oxymatrine 52

Hình 3.9: Sắc ký đồ và phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết của matrine điều chế. 54

Hình 3.10: Sắc ký đồ và phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết của oxymatrine điều chế 55

Hình 3.11: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cao chiết EA 56

Hình 3.12: Tương quan tuyến tính giữa nồng đ gallic acid và đ hấp thu quang 765 nm 58

Hình 3.13: Tương quan tuyến tính giữa nồng đ quercetin và đ hấp thu quang ở 415 nm 59

Hình 3.14: Phân bố TPC và TFC trong b t rễ Khổ sâm và các loại cao 60

Hình 3.15: Ảnh hưởng của cao EA (A), CHCl3 (B), EtOH (C) và H2O (D) lên tế bào HepG2 63

Hình 3.16: Ảnh hưởng của cao EA (A), CHCl3 (B), EtOH (C) và H2O (D) lên tế bào BT474 64

Hình 3.17: Ảnh hưởng của cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên s tăng sinh tế bào ung thư BT474 a c : kh c iệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,05) 64

Hình 3.18: S thay đổi hình thái tế bào HepG2 xử lý v i các mức nồng đ cao chiết

CHCl3 từ rễ Khổ sâm: 3,125 µg/mL (A), 6,25 µg/mL (B), 12,5 µg/mL (C), 25 µg/mL (D), 50 µg/mL (E) và 100 µg/mL (F) đ phóng đại x 100 66

Hình 3.19: Đường tuyến tính giữa mật đ tế bào/ giếng v i giá trị OD tương ứng

đư c đo tại ư c sóng 450 nm 66

Hình 3.20: Mật đ tế bào HepG2/giếng khi xử lý v i các mức nồng đ khác nhau

của cao chiết CHCl3 67

Hình 3.21: Tỉ lệ quẩn thể tế bào HepG2 xử lý v i các mức nồng đ cao chiết CHCl3

(A) Q1: quần thể tế bào necrosis, Q2: quần thể tế o nh thường, Q3: quần thể tế bào apoptosis s m, Q4: quần thể tế bào apoptosis mu n và (B) *** khác biệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,001), ** khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.01) 68

Hình 3.22: Ảnh hưởng của cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên hình thái nhân A (0 mg/L) , B (1 µg/mL), C (10 µg/mL), D (100 µg/mL); Thang đo: 30 µm 69

Hình 3.23: Ảnh hưởng của cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên hình dạng tròn nhân (Nuclear round shape) a, b, c: khác biệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,05) 70

Hình 3.24: Tỉ lệ tế bào trong pha G0/G1 và G2/M khi đư c xử lý v i cao chiết

CHCl3 từ rễ Khổ sâm ở các nồng đ khác nhau 71

Hình 3.25: Tỉ lệ tế bào trong pha G0/G1 và G2/M khi đư c xử lý v i cao chiết

CHCl3 từ rễ Khổ sâm ở các nồng đ khác nhau a, b, c, d: khác biệt có ý nghĩa thống

k (P ≤ 0,05) 72

Hình 3.26: S biểu hiện mRNA gene p53, Bcl-2, Caspase 9, Caspase 3 và Bax của

tế bào HepG2 thông qua phản ứng Realtime-PCR sau 24h và 48h cảm ứng bằng CHCl3 v nhóm đối chứng 73

Hình 3.27: Tỉ lệ tế bào nh thường ư i s cảm ứng của dịch chiết sau 24h, 48h và

72h so v i nhóm đối chứng (*p<0,05) (Q1: quần thể tế bào necrosis, Q2: quần thể

tế o nh thường, Q3: quần thể tế bào apoptosis s m, Q4: quần thể tế bào apoptosis mu n) 75

Hình 3.28: Tỉ lệ tế bào apoptosis s m và apoptosis mu n ƣ i s cảm ứng của dịch

chiết sau 24h, 48h và 72h so v i nhóm đối chứng (*p<0,05) 76

Hình 3.29: Kết quả Western Blot đ nh gi mức đ biểu hiện protein caspase 3 và

MỞ ĐẦU

Nghiên cứu sử dụng cây thuốc trong y học cổ truyền hiện nay đang đư c phát triển rất mạnh và có chiều sâu ở Việt Nam Nằm ở vùng khí hậu nhiệt đ i gió mùa, Việt Nam đư c đ nh gi l nư c đứng thứ 16 trên thế gi i về s phong phú,

đa ạng sinh vật trong đó có đ đa ạng về cây thuốc Để tăng th m tính đa ạng của cây thuốc Việt Nam và phong phú các bài thuốc trong y học cổ truyền thì việc

di th c m t số cây thuốc có giá trị về trồng và phát triển l m ư c liệu cũng l m t việc làm rất cần thiết

Trong đó khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) l ư c liệu đã đư c sử ụng từ

lâu trong y học cổ truyền phương đông để chữa nhiều ệnh như chống loạn nhịp tim c c chứng vi m xuất huyết ti u ho l v ký sinh tr ng Rễ của cây Khổ sâm (Sophorae Flavescentis Radix) đã đư c chứng minh trong thử nghiệm lâm sàng là không gây đ c đối v i con người Các nghi n cứu tr n thế gi i cho thấy cao chiết từ

rễ khổ sâm có chứa c c h p chất alkaloi v flavonoi có hoạt tính kh ng oxy hóa

kh ng vi m kh ng khuẩn v ức chế s ph t triển của m t số ng tế o ung thư như HepG2, MCF7 và A549 Tuy nhi n cơ chế tăng sinh ị ức chế trong tế bào HepG2 v BT474 ư i t c đ ng của chiết xuất từ rễ Khổ sâm vẫn chưa đư c nghiên cứu chuyên sâu

Tại Việt Nam, m t số chế phẩm đư c sản xuất từ cây Khổ sâm như Ninh tâm vương h tr trong ệnh lý nhịp tim nhanh Nữ vương h tr trong điều trị vi m nhiễm phụ khoa ở nữ gi i, tuy nhiên chủ yếu nhập nguyên liệu từ Trung Quốc Hệ quả là nguồn nguyên liệu còn bị đ ng và các đ nh gi chất lư ng ư c liệu chưa kiểm soát chặt chẽ Hiện nay, khổ sâm đã đư c i th c trồng tại Đắk Nông - Tây Nguy n bởi Công ty Cổ phần Dư c phẩm BV Pharma Từ đó, các nghiên cứu đ nh giá chất lư ng ư c liệu nhằm x c định thành phần h m lư ng hoạt chất có hoạt tính sinh học v x c định đ c tính là việc cần phải đư c th c hiện giúp chủ đ ng nguồn ư c liệu trong sản xuất v đảm ảo chất lư ng nguy n liệu Trong định

hư ng chiến lư c của ng nh ư c Việt Nam đến năm 2020 v tầm nh n đến năm

2030 cũng đã đề ra mục tiêu phát triển để Việt Nam có thể chủ đ ng đư c 60 % về thuốc v o năm 2020 m trong đó chú trọng đến thuốc có nguồn gốc th c vật Theo báo cáo của cục quản lý ư c và tổ chức IQVIA năm 2020 thuốc sản xuất trong

nư c chiếm 47 % nhu cầu sử dụng

Tuy vậy ư c điển Việt Nam V vẫn chưa có chuy n luận ri ng về ư c liệu

rễ khổ sâm đồng thời hiện nay chỉ có m t v i công tr nh nghi n cứu về ư c liệu khổ sâm tại Việt Nam, gây khó khăn trong đ nh gi chất lư ng ư c liệu thô v chế phẩm chứa ư c liệu n y trong nư c v ngoại nhập

Từ những lý do cấp thiết tr n đề t i: “Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây Khổ sâm

(Sophora flavescens Ait.)” trồng tại Tây Nguyên” đư c th c hiện

Mục tiêu nghiên cứu của luận án:

- Đ nh gi đư c m t số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết xuất từ rễ Khổ sâm trồng tại Việt Nam

Nội dung nghiên cứu chính của luận án:

- Đ nh gi chất lư ng ư c liệu

- Nghiên cứu tách chiết m t số hoạt chất chính trong rễ Khổ sâm

- Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hoá của các cao chiết rễ Khổ sâm

- Nghiên cứu khả năng kh ng ung thư của cao chiết rễ Khổ sâm trên các dòng tế o ung thư gan HepG2 v ng tế o ung thư vú BT474

Tính mới của đề tài:

- Các kết quả đư c th c hiện và công bố trong đề tài này là những nghiên cứu chuy n sâu đầy đủ nhất từ trư c t i nay tr n đối tư ng th c vật Khổ sâm di

th c đang đư c trồng tại Tây Nguyên

- Lần đầu ti n đ nh gi đư c tác dụng kháng oxy hóa và ức chế tăng sinh tế

o ung thư gan ung thư vú của cao rễ cây Khổ sâm trồng ở Tây Nguyên

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Việc x c định khả năng kh ng oxy hóa v ức chế tăng sinh tế o ung thư gan ung thư vú của cao CHCl3 từ rễ cây Khổ sâm đã góp phần khẳng định chất

lư ng của cây Khổ sâm đang trồng tại Tây Nguyên

- Phát hiện và chứng minh ư c tính của rễ cây Khổ sâm trồng tại Tây Nguy n đã góp phần xây d ng chiến lư c bảo tồn, phát triển và thương mại hóa cây Khổ sâm ở Tây Nguyên

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về thực vật học Khổ Sâm

Theo The Plant list, có 62 loài thu c chi Sophora đư c chấp nhận và phân bố

chủ yếu tại c c v ng Trung Đông Đông Á, Nam Mỹ và New Zealand [1]

1.1.1 Vị trí phân loại

Tên khoa học: Sophora flavescens Ait

Tên Việt Nam: Dã hòe, khổ cốt, Khổ sâm cho rễ (phân biệt v i Khổ sâm cho

lá - Croton tonkinensis Gagnep) sơn đậu căn địa sâm…

Theo hệ thống phân loại Takhtajan A.L (2009) cây Khổ sâm có vị trí phân loại thu c ng nh Ngọc lan (Magnoliophyta) l p Ngọc lan (Magnoliopsi a) phân

l p Hoa hồng (Rosi ae) li n Đậu (Fa anae) Đậu (Fa ales) họ Đậu

(Fabaceae), chi Sophora, loài Sophora flavescens Ait [2]

1.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái

Khổ sâm là cây bụi nhỏ có c c đặc điểm đặc trưng như: Thân cây cao 0,5 - 1,2 m; phân nhiều cành và c nh non có lông tơ rải rác; lá cây kép lông chim lẻ mọc

so le gồm 5 - 10 đôi, lá chét hình mác dài 3 - 4 cm, r ng 1 - 2 cm, dốc thuôn đầu nhọn hoặc hơi tù, mặt trên nhẵn, mặt ư i lông mịn màu xám; hoa màu vàng nhạt,

đ i 5 răng h nh chuông tr ng 5 c nh không đều, nhị 10, rời nhau, bầu có lông mịn

và cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùm dài 10 - 20 cm; quả đậu, thắt lại giữa các hạt, thuôn dài 5 - 12 cm, đường kính 5 - 8 mm, đầu có mỏ thuôn dài; hạt 3-7, hình cầu m u đen; rễ hình trụ dài, vỏ ngoài màu vàng trắng [3, 4]

Theo ư c điển Trung Quốc 2015 (DĐTQ), rễ Khổ sâm có dạng hình trụ dài

10 – 30 cm đường kính từ 1 đến 6,5cm và phân nhánh phần phía ư i Bề mặt ngoài của rễ có màu nâu xám hoặc nâu vàng, có nếp nhăn ọc theo rễ và có các nốt sần Vỏ ngoài của rễ có màu vàng, mỏng và nhẵn, dễ gãy và cu n lại, dễ bong tróc Mặt cắt rễ có màu vàng trắng, cứng, không dễ gãy, dạng s i có kết cấu xuyên tâm

và có bó mạch không điển h nh trong c c v ng đồng tâm hoặc phân tán rời rạc Rễ cây Khổ sâm có vị đắng [5]

Hình 1.1: B phận trên mặt đất (A) và rễ (B) của Khổ sâm [6]

1.1.3 Phân bố sinh thái, thu hái và chế biến

Khổ sâm có nguồn gốc ở Trung Quốc đư c di th c vào Việt Nam v o đầu những năm 1970 Chúng là cây sống lâu năm về m a đông phần trên tàn lụi, phần gốc còn lại sẽ nảy mầm vào giữa m a xuân năm sau Cây ưa s ng ưa ẩm, thích nghi

v i điều kiện của nư c ôn đ i ẩm và vùng nhiệt đ i núi cao, nhiệt đ trung bình năm khoảng 15 o

C Cây trồng ở Sa Pa sinh trưởng tốt, ra hoa nhiều nhưng không có quả [3]

Khổ sâm đư c công ty cổ phần sản xuất chế biến nông lâm sản ư c liệu sạch Đắk Nông trồng để lấy ư c liệu Rễ sau khi thu h i đư c rửa sạch đất cát, thái phiến phơi khô, hoặc đem rễ tươi ngâm nư c vo gạo nếp m t đ m rửa sạch để trong 3 giờ rồi thái phiến phơi khô [3]

1.1.4 Thành phần hóa học

Các công trình nghiên cứu về cây Khổ sâm chủ yếu từ các nhà khoa học Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản Nga nơi m lo i cây n y chủ yếu tập trung phân

bố Tính đến năm 2015 đã có hơn 200 h p chất đư c phân lập v x c định cấu trúc

từ ư c liệu này bao gồm: 47 alkaloid, 9 terpenoid, 124 flavonoid (3 isoflavanon,

41 flavanon, 15 flavonol, 13 flavanonol, 27 isoflavon, 2 homoisoflavon, 7 chalcon,

2 biflavonoid, 14 pterocarpan), và 26 chất là thành phần khác như lignan phenylpropanoid, coumarin và phenolic acid, trong đó hai nhóm hoạt chất chủ yếu

đó là flavonoid và alkaloid [6]

Kuraramin Isokuraramin Sophocarpin Isosophocarpin

7,11-Dehydromatrin Matrine 9a-Hydroxysophocarpin Sophoridin

Lupanin 9a-hydroxysophoramin Isomatrine Oxysophocarpin

7a-hydroxysophoramin Sophoranol Oxymatrine Leontalbinin N-oxid

9a-hydroxymatrin Mamanin Lamprolobin

Hình 1.2: M t số thành phần alkaloid của Khổ sâm [6]

Ở Việt Nam, công trình nghiên cứu chiết xuất, phân lập các h p chất trong rễ Khổ sâm còn hạn chế M t số tài liệu tham khảo tiếng Việt chỉ viết về Khổ sâm nói chung, và chủ yếu viết về mô tả h nh th i đặc tính sinh thái, nguồn gốc xuất xứ, hay bài thuốc đông y có th nh phần Khổ sâm phối h p v i các vị thuốc khác và các ứng dụng trong dân gian Năm 2015 Trần Hồng Quang và c ng s tiến hành chiết tách các flavonoid từ rễ Khổ sâm gồm isoxanthohumol, norkurarinon, kurarinon, 2-methoxykurarinon, kushenol T, norkurarinol, kuraridin và formononetin [7] Năm

2019, Phan Nguyễn Trường Thắng và c ng s đã tiến hành phân lập ba h p chất

flavonoid từ rễ Khổ sâm là isoxanthohumol, kurarinon, (2S)-2’-methoxykurarinon

[8]

1.1.4.1 Alkaloid

Alkaloid là thành phần hóa học có hoạt tính chính trong Khổ sâm Hiện nay

có khoảng 27 alkaloi đã đư c phân lập v x c định cấu trúc từ rễ Khổ sâm, 20 alkaloid khác từ các b phận trên mặt đất của Khổ sâm như hoa và hạt của cây đã

đư c báo cáo [9] C c alkaloi đư c phân loại d a vào cấu trúc bao gồm: cấu trúc kiểu matrine, cấu trúc kiểu cytisin, cấu trúc kiểu anagyrin và cấu trúc kiểu lupinin (Hình 1.2) [10, 11, 12]

1.1.4.2 Flavonoid

Flavonoid là nhóm l n nhất của h p chất polyphenol và hầu hết đều có màu Flavonoid có cấu trúc mạch car on cơ ản là C6 – C3 – C6, trong đó gốc C6 (B) gắn tại vị trí C3 có nguồn gốc từ con đường shikimic; C6 (A) còn lại có nguồn gốc từ s

h p lại của 3 phân tử acetic acid [13, 14]

C C

C A

B

Hình 1.3: Khung cấu trúc chung của flavonoid

Từ các b phận của cây Khổ sâm, 124 h p chất nhóm flavonoi đã đư c phân lập như kushenol A, B, C, E, F, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, U, V, W, X,

kurarinon, isokurarinon, norkurarinon, (2S)-2’-methoxykurarinon, kurarinol,

neokurarinol, norkurarinol, kosamol A, leachianone A, leachianone G,

sophoraflavanone G, 8- lavan ulylkaempferol formononetin v isoxanthohumol đã

đã đƣ c phân lập từ rễ Khổ sâm 12 dẫn xuất dibenzoyl m i (sophodibenzosid A-L)

đã đƣ c tinh chế từ phân đoạn cao chiết n-butanol của Khổ sâm Các chất khác nhƣ syringin, corchionosid C, coniferin, piscidic acid và benzyl O-β-D-glucopyranosid cũng đã đƣ c phân lập từ thân và lá của cây này [21, 22]

1.1.5 Tác dụng dược lý của Khổ Sâm

Các hoạt chất của Khổ sâm có tác dụng ƣ c lý khác nhau: tác dụng đối v i trung khu thần kinh, kháng viêm, kháng oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, tác dụng l i tiểu, tác dụng đối v i huyết áp, tác dụng đối v i dạ dày và ru t M t số nghiên cứu m i đây cho thấy chúng còn có khả năng kh ng ung thƣ của tế bào ung thƣ Trung tâm quản lý ƣ c phẩm và th c phẩm Trung Quốc về việc chứng nhận sản xuất thuốc đã liệt kê ra 20 ứng dụng lâm sàng cho các chế phẩm matrine và oxymatrine Những ƣ c phẩm này bao gồm: thuốc đạn, viên nén, hạt, viên nang, cốm, viên nang và thuốc tiêm pha liều đã đƣ c sử dụng ở Trung Quốc để chữa các bệnh nhiễm trùng và bệnh tim mạch [6] Ngoài ra, sản phẩm thuốc và th c phẩm

chức năng từ rễ Khổ sâm nhƣ thuốc tiêm Yanshu, Fufang kushen, viên nén Kushen

Pian, th c phẩm bổ sung Kushen Hawaii Pham v Kushen Nature’s Health đƣ c sản xuất d a trên những thành phần alkaloid của ƣ c liệu này

1.1.5.1 T ụ g h g i

Các nghiên cứu in vivo và in vitro đã chỉ ra rằng Khổ sâm ức chế phản ứng

vi m v ngăn chặn tình trạng viêm, bao gồm cả việc ức chế sản xuất COX-2, iNOS,

NO, IL-8, IL-6 và TNF-α Chiết xuất từ rễ Khổ sâm v i liều ng 200 mg/kg ức chế phản ứng phản vệ a thông qua ƣỡng o (mast cell), giảm s phóng thích histamine từ ƣỡng o của phúc mạc tr n chu t, tr c tiếp l m giảm iểu hiện của phorbol 12-myristate 13-axetat (PMA) và giảm kích thích TNF-a, IL-6 và IL-8 bởi calcium ionophore A23187 [23] Các hoạt chất đƣ c phân lập từ Khổ sâm nhƣ

7 9 2’ 4’-Tetrahydroxy-8-isopentenyl-5-methoxychalcone có hoạt tính ức chế vi

khuẩn Staphylococcus aureus Dư c phẩm đư c bào chế từ rễ Khổ sâm dạng nano

SFNP có khả năng kh ng vi m hiệu quả [24, 25, 26]

1.1.5.2 T ụ g h g h i ị he ễ

Trong dân gian, rễ Khổ sâm đư c sử dụng phổ biến điều trị các bệnh dị ứng như vi m a ị ứng và hen suyễn Phân đoạn dịch chiết MeOH của rễ Khổ sâm v i liều dùng 50 – 200 mg/kg đư c chuyển v o cơ thể chu t cho thấy ức chế đ ng kể chất dẫn truyền thần kinh serotonin liên quan t i ngứa và gãi ở chu t [27] Wen và

c ng s ứng dụng Khổ sâm đưa v o dạ dày chu t bị hen suyễn dị ứng trong 17 ngày cho thấy kết quả giảm đ ng kể s tăng phản ứng đường thở (airway-hyperreactivity), giảm vi m đường thở và giảm nồng đ các globulin miễn dich IgE, IL-4 và IL-5 trong nuôi cấy tế bào lách của chu t [28] Dạng thuốc dung dịch chống hen suyễn đư c bào chế từ rễ Khổ sâm cho thấy khả năng l m giảm đ ng kể dị ứng tăng phản ứng đường thở ở chu t và ức chế acetylcholine trong co thắt cơ trơn phế quản [29]

1.1.5.3 T ụ g h g h ẩ , virut

Từ xa xưa rễ Khổ sâm đã đư c dùng làm thuốc trị nhiễm trùng v i tính năng kháng khuẩn vư t tr i Gần đây cũng đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn của cây Khổ sâm Dịch chiết xuất nư c từ rễ Khổ sâm cho hoạt tính kháng

khuẩn tr n c c đối tư ng như Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus sp., Bacillus dysenteriae, Salmonella sp và Bacillus proteus [30]

Dịch chiết EA rễ Khổ sâm có khả năng ức chế virut Herpes loại I và II (HSV-1 và 2) v i các giá trị EC50 lần lư t là 125 mg/mL và 93,37 mg/mL [31] Ma và c ng s thí nghiệm trên 40 loại ư c liệu trong điều trị bệnh hô hấp và các bệnh truyền nhiễm đường ru t bằng phương ph p thử nghiệm hiệu ứng tế bào cho thấy hoạt tính kháng virut của rễ Khổ sâm l vư t tr i v i IC50 là 50 mg/mL và chỉ số chọn lọc là

16 [32]

Thử nghiệm ư c lý và quan sát lâm sàng cho thấy dịch chiết của rễ Khổ

sâm có tác dụng diệt côn tr ng tr n c c đối tư ng như Trichomonas, bệnh sán máng (Schistosomiasis) và Toxoplasma gondii [33] Dịch chiết EtOH từ rễ Khổ sâm cho thấy hiệu quả giảm s sao chép của T.gondii t i 98,7 % tại liều dùng 0,156 mg/mL

và Neospora caninum t i 98,6 % tại liều dùng 0,16 mg/mL Dịch chiết aceton của

rễ Khổ sâm tại nồng đ 0,2 g/mL có khả năng chống lại s tăng trưởng của Candida albicans ở mức 33 % và Saccharomyces cerevisiae ở mức 23 % [34]

Từ các kết quả cho thấy ngoài ứng dụng làm thuốc trị nhiễm trùng cho con người đặc tính kháng khuẩn của rễ Khổ sâm còn có khả năng to l n trong lĩnh v c bảo quản th c phẩm v ư c phẩm chống lại s tấn công từ vi khuẩn

1.1.5.4 T g ới h h g i h

Tác dụng ch ng lo n nhịp tim

Dịch chiết chứa alkaloi đư c phân lập từ rễ Khổ sâm cho thấy tác dụng chống lại chứng loạn nhịp tim đư c t c đ ng từ CHCl3 và isoproterenol gây ra ở mèo trong trạng thái gây mê Kết quả tương t thu đư c khi thử nghiệm trên chu t

đư c t c đ ng do ouabain, BaCl2 và strophanthin Dịch chiết chứa flavonoi đư c phân lập từ Khổ sâm có tác dụng chống lại rung nhĩ do chloroformind gây ra ở chu t hay CHCl3 gây ra ở thỏ [35] Kết quả nghiên cứu khác cho thấy rằng, hàm

lư ng flavonoid trong khoảng 125 - 250 mg/mL đư c phân lập từ Khổ sâm làm chậm tần số xung t phát trong tế o cơ tim của chu t sơ sinh v giảm chứng loạn nhịp tim gây ra bởi strophanthin [36]

Tác dụng ch g ơ hó ơ i

Th c hiện thí nghiệm trên chu t và tiến h nh xơ hóa cơ tim gây ra ằng isoprenaline (5 mg/kg), dùng liều 200 v 400 mg/kg flavonoi đư c phân lập từ Khổ sâm có tác dụng làm giảm hoạt đ ng của enzyme xúc tác creatine kinase (enzyme chuyển hóa creatine th nh phosphocreatine) trong m u v tăng hoạt đ ng của enzyme superoxide dismutase (enzyme phân hủy gốc superoxide) trong tâm thất trái [37]

t nhiên, và hoạt đ ng của tăng hoạt đ ng của myeloperoxidate [39] Liều dùng từ

25 – 100 mg/kg Khổ sâm m i ngày trong thời gian 14 ngày liên tục có tác dụng làm tăng đại th c bào giúp tiêu diệt khối u H22 kích thích đại th c bào sản sinh NO dạng hoạt đ ng [40]

1.2 Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa

1.2.1 G c t do và stress oxy hóa

tế bào gây tổn hại đến c c đại phân tử sinh học như DNA protein, lipid, carbohydrate làm tổn thương tế bào và phá vỡ cân bằng n i môi Tất cả các phân tử trong cơ thể đều có thể là mục tiêu của gốc t o trong đó protein nucleic acid và lipid là dễ bị tấn công và gây ra hậu quả nghiêm trọng hơn cả [42, 43, 44, 45]

1.2.1.2 S h h h h g g ơ hể g i

Các gốc t o nói chung v c c ROS nói ri ng đều có thể xuất phát từ các

qu tr nh trao đổi chất thiết yếu nh thường trong cơ thể người, hoặc từ s t c đ ng của các yếu tố môi trường như tia X ozone khói thuốc lá, các chất ô nhiễm trong không khí hoặc các hóa chất công nghiệp [46] S hình thành gốc t do diễn ra m t cách liên tục trong tế bào bởi cả các phản ứng có hoặc không có s xúc tác của enzyme Các phản ứng enzyme trong chu i hô hấp tế bào, trong s th c bào, trong

s tổng h p prostaglandin, và trong hệ thống cytochrome P-450 đư c coi là nguồn gốc chính tạo ra các gốc t o trong cơ thể Trong các phản ứng không có s tham gia của enzyme, oxy tác dụng v i các h p chất hữu cơ cũng tạo ra gốc t do [47]

1.2.1.3 G g i h họ

Trong sinh học, các phản ứng của gốc t do tạo ra những biến đổi càng bất

l i cho cơ thể khi tuổi c ng cao Ung thư v xơ vữa đ ng mạch l hai căn ệnh hiểm nghèo điển h nh đư c gây ra bởi gốc t o Giai đoạn khởi đầu v giai đoạn phát triển của bệnh ung thư đều li n quan đến s khiếm khuyết của nhiễm sắc thể và s

khởi đ ng gene ung thư có thể là do các phản ứng của gốc t do n i sinh gây ra, theo cách giống như o c c ức xạ ion hóa, và dẫn t i hình thành khối u Người ta thấy ở những người trên tuổi 55, có m t s tương quan rõ rệt giữa tỷ lệ tử vong do bệnh bạch cầu, ung thư c tính ở vú, buồng trứng, tr c tràng v i mức đ tiêu thụ chất béo và các loại dầu Điều đó có thể là do s peroxide hóa lipid ở những người này xảy ra v i tốc đ cao hơn nh thường [48, 49] Chứng xơ vữa đ ng mạch do các phản ứng sinh gốc t do từ thức ăn nhiều lipid xảy ra trên thành mạch hoặc trong huyết gây ra s tổn thương c c tế bào [50]

Trạng thái khử m t điện tử của phân tử O2, hoạt đ ng yếu nhưng

có thể làm phóng thích Fe2+ từ các protein Fe-S và ferritin O2- có thể ghép đôi để tạo ra H2O2 m t cách t sinh, hoặc đư c xúc tác bởi enzyme, và hình thành gốc OH xúc tác bởi kim loại

ROOH Đư c tạo ra bởi các phản ứng giữa bức xạ v i lipid

RO• (alkoxy)

ROO• (peroxy)

Các gốc t do hữu cơ có tâm l oxygen Lipid tham gia vào các phản ứng peroxid hóa đư c tạo thành khi có s hiện diện của oxygen nhờ thêm gốc để hình thành liên kết đôi v loại hydrogen

HClO

(hypochlorous

acid)

Hình thành từ H2O2 bởi myeloperoxidase, phản ứng rất mạnh trong quá trình oxy hóa protein, gồm nhóm thiol, amino và methionine

ONOO-

(peroxynitrite)

Là m t đồng phân của nitric acid đư c hình thành từ phản ứng giữa O2- và NO, tan trong lipid và khả năng phản ứng tương đương v i HClO

1.2.1.4 S e hó h ở g i

Stress oxy hóa là m t thuật ngữ ng để chỉ tình trạng tổn hại do s oxy hóa diễn ra có s mất cân bằng giữa tốc đ tạo gốc t do và tốc đ tạo các chất bảo vệ kháng oxy hóa Stress oxy hóa làm tổn hại nhiều đại phân tử sinh học như nucleic acid, protein, lipid Stress oxy hóa trong thời gian ngắn có thể diễn ra trong mô bị tổn thương o s chấn thương nhiễm trùng, bỏng nhiệt đ c tố hoặc do tập thể dục quá sức C c mô n y sinh ra c c enzyme như xanthine oxi ase lipoxygenase, cyclooxygenase, hoạt hóa các quá trình th c bào, giải phóng các ion t do, các ion đồng, hoặc phá vỡ các chu i vận chuyển điện tử của quá trình phosphoryl hóa - oxy hóa và tạo ra ROS lư ng l n Giai đoạn khởi ph t tăng sinh v ph t triển của bệnh ung thư hoặc các tác dụng phụ của quá trình hóa trị và xạ trị đều có li n quan đến

s mất cân bằng giữa ROS và hệ thống phòng vệ kháng oxy hóa ROS có liên quan đến các biến chứng của đ i th o đường, các bệnh về mắt ở người l n tuổi, và các bệnh do thoái hóa thần kinh như ệnh Parkinson [52]

Người ta cho rằng, stress oxy hóa là nguyên nhân gây nên chứng xơ vữa

đ ng mạch, các bệnh về viêm, m t số bệnh ung thư v qu tr nh lão hóa Stress oxy hóa là m t trong các nguyên nhân chính gây ra các bệnh về vi m như: vi m kh p, viêm mạch, viêm cầu thận lupus an đỏ, các triệu chứng của bệnh hô hấp ở người

l n, bệnh thiếu máu cục b (bệnh tim đ t qu , thiếu máu cục b ở ru t), h i chứng suy giảm miễn dịch (AIDS), bệnh khí thủng, cấy ghép n i tạng, viêm loét dạ dày, tăng huyết áp và tiền sản giật, rối loạn thần kinh (Alzheimer Parkinson teo cơ) nghiện rư u, các bệnh li n quan đến hút thuốc lá, và nhiều bệnh khác [53]

1.2.2 Chất kháng oxy hóa

M t chất đư c coi là có khả năng kh ng oxy hóa khi nó l m t phân tử đủ bền và có khả năng cho m t điện tử đến gốc t do và trung hòa nó, từ đó loại trừ khả năng gây hại của nó Các chất kháng oxy hóa làm chậm hoặc ngăn chặn các tổn hại của tế bào chủ yếu nhờ đặc tính bắt gốc t do Các chất kh ng oxy hóa thường

có phân tử lư ng nhỏ, có thể tương t c m t cách an toàn v i các gốc t do và kết thúc chu i phản ứng trư c khi chúng làm hại c c đại phân tử sinh học Cơ thể có khả năng sinh ra m t số chất kháng oxy hóa quan trọng như glutathione u iquinol

và uric acid; chúng đư c sinh ra trong quá trình biến ưỡng nh thường của cơ thể [54] M t số chất kháng oxy hóa khác yếu hơn có sẵn trong thức ăn Mặc dù có

nhiều hệ enzyme trong cơ thể có thể bắt gốc t o nhƣng c c chất inh ƣỡng vi

lƣ ng (vitamins) có hoạt tính kh ng oxy hóa l vitamin E (α-tocopherol), vitamin C (ascor ic aci ) v β-carotene vẫn rất cần thiết cho cơ thể [55] Cơ thể chúng ta không thể sản xuất ra các yếu tố vi lƣ ng này, mà phải lấy từ thức ăn

1.2.2.1 H h g h g h g hó

Các chất kháng oxy hóa hoạt đ ng nhƣ những yếu tố bắt gốc t do, cho

hy rogen cho điện tử, phân hủy peroxide, dập tắt các oxy nguyên tử, ức chế enzyme, chất h tr , bắt kim loại Cả các những chất kháng oxy hóa theo cách có hoặc không có s xúc tác của enzyme đều tồn tại trong tế bào và ngoài tế o để khử ROS [56]

1.2.2.2 ơ hế h g ủ h h g hó

Có hai cơ chế chính về t c đ ng của chất kh ng oxy hóa đã đƣ c đề nghị: (1)

L m gi n đoạn chu i phản ứng của gốc t do bằng c ch cho điện tử vào gốc t do

để trung hòa chúng, và (2) s loại bỏ các yếu tố kích hoạt ROS/RNS bằng cách ngăn chặn s khởi đ ng chu i phản ứng của các gốc t do Các chất kháng oxy hóa

có thể tạo ra t c đ ng lên hệ thống sinh học bằng nhiều cơ chế kh c nhau nhƣ s cho điện tử, bắt cặp ion kim loại, nhờ các chất đồng kháng oxy hóa, hoặc bởi s điều hòa biểu hiện gen [57]

1.2.2.3 h g hó

Chất kháng oxy hóa trong các hệ thống phòng vệ của cơ thể hoạt đ ng ở nhiều cấp đ khác nhau, từ phòng ngừa, tiêu diệt gốc t do, sửa chữa lại và cuối cùng là s thích nghi

C 1: Phòng ngừa

Các chất kháng oxy hóa ở cấp đ này có tác dụng ngăn cản s hình thành gốc

t do Mặc cơ chế chính xác và vị trí hình thành gốc t do in vivo c n chƣa iết

đƣ c thấu đ o nhƣng qu tr nh phân hủy các hydroperoxide và hydrogen peroxide

đƣ c cảm ứng bởi kim loại có thể là m t trong những nguồn chính sinh ra gốc t

o Để ngăn chặn những phản ứng này, m t số chất kháng oxy hóa khử các

hy roperoxi e v hy rogen peroxi e th nh nƣ c và các alcol trƣ c khi chúng gây hại o đó không tạo ra đƣ c gốc t do và m t số ion kim loại t do

Glutathion peroxidase, glutathione-s-transferase, phospholipid hydroperoxide glutathione peroxi ase (PHGPX) v peroxi ase đƣ c cho là phân hủy các lipid

hydroperoxide th nh c c alcol tương ứng PHGPX là thành phần duy nhất có thể khử các hydroperoxide của các phospholipid màng Glutathione peroxidase và catalase khử hy rogen peroxi e th nh nư c

C 2: Bắt g c t do

Các chất kháng oxy hóa bắt và tiêu diệt các gốc t o để chặn s khởi đầu và/hoặc l m gi n đoạn s lan truyền các chu i phản ứng của chúng Nhiều chất kháng oxy hóa có khả năng ắt gốc t do n i sinh trong đó m t số ưa nư c như: Vitamin C, uric acid, bilirubin, albumin và các thiol; m t số ưa lipi như: vitamin E,

u iquinol Trong nhóm ưa lipi vitamin E đư c coi là chất kháng oxy hóa tốt hơn

cả

C 3: Sửa ch a và phục hồi l i ho t tính

Các enzyme thủy giải protein, các proteinase, các protease và các peptidase, hiện diện trong cytosol và ti thể của tế o đ ng vật, nhận dạng, làm suy giảm, và loại bỏ c c proteins đã ị oxy hóa ngăn chặn s tích tụ của chúng trong tế bào

Các hệ thống sửa chữa DNA cũng đóng m t vai trò c c kỳ quan trọng trong

hệ thống phòng vệ chung của tế bào chống lại s tổn hại do oxy hóa Nhiều loại enzyme như c c glycosylase v c c nuclease sửa chữa DNA đã đư c biết đến

M t chức năng quan trọng kh c đư c gọi là s thích nghi, s sản sinh và các phản ứng của gốc t o cũng l tín hiệu cảm ứng cho s hình thành và vận chuyển các chất kh ng oxy hóa tương ứng đến đúng ngay vị trí tế bào cần [16]

1.2.3 Hoạt tính kháng oxi hóa của flavonoid trong rễ cây Khổ sâm

Flavonoid là m t trong những thành phần có hoạt tính sinh học chính của rễ

Khổ sâm đã đư c x c định có tác dụng ư c lý in vitro và in vivo [6] Các dẫn chất

flavonoid có hoạt tính dập tắt các gốc t do ROS, RNS, tiêu biểu như HOO, ROO,

NO Flavonoid có thể tạo đư c phức v i các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hoá; bảo vệ tế bào và thể ngăn ngừa các nguy cơ như xơ vữa đ ng mạch, tai biến mạch, lão hoá , tổn thương o ức xạ, thoái hoá gan; kháng viêm bằng cách ức chế con đường tổng h p prostaglandin; điều hòa nhịp tim v tăng tuần hoàn máu; chống lão suy, rối loạn trí nh , mất tập trung [15]

Xiang-Lan Piao và c ng s đã ng c c thử nghiệm sinh học chứng minh

đư c rằng, cao butanol chiết từ rễ Khổ sâm có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh

Phương ph p HPLC đư c sử dụng ghép MS đã x c định đư c cấu trúc của 2 flavonoid là sophoraflavonone và kurarinone, có khả năng ắt gốc t do DPPH• v i chỉ số IC50 tương ứng là 5,26 và 7,73 µg/mL [14] Kết quả của nhóm nghiên cứu Kim JH và c ng s tiếp tục khẳng định rằng, các flavonoid trong rễ Khổ sâm có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh [58, 59]

1.3 Tổng quan về hoạt tính kháng tế bào ung thư:

1.3.1 Quá trình Apoptosis

Apoptosis (s chết theo chương tr nh) l qu tr nh chết có kiểm so t của tế

o ở c c lo i đ ng vật đa o [60] Quá trình apoptosis iễn ra qua 2 giai đoạn Trư c hết l s cô đặc nhân v nhiễm sắc chất của tế o v phân cắt tế o th nh nhiều mảnh nhỏ m l n ề mặt gọi l c c thể apoptotic Trong giai đoạn thứ hai

c c thể apoptotic đư c t ch ra trải qua qu tr nh iến đổi tương t như s th c bào

in vitro n trong phagosome v ị phân hủy nhanh chóng ởi c c enzyme

lysosome [61, 62] Apoptosis l c c qu tr nh enzyme hóa c c phần tử đư c sắp theo trật t nhất định m khi đến điểm kết thúc ẫn đến s chết tế o v ly giải DNA th nh c c đoạn nucleosome đặc trưng Qu tr nh apoptosis iễn ra thường xuy n v xuy n suốt từ giai đoạn ph t triển phôi thai cho đến khi cơ thể trưởng thành Apoptosis đóng vai tr quan trọng trong c c qu tr nh sinh lý kh c của cơ thể như s t i cấu trúc mô v điều h a c c phản ứng miễn ịch Qu tr nh apoptosis đ i hỏi phải có s chính x c về tín hiệu v phải có s kiểm so t chặt chẽ thông qua m t mạng lư i tín hiệu để có thể phản ứng nhanh v kịp thời đối v i c c tín hiệu n i o

v ngoại o S suy giảm c c yếu tố tăng trưởng c c hormone pepti e đặc hiệu s thay đổi calcium n i o hoặc ngoại o tổn thương DNA chất đ c ty thể có thể cảm ứng qu tr nh apoptosis M i tín hiệu kích hoạt sẽ ẫn đến m t con đường kh c nhau trong apoptosis [63]

1.3.2 Quá trình Necrosis

Necrosis (s chết tế o o hoại tử) l s chết tế o gây ra o tổn thương cấp tính ở tế o đư c gây ra ởi c c yếu tố n ngo i tế o hoặc mô ví ụ như o nhiễm tr ng đ c tố hoặc tổn thương Necrosis xảy ra không tuân theo các con đường tín hiệu trong apoptosis m nhiều thụ thể sẽ đư c hoạt hóa ẫn đến đ nh mất tính to n vẹn của m ng tế o v c c sản phẩm của s chết tế o sẽ đư c ph t t n

v o không gian ngoại o m t c ch không thể kiểm so t [64] Việc ph t t n c c sản

phẩm n y sẽ khơi m o c c phản ứng vi m ở c c mô xung quanh thu hút c c ạch cầu v đại th c o ở gần đó đến để ti u iệt chúng ằng c ch th c o Tuy nhi n

c c chất ti u iệt vi khuẩn m ạch cầu tiết ra cũng đồng thời gây hại đến c c mô ở xung quanh đó Việc tổn hại đến c c mô xung quanh n y ngăn cản qu tr nh chữa

l nh o đó những tế o chết o hoại tử m không đƣ c điều trị sẽ h nh th nh n n những khối mô chết v mảnh vỡ tế o

Hình 1.4: Phân iệt s kh c nhau giữa Apoptosis v Necrosis [62, 64]

Để phân tích c c tế o apoptosis v necrosis trong quần thể tế o có thể sử ụng c ch đ nh gi h nh th i ằng việc quan s t ƣ i kính hiển vi trong thời gian dài (time-lapse microscopy) kỹ thuật flow fluorocytometry hoặc ằng kính hiển vi điện tử truyền qua Cũng có những kỹ thuật sinh hóa để phân tích c c marker ề mặt tế o (phosphati ylserine v tính thấm ề mặt tế o ằng kỹ thuật flow cytometry) c c phân tử đặc trƣng cho tế o nhƣ c c mảnh DNA ( ằng kỹ thuật flow cytometry), s hoạt hóa caspase cắt ỏ Bi v s ph t t n cytochrome c ( ằng

kỹ thuật Western lot) [65]

1.3.3 Hoạt tính kháng ung thư từ rễ Khổ sâm

Các nghiên cứu ư c lý hiện đại đã chỉ ra rằng: matrine có rất nhiều tác dụng như kháng ung thư, kháng virus, kháng viêm, bảo vệ gan, chống loạn nhịp tim, giảm đau hạ sốt, chống sốc phản vệ và trị hen [66, 67, 68, 69]

Oxymatrine đư c chứng minh là có các hiệu quả như l kh ng vi m kháng ung thư, chống tăng huyết áp, chống oxy hóa, chống loạn thần, kháng virus, chức năng ảo vệ gan, ức chế phản ứng miễn dịch và giảm qu tr nh xơ hóa gan [70, 71, 72] Các dẫn xuất oxysophocarpin, sophocarpin và lehmannin v i liều 0,2 mmol/mL cho thấy hoạt tính kh ng HBV đ ng kể v i hiệu l c tương ứng là 48,3 %, 57,2 %, 52,6 % và chống s bài tiết HbeAg lần lư t là: 24,6 %, 34,6 % và 25,4 %

Các nghiên cứu th c nghiệm phát hiện cơ chế chống khối u của Khổ sâm,

bao gồm gây ra quá trình chết theo chương tr nh apoptosis khiến tế o ung thư biệt hóa thành tế bào bình thường, ức chế m t số hoạt đ ng của enzyme, ức chế tổng h p DNA của tế o ung thư ảnh hưởng đến quá trình bắt giữ chu kỳ tế bào và

s i căn của khối u, kiểm soát mức đ biểu hiện của các yếu tố li n quan đến khối

u và ảnh hưởng đến hoạt đ ng của telomerase Tuy nhi n điều quan trọng cần lưu ý

là hầu hết nghiên cứu hoạt đ ng chống khối u đều sử dụng c c phương ph p a

trên in vitro v o đó cần khuyến khích các thử nghiệm in vivo hơn nữa

Nghiên cứu in vitro cho thấy chiết xuất nư c của Khổ sâm, ở nồng đ 100 và

200 μg/mL đã ức chế s phát triển dòng tế o ung thư iểu mô (EAC) v i tỷ lệ ức chế lần lư t là 50 % và 66 % Nghiên cứu khác về chiết xuất EtOH của rễ Khổ sâm (95 % EtOH, tỷ lệ ư c liệu: dung môi chiết là 1: 9, hồi lưu nhiệt 80 phút) đã chứng minh ức chế đ ng kể s tăng sinh của tế o HT29 ung thư ru t kết v i tỷ lệ ức chế tương đối cao như đư c phân tích bởi thử nghiệm matrine [73] Ngoài ra, lectin gắn

v i mannose phân lập từ rễ Khổ sâm đã ức chế rõ rệt s phát triển của tế bào

MCF-7 phụ thu c vào liều lư ng và thời gian và v i giá trị IC50 l 20 μg/mL Dịch chiết xuất từ Khổ sâm cho thấy tác dụng gây đ c tế bào mạnh mẽ trong các tế bào HeLa bằng cách gây ra quá trình chết theo chương tr nh rụng theo cách phụ thu c vào thời gian và liều lư ng, và các dịch chiết khác nhau từ Khổ sâm trong khoảng 0 01 đến 5 mg/mL có tác dụng ức chế mạnh đối v i s phát triển của tế bào HeLa [74, 75, 76,

77, 78, 79, 80, 81, 82]

Nghiên cứu in vivo cho thấy c c flavonoi đư c phân lập từ rễ Khổ sâm ức

chế s phát triển các dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư gan H22 sarcoma 180 (S180) ung thư phổi Lewis ung thư iểu mô vảy ở người Eca-109 và dòng tế bào H460 ung thư phổi, v i tỷ lệ ức chế lần lư t là 40 %, 82,14 %, 59,74 %, 42,71 % và 46,8 % và v i liều dung nạp tối đa ằng đường uống hoặc ti m tĩnh mạch của chiết xuất l hơn 2 8 g/kg hoặc 0,75 g/kg tương ứng [83, 84, 85]

1.3.4 Dòng tế bào ung thư gan

Theo Dư c thư quốc gia 2, tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam rất cao Tỷ lệ người mang kháng nguyên bề mặt của HBV (HBsAg) ở người khỏe mạnh từ 11 % đến 25 %, tùy theo từng v ng địa lý Theo ư c tính của Tổ chức Y tế thế gi i (WHO) thì Việt Nam có khoảng 8 triệu người nhiễm HBV v ung thư gan nguy n phát là nguyên nhân thứ hai gây tử vong ở nam gi i [86]

Hình 1.5: Dòng tế bào ung thư gan HepG2 [87]

Ở nhiều nghiên cứu khoa học, các xét nghiệm lâm sàng chủ yếu d a trên tế

o đ ng vật do chi phí thấp đ lặp lại cao và vấn đề đạo đức sinh học; trong khi

đó c c nghi n cứu lâm sàng trên dòng tế o người phần l n đều sử dụng tế bào gan, m t cơ quan trung tâm để th c hiện các cân bằng n i môi hóa học trong quá trình tổng h p protein và giải đ c cơ thể

HepG2 là m t dòng tế bào ung thu gan ở người có nguồn gốc từ bệnh ung thu biểu mô tế bào gan của m t nam gi i da trắng 15 tuổi và theo hình thái học chúng thu c loại biểu mô (Epithelial) Qua xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ

(karyotype), MN (modal number) = 55 và có s sắp xếp lại m t nhiễm sắc thể

Dòng tế o n y thường xuy n đư c dùng trong các nghiên cứu in vitro do chúng

có mức đ biệt hóa cao về hình thái học và chức năng ễ xử lý, không chứa virut

và cho kết quả ổn định trong quá trình thí nghiệm [87]

Cơ chế sinh học phân tử của ung thu gan chưa th c s rõ ràng, nhưng có a

cơ chế đư c công nhận bao gồm:

Cơ chế 1: đầu ti n ung thư gan nguy n ph t l khối u có nhiều mạch máu, biểu hiện của các yếu tố tăng sinh mạch (VEGF) điều này dẫn đến s phát triển của các thuốc điều trị nhắm trúng đích VEGF và hoặc thụ thể của VEGF (VEGFR)

Cơ chế 2: m t số bằng chứng cho thấy vai trò của các thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) hoặc con đường tín hiệu EGF (HER1) trong các chất sinh ung thư v con đường ung thư ho của ung thư iểu mô tế bào gan Những thông tin

n y đã ẫn đến việc thăm hiệu quả của m t số thuốc ức chế EGFR như c c TKI (erlotinib) và thuốc ức chế kháng thể đơn dòng EGFR (cetuximab)

Cơ chế 3: li n quan đến sinh bệnh ung thư gan nguy n ph t l con đường Raf/MAP kinase- ERK kinase (MEK)/ tín hiệu ngoại o quy định kinase (ERK) Raf (thụ thể yếu tố kích hoạt) kinase là m t thành phần thiết yếu của con đường MAP kinase đây l m t cơ chế truyền tín hiệu quan trọng m điều chỉnh các chức năng của tế o như tăng trưởng, chuyển dạng và con đường apoptosis ERK là enzyme giáng hoá của con đường MAP kinase đư c kích hoạt tr c tiếp bởi Raf kinase dẫn đến phosphoryl hoá ERK S b c l quá mức của MEK1 trong các dòng

tế bào ung thư gan nguy n ph t ẫn đến s tăng trưởng u bằng c ch ngăn cản chu

tr nh apoptosis Th m v o đó c c protein lõi của virus viêm gan C, yếu tố nguy cơ của ung thư gan tăng cường hoạt đ ng của Raf1 trong tế bào gan l m tăng nguy cơ chuyển dạng ác tính Những thông tin này tạo cơ sở cho việc sử dụng các thuốc ức chế Raf kinase trong điều trị ung thư gan nguyên phát [88]

1.3.5 Dòng tế bào ung thu vú

Theo Globocan 2018, ung thư vú ở Việt Nam là bệnh lý ác tính phổ biến nhất

v i 15.229 trường h p m i đư c chẩn đo n hằng năm chiếm 20,6 % c c trường

h p ung thư ở phụ nữ và 6.103 trường h p tử vong chiếm 5,3 % c c trường h p tử vong o ung thư ở cả hai gi i sau ung thư gan nguy n ph t ung thư phổi v ung thư

dạ dày [89]

Hình 1.6: Dòng tế o ung thư vú BT474 [90]

BT474 là m t dòng tế bào ung thu vú ở người đư c phân lập từ m t ung thu biểu mô ống xâm lấn của vú từ phụ nữ da trắng 60 tuổi và theo hình thái học chúng thu c loại biểu mô Chúng là loại tế bào nữa dị b i (aneuploid) v i phần l n các nhiễm sắc thể là siêu b i (hypertetraploid) Trong cấu trúc, tế bào này không có m t

số nhiễm sắc thể như N11 N13 v N22 v m t số nhiễm sắc thể biểu hiện không rõ

r ng như N9 N14 v N15 so v i các nhiễm sắc thể nh thường Trong xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ (karyotype), nhiễm sắc thể N7 có mức biểu hiện quá mức Biểu hiện đ nh ấu sinh học thiếu nhiễm sắc thể thông qua 9 nhiễm sắc thể sau: der(14)t(14;?)(q32,?), unknown, iso(13q), der(6)t(6;7)(q21;q21), der(11) t(11;?)- (14;?), del(11)(p11), unknown, unknown, der(2)t(2;?)(p21;?) [90]

Theo cơ chế sinh học có hai cơ chế chính liên quan t i ung thư vú:

Cơ chế 1: yếu tố di truyền chiếm khoảng 10 – 15 % số ca mắc ung thư vú Các nghiên cứu về gene đưa ra c c ẫn chứng tại vùng nhiễm sắc thể số 17 (gene BRCA1 và BRCA2) có liên quan trong yếu tố di truyền [91]

Cơ chế 2: t c đ ng từ s tăng n i tiết tố sinh dục estrogen gây c c t c đ ng như iến đổi mô vú nh thường th nh c tính tăng s tiết prolactin (hormon phát triển tuyến vú)

1.4 Phương pháp xác định matrine và oxymatrine trong Khổ sâm

1.4.1 Định tính và định lượng matrine

Tính ch t hóa lý của matrine và oxymatrine

B ng 1.2: Tính chất hóa lý của matrine và oxymatrine

Đ hòa tan trong

lư ng ư c liệu về đ ẩm, tro toàn phần và tổng chất chiết đư c

Đị h ng

Theo DĐTQ phương ph p HPLC-UV đư c sử dụng định lư ng đồng thời matrine và oxymatrine trong rễ Khổ sâm

Điều kiện HPLC-UV như sau: C t sắc ký pha đảo C18 ( 250 mm × 4,6 mm,

5 µm) chương tr nh rửa giải gồm pha A là acetonitrile và pha B là nư c chứa hệ đệm 0,3 % phosphoric acid/ triethylamine có tỉ lệ pha A : pha B là 4: 96 (v/v) đẳng dòng tại tốc đ 1 mL/phút, phát hiện ở ư c sóng 220 nm

Phan Nguyễn Trường Thắng và c ng s (2019) đã thẩm định phương ph p định lư ng đồng thời matrine và oxymatrine trong rễ Khổ sâm bằng phương ph p HPLC-UV sử dụng c t Nucleodur-C18 Isis (250mm x 4,6 mm x 5 µm) đầu dò PDA ư c sóng phát hiện 220 nm, tốc đ dòng 1,0 mL/phút v i pha đ ng gồm pha

A là acetonitrile và pha B là nư c chứa hệ đệm 0.3 % phosphoric acid và 0.3 % triethylamine chạy đẳng dòng tại tỉ lệ pha A : pha B là 2: 98, (v/v) Các kết quả thẩm định phương ph p matrine v oxymatrine tr n cao to n phần v cao phân đoạn giàu alkaloi có đ đúng trong khoảng 98 – 102 % v đ chính xác RSD < 2 % [8]

1.4.2 Phân lập matrine và oxymatrine làm chất đối chiếu

Theo yêu cầu GMP của WHO trong sản xuất, việc đ nh gi chất lư ng các cây thuốc và các chế phẩm phải d a v o h m lư ng hoạt chất (hoặc chất đ nh ấu sinh học) Ngo i ra c c lĩnh v c kh c như trồng trọt, nghiên cứu Khổ sâm cũng cần theo õi đ nh gi chất lư ng các mẫu nghiên cứu Theo DĐTQ đối v i rễ Khổ sâm, nhóm hoạt chất đ nh dấu sinh học là matrine và oxymatrine

Trần Hồng Quang và c ng s (2015) đã tiến hành phân lập ba h p chất

flavonoid từ rễ Khổ sâm là isoxanthohumol, kurarinon, (2S)-2’-methoxykurarinon

[7] Mẫu b t rễ Khổ sâm đư c chiết trong ung môi MeOH sau đó đư c chiết tách phân đoạn qua phân l p dichloromethane và EA Các dịch chiết phân đoạn đư c tiếp tục t ch phân đoạn bằng sắc ký c t silica v C18 để thu đư c các h p chất tinh khiết Tiến h nh đo c ng hưởng từ hạt nhân để nhận diện cấu trúc các h p chất phân lập đư c

Khả năng ức chế s phát triển m t số dòng tế o ung thư của matrine và oxymatrine rất đư c quan tâm hiện nay Nhiều t c giả đã nghi n cứu về hoạt tính ức chế s ph t triển của c c ng tế o ung thư tr n rễ Khổ sâm trồng ở Trung Quốc như Ying Zhang v c ng s (2009) [94], ở Nga như K Kalinkevich và c ng s (2014) [95] Qua đó chứng minh Khổ sâm là m t trong những loại ư c liệu đầy hứa hẹn nhưng cần có các nghiên cứu sâu hơn để kiểm tra tính an toàn và giá trị lâm sàng của các cao hoạt tính, các h p chất tinh khiết từ rễ v để l m rõ cơ chế hoạt đ ng của chúng, ứng dụng trong sản xuất ư c liệu tại Việt Nam

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

Đị iểm

- Viện Sinh học Nhiệt đ i Thành phố Hồ Chí Minh

- Trường Đại học Văn Lang

- Trường Đại học Khoa học T nhiên - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí

Minh

Th i gian:- Từ th ng 11 năm 2015 đến th ng 06 năm 2021

2.1.2 Vật Liệu

Cây Khổ sâm

Cây Khổ sâm trồng tại Công ty cổ phần sản xuất chế biến nông lâm sản

Dư c liệu sạch Đắk Nông, 2 năm tuổi có đường kính rễ l n hơn 1cm đư c thu hái

v o th ng 3/2016 v đư c định danh bằng kỹ thuật PCR tại công ty TNHH Dịch Vụ

v Thương Mại Nam Khoa B phận rễ của Khổ sâm đư c phơi khô xay mịn và rây qua cỡ rây 2 mm để thu đư c b t ư c liệu có kích thư c đồng nhất

Tế g h

Tế bào ung thư gan HepG2 v tế o ung thư vú BT747 đư c mua từ hãng American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, Mỹ) Các tế o đư c đông lạnh và bảo quản trong nitơ lỏng

Các hóa ch t sử dụng

- Chất chuẩn matrine và oxymatrine (Sigma aldrich, Mỹ) Acetonitrile loại tinh khiết HPLC, hexan, chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EA), methanol (MeOH), aceton, ethanol (EtOH) loại tinh khiết phân tích đư c mua của hãng Scharlau (Tây Ban Nha) Formic acid, triethylamine, HCl 37 % loại tinh khiết phân tích của hãng Merck

- Dung dịch Phosphate-buffered Saline (PBS), Trypsin-EDTA 0.25 %, DMEM/Ham’s F - 12 bổ sung 15 % huyết thanh bò mang thai (FBS) của hãng Capricorn Scientific (Đức) và 1 % Pen/Strep (Gibco, Mỹ)

- Các b kit gồm có: WST1 (Sigma, Mỹ), FITC Annexin V Apoptosis Detection (BD Biosciences, Mỹ), ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega, Mỹ), 2x qPCR SyGreen 1-Step Go Hi-ROX kit (PCRBiosystem, Anh) và Automatic x-ray (873498, Fujifilm, Nhật Bản)

- Tác chất paraformaldehyde 4 % (Nacalai Tesque, Nhật Bản), Triton X100 0,1 % (Sigma-Aldrich, Mỹ), 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Molecular Probes, Mỹ)

- Các hóa chất sử dụng trong phương ph p Western Blot gồm có dung dịch đệm ly giải Optiblot LDS Sample Buffer, Gel Precast Gel SDS-PAGE 4-12 %, dung dịch đệm Optiblot SDS Run Buffer, màng PVDF, dung dịch Blocking Buffer của hãng Abcam (Mỹ) Kháng thể đư c sử dụng bao gồm: Anti-beta Actin antibody, Anti-alpha Tubulin antibody, kháng thể Anti-GAPDH antibody, kháng thể thứ cấp Goat Anti-Rabbit IgG (HRP) của hãng Abcam (Mỹ) Các vạch protein

đư c hiển thị bằng ECL Western Blotting Substrate Kit của hãng Abcam (Mỹ)

2.1.3 Thiết bị sử dụng

B ng 2.1: các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu

Bruker Đức 9 Giấy lọc Extra

Thick Blot Paper

10 Tấm phim XPosure Film

12 M y nư c khử ion WP710

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Định danh và đánh giá chất lượng dược liệu

2 2 1 1 Đị h h i

X c định tính đúng của ư c liệu theo DĐTQ [5]: d a vào nguồn gốc thu hái – định danh Mô tả bằng cảm quan mô tả chi tiết b phận dùng (hình dạng, màu sắc, đặc điểm riêng biệt) Nghiên cứu đặc điểm vi học: cắt và làm tiêu bản vi phẫu, soi

b t thân rễ và rễ, mô tả và chụp ảnh

2.2.1.2 Đị h h h ử ằ g h ơ g h gi i h DNA

Giải tr nh t gen đư c th c hiện tại Công Ty TNHH Dịch Vụ v Thương Mại Nam Khoa ằng phương ph p Sanger tr n m y 3130XL của AIB Phương ph p này th c hiện d a trên kỹ thuật PCR kết thúc chu i bằng cách bổ sung deoxy nucleoti e đã đư c biến đổi làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường

v o DNA quan tâm Trong ư c bổ sung enzyme polumerase xúc tác phản ứng gắn thêm nucleotide vào mạch đơn của DNA tại vị trí 3’-OH của nucleotide cuối cùng

và phản ứng kéo dài mạch sẽ ngừng lại nếu c c eoxy nucleoti e đư c gắn vào chu i Phản ứng gắn deoxy nucleotide là ngẫu nhiên nên sau khi kết thúc phản ứng

sẽ thu đư c c c đoạn DNA có đ dài khác nhau Có 4 loại deoxy nucleotide khác nhau đư c sử dụng và m i loại đư c gắn màu huỳnh quang kh c nhau đư c phân tách trên hệ thống điện di mao quản và ghi nhận cường đ c c đỉnh sáng này trên điện i đồ Từ điện i đồ c c đỉnh cường đ sáng này, máy sẽ so dòng của c c đỉnh tương ứng v i nhau và phân tích thành trình t của đoạn DNA Từ dữ liệu phân tích

điện i đồ, th c hiện tải toàn b dữ liệu l n thư viện tra cứu dữ liệu Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) và th c hiện thuật toán dò tìm theo xác xuất để

kiểm tra trình t DNA

2.2.1.3 Đ h gi h g i

Các tiêu chí chất lư ng ư c liệu về đ ẩm, tro toàn phần và tổng chất chiết

đư c

Đ ẩm: tiến h nh x c định đ ẩm mẫu ư c liệu theo hư ng dẫn trong

DĐVN V, tập 2, phụ lục 9.6 [96] Cân chính xác khoảng m =1,0 g b t ư c liệu trong m t chén cân đã sấy khô đến khối lư ng không đổi (mo, g) Đặt cốc chứa mẫu trong tủ sấy ở nhiệt đ 105 oC – 110 oC, ở áp suất thường, trong thời gian 3 giờ Lấy

ra để ngu i trong bình hút ẩm chứa silica gel và cân ghi lại khối lư ng (m1, g) Tiếp

tục sấy ở điều kiện nhƣ trên t i khi thu đƣ c khối lƣ ng cân m2 chênh lệch không quá 0,5 g so v i m1

Phần trăm mất khối lƣ ng do làm khô (% LOD) đƣ c tính theo công thức sau:

( ) ( ) (Công thức 2.1)

Tro toàn ph n: tiến h nh x c định tro toàn phần mẫu ƣ c liệu theo hƣ ng

dẫn trong DĐVN V, tập 2, phụ lục 9.8 [96] Cân chính xác khoảng m = 2,0 gam b t

ƣ c liệu trong m t chén nung đã đƣ c nung đến khối lƣ ng không đổi và xác định khối lƣ ng bì (m0, gam) Đem nung trong lò nung tại nhiệt đ 450 oC đến khi phần mẫu đƣ c tro hóa hoàn toàn Mẫu sau khi để ngu i trong bình hút ẩm và cân xác định khối lƣ ng (m1, gam) Tiếp tục sấy ở điều kiện nhƣ trên t i khi thu đƣ c khối

lƣ ng cân m2 chênh lệch không quá 0,5 g so v i m1

Hàm lƣ ng tro toàn phần (A) đƣ c tính theo công thức sau:

( ) ( )

(Công thức 2.2)

Tổng ch t chiế c: tiến h nh x c định tổng chất chiết đƣ c từ mẫu ƣ c

liệu theo hƣ ng dẫn trong DĐTQ [5] Cân chính xác khoảng m = 4,0 g b t ƣ c liệu cho vào bình nón nút mài có thể tích 250 mL Thêm chính xác 100 mL EtOH ở điều kiện nhiệt đ phòng đậy kín đem cân x c định khối lƣ ng (p) rồi lắc đều m i

30 phút trong 6 giờ Sau đó để yên ở nhiệt đ phòng trong 18 giờ Cân x c định khối lƣ ng và bổ sung EtOH về đúng khối lƣ ng (p) Lắc đều và lọc qua giấy lọc khô thu lấy dịch lọc Lấy chính xác 20,0 mL dịch lọc cho vào m t chén cân đã x c định khối lƣ ng bì (m0 gam) đem ốc hơi cho đến cắn khô trên bếp cách thủy Tiếp tục sấy ở 105 oC trong 3 giờ Lấy ra để ngu i trong bình hút ẩm và cân nhanh

để x c định khối lƣ ng (m1, gam) Tiếp tục sấy ở điều kiện nhƣ trên t i khi thu

đƣ c khối lƣ ng cân m2 chênh lệch không quá 0,5 g so v i m1

Tính hàm lƣ ng tổng chất chiết đƣ c theo công thức:

( ) ( )

Mẫu chuẩn: hòa tan 1,0 mg matrine trong 1mL EtOH để thu đư c dung dịch

có nồng đ 1,0 mg/mL Th c hiện tương t v i oxymatrine

Mẫu thử: lấy khoảng 4 g b t ư c liệu cho vào bình nón 50 mL, thêm 15 mL

EA và 0,3 mL dung dịch ammonium hydroxide 25 %, siêu âm trong 30 phút, lọc lấy dịch

Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 μL m i dung dịch trên Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô trong không khí Quan sát bản mỏng bằng nh s ng thường, UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử Dragendorff Trên sắc

ký đồ của dung dịch thử phải có vết có cùng màu sắc và giá trị Rf v i vết của matrine, oxymatrine trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu

2.2.1.5 Đị h g matrine và oxymatrine ằ g h ơ g h HPL -UV

Tham khảo theo DĐTQ [5] và có cải biên X c định h m lư ng matrine và oxymatrine trong mẫu ư c liệu bằng phương ph p phân tích trên HPLC -UV v i các thông số c i đặt như sau:

B ng 2.2: Chương tr nh pha đ ng phân tách matrine và oxymatrine

Th i gian ph t) Pha A (% v/v) Pha B (% v/v)