HCMKHOA SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY ANTHOCYANIN TỪ BÃ BỤP GIẤM Giảng viên hướng dẫn: ThS... HCMKHOA SINH HỌC VÀ
TÔNG QUAN 1 ̉j ̉j ̉n ̉o 1 1 1 1 TÔNG QUAN VÊ CÂY BUP ̉tGIÂM
Vật liệu
Bã hoa bụp giấm được cung cấp từ phòng thí nghiệm, rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 70°C trong 16 giờ cho tới khi độ ẩm còn lại dưới 5% Sau đó, bã được xay nhuyễn và lọc qua rây có kích thước 4 mm (Linh và cộng sự, 2019) Hóa chất sử dụng gồm ethanol, đệm Kali clorua pH=1 và đệm acetate pH=4,5.
Thiết bị và dụng cụ: Ống ly tâm, ống nghiệm, tủ ấm, tủ sấy, máy ly tâm,…
Chuẩn bị mẫu nguyên liệu
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình tách chiết Anthocyanin
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tách chiết
Hình 2 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình tách chiết anthocyanin từ bã bụp giấm.
Dung môi dùng tách chiết anthocyanin là ethanol với các nồng độ: 20°, 40°, 60°, 80°,
Trong thí nghiệm được Nhi và cộng sự (2020) mô tả, quá trình diễn ra ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ bã bụp giấm/ethanol 1:10 và thời gian chiết 120 phút, như Nguyễn và Trần (2019) đã ghi nhận.
Chuẩn bị 5 bình tam giác 250 ml, cho mỗi bình 25 g bã bụp giấm rồi thêm 50 ml ethanol ở các nồng độ 20%, 40%, 60%, 80% và 98%, đậy kín và ủ ở nhiệt độ phòng 120 phút; sau đó ly tâm với 5000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch, bổ sung dung dịch đệm pH 1 và pH 4,5 và xác định hàm lượng Anthocyanin theo phương pháp pH vi sai; lặp lại thí nghiệm 3 lần; nồng độ ethanol cho hàm lượng Anthocyanin cao nhất sẽ được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian chiết đến quá trình tách chiết anthocyanin từ bã bụp giấm.
Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly lên khả năng thu hồi anthocyanin, từ đó xác định thời gian tối ưu cho mức trích ly cao nhất Thí nghiệm được tiến hành với các khoảng thời gian 60, 90, 120, 150 và 180 phút để đo lường lượng anthocyanin trích ly ở từng mốc thời gian, sau đó phân tích dữ liệu nhằm xác định thời điểm trích ly tối ưu cho hiệu suất cao nhất.
Tiến hành chiết 25 g bã bụp giấm vào 5 bình tam giác 250 ml, thêm 50 ml dung môi ethanol có nồng độ thích hợp đã được xác định ở thí nghiệm trên, đậy kín và để ở nhiệt độ phòng với các thời gian lần lượt 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút và 180 phút Sau mỗi thời gian ủ, ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch, rồi bổ sung dung dịch đệm pH 1 và pH 4,5 và xác định hàm lượng Anthocyanin theo phương pháp pH vi sai Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.3 Các phương pháp sinh hóa sử dụng trong đề tài
Xác định hàm lượng anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai (Wrolstad, 1976)
Nguyên lý định lượng sắc tố anthocyanin dựa trên sự biến đổi theo pH: ở pH 1,0 anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ tối đa, còn ở pH 4,5 chúng ở dạng carbinol không màu Đo mật độ quang của mẫu ở hai trạng thái pH này tại bước sóng hấp thụ tối đa và so sánh với độ hấp thụ tại 700 nm cho thấy sự khác biệt về hấp thụ của sắc tố Hàm lượng sắc tố anthocyanin được tính theo công thức được nêu trong bài.
퐴×퐴×퐴×퐴 a = 퐴×퐴 (g) Trong đó: a: hàm lượng Anthocyanin, (g).
A: Mật độ quang, A = {(퐴퐴 Max,pH=1 − 퐴퐴 700,pH=1) − (퐴퐴 Max,pH=4,5 − 퐴퐴
퐴퐴 520,pH=1,0, 퐴퐴 700,pH=4,5: Độ hấp thụ tại bước sóng cực đại 520 nm và 700 nm ở pH1,0 và pH 4,5.
M: Khối lượng phân tử của Anthocyanin (g/mol), M = 449,2 (g/mol).
V: Thể tích dịch chiết, (lít).
퐴: Hệ số hấp thụ phân tử, 퐴= 26900 (mol -1 cm -1 )
L: Là chiều dày cuvet (1 cm).
Phần trăm Anthocyanin toàn phần:
% Anthocyanin = 퐴×(100−퐴)×10 퐴 −2× 100 Trong đó: a: Lượng Anthocyanin (g). m: Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g). w: Độ ẩm nguyên liệu (%).
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng trích ly anthocyanin từ bã bụp giấm
Anthocyanin là chất phân cực nên dễ tan trong dung môi phân cực; do đó việc lựa chọn dung môi phù hợp cho quá trình chiết sẽ giúp thu được hàm lượng anthocyanin cao nhất và màu sắc bền hơn Để xác định giá trị tối ưu của nồng độ dung môi cồn, người ta xác định hàm lượng anthocyanin theo phương pháp pH vi sai Kết quả được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3 1: Phần trăm anthocyanin trong dịch chiết với các nồng độ dung môi khác nhau.
STT Nồng độ cồn % Anthocyanin toàn phần
99 o 0,352 ± 0,119 c a, b, c theo sau giá trị trung bình trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt giữa các nghiệm thức với mức ý nghĩa P≤0,05
Hình 3 1: Biểu đồ thể hiện phần trăm Anthocyanin trong dịch chiết với các nồng độ dung môi khác nhau
Theo bảng 3.1, tỷ lệ anthocyanin tăng lên 0,864% ở nồng độ dung môi 60%, sau đó giảm xuống 0,729% ở nồng độ dung môi 80%, và đạt mức thấp nhất 0,352% ở nồng độ cồn 99%.
Anthocyanin là chất hữu cơ thơm đa vòng nên hòa tan tốt trong dung môi hữu cơ như ethanol Vì vậy, khi tăng nồng độ ethanol lên, lượng anthocyanin chiết được tăng lên ban đầu Tuy nhiên, do anthocyanin chứa nhóm OH nên cũng có khả năng hòa tan trong nước và các dung môi phân cực khác Khi nồng độ ethanol quá cao sẽ làm giảm tính phân cực của hệ dung môi, khiến khả năng hòa tan anthocyanin giảm theo Đó là lý do vì sao hàm lượng anthocyanin thu được tăng khi tăng nồng độ ethanol và đạt đỉnh ở khoảng 60%, sau đó sẽ giảm.
Vì vậy, ethanol 60° là nồng độ dung môi thích hợp để chiết anthocyanin từ bã bụp giấm Thí nghiệm của các tác giả Ghasemzadeh A, Baghdadi A, Z E Jaafar H, Swamy MK, Megat Wahab (Ghasemzadeh và cộng sự, 2018) cho thấy hệ dung môi 6 ethanol/4 nước cho chiết flavonoid ở gạo lứt và gạo huyết rồng đạt kết quả cao nhất Kết quả này gần khớp với nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất giàu anthocyanin từ gạo đen và tác dụng của nó đối với khả năng tiêu hóa in vitro của In Young Bae và cộng sự (2017), trong đó nồng độ ethanol 50,78% (v/v) được xác định là tối ưu cho quá trình tách chiết anthocyanin.
3.2 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin từ bã bụp giấm
Trong nghiên cứu này, bã bụp giấm được bổ sung ethanol 60° theo tỷ lệ 1:10 và đặt ở nhiệt độ phòng với các thời gian xử lý là 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và 150 phút Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.2, cho thấy sự biến động của các đặc tính theo từng khoảng thời gian và giúp đánh giá hiệu quả xử lý của điều kiện thử nghiệm.
Bảng 3 2: Phần trăm anthocyanin trong dịch chiết với các thời gian chiết khác nhau
5 0,680 ± 0,025 c a, b, c, d theo sau giá trị trung bình trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt giữa các nghiệm thức với mức ý nghĩa P≤0,05
Thời gian trích ly (phút)
Hình 3 2: Biểu đồ thể hiện phần trăm Anthocyanin trong dịch chiết với các thời gian chiết khác nhau
Qua kết quả ở bảng 3.2 ta thấy phần trăm Anthocyanin thấp nhất là 0,441% ở 30 phút, tăng dần đến 0,904% ở 90 phút, sau đó giảm xuống.
Ở thời điểm 30 phút, thời gian chiết quá ngắn khiến dung môi chưa hòa tan hết anthocyanin, dẫn tới tỷ lệ anthocyanin thu được ở mức thấp Khi tăng thời gian chiết, lượng anthocyanin tăng và đạt đỉnh ở 90 phút Sau 90 phút, lượng anthocyanin bắt đầu giảm ở các mốc 120 phút và 150 phút Nghiên cứu của Jaafar NF và cộng sự (2020) cũng xác định thời gian tối ưu để tách chiết anthocyanin là 90 phút.
Thời gian trích ly ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả chiết xuất anthocyanin Nếu thời gian quá ngắn, dung môi không thể hòa tan hết anthocyanin trong nguyên liệu Ngược lại, thời gian quá dài có thể làm giảm chất lượng sản phẩm chiết vì dung môi sẽ hòa tan cả các chất khác trong nguyên liệu Hơn nữa, thời gian kéo dài làm tăng nguy cơ phân hủy anthocyanin do tiếp xúc với không khí và ánh sáng, dẫn đến giảm lượng anthocyanin thu được.
Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin từ bã bụp giấm
Nghiên cứu này xác định một số yếu tố hưởng đến quá trình trích ly anthocyanin từ bã bụp giấm như:
Trong quá trình chiết, ethanol được dùng làm dung môi chính với tỷ lệ ethanol: nước 6:4 nhằm tối ưu hàm lượng anthocyanin; thời gian chiết tối ưu là 90 phút để đạt tổng anthocyanin toàn phần cao nhất ở mức 0,904% Các kiến nghị được đề xuất trong mục 4.2 nhằm nâng cao hiệu quả chiết và chất lượng sản phẩm.
Khảo sát bổ sung các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách Anthocyanin từ bụp giấm, tập trung vào tác động của enzyme và nhiệt độ nhằm tối ưu hóa hiệu suất chiết và độ ổn định của anthocyanin Nghiên cứu xem xét các tham số như loại enzyme, nồng độ enzyme, thời gian chiết và mức nhiệt để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình chiết từ bụp giấm Đồng thời đánh giá khả năng kháng oxy hóa của Anthocyanin từ bụp giấm, nhằm làm sáng tỏ tiềm năng ứng dụng của chiết anthocyanin trong thực phẩm chức năng và dược phẩm, cũng như so sánh hoạt tính chống oxy hóa với các nguồn anthocyanin khác.