NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẮC XIN TÁI TỔ HỢP PHÒNG BỆNH DO XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY RA Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Cho đến thời điểm hiện tại, Việt Nam chưa có đơn vị nào sản xuất vắc xin Leptospirosis tái tổ hợp trong khi đó dịch tễ của bệnh cho thấy có 5 serovar khác nhau gây bệnh trên động vật nên

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Tuấn Hùng

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẮC XIN TÁI TỔ HỢP PHÒNG BỆNH DO XOẮN KHUẨN

Leptospira interrogans GÂY RA

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Mã số : 9420201

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2022

nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Võ Thị Bích Thủy

Người hướng dẫn khoa học 2: GS.TS Nghiêm Ngọc Minh

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) là một trong những bệnh truyền nhiễm cấp tính, lan truyền từ động vật sang người phổ biến trên thế giới, được Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (OIE) xếp vào nhóm thứ 2 của Bệnh nguy hiểm và được bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp ở Việt Nam Nguyên nhân gây ra

bởi một loại xoắn khuẩn Leptospira interrogans Bệnh lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da, mắt hoặc các

màng nhầy tiếp xúc với nước bị ô nhiễm nước tiểu động vật nhiễm bệnh

Hiện nay, các vắc xin dùng phòng chống bệnh Leptospirosis cho động vật chủ yếu là loại nhược độc

và vô hoạt Trong thời đại công nghệ 4.0, sinh học công nghệ cao phát triển mạnh mẽ nên các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu sinh học phân tử, hướng tới làm vacxin tái tổ hợp cho động vật, đó là loại vắc xin

an toàn, hiệu quả miễn dịch tốt, dễ sử dụng, giá thành hạ, phù hợp với nhu cầu của nền nông nghiệp sạch

Cho đến thời điểm hiện tại, Việt Nam chưa có đơn vị nào sản xuất vắc xin Leptospirosis tái tổ hợp trong khi đó dịch tễ của bệnh cho thấy có 5 serovar khác nhau gây bệnh trên động vật nên việc tìm ra gen

quyết định kháng nguyên cùng xuất hiện trên cả 5 chủng Leptospira gây bệnh để làm cơ sở sản xuất vắc xin

tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis là rất cần thiết Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chế tạo

vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra.”

2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

1) Xác định một số gen quyết định kháng nguyên tiềm năng, có giá trị ứng dụng trong chế vắc xin tái

tổ hợp chống lại Leptospirosis tại Việt Nam 2) Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng và chống lại

bệnh gây ra do xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam

3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

1) Nuôi cấy, định danh phân tử và xây dựng cây phát sinh chủng loại 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam 2) Xác định các gen quyết định kháng nguyên trên 5 chủng và vùng giàu epitope của gen được lựa chọn 3) Nhân dòng đoạn gen quyết định kháng nguyên vào vector PJET1.2 trong hệ biểu

hiện E.coli DH10b Biểu hiện gen đích trong chủng E coli BL21 4) Sản xuất và tinh sạch protein tái tổ hợp

rLipL21 5) Kiểm tra khả năng gây miễn dịch cho thỏ của kháng nguyên rLipL21 6) Sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21 và kiểm nghiệm vắc xin trong qui mô phòng thí nghiệm 7) Sản xuất qui mô pilot 600 liều vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis 8) Đánh giá hiệu quả việc tiêm thử nghiệm vắc xin tái tổ hợp trên đàn gia súc tại một số địa phương

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis

Leptospirosis là bệnh truyền nhiễm chung giữa nhiều loài động vật và người (Zoonosis) do xoắn

khuẩn Leptospira thuộc họ Leptospiraceae gây ra Leptospira là những vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, có hình

móc câu, xoắn, chuyển động của Leptospira rất đa dạng không theo qui luật nào, có thể di chuyển thẳng, xoay tròn, theo hình sóng… Leptospira có kích thước: khoảng rộng 0,1-0,2 µm; dài 6-20 µm, khoảng cách giữa các vòng xoắn là 0,5 µm [3]

Hiện nay một số kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng để xác định và mô tả đặc điểm của

Leptospira spp đến nay đã xác định được 20 loài Leptospira spp trong đó có 9 loài Leptospira gây bệnh [6]

Việc phân loại này dựa trên kết quả phân tích phát sinh loài gen 16S rRNA được xem như thử nghiệm sàng lọc ban đầu để xác định Leptospira trong các mẫu lâm sàng nghi ngờ nhiễm Leptospira [9, 10]

Do tính đa dạng của các triệu chứng, bệnh Leptospirosis khó chẩn đoán nên tỉ lệ tử vong tại một số vùng trên thế giới có thể lên đến 20%-25%, thậm chí được điều trị bệnh vẫn gây tỷ lệ tử vong cao hơn 10%

Ở các nước đang phát triển, những người mắc bệnh chủ yếu là nông dân và người nghèo ở các thành phố Ở các nước phát triển, những người thường phải làm việc ngoài trời ở những nơi ấm và ẩm thấp thường có nguy cơ nhiễm bệnh Đến nay, Việt Nam vẫn nằm trong vùng dịch tễ học cao của bệnh xoắn khuẩn

1.2 Nghiên cứu hệ gen xoắn khuẩn Leptospira

Bộ gen của Leptospira spp bao gồm hai nhiễm sắc thể tròn có chiều dài dao động từ 3,9 đến 4,6 Mb

Sự thay đổi về chiều dài bộ gen này khiến vi khuẩn có khả năng sống trong các môi trường khác nhau và thích nghi với nhiều loại vật chủ [47] Hàm lượng guanine và cytosine (G+C) nằm trong khoảng từ 35% đến 41% [8] Tuy nhiên, kiến thức chi tiết và hiểu biết về sinh bệnh học phân tử và tiến hóa độc lực của

Leptospira spp vẫn chưa có [48] Công nghệ giải trình tự DNA thế hệ tiếp theo đã được sử dụng rộng rãi để

thực hiện một số phân tích so sánh về sự đa dạng gen giữa các Leptospires và mầm bệnh gây bệnh [47] và giữa các loài Leptospires gây bệnh khác nhau [48] Giải trình tự Leptospira mới phân lập từ nhiều nguồn

toàn cầu khác nhau tạo ra dữ liệu bổ sung có thể tạo điều kiện hiểu rõ hơn về mầm bệnh này

1.3 Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis

Trong quá trình nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam đang tập trung vào các loại vắc xin có khả năng phòng chống dịch bệnh mang tính dịch tễ vùng, an toàn, mức độ bảo hộ cao

và lâu dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏe cộng đồng và động vật Vắc xin tái tổ hợp dựa trên các gen gây

đáp ứng miễn dịch cao được bảo tồn trong các chủng Leptospires gây bệnh như LipL32, LipL41, OmpL1,

LigA và gen yếu tố độc lực như Loa22

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và dụng cụ nghiên cứu

* Chủng vi sinh vật

Năm chủng xoắn khuẩn gồm: Leptospira (L.) Bataviae, L Canicola, L Gryppothyphosa, L Icterohaemohagiae, L Pomona cung cấp từ Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, được nuôi cấy tăng sinh tại Công ty Cổ phần Thuốc Thú y Trung ương VETVACO Chủng Escherirchia coli (E coli) DH10b (Invitrogen, Mỹ) Chủng E.coli BL12 (DE3) (Invitrogen, Mỹ)

* Hóa chất

Các hóa chất dùng trong sinh học phân tử (DNA, cloning, westen blot…) đều tinh khiết, đạt yêu cầu

về kỹ thuật, đặt mua từ Invitrogen, Sigma, Thermor Fisher, Ferrmentas (Mỹ), Serva (Pháp), Biobasic (Canada), Merck (Đức) Các hóa chất nuôi cấy tăng sinh Xoắn khuẩn Các loại hóa chất phối trộn tạo vắc xin (Thermo Fisher, Mỹ)

2.2.1 Tạo kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 mang các epitope

Nuôi cấy, tăng sinh 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira Tách chiết DNA tổng số Thiết kế cặp mồi của

gen 16S rRNA và 6 gen quyết định kháng nguyên: OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, và LigB Kỹ thuật PCR Giải trình tự gen bằng kỹ thuật Sanger Định danh chính xác 5 chủng Leptospira về mặt phân tử Xác

định mức độ tương đồng về trình tự nucleotit và trình tự axit amin, các vùng giàu epitop trên các đoạn gen quyết định kháng nguyên

Gắn đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli

Cắt vector nhân dòng mang đoạn gen đặc hiệu và vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn Gắn gen mã hóa

protein LipL21 vào vector biểu hiện Biểu hiện gen đích trong chủng E coli BL21 Điện di kiểm tra protein

tái tổ hợp trên gel polyacrylamide có chất khử (SDS- PAGE)

2.2.2 Các kĩ thuật sử dụng gây miễn dịch cho thỏ tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein tái tổ hợp rLipL21

Trong nghiên cứu này chúng tôi tạo kháng thể bằng phương pháp gây miễn dịch trên thỏ Bao gồm các kỹ thuật sau: 1) Chuẩn bị dung dịch tiêm để gây miễn dịch 2) Gây miễn dịch tạo kháng thể kháng kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 3) Kỹ thuật phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể 4) Kỹ thuật phản ứng

vi ngưng kết (Microscopic Agglutination Test: MAT)

2.2.3 Kỹ thuật sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21

2.2.3.1 Kiểm tra tính sinh miễn dịch với hàm lượng protein tái tổ hợp rLipL21 khác nhau

Để có cơ sở đánh giá chất lượng kháng nguyên tái tổ hợp (protein tái tổ hợp rLipL21) chúng ta phải định lượng hàm lượng protein có trong dung dịch mẫu theo nguyên tắc từ nồng độ thấp đến nồng độ cao Dung dịch mẫu sẽ được chia làm các nồng độ từ 100 µg - 250 µg - 500 µg, sau đó tiêm cho thỏ (2 - 2,5kg/con) 2 mũi cách nhau 7 ngày Sau 14 - 21 ngày tiến hành lấy máu, chắt huyết thanh và kiểm tra hàm

lượng kháng thể trong huyết thanh bằng phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể 2

2.2.3.2 Kỹ thuật tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21

Dung dịch mẫu chứa protein ở nồng độ tối ưu Pha trộn với chất bổ trợ theo liều nhất định Kỹ thuật tuân theo các quy định của Công ty VETVACO

2.2.3.3 Định liều tiêm vắc xin

Căn cứ vào hàm lượng protein đã tính ở trên, ta tiến hành định liều tiêm là 1-2ml Liều tiêm có lượng kháng nguyên đủ để sinh miễn dịch trên động vật

2.2.3.4 Qui trình kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp rLipL21

Đánh giá chỉ tiêu vô trùng, chỉ tiêu an toàn, chỉ tiêu hiệu lực theo các quy định của kiểm nghiệm

vắc xin trên động vật

2.2.3.5 Đánh giá hiệu quả tạo miễn dịch

Tiến hành tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 và tiêm đối chứng PBS để xác định khả năng gây chết động vật thí nghiệm, khả năng tạo miễn dịch, thay đổi mô học ở các cơ quan sinh miễn dịch

2.2.3.6 Chế tạo thử nghiệm 600 liều vắcxin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis

Căn cứ kết quả trên ta tiến hành sản xuất thử nghiệm 600 liều vắc xin Leptospirosis tái tổ hợp tại Công ty cổ phần thuốc thú y trung ương Vetvaco

2.3 Phân tích và xử lý kết quả trong nghiên cứu

Xử lý số liệu bằng phần mềm: SPSS 6.0, GraphPrism ver 5 Sử dụng các thuật toán: χ2, tính tỷ lệ phần trăm, so sánh giá trị trung bình

2.4 Địa điểm tiến hành nghiên cứu

Phòng Hệ gen học vi sinh, Viện Nghiên cứu hệ gen thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Bộ môn vi trùng, Xưởng sản xuất vắc xin, Trại nuôi động vật sạch thuộc Công ty Thuốc Thú y Trung ương VETVACO

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nuôi cấy, định danh phân tử và xây dựng cây phát sinh chủng loại

3.1.1 Nuôi cấy, tăng sinh xoắn khuẩn

Các ống giống nhận từ Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương được cấy vào môi trường EMJH bổ sung 10% huyết thanh thỏ Sau khi cấy, môi trường nuôi được nuôi lắc 200rpm ở 28 - 30ºC trong 7 – 10 ngày cho đến khi đạt lượng khuẩn cần thiết khoảng 2x108

vi khuẩn/ml Sau khi đạt nồng cần thiết, sinh khối được thu nhận bằng cách ly tâm 4000rpm ở 4o

của 5 chủng nghiên cứu với 32 chủng xoắn khuẩn đã được công bố trên GenBank, nhằm xác định mối quan

hệ của các chủng Leptospira tại Việt Nam đối với các chủng cổ điển, đồng thời định danh phân tử lại các

chủng này, một số chương trình tin sin học đã được sử dụng để xây cây phát sinh chủng loại (Hình 3.6)

Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loại các chủng xoắn khuẩn nghiên cứu

Kết quả xây dựng cây cho thấy cả 5 serovar được chúng tôi giải trình tự đều nằm trong nhóm loài

Leptospira interrogans (nhóm gây bệnh của xoắn khuẩn Leptospira), cùng nhánh với chủng L Pomona-5621

(mã GenBank: FJ154559), L Icterohaemorhagiae-CCZ45 (mã GenBank: EU581713), L

Grippotyphosa-L-1006 (mã GenBank: EF536975), L Bataviae-UT075 (mã GenBank: EF536993), và cũng khá gần nhánh với chủng L Canicola DB34 (mã GenBank: JQ988866) Từ các kết quả của cây phát sinh chủng loại đã cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa các chủng của chúng tôi với các chủng cùng loài Leptospira interrogans được

công bố trước đó

3.2 Xác định các gen quyết định kháng nguyên trên 5 chủng và vùng giàu epitop của gen

3.2.1 Nhân gen với các cặp mồi của 6 gen quyết định kháng nguyên

Sử dụng DNA tổng số thu được làm khuôn khuếch đại trình tự các gen phù hợp trong nghiên cứu

vắc xin tái tổ hợp: OmpL1 [54, 76, 114], LipL21 [51], LipL32 [115], LipL41, LigA [82], và LigB [67] bằng

phản ứng PCR với cặp mồi xuôi ngược được thiết kế dựa trên trình tự gen được công bố trên ngân hàng gen quốc tế Sau khi tiến hành PCR qua 25 chu kỳ, ở các điều kiện nhiệt độ gắn mồi thích hợp với từng loại mồi

(OmpL1 ở Tm 55oC, LigA ở Tm 55 oC, LigB ở Tm 55 oC, LipL21 ở Tm 50 oC, LipL32 ở Tm 50 oC, LipL41 ở

Tm 50 oC).kết quả nhân gen được kiểm tra trên agarose 1% và Marker 1Kb plus

Kết quả thu được như sau: 5 gen OmpL1, LipL21, LipL32, LipL41, LigA xuất hiện ở cả 5 chủng, rõ

ràng, chỉ có 1 băng duy nhất, không lẫn tạp, kích thước nằm trong khoảng kích thước của gen khi thiết kế Tuy nhiên, trong đó gen LipL21 là gen được nhiều nghiên cứu trên thế giới đánh giá là gen tiềm năng trong sản xuất vắc xin tái tổ hợp do khả năng tạo miễn dịch đặc hiệu của protein tái tổ hợp Vì vậy, trong khuôn khổ luận án này, chúng tôi chỉ tiến hành nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen LipL21 để tiến hành các sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng chống bệnh Leptospirosis

3.2.2 Tinh sạch và giải trình tự đoạn gen quyết định kháng nguyên xuất hiện trên cả 5 chủng xoắn khuẩn

Tiến hành chạy PCR với mồi của gen LipL21 Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng

GeneJETTM PCR Purification Kit, và kiểm tra trên agarose 1% với Marker 1 Kb plus trước khi tiến hành giải trình tự gen

3.2.3 Xác định trình tự nucleotit, trình tự axit amin và vùng giàu epitop của các gen quyết định kháng nguyên LipL21

3.2.3.1 Trình tự nucleotit

Trình tự của gen quyết định kháng nguyên LipL21 sẽ được so sánh với nhau nhằm tìm kiếm những

vùng khác biệt giữa các chủng đồng thời xác định vùng bảo thủ giữa các chủng Sau khi giải trình tự gen

quyết định kháng LipL21, trình tự nucleotit nhận được: Kết quả so sánh trình tự nucleotit của gen LipL21 ở 5 chủng xoắn khuẩn cho thấy cả 5 chủng L Bataviae, L Canicola, L Grippotyphosa, L Icterohaemorrhagiae

và L Pomona đạt tỷ lệ tương đồng lên đến 99% giữa các chủng, chỉ có 6 vị trí sai lệnh, xuất hiện rải rác ở trên toàn bộ gen Các vị trí sai khác lần lượt: 99 (L Icterohaemorrhagiae), 171, 276, và 279 (L Canicola, L Pomona), 324 (L Pomona), 450 (L Canicola, L Grippotyphosa, L Pomona)

3.2.3.2 So sánh trình tự axit amin

Trình tự nucleotit thu được đã được diễn giải sang trình tự axit amin nhằm kiểm tra sự sau khác về trình tự amino acid giữa các chủng Xoắn khuẩn thu nhận được (Hình 3.10) Mặc dù có 6 vị trí sai khác tìm thấy từ trình tự nucleotit, nhưng không dẫn đến sự sai khác nào trong trình tự axit amin của 5 chủng xoắn khuẩn Trình tự axit amin của cả 5 chủng Leptospira là giống nhau hoàn toàn, đây là điều kiện thuận lợi cho

việc tạo ra chung 1 loại protein tái tổ hợp đặc trưng cho cả 5 loài xoắn khuẩn Leptospira

Hình 3.9 Trình tự nucleotit của gen LipL21

Hình 3.10 Trình tự axit amin của gen LipL21

Từ kết quả trình tự nucleotit và axit amin, chúng tôi sử dụng công cụ I-TASSER để xây dựng cấu

trúc 3D gen LipL21 của cả 5 chủng xoắn khuẩn Với gen LipL21, do trình tự axit amin là đồng nhất ở 5

chủng, nên chúng tôi đã thu được mô hình 3D duy nhất biểu diễn cho tất cả các chủng này (Hình 3.11)

Hình 3.11 Cấu trúc 3D gen LipL21 của 5 chủng xoắn khuẩn

3.3.3 3 Xác định vùng giàu epitop

Việc lựa chọn một kháng nguyên tối ưu là điều rất quan trọng để thiết kế một vắc xin hiệu quả Các protein kháng nguyên này, tùy thuộc vào đáp ứng mong muốn, nên chứa các vùng epitope thích hợp với các

thụ thể tế bào B và tế bào T [116, 117] Trong nghiên cứu này, để xác định các vùng giàu epitope trên gen

LipL21, các công cụ tin sinh khác nhau đã được sử dụng để dự đoán Kết quả dự đoán được tổng hợp lại tại

Bảng 3.1

Bảng 3.1 Trình tự các vùng giàu epitop được dự đoán của gen LipL21

epitope

Công cụ tin sinh

Cytotoxic T cell (Tc cell) 53 NetMHC, NetCTL, ProPred

T helper cells (Th cells) 19

B lymphocytes (B cells) 23 IEDB, ABCPred, BepiPred, SMVTriP

peptide trên đoạn gen LipL21 (12 vị trí của tế bào T và 10 vị trí trên tế bào B) được dự đoán giàu tính kháng

nguyên Tiếp tục sử dụng phần mềm IEDB để nghiên cứu cấu trúc protein, phân tích tính thiên vị mã và tính

kháng nguyên LipL21 cho thấy 2 vùng axit amin có vị trí 2 đến 70 và 71 đến 119 là có hiệu suất biểu hiện cao ở trong tế bào tính kháng nguyên Trình tự các vùng giàu epitop được dự đoán cũng cho biết chính xác

độ dài, điểm mở đầu và điểm kết thúc của từng đoạn epitop

Dựa trên kết quả phân tích về trình tự nucleotide và trình tự axit amin, lựa chọn vùng gen đặc hiệu

giàu epitope, xuất hiện trên cả 5 chủng vi khuẩn Leptospira, từ đó, chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen LipL21 phù hợp với nghiên cứu

Bảng 3.2 Trình tự mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen LipL21

(bp)

Nhiệt độ bắt cặp

3.3 Nhân dòng và biểu hiện gen quyết định kháng nguyên LipL21 trong tế bào vật chủ E.coli và tinh

sạch protein tái tổ hợp rLipL21

Kỹ thuật này bao gồm việc chèn phân tử DNA ngoại lai mã hóa kháng nguyên như protein ngoài màng, kích thích phản ứng miễn dịch, vào tế bào vi khuẩn hoặc động vật có vú, biểu hiện kháng nguyên

trong các tế bào này và sau đó tinh chế chúng để sử dụng làm vắc xin

3.3.1 Nhân dòng gen quyết định kháng nguyên LipL21 vào vector pJET1.2 trong hệ biểu hiện E.coli DH 10b

Hình 3.12 Tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pJET1.2-LipL21 ở tế bào E.coli DH10b

A: Tách chiết DNA vi khuẩn B: PCR khuẩn lạc C: Cắt mở vòng plasmid với 2 enzyme EcoRV và XhoI D: Kiểm tra khuẩn lạc E.coli DH10b mang plasmid trên môi trường LB có bổ sung ampicillin E: PCR sàng lọc khuẩn lạc mang plasmid pJET1.2 và gen LipL21 F: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng cắt với enzyme EcoRV

và XhoI

Sản phẩm PCR thu được được gắn vào plasmid pJET1.2 và biến nạp vào chủng E.coli DH10b Sản

phẩm biến nạp được nuôi chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh ampicillin và nuôi qua đêm ở

37oC Các khuẩn lạc phát triển được trên ampicillin được sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc với mồi nằm trên gen

Hình 3.12E đều cho kết quả với một vạch gen có kích thước khoảng 548 bp, đúng bằng kích thước gen

LipL21, chứng tỏ có sự tồn tại của gen cần chuyển trong các khuẩn lạc Tiến hành tăng sinh và tách plasmid

từ các khuẩn lạc này để tiếp tục kiểm tra ở các bước sau Khi cắt plasmid tái tổ hợp bằng hai enzyme EcoRV

và XhoI đã dùng để xử lý và nối gen LipL21 vào vector, kết quả nhận được một băng vạch LipL21 (kích

thước khoảng 548 bp) và vạch còn lại có kích thước tương đương kích thước pJET1.2 có chứa gen đích

(Hình 3.12F) Điều đó cho thấy đã biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp pJET1.2-LipL21 vào tế bào E coli

DH10b Plasmid DNA được gửi đi kiểm tra xác định trình tự gen tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc) Kết quả

cho thấy không có sự thay đổi nucleotide giữa trình tự gen LipL21 được chuyển vào plasmid và trình tự gen

gốc Mức độ tương đồng đạt 99,78 – 100 % (Hình 3.13)

Hình 3.13 Kết quả so sánh trình tự gen LipL21 của 05 chủng Leptospira

và trình tự gen LipL21 trong plasmid

3.3.2 Chèn gen LipL21 vào vector biểu hiện pET32a

Cắt plasmid pET32a và plasmid pJET-LipL21với enzyme giới hạn XhoI và EcoRV, sản phẩm cắt sau khi điện di kiểm tra sẽ được tinh sạch nhằm thu được gen LipL21 (~548 bp) và vector pET32a (~6.0kb)

Sản phẩm tinh sạch được hòa trong nước khử ion và bảo quản ở -20oC Sau đó, hai đoạn DNA này được nối bằng T4 ligase, ủ 4oC qua đêm Tiếp theo, sản phẩm ligase được biến nạp vào E coli BL21 (DE3) Vi khuẩn

sau biến nạp được gạt trên đĩa LB có bổ sung ampicillin (Hình 3.14B) Các khuẩn lạc được lựa chọn ngẫu

nhiên, tách DNA plasmid và kiểm tra sự có mặt của đoạn LipL21 trong vector với cặp mồi T7 promoter Fw/ T7 terminater Rv và gen LipL21 Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy xuất hiện băng với kích thước

khoảng 550bp (LipL21) và đúng với tính toán lý thuyết (Hình 3.14D) Từ các kết quả trên, kết luận rằng chúng tôi đã thu được E coli BL21 mang plasmid pET32a-LipL21

Hình 3.14 Tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pET32a-LipL21 ở tế bào E.coli BL21

(A): Cắt mở vòng vector pET32a với 2 enzyme EcoRV và XhoI (B): Kiểm tra khuẩn lạc E.coli BL21 mang

plasmid trên môi trường LB có bổ sung ampicillin (C): Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng cắt với enzyme

EcoRV và XhoI PCR sàng lọc khuẩn lạc mang gen LipL21 (D) và plasmid pJET1.2 (E)

Plasmid tái tổ hợp sau các bước kiểm tra, được giải trình tự và sắp gióng cột Kết quả cho thấy trình

tự của pET32a-LipL21 tương đồng ≥ 99% so với trình tự gen LipL21 của Leptospira interogen trên thế giới

Hình 3.15 Kết quả so sánh trình tự gen LipL21 của Leptospira interogen

và trình tự gen LipL21 trong plasmid

3.3.3 Biểu hiện và tối ưu các điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp rLipL21

Để kiểm tra khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp LipL21 (rLipL21) ở E coli BL21, dịch chiết sinh khối tế bào E coli BL21 đã được điện di trên gel poyacrylamide 12,5% có chứa SDS Theo thiết kế protein

rLipL21 dạng tan thu được có kích thước là 39 kDa

Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm protein tái tổ hợp LipL21 ở E coli BL21

Kí hiệu sử dụng: M: Thang chuẩn protein; (-) IPTG Dạng tan: Protein tổng số của E.coli BL21 mang vector pET32a – LipL21 không cảm ứng IPTG ở dạng tan; (+) IPTG Dạng không tan: Protein tổng số của E.coli

BL21 mang vector pET32a – LipL21 cảm ứng IPTG ở dạng không tan; (+) IPTG Dạng tan: Protein tổng số

của E.coli BL21 mang vector pET32a – LipL21 cảm ứng IPTG ở dạng tan

Kết quả SDS-PAGE cho thấy dịch chiết tổng số tế bào E coli BL21 mang vector pET32a – LipL21

ở dạng tan đã xuất hiện băng protein với khối lượng phân tử khoảng 39 kDa tương ứng với kích thước

rLipL21 theo tính toán lý thuyết, trong khi đó dịch chiết tổng số tế bào E coli không mang vector pET32a –

LipL21 không xuất hiện băng protein có kích thước tương ứng 39 kDa Do đó, bước đầu khẳng định vi

khuẩn E coli BL21 đã biểu hiện được protein LipL21 tái tổ hợp ở dạng tan Protein LipL21 tái tổ hợp được

biểu hiện ở dạng tan phù hợp với mục đích trong các nghiên cứu tạo vắc xin tái tổ hợp tiếp theo

Nhằm thu được lượng protein tái tổ hợp là lớn nhất, chúng tôi tiến hành tối ưu các điều kiện ảnh hưởng tới biểu hiện protein tái tổ hợp bao gồm: Nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảm ứng

- Tối ưu nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng protein tái tổ hợp Dựa trên các

kết quả nghiên cứu bieur hiện protein tái tổ hợp trên hệ biểu hiện tế bào E.coli, chúng tôi tiến hành đánh giá

mức độ biểu hiện protein LipL21 tại các điều kiện nhiệt độ: 28oC, 30oC, 32oC, và 37oC Kết quả được kiểm tra trên gel polyacrylamide có chứa SDS 12% Kết quả điện đi kiểm tra trên gel polyacrylamide có chứa SDS cho thấy tại 37oC, protein LipL21 được biểu hiện tốt nhất

Hình 3.17 Điện di đồ sản phẩm protein được biểu hiện trong các điều kiện

nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác nhau Kí hiệu sử dụng: M: Thang chuẩn protein; (-) IPTG: Không cảm ứng

IPTG; Cảm ứng IPTG ở 28oC, 30oC, 32oC, và 37oC

- Tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG

IPTG là chất cảm ứng giúp cho lac promoter hoạt động, khởi động quá trình sinh tổng hợp T7

polymerase, bởi vậy nó được sử dụng để kích ứng biểu hiện protein ở E.coli mà được kiểm soát bởi lac

operator Tuy nhiên, nồng độ IPTG quá cao có thể gây độc tế bào Do đó, chúng tôi tiến hành đánh giá mức

độ biểu hiện protein LipL21 tại các điều kiện nồng độ IPTG: 0,1 mM; 0,2 mM; 0,3 mM; và 0,4 mM Kết quả được kiểm tra trên gel polyacrylamide có chứa SDS

Hình 3.18 Điện di đồ sản phẩm protein được biểu hiện trong các điều kiện

nồng độ cảm ứng IPTG khác nhau Kí hiệu sử dụng: M: Thang chuẩn protein; (-) IPTG: Không cảm ứng

IPTG, Nồng độ IPTG cảm ứng: 0,1 mM; 0,2 mM; 0,3 mM; và 0,4 mM

Kết quả điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide có chứa SDS cho thấy tại nồng độ IPTG là 0,2 mM

và 0,4 mM, protein LipL21 được biểu hiện tốt nhất Tuy nhiên, trong sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp, lượng IPTG dùng không nên cao quá làm giá thành sản xuất cao, do vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ chất cảm ứng là 0,2 mM là thích hợp

- Tối ưu thời gian cảm ứng

Thời gian cảm ứng có liên quan mật thiết tới khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp Theo các nghiên cứu trước đó, thời gian cảm ứng thích hợp nhất là khoảng thời gian từ 2h đến 5h Do đó, chúng tôi tiến hành đánh giá mức độ biểu hiện protein LipL21 tại các thời gian cảm ứng: 1h, 2h, 3h, và 4h Kết quả được kiểm tra trên gel polyacrylamide có chứa SDS

Hình 3.19 Điện di đồ sản phẩm protein được biểu hiện trong các điều kiện

thời gian cảm ứng IPTG khác nhau Kí hiệu sử dụng: M: Thang chuẩn protein; (-) IPTG: Không cảm ứng

IPTG; Cảm ứng IPTG trong 1h, 2h, 3h, và 4h

Kết quả điện đi kiểm tra trên gel polyacrylamide có chứa SDS cho thấy tại thời gian biểu hiện là 4h, protein LipL21 được biểu hiện tốt nhất (nồng độ protein đo được gấp 1,25-1,5 so với cảm ứng IPTG ở 2 và 3h)

Như vậy, từ các kết quả thu được ở trên, chúng tôi đưa ra điều kiện tối ưu cho biểu hiện protein LipL21 tái tổ hợp là: Nhiệt độ nuôi cấy là 37oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,2mM, thời gian cảm ứng là 4h