NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ DỰ PHÒNG CỦA IGY KHÁNG UREASE CỦA VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG

NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ DỰ PHÒNG CỦA IGY KHÁNG UREASE CỦA VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Đỗ Hoàng Long Trường Đại học Y Dược Cần Thơ Email: dhlong@ctump.edu.vn TÓM TẮ

NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ DỰ PHÒNG CỦA IGY KHÁNG UREASE

CỦA VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI

TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG

Đỗ Hoàng Long

Trường Đại học Y Dược Cần Thơ Email: dhlong@ctump.edu.vn

TÓM TẮT

Đặt vấn đề: Ức chế enzyme urease bằng kháng thể đặc hiệu theo đường uống là hướng nghiên cứu mới trong điều trị và dự phòng nhiễm Helicobacter pylori Mục tiêu: Nghiên cứu này được tiến

hành nhằm khảo sát tác dụng dự phòng nhiễm H pylori của IgY kháng urease H pylori trên chuột nhắt

trắng Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Chuột được điều trị dự phòng bằng thức ăn có hoặc

không có chứa IgY kháng urease H pylori một tuần trước khi cho uống H pylori và liên tục cho đến khi kết thúc thí nghiệm Chín tuần sau khi bắt đầu điều trị, chuột được xác định nồng độ kháng thể IgG kháng H pylori trong huyết thanh, tình trạng viêm và nhiễm H pylori trong mảnh sinh thiết dạ dày

Kết quả: Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hiệu giá kháng thể IgG, về sự tiệt trừ H pylori và sự giảm tình trạng viêm dạ dày liên quan H pylori giữa hai nhóm chuột trong nhóm nhiễm H pylori Kết luận: Miễn dịch thụ động đường uống với IgY kháng đặc hiệu urease H pylori đã dự phòng được sự

thâm nhiễm của vi khuẩn H pylori trên chuột thực nghiệm

Từ khóa: H pylori; IgY kháng urease; miễn dịch thụ động đường uống; tác dụng dự phòng

ABSTRACT

STUDY OF THE PREVENTIVE EFFECT OF ANTI-UREASE IGY

ON HELICOBACTER PYLORI INFECTION IN WHITE MICE

Do Hoang Long

Can Tho University of Medicine and Pharmacy

Background: Urease inhibition with oral specific antibody is a new approach in prevention and treatment of Helicobacter pylori infection Objectives: This research aimed to investigate the preventive effect of anti-urease IgY on H pylori infection in experimental animal Materials and methods: White mice were prophylactic treated by having food with or without anti-urease IgY a week

before H pylori inoculation and continuously till end of the monitoring time Nine weeks after the start

of the diet, the mice were examined to determine the reactivity of anti-H pylori IgG in serum and the

inflammation and infection status of the stomach biopsy Results: There were significant differences in

the anti-H pylori IgG titer, the eradication of H pylori and the reduction of H pylori-associated

gastritis between the two groups of infected mice Conclusion: Oral administration of urease-specific IgY prevented H pylori colonization in the inocculated mice

Keywords: Helicobacter pylori; Anti-urease IgY; Oral passive immunization; Preventive effect

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Helicobacter pylori là một trong những nguyên nhân gây viêm loét dạ dày - tá tràng

thường gặp ở Việt Nam cũng như trên thế giới chiếm tỉ lệ 75 – 95%, trong đó enzyme urease

do H pylori tiết ra là yếu tố quyết định sự sống còn của vi khuẩn và tạo thuận lợi cho chúng tấn công vào niêm mạc dạ dày [3] Điều trị viêm loét dạ dày - tá tràng do nhiễm H pylori rất

phức tạp mặc dù đã áp dụng nhiều phác đồ mới nhưng khả năng thất bại điều trị rất lớn do tình trạng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh ngày càng tăng, đặc biệt là ở các nước chậm phát triển

và đang phát triển [4], [5]

Gà có khả năng sinh kháng thể đặc hiệu với mầm bệnh tương tự như động vật có vú, các kháng thể đặc hiệu từ máu gà mái được chuyển qua và tích tụ trong lòng đỏ trứng mà chúng

đẻ ra, lớp kháng thể có trong lòng đỏ trứng được gọi là kháng thể IgY (yolk immunoglobulin)

và quy trình sản xuất IgY đặc hiệu kháng nguyên đã được tiến hành [1], [2] IgY được sử dụng theo đường uống như một liệu pháp miễn dịch thụ động để dự phòng và điều trị một số bệnh

tiêu chảy ở súc vật và người Với hy vọng phương pháp miễn dịch trị liệu thụ động sử dụng

kháng thể kháng urease của H pylori sẽ có tác dụng ngăn ngừa nhiễm H pylori hoặc ức chế

sự gây tổn thương của chúng trên niêm mạc dạ dày, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với

mục tiêu đánh giá hiệu quả ức chế H pylori trên động vật thực nghiệm của chế phẩm IgY kháng urease của H pylori

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng được dùng để nghiên cứu khả năng dự

phòng nhiễm H pylori của chế phẩm IgY kháng urease: 28 con chuột nhắt trắng đực, dòng

Swiss, cân nặng từ 18 - 20g, khoẻ mạnh do Ban Chăn nuôi động vật thí nghiệm, Phòng trang

bị và Vật tư kỹ thuật, Học viện Quân y cung cấp

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu:

- 3 chủng vi khuẩn H pylori (HP13, HP16, HP18) đã được phân lập từ mẫu sinh thiết

niêm mạc dạ dày của bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng ở Bệnh viện 103

- Kháng thể IgY kháng enzyme urease của 3 chủng vi khuẩn H pylori (HP13, HP16,

HP18) đã được tách chiết và tinh chế tại Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y và Phòng Protein

- Độc chất - Tế bào, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học, Học viện Quân y

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị thức ăn chứa IgY kháng urease của H pylori:

Thức ăn chứa IgY kháng urease được chuẩn bị bằng cách tẩm dung dịch protein lòng

đỏ trứng gà chứa IgY kháng urease vào thức ăn chăn nuôi công nghiệp dạng sợi ống giàu dinh dưỡng đã hấp tiệt trùng và làm khô với tỷ lệ 4mg IgY/gam thức ăn theo phương pháp ước lượng nồng độ IgY trong lòng đỏ trứng của Nomura

2.2.2 Phân nhóm chuột và tiến hành nghiên cứu hiệu quả dự phòng:

Chuột nhắt trắng được chia 4 nhóm: nhóm 1 và 2 (5 con/nhóm), không gây nhiễm

H pylori, trong đó nhóm 1 cho ăn thức ăn thường trong khi nhóm 2 có bổ sung IgY kháng

urease vào thức ăn; nhóm 3 (nhóm chứng) và nhóm 4 (nhóm bệnh), mỗi nhóm 9 con, có gây nhiễm, trong đó nhóm 3 cho ăn thức ăn thường trong khi nhóm 4 có bổ sung IgY kháng urease

vào thức ăn Một tuần sau tính từ lúc cho ăn thức ăn có IgY kháng urease của H pylori (tuần 1), 9 chuột nhóm bệnh có ăn thức ăn có IgY kháng urease của H pylori không cho ăn trong đêm và sáng hôm sau sẽ được gây nhiễm H pylori bằng cách dùng bơm tiêm cải tiến để bơm

vi khuẩn vào dạ dày với liều 108 CFU/ml (15 ml/kg cân nặng chuột) Các nhóm chuột tiếp tục được cho ăn thức ăn có bổ sung IgY kháng urease hoặc không Đến tuần 9, kết thúc thí nghiệm

lấy máu chuột xác định hiệu giá kháng thể kháng H pylori; mổ chuột lấy dạ dày xét nghiệm giải phẫu bệnh để đánh giá mức độ viêm niêm mạc dạ dày và sự có mặt của H pylori dưới

niêm mạc dạ dày chuột

III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Diễn biến hoạt động của chuột trong quá trình làm thí nghiệm

Chuột các nhóm hoạt động nhanh nhẹn và ăn uống bình thường từ tuần 1 đến tuần 9,

trừ chuột nhóm 3 và 4 hoạt động kém trong 3 ngày sau gây nhiễm H pylori kèm theo bỏ ăn và

xù lông Riêng chuột nhóm 3 có giảm cân sau gây nhiễm và những tuần tiếp theo cho đến khi kết thúc thí nghiệm

3.2 Ảnh hưởng của việc ăn thức ăn bổ sung IgY kháng urease lên cân nặng chuột

- Với nhóm chuột không gây nhiễm H pylori, cân nặng trung bình của chuột nhóm 1

và nhóm 2 có tăng từ 16,8 và 16,4g ở thời điểm bắt đầu thực nghiệm đến 18,2g ở thời điểm kết thúc thực nghiệm lần lượt theo thứ tự Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 2 nhóm

chuột Không ghi nhận ảnh hưởng của việc ăn thức ăn bổ sung IgY kháng urease lên cân nặng của chuột

- Với nhóm chuột gây nhiễm H pylori, cân nặng trung bình của chuột nhóm 3 (nhóm

chuột không dự phòng) giảm từ 17,5g ở thời điểm bắt đầu thực nghiệm đến 17,4g ở thời điểm kết thúc thí nghiệm (giảm 0,1g) Trong khi đó, cân nặng trung bình của chuột nhóm 4 (nhóm

chuột dự phòng bằng IgY kháng urease của H pylori) thay đổi từ 17,3g ở thời điểm bắt đầu

thực nghiệm đến 19,1g ở thời điểm kết thúc thí nghiệm (tăng 1,7g) Mặc dù không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 2 nhóm chuột (nhóm 3 và nhóm 4) nhưng sự tăng cân của nhóm

4 cũng đã cho thấy ảnh hưởng của dự phòng IgY kháng urease của vi khuẩn H pylori ở nhóm

chuột gây nhiễm trong việc tăng cân của chuột

Như vậy, nhóm chuột ăn thức ăn có IgY kháng urease của H pylori ở nhóm chứng và

nhóm nhiễm đều có tăng cân nhiều hơn, điều này có thể giải thích là do IgY bản chất là protein

có thể tăng cường thêm dinh dưỡng để giúp chuột phát triển tốt hơn Nhưng điểm đặc biệt cần nhấn mạnh là qua kết quả thu được đã sơ bộ chứng minh tính không gây dị ứng của kháng thể

gà khi sử dụng trên chuột Qua đó đã phần nào khẳng định được tính không độc của chế phẩm

IgY kháng urease của H pylori và tính an toàn của chế phẩm này khi được sử dụng bằng đường uống Thêm vào đó, cân nặng chuột nhóm nhiễm có dự phòng IgY kháng urease của H pylori tăng cũng đã biểu hiện được khá rõ hiệu quả ức chế vi khuẩn H pylori của chế phẩm IgY kháng urease của H pylori

Biểu đồ 1 và 2 Diễn biến cân nặng trung bình của chuột: (1) nhóm không gây nhiễm và (2) nhóm gây nhiễm

3.3 Xét nghiệm kháng thể kháng H pylori trong máu chuột gây nhiễm vi khuẩn

Kháng thể kháng H pylori được sinh ra trong toàn bộ máu chuột (100%) ở nhóm không dự phòng (nhóm 3) trong khi nhóm chuột có dự phòng (nhóm 4) bằng IgY kháng urease của H pylori chỉ đạt được 66,6% kháng thể kháng H pylori Thêm vào đó, hoạt độ kháng thể kháng H pylori trong máu chuột gây nhiễm H pylori có được dự phòng bằng IgY kháng urease của H pylori thấp

hơn so với nhóm chuột không được dự phòng (p = 0,003)

3.4 Kết quả đánh giá mức độ viêm niêm mạc dạ dày chuột

Tỷ lệ dạ dày bị viêm ở nhóm chuột gây nhiễm H pylori không được dự phòng bằng ăn

thức ăn chứa IgY kháng urease rất cao (100%) trong khi tỷ lệ dạ dày bị viêm ở nhóm chuột gây

nhiễm H pylori có được dự phòng bằng ăn thức ăn chứa IgY kháng urease chỉ đạt 77,7% Mức

độ viêm dạy dày của chuột gây nhiễm H pylori không được dự phòng bằng IgY kháng urease của H pylori cao hơn so với nhóm chuột được dự phòng (p = 0,004)

3.5 Kết quả đánh giá mật độ vi khuẩn dưới niêm mạc dạ dày chuột

Chuột không gây nhiễm (nhóm 1 và 2) không có sự hiện diện của vi khuẩn H pylori, trong khi toàn bộ chuột gây nhiễm H pylori không được dự phòng bằng ăn thức ăn chứa IgY kháng urease (nhóm 3) có H pylori hiện diện dưới niêm mạc dạ dày (100%) Riêng nhóm

chuột có dự phòng bằng ăn thức ăn chứa IgY kháng urease (nhóm 4) thì mật độ vi khuẩn ít hơn

(44,4%) Mật độ H pylori ở niêm mạc dạy dày của chuột gây nhiễm H pylori không được dự

phòng bằng IgY kháng urease của H pylori cao hơn so với nhóm chuột được dự phòng (p 

0,0001)

Biểu đồ 3 và 4 Dạ dày chuột gây nhiễm: (3) mức độ viêm và (4) mật độ vi khuẩn H pylori

Hình 1 và 2 Tổn thương mô học dạ dày chuột N3-C1: (1) nhuộm H&E và (2) nhuộm Giemsa

Khi so sánh về tác dụng dự phòng của IgY kháng urease của H pylori thì kết quả của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Nomura và cộng sự Thứ nhất, toàn bộ chuột nhóm 4 đã nêu được sự giảm kháng thể kháng H pylori trong huyết thanh mặc dù sự tiệt trừ H pylori trong mô bệnh học dạ dày của nhóm chuột gây nhiễm vẫn chưa đạt hiệu quả 100% Thứ hai,

có 55,6% chuột nhóm 4 đã tiệt trừ được H pylori (HP-) mặc dù thấp hơn Nomura và cộng sự

(100%), tuy vậy trong số HP (-) của nghiên cứu chúng tôi đã có 40% cho kết quả viêm dạ dày

âm tính, điều này đã phản ánh phần nào khả năng tiệt trừ H pylori hay tác dụng dự phòng của chế phẩm IgY kháng urease của H pylori đã giúp bảo vệ dạ dày chuột chống lại sự tấn công

và thâm nhiễm của H pylori, nghĩa là đã loại bỏ tác nhân gây viêm dạ dày Vai trò dự phòng của IgY kháng urease của H pylori đối với chuột nhóm 4 đã được biểu hiện qua sự giảm có ý nghĩa thống kê của vi khuẩn H pylori ở niêm mạc dạ dày (p < 0.0001) Thêm vào đó, tình trạng viêm dạ dày ở chuột nhóm 4 cũng giảm tỉ lệ thuận theo sự giảm H pylori ở niêm mạc dạ dày

một cách có ý nghĩa thống kê (p = 0.004)

Nhìn chung, tỉ lệ nhiễm H pylori ở nhóm 3 chiếm cao nhất, tương đương với kháng thể kháng H pylori trong huyết thanh cao nhất và mức độ viêm dạ dày cũng cao nhất ở nhóm 3 Điều này giúp nhận định rằng IgY kháng urease của H pylori có thể đã góp phần làm giảm nhẹ viêm dạ dày do H pylori và làm yếu đi một phần tác động của urease ở dạ dày thông qua việc

ức chế urease của H pylori, từ đó đã làm mất đi yếu tố sinh tồn của H pylori làm cho chúng

giảm gây tổn thương viêm niêm mạc dạ dày chuột và dễ bị tiệt trừ

IgY kháng urease của H pylori được sử dụng cho chuột nhắt trắng trước khi gây nhiễm

vi khuẩn H pylori với mong muốn đánh giá tác dụng dự phòng nhiễm vi khuẩn này trên động vật thực nghiệm Qua nghiên cứu nhận thấy tỉ lệ nhiễm H pylori cũng thấp hơn, mức độ viêm

dạ dày cũng nhẹ hơn và chuột cũng tăng cân nhiều hơn ở nhóm chuột được sử dụng IgY kháng

urease của H pylori và chế phẩm này cũng chứng minh được tính không độc và tính an toàn

khi sử dụng bằng đường uống Như vậy, IgY kháng urease của H pylori đã có tác dụng trong

dự phòng nhiễm vi khuẩn H pylori

IV KẾT LUẬN

(3)

(4)

Đã gây nhiễm thành công H pylori qua đường tiêu hóa cho chuột nhắt trắng dòng Swiss

với liều 108 CFU/ml/chuột Tỷ lệ chuột nhiễm H pylori đạt 100% qua khảo sát bằng xét nghiệm ELISA tìm kháng thể kháng H pylori trong máu và vi khuẩn H pylori dưới niêm mạc dạ dày

chuột được gây nhiễm Ăn thức ăn tẩm IgY kháng urease liều 4mg IgY/gam thức ăn trước gây nhiễm 1 tuần và liên tục sau khi gây nhiễm thấy có tác dụng dự phòng trên động vật thực

nghiệm thông qua các chỉ tiêu hạn chế giảm cân, giảm hoạt độ kháng thể kháng H pylori trong máu, giảm viêm và giảm mật độ vi khuẩn H pylori trên tiêu bản giải phẫu bệnh lý

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Đỗ Minh Trung, Hoàng Trung Kiên, Lê Văn Đông (2010) Nghiên cứu tách chiết, tinh sạch

kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà Tạp chí Thông tin y dược, Chuyên đề Miễn dịch học, 77-81

2 Ko K.Y., Ahn D.U (2007) Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium

sulfate precipitation and ion exchange chromatography Poultry Science, 86(2):400-407

3 Kusters J.G., van Vliet A.H.M., Kuipers E.J (2006) Pathogenesis of Helicobacter pylori infection Clinical Microbiology Reviews, 19(3):449-490

4 Miwa H., Ghoshal U.C., Gonlachanvit S., et al (2012) Asian Consensus report on Functional

dyspepsia Journal of Neurogastroenterology and Motility, 18(2):150 - 168

5 Nomura S., Suzuki H., Masaoka T., et al (2005) Effect of dietary anti-urease immunoglobulin

Y on Helicobacter pylori infection in Mongolian gerbils Helicobacter, 10(1):43-52

6 WHO Geneva (2009) Proposal for the inclusion of a proton pump inhibitor for the treatment of

dyspepsia in the WHO model list of essential medicines 17 th Expert Committee on the selection and use of essential medicines, 1-31

(Ngày nhận bài: 20/9/2019 - Ngày duyệt đăng: 04/11/2019)