Luận văn thạc sĩ VNU UET nghiên cứu thiết kế và chế tạo cảm biến đo khí NH3 bằng phương pháp in phun 001

Các phương pháp biến đổi bề mặt để ứng dụng cảm biến thanh dao động trong việc phát hiện ung thư gan .... Đề tài này nghiên cứu phương pháp biến đổi bề mặt thanh dao động nhằm tăng khả n

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

PTN CÔNG NGHỆ NANO

NGUYỄN TRUNG THÀNH

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BIẾN ĐỔI BỀ MẶT THANH DAO ĐỘNG HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM CẢM BIẾN PHÁT

HIỆN CHỈ THỊ UNG THƯ GAN AFP VÀ DKK1

Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanô (Chuyên ngành đào tạo thí điểm)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2014

Lời cảm ơn

Công sinh thành, dưỡng dục, trao trọn yêu thương không bờ bến, một đời của cha mẹ

để con có được những ngày hôm nay, con xin tạc dạ Cảm ơn người!

Ơn dạy dỗ tận tâm của thầy cô không thể nào đền đáp, em xin ghi lòng Em xin cảm ơn!

Xin gửi tới thầy giáo, cán bộ hướng dẫn em đề tài luận văn này, PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng lời cảm ơn chân thành nhất Thầy đã tận tâm hướng dẫn, dành thời gian quý giá của mình để đọc và sửa nội dung khoa học của bài luận này

Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Đặng Mậu Chiến Một người thầy, người quản lý tận tâm vì sự phát triển của sự nghiệp khoa học nước nhà

Xin gửi tới Thạc Sỹ Phan Nhật Thanh Khoa lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất

Anh là một người thầy, một người anh chưa bao giờ thiếu nhiệt tình và tâm huyết giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Cảm ơn Thạc sỹ Phạm Văn Bình, anh đã giúp tôi hiểu sâu hơn một số vấn đề liên quan đến y sinh trong đề tài này

Cảm ơn em Phạm Văn Thọ, các nghiên cứu viên, nhân viên của Phòng thí Nghiệm Công nghệ Nano đã có những giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài ở LNT

Chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Hội đồng bảo vệ luận văn này đã đọc, phản biện giúp em hiểu rõ hơn những vấn đề chưa rõ

Tôi cũng chân thành cảm ơn đề tài C2014-32-01 thực hiện tại PTN Công nghệ Nano, Đai học Quốc gia Tp HCM đã cho tôi cơ hội tham gia thực hiện nghiên cứu này

Xin gửi lời chúc sức khoẻ, hạnh phúc tới quý thầy cô, anh chị và các bạn!

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2014

Học viên cao học

Nguyễn Trung Thành

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Học viên thực hiện Luận văn

Nguyễn Trung Thành

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Lời cam đoan ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ viết tắt vii

Danh muc các bảng viii

Danh mục hình ảnh ix

Mở đầu 01

1 Giới thiệu 01

2 Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài 02

2.1 Mục tiêu 02

2.2 Ý nghĩa của đề tài 02

3 Tóm tắt nội dung của đề tài 03

CHƯƠNG 1 04

TỔNG QUAN 1.1 Cảm biến sinh học trên cơ sở thanh dao động 04

1.1.1 Cảm biến sinh học 04

1.1.1.1 Lịch sử phát triển công nghệ cảm biến sinh học 04

1.1.1.2 Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cảm biến sinh học 05

1.1.1.3 Phân loại 06

1.1.2 Cảm biến sinh học trên cơ sở thanh dao động 08

1.1.2.1 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học dựa trên nguyên lý thanh dao động 08

1.1.2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của cảm biến sinh học trên cơ sở thanh dao động 10

1.2 Ung thư gan 11

1.2.1 Thực trạng bệnh nhân ung thư gan trên thế giới 14

1.2.2 Phòng tránh, chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư gan 16

1.2.2.3 Một số phương pháp điều trị bệnh ung thư gan 18

1.2.3 Hệ kháng thể-kháng nguyên 20

1.2.4 Chất chỉ thị ung thư gan 22

1.2.4.1 Chất chỉ thị AFP 22

1.2.4.2 Chất chỉ thị DKK1 23

1.3 Các phương pháp biến đổi bề mặt để ứng dụng cảm biến thanh dao động trong việc phát hiện ung thư gan 24

1.3.1 Biến đổi xuất phát từ bề mặt Au 24

1.3.2 Biến đổi xuất phát từ bề mặt SiNx 25

1.3.2.1 Phương pháp biến đổi và vấn đề đối với SiNx 25

1.3.2.2 Vai trò của xử lý bề mặt SiNx bằng plasma O2 26

1.3.2.2.1 Giới thiệu về plasma O2 26

1.3.2.2.2 Một số kỹ thuật tạo plasma 26

1.3.2.2.3 Vai trò của plasma đối với bề mặt SiNx 29

1.4 Các phương pháp đánh giá hiệu quả của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động 29

1.4.1 Đánh giá các bước biến đổi bề mặt 29

1.4.1.1 Phương pháp chụp ảnh huỳnh quang 29

1.4.1.2 Phương pháp đo góc tiếp xúc 30

1.4.1.3 Phương pháp phản ứng đổi màu nhờ enzyme HRP 33

1.4.2 Phương pháp đo độ lệch thanh dao động để phát hiện chất đánh dấu sinh học

33

CHƯƠNG 2 36

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Quy trình biến đổi bề mặt thanh dao động 36

2.1.1 Quy trình xuất phát từ Au 36

2.1.1.1 Khảo sát trên wafer 36

2.1.1.2 Thử nghiệm trên chíp thanh dao động để dò tìm AFP 37

2.1.2 Qui trình xuất phát từ bề mặt SiNx/SiO2 39

2.1.2.1 Khảo sát silane hóa bề mặt SiNx và SiO2 và vấn đề của SiNx 39

2.1.2.2 Xử lý bề mặt SiNx bằng plasma O2 43

2.1.2.3 Tối ưu hóa quy trình xử lý plasma oxy 44

2.1.2.4 Áp dụng các quy trình tối ưu hóa để biến đổi bề mặt SiNx với GOPTS 44

2.1.2.5 Áp dụng các quy trình tối ưu hóa để biến đổi bề mặt SiNx với APTES +GAD 44

2.1.2.6 Ứng dụng thanh dao động động để dò tìm DKK1 45

2.2 Các phương pháp, thiết bị khảo sát và hoá chất sử dụng trong đề tài 47

2.2.1 F-LCA và kính hiển vi huỳnh quang 47

2.2.2 Máy đo góc tiếp xúc 48

2.2.3 Khảo sát bằng enzim HRP 48

2.2.4 Đo độ lệch 49

2.2.5 Các hoá chất sử dụng trong đề tài 49

CHƯƠNG 3 51

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát qui trình biến đổi xuất phát từ bề mặt Au 51

3.1.1 Khảo sát thời gian ngâm GAD 51

3.1.2 Khảo sát nồng độ GAD 54

3.1.3 Đánh giá hiệu quả quy trình tối ưu thông qua góc tiếp xúc 55

3.1.4 Kết quả thử nghiệm thanh dao động để phát hiện AFP 56

3.2 Qui trình xuất phát từ bề mặt SiN/SiO 2 57

3.2.1 Kết quả biến đổi bề mặt SiNx chưa qua xử lý plasma O2 và bề mặt SiO2 57

3.2.2 Cải tiến quy trình xuất phát từ bề mặt SiNx bằng phương pháp xử lý plasma oxy 58

3.2.3 Tối ưu hóa quy trình xử lý plasma oxy 59

3.2.3.1 Thời gian xử lý plasma 59

3.2.3.2 Ảnh hưởng của lưu lượng khí oxy 61

3.2.3.3 Ảnh hưởng của công suất plasma 64

3.2.3.4 Các thông số xử lý plasma tối ưu 65

3.2.4 Áp dụng quy trình xử lý plasma vào quy trình APTES +GAD tối ưu 66

3.2.5 Áp dụng quy trình xử lý plasma oxy +APTES+GAD tối ưu để biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động để dò tìm DKK1 68

KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN ĐỀ TÀI

4.1 Kết luận 70 4.2 Hướng phát triển của đề tài 70

Tài liệu tham khảo 71

Tên bảng Trang

Bảng 1.1.1: Các thành phần chính của một cảm biến sinh học 6

Bảng 2.2.1 Danh mục các hóa chất 49

Bảng 3.1.1: Khảo sát thời gian ngâm GAD 51

Bảng 3.1.2: Khảo sát nồng độ GAD 54

Bảng 3.1.3: Kết quả đo góc tiếp xúc nước 56

Bảng 3.2.1: Các thông số của quá trình xử lý plasma oxy 58

Bảng 3.2.2: Các thông số quá trình xử lý plasma oxy 60

Bảng 3.2.3: Các thông số quá trình xử lý plasma oxy 61

Bảng 3.2.4: Các thông số quá trình xử lý plasma oxy 64

Bảng 3.2.5: Các thông số tối ưu của quá trình xử lý plasma oxy 65

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1: a) Thanh dao động khi chưa nhận kháng nguyên; b) thanh dao động khi đã nhận

kháng nguyên 01

Hình 1.1.1: “enzyme electrode” đầu tiên 04

Hình 1.1.2: Sơ đồ cấu tạo của một cảm biến sinh học 06

Hình 1.1.3: Một số thành phần sinh hoá được sử dụng trong thiết kế cảm biến sinh học và các chất phân tích riêng tương ứng 07

Hình 1.1.4: Sự thay đổi màu sắc của ánh sáng phản xạ trên bề mặt khi chiết suất và độ dày màng thay đổi 08

Hình 1.1.5: Các nguyên tắc truyền dẫn của cantilever, a) sự thay đổi về độ cong bởi nhiệt độ thay đổi; b) sự thay đổi về độ cong bởi ứng suất bề mặt; c) sự thay đổi về tần số dao động cộng hưởng khi thay đổi khối lượng 09

Hình 1.1.6: Hai cơ chế liên kết kháng thể - kháng nguyên gây ra hai dạng ứng suất bề mặt khác nhau a) ứng suất kéo; b) ứng suất nén 09

Hình 1.1.7: Sơ đồ một chip thanh dao động nhìn từ trên xuống 10

Hình 1.1.8: Sơ đồ mặt cắt ngang một chip thanh dao động 10

Hình 1.2.1: Hình ảnh lá gan bình thường và lá gan bị ung thư 11

Hình 1.2.2: Giai đoạn 1 của ung thư gan 12

Hình 1.2.3: Giai đoạn 2 của ung thư gan 12

Hình 1.2.4: Giai đoạn 3 của ung thư gan 13

Hình 1.2.5: Giai đoạn 4 của ung thư gan 14

Hình 1.2.6: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mắc bệnh và chết vì các loại ung thư trên thế giới trung bình trong 100 người dân: a) nam; b) nữ 14

Hình 1.2.7: a) Biểu đồ số người mắc bệnh và chết vì các loại ung thư ở một số vùng trên thế giới; b) Bản đồ mô tả phân bổ bệnh nhân ung thư trên toàn thế giới 15

Hình 1.2.8: Cấu trúc điển hình của một kháng thể 21

Hình 1.2.10: Sự gắn kết kháng nguyên-kháng thể 22

Hình 1.2.11: Sự phụ thuộc của khả năng sống sót theo thời gian sau khi phẩu thuật liên hệ với hàm lượng DKK1 của những bệnh nhân HCC 24

Hình 1.3.1: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au 25

Hình 1.3.2 : Công thức cấu tạo của cysteamine 25

Hình 1.3.3: Cấu tạo buồng phản ứng của kỹ thuật CCP 27

Hình 1.3.4: Cấu tạo của buồng phản ứng của kỹ thuật ICP 28

Hình 1.3.5: Quá trình thay thể nguyên tử Nitơ của nguyên tử Oxy 29

Hình 1.3.6: Vai trò của plasma oxy đối với bề mặt SiNx 29

Hình 1.4.1: Một số chất huỳnh quang, a) fluorescein isothiocyanate (FITC); b) 5-carboxyfluorescein succinimidyl ester; c) 6-fluorescein-5-carboxamido hexanoic acid succinimidyl ester 30

Hình 1.4.2: Hình ảnh những giọt nước trên lá sen 31

Hình 1.4.3: Góc thấm ướt của nước trên thủy tinh (trái) và lá sen (phải) 31

Hình 1.4.4: Các trường hợp không thấm ướt, ít thấm ướt và thấm ướt tốt 31

Hình 1.4.5: Sự phụ thuộc của góc tiếp xúc vào các dạng lực căng bề mặt 32

Hình 1.4.6: Mô tả nguyên lý đo độ lệch của thanh dao động 34

Hình 1.4.7: a) Hệ đo độ lệch thanh dao động của các chíp trên cùng một mảng; b) Một chíp với 9 thanh dao động 35

Hình 2.1.1: Quy trình biến đổi bề mặt Au của mẫu wafer 36

Hình 2.1.2: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au 37

Hình 2.1.3: Cơ chế phản ứng giữa nhóm amine (-NH2) và nhóm aldehyde (-CHO) 37

Hình 2.1.4: Quá trình khử của hợp chất NaCNBH3 37

Hình 2.1.5: Quy trình xử lý bề mặt thanh dao động có phủ Au 38

Hình 2.1.6: Vai trò của BSA 39

Hình 2.1.7: Sơ đồ quy trình silane với GOPTS trên bề mặt SiNx và SiO2 40

Hình 2.1.8: Liên kết silanol trên bề mặt SiNx/SiO2 40

Hình 2.1.9: Cấu tạo phân tử GOPTS và APTES 41

Hình 2.1.10: Quá trình silane hoá trên bề mặt SiNx/SiO2 với các chất có nhóm silane R là một nhóm chức (như là epoxy, amine, ) 42

Hình 2.1.11: Cơ chế phản ứng giữa nhóm amine và nhóm epoxy 43

Hình 2.1.12: Quy trình biến đổi bề mặt SiNx bằng plasma oxy 43

Hình 2.1.13: Thiết bị RIE 200ipB, SAMCO, tại Phòng thí Nghiệm Công nghệ Nano 44

Hình 2.1.14: Quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD áp dụng các quy trình tối ưu hoá 45

Hình 2.1.15: Sơ đồ quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD nhằm thu nhận DKK1 46

Hình 2.1.16: Vai trò của BSA trong trong quy trình APTES+GAD để biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động 47

Hình 2.2.1: Kính hiển vi huỳnh quang BX41 (Olympus) tại LNT 47

Hình 2.2.2: Thiết bị đo góc tiếp xúc CAM 101 48

Hình 2.2.3: Thiết bị Scala tại LNT 49

Hình 3.1.1: Sự phụ thuộc của tín hiệu huỳnh quang và thời gian ngâm GAD 52

Hình 3.1.2: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo thời gian ngâm GAD: a) 15 phút; b) 30 phút; c) 60 phút; d) 60 phút; e) 120 phút 53

Hình 3.1.3: Sự phụ thuộc của tín hiệu huỳnh quang vào nồng độ GAD 54

Hình 3.1.4: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo nồng độ GAD: a) 1%; b) 1.5%; c) 2%; d) 2.5%; e) 3% 55

Hình 3.1.5: Đồ thị thể hiện sự thay đổi độ lệch của thanh dao động ứng với nồng độ khác nhau của AFP 57

Hình 3.2.2: Ảnh huỳnh quang của mẫu SiNx có xử lý plasma oxy 59

Hình 3.2.3: Đồ thị thể hiện sự thay đổi của độ sáng huỳnh quang theo thời gian xử lý

plasma oxy 60

Hình 3.2.4: Ảnh huỳnh quang của 4 mẫu wafer ứng với thời gian xử lý plasma khác

nhau: a) 20 phút; b) 30 phút; c) 45 phút; d) 60 phút 61

Hình 3.2.5: Đồ thị sự phụ thuộc của độ sáng huỳnh quang vào lưu lượng khí oxy 62

Hình 3.2.6: Ảnh huỳnh quang của các mẫu ứng với lưu lượng khí oxy khác nhau: a) 20

Hình 3.2.9: Ảnh huỳnh quang: a) mẫu không được xử lý plasma oxy; b) mẫu xử lý

plasma oxy với các thông số tối ưu 66

Hình 3.2.10: Hình ảnh huỳnh quang của F-LCA trên thanh dao động được biến tính bề

mặt sử dụng các thông số tối ưu của quy trình APTES 67

Hình 3.2.11: Độ hấp thụ của dung dịch được đo bằng máy quang phổ UV-VIS với bước

sóng hấp thụ khoảng 540 nm 68

Hình 3.2.12: Đường chuẩn độ lệch của thanh dao động ứng với nồng độ DKK1 khác

nhau 69

Mở đầu

1 Giới thiệu

Ung thư gan là 1 trong 9 bệnh ung thư hay gặp nhất trên toàn thế giới, chiếm 5,6%

trong tổng số các bệnh ung thư và là bệnh có tiên lượng xấu Thời gian sống trung bình từ

khi phát hiện khoảng 6 tháng, chỉ có khoảng 4,7% có khả năng sống sót sau 5 năm [26]

Thật nguy hiểm hơn khi ngày càng ảnh hưởng mạnh từ mặt trái của sự phát triển như, ôi nhiễm môi trường, lạm dụng hóa chất trong bảo quản thực phẩm, uống rượu bia,… làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư

Để tăng khả năng điều trị bệnh ung thư thì yêu cầu cốt yếu là phát hiện bệnh sớm và chính xác Nhiều thập niên qua, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu ra nhiều phương pháp để chuẩn đoán sớm bệnh ung thư như, chụp cộng hưởng từ (MRI), chụp cắt

lớp đồng vị phóng xạ phát positron, chụp cắt lớp, nội soi,…[27]

Các phương pháp trên chủ yếu là chỉ phát hiện được bệnh khi bệnh đã phát triển thành khối u Một phương pháp có khả năng phát hiện được bệnh sớm hơn, đơn giản, chi phí thấp là phương pháp dùng chất chỉ thị thông qua cảm biến sinh học

Các thanh dao động với kích thước micromet được ứng dụng làm cảm biến phát hiện chất chỉ thị ung thư được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây Với độ dày của thanh dao động khoảng 1µm, dài khoảng 500-700µm, nhiều tính chất vật lý của thanh sẽ thay đổi rõ rệt khi một lượng nhỏ chất chỉ thị (chất cần phân tích) bám lên bề mặt thanh

Đo tín hiệu điện hoá, ứng suất bề mặt, độ lệch hoặc sự thay đổi của tần số dao động của thanh thì ta thu được nhiều thông tin chính xác phục vụ cho quá trình phân tích và chẩn đoán bệnh Hình 1 mô tả sự thay đổi của thanh dao động trước và sau khi gắn kết chất chỉ thị

Hiệu quả của phương pháp phụ thuộc rất lớn vào khả năng cố định các phần tử sinh học lên bề mặt của thanh dao động Do đó, việc nghiên cứu phương pháp tăng khả năng gắn kết các thụ thể sinh học lên bề mặt thanh dao động là rất cần thiết

Các thanh dao động ứng dụng trong cảm biến sinh học thường làm từ vật liệu SiNx và được phủ lên một lớp vàng và crom mỏng Bản thân Au và SiNx không phản ứng trực tiếp với các thụ thể nên để gắn kết các thụ thể này lên bề mặt thì chúng ta phải biến đổi

bề mặt của thanh dao động

Đề tài này nghiên cứu phương pháp biến đổi bề mặt thanh dao động nhằm tăng khả năng gắn kháng thể lên bề mặt thanh dao động hướng đến ứng dụng làm cảm biến phát hiện chỉ thị ung thư gan AFP và DKK1

2 Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài 2.1 Mục tiêu

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phương pháp biến đổi bề mặt thanh dao động được phủ lớp Au, SiNx hướng ứng dụng làm cảm biến phát hiện chất chỉ thị AFP và

DKK1

2.2 Ý nghĩa của đề tài

Sử dụng cảm biến thanh dao động để phát hiện các chất chỉ thị ung thư gan là một phương pháp xét nghiệm miễn dịch không đánh dấu, đơn giản, chi phí thấp và đặc biệt là có thể phát hiện được bệnh ung thư gan ở giai đoạn đầu Điều này sẽ giúp tăng khả năng điều trị hiệu quả bệnh ung thư gan Ở nước ta, đây là một đề tài khá mới mẻ Nghiên cứu này có thể mở ra những hướng nghiên cứu mới về xét nghiệm miễn dịch nhằm chẩn đoán sớm bệnh ung thư gan

3 Tóm tắt nội dung của đề tài

Nội dung chính của đề tài bao gồm:

 Khảo sát thí nghiệm biến đổi bề mặt Au của thanh dao động thông qua cysteamine, GAD Xây dựng quy trình dò tìm AFP

 Khảo sát phương pháp biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động thông qua GOPTS, APTES, GAD Xây dựng quy trình dò tìm DKK1

TỔNG QUAN

1.1 Cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động

1.1.1 Cảm biến sinh học 1.1.1.1 Lịch sử phát triển công nghệ cảm biến sinh học

Sự phát triển của cảm biến sinh học đầu tiên gắn liền với cái tên L C Clark, người đầu tiên đề xuất đầu dò oxy (1956) cho việc xác định oxy trong máu và sau đó được coi

là “enzyme electrode” gồm có đầu dò enzim và hai màng lọc máu kèm theo một phần nhỏ dung dịch glucose oxidase giữa chúng (hình 1.1.1)

Hình 1.1.1: “enzyme electrode” đầu tiên

Enzim xúc tác sự oxi hoá chuyển đổi glucose thành axít gluconic Vì vậy, lượng oxy

bị phân giải gần bề mặt điện cực tương ứng với nồng độ glucose Sau này, một thiết bị tương tự với glucose oxidase được giữ trong gel polyacrylamide đã được mô tả bởi Updike và Hicks (1967) Tuy nhiên, ứng dụng phân tích đầu tiên của cố định enzim đã được tạo ra vào năm 1962 (Guilbault et al 1962) G Guilbault đã đề xuất hệ thống cảnh báo cho việc phát hiện sớm chất độc thần kinh Nó bao gồm 2 điện cực lưới Pt với một thanh xốp hấp thụ chứa các enzim cholinesterase cố định

Năm 1969, cảm biến enzyme potentiometric đầu tiên dựa trên điện cực NH3 chọn lọc

và urease cho việc kiểm tra u-rê trong nước tiếu (Guilbault và Montalvo 1969)

Năm 1970, Bergveld đã phát minh transistor hiệu ứng trường chọn lọc ion (ISFET)

Năm 1972, cảm biến sinh học thương mại đầu tiên được sản xuất Nó là thiết bị kiểm tra đường huyết, có dạng cây bút sử dụng một điện cực

Năm 1975, Janata phát minh ra cảm biến miễn dịch đầu tiên dự trên một bộ phân thế (potentiometric transducer)

Năm 1976, ra đời cảm biến miễn dịch amperometric đầu tiên (Aizawa et al 1976)

Cũng trong năm này, Karube phát mình ra cảm biến sinh học vi khuẩn (microbial biosensor) dựa trên tốc độ hô hấp như là một tín hiệu đặc trưng trong tổng lượng vật chất hữu cơ có thể oxi hoá trong nước

Năm 1980, Peterson phát minh ra cảm biến pH sợi quang đầu tiên trong khí huyết cơ thể

Năm 1982, lần đầu tiên ra đời cảm biến sinh học glucose dựa trên cơ sở sợi quang

Năm 1983, lần đầu ra đời cảm biên miễn dịch cộng hưởng gen nguyên sinh bề mặt (surface plasmon reconance-SPR)

Năm 1984, ra đời cảm biến sinh học đo dòng gián tiếp đầu tiên Ferrocene được sử dụng với glucose oxidase cho việc thu nhận glucose

Năm 1987, ra mắt cảm biến sinh học đường huyết MediSense ExacTechTM

(mô hình dải/bút và dùng một lần)

Năm 1990, ra mắt Pharmacia BIACore SPR dựa trên hệ thống cảm biến sinh học

Năm 1992, i-STAT ra mắt thiết bị phân tích máu cầm tay

Năm 1996, Glucocard được ra mắt

Năm 1998, ra mắt cảm biến sinh học đường huyết LifeScan FastTake

Năm 2001, LifeScan đã mua hệ thống kinh doanh thiết bị kiểm tra glucose của Inverness Medical’s với giá 1,3 tỷ đô

Từ năm 1999-nay, các nhà nghiên cứu đã ứng dụng một số kỹ thuật như BioNMES, Quantum dots, nanopartivles, Nanocantilever, Nanowire và Nanotube vào cảm biến sinh

học [2], [3]

1.1.1.2 Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cảm biến sinh học

Cấu tạo cơ bản của một cảm biến sinh học được mô ta ở hình 1.1.2 [5]:

Hình 1.1.2: Sơ đồ cấu tạo của một cảm biến sinh học

Một cảm biến sinh học bao gồm 3 phần chính: (1) các thụ thể (kháng thể, bộ dò DNA, cell receptor…) có thể bắt giữ các phần tử sinh học (như là kháng nguyên, DNA đích, cell…); (2) bề mặt cảm biến, nơi gắn các thụ thể đồng thời cũng là nơi sinh ra các tín hiệu vật lý (độ lệch, điện trở, chiết suất…) hoặc hóa học thay đổi khi các thụ thể bắt giữ được các phần tử sinh học, (3) thiết bị điện tử có nhiệm vụ biến các tín hiệu vật lý, hóa học từ cảm biến và chuyển thành tin hiệu chuyển về hệ thống máy tính để xử lý và hiển thị kết quả

Nguyên tắc hoạt động cơ bản của cảm biến sinh học: bề mặt cảm biến được biến đổi

và cố định các thụ thể lên đó, khi tiếp xúc với môi trường cần phân tích, các thụ thể này

sẽ bắt giữ các chất cần phân tích dẫn đến làm thay đổi một số tính chất hóa, lý của bề mặt (độ lệch, điện trở, chiết suất…) Sau đó, thông qua bộ chuyển đổi, những thay đổi này được chuyển sang các tín hiệu quang, điện, cơ, và nhờ bộ phận xử lý tín hiệu (vi xử lý, thiết bị điện tử) khuếch đại, đo lường các tín hiệu này và cho ta biết được thông tin về chất phân tích

1.1.1.3 Phân loại cảm biến sinh học

Việc phân loại cảm biến sinh học thông thường dựa vào nguồn gốc các bộ phận chính

của chúng (bảng 1.1.1.) [2]

Bảng 1.1.1: Các thành phần chính của một cảm biến sinh học

Thành phần sinh hoá Bộ phận truyền dẫn Thành phần phân tích Enzim

Kháng thể Axít nucleic Chất cảm thụ

Mô

Điện hoá Quang

Vi cơ điện Mass sensitive Enthalpiemetric

Thuốc và chất chuyển hoá của chúng Chất chỉ thị sinh học

Vitamin và các chất chống oxi hoá Các chất chuyển đổi

Chất ô nhiễm môi trường

Tế bào Công nghiệp hoá mỹ phẩm Cảm biến sinh học enzim (còn gọi là cảm biến enzim, hay điện cực enzim) sử dụng các enzim làm công cụ trên bề mặt của lớp chuyển đổi Cảm biến miễn dịch (immunosensors) sử dụng các thành phần tương tác miễn dịch, như là các kháng thể hay kháng nguyên Cảm biến DNA bao gồm đầu dò DNA và các aptamer Một đầu dò DNA

là một chuỗi oligonucleotide ngắn sao chép lại một phần của gen Những cảm biến sinh học dựa trên chuỗi này và được mong đợi thu nhận những đoạn DNA đặc trưng cho những gen thích hợp còn được gọi là genosensors (Yang và McGovern 1997) Các aptamer cũng bao gồm các nucleotide nhưng không có cấu trúc tương tự như DNA tự nhiên Những aptamer được tổng hợp bằng phương pháp trùng hợp và được lựa chọn bằng phép ghi sắc mô phỏng đối chiếu với một mục tiêu phân tích Những aptamer có thể dựa trên một thư viên RNA, trong khi đó các phần tử RNA tự nhiên vẫn chưa được sử dụng trong cảm biến sinh học Những cảm biến sinh học trên cơ sở aptamer được gọi là aptasensor (Famulok và Mayer 2011)

Trong vài thập niên qua, người ta đã đề xuất việc sử dụng các mô sinh học trong cấu trúc của cảm biến sinh học Trong nhiều trường hợp, chúng được ứng dụng như một nguồn hoạt tính của enzim riêng biệt Theo đó, chúng được thay thế cho những enzim đắt tiền hoặc không có Bên cạnh đó, sự ổn định của những enzim trong các mô sinh học thậm chí còn cao hơn so với ở trạng thái được tách riêng biệt bởi hiệu ứng bảo vệ của vi môi Sau này, việc sử dụng các mô sinh học giảm đi bởi việc tiếp cận các protein tinh khiết và thậm chí còn cung cấp một số sản phẩm thực tế kết hợp các enzim và những chất

hỗ trợ (dẫn xuất cellulose, các hạt silica, và các hạt từ)

Hình 1.1.3: Một số thành phần sinh hoá được sử dụng trong thiết kế cảm biến sinh

học và các chất phân tích riêng tương ứng

- Cảm biến sinh học dựa trên tín hiệu điện hóa: Nguyên lý của việc thu nhận tín hiệu điện hoá sử dụng trong cảm biến sinh học là dựa trên quá trình di chuyển của các điện tích xảy ra trên mặt tiếp xúc của dung dịch phân tích-điện cực Một số chất phản ứng (các chất điều hoà, enzim nền, chất điện phân) được cho vào dung dịch, nhưng những thay đổi các đặc trưng điện hoá (thế, dòng, độ dẫn) theo những chất thêm vào liên quan đến sự thay đổi sự phân bổ năng lượng, cấu trúc và thành phần hoá học của mặt tiếp xúc

- Những cảm biến sinh học quang dựa trên sự thay đổi pha và biên độ của ánh sáng

bị phân cực cung cấp thông tin độ dày và chiết suất của lớp phần tử sinh học bị hấp thụ trên bề mặt Sự thay đổi của chiết suất và độ dày của lớp màng mỏng này sẽ làm thay đổi

màu sắc của ánh sáng phản xạ trên bề mặt của cảm biến [4]

Hình 1.1.4: Sự thay đổi màu sắc của ánh sáng phản xạ trên bề mặt khi chiết suất và độ

dày màng thay đổi

1.1.2 Cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động (cantilevers)

1.1.2.1 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động

Trong những năm gần đây, các cantilever được ứng dụng rộng rãi trong cảm biến sinh học bởi những ưu điểm nổi bật của nó như độ nhạy cao, kích thước nhỏ, thời gian xử

lý ngắn, và chi phí thấp Chúng được ứng dụng: để phát hiện những thay đổi về nhiệt độ, ứng suất bề mặt, và khối lượng với một lượng cỡ picogram của chất phân tích Những cantilever được sử sụng trong hệ thống cảm biến để có được một dạng bộ chuyển đổi nhỏ hoàn toàn mới dựa trên các nguyên lý cơ ban của vật lý như là hiệu ứng lưỡng kim, ứng suất bề mặt, hoặc dao động điều hoà

Có 3 nguyên tắc truyền dẫn của cantilever chia làm ba phương pháp khác nhau Thứ nhất, là do sự thay đổi tần số cộng hưởng bởi sự tăng khối lượng hoặc sự thay đổi về hằng số lực có thể đo được Thứ hai, là do độ cong của một cantilever lưỡng kim bởi sự

thay đổi về nhiệt độ Cuối cùng, là do cantilever thay đổi độ cong khi thành phần các chất

trên bề mặt thay đổi Những nguyên tắc này được thể hiện trong hình 1.1.5 [6]

Hình 1.1.5: Các nguyên tắc truyền dẫn của cantilever, a) sự thay đổi về độ cong bởi nhiệt độ

thay đổi; b) sự thay đổi về độ cong bởi ứng suất bề mặt; c) sự thay đổi về tần số dao động cộng

hưởng khi thay đổi khối lượng

Sự thay đổi ứng suất bề mặt của cantilever có thể do sự thay đổi về khối lượng chất hấp phụ, sự tương tác tĩnh điện của các chất trên bề mặt hoặc sự tương tác giữa các kháng nguyên và kháng thể (hình 1.1.6)

Việc đo độ lệch của các cantilever hoặc độ dịch tần số dao động cộng hưởng sau khi gắn các kháng nguyên cho phép ta định lượng được nồng độ của các chất cần phân tích

Hình 1.1.6: Hai cơ chế liên kết kháng thể - kháng nguyên gây ra hai dạng ứng suất

bề mặt khác nhau a) ứng suất kéo; b) ứng suất nén

Thanh dao động trong nghiên cứu này làm bằng vật liệu silicon nitride trên đế wafer

Si Mặt trên của thanh có phủ một lớp màng mỏng Cr và Au nhằm tăng độ phản xạ (phục

vụ cho việc đo độ lệch của thanh, vì bản thân màng mỏng SiNx là trong suốt, không phản

xạ ánh sáng)

Hình 1.1.7: Sơ đồ một chip thanh dao động nhìn từ trên xuống

Hình 1.1.8: Sơ đồ mặt cắt ngang một chip thanh dao động

Để có thể ứng dụng thanh dao động làm cảm biến sinh học cần phải gắn lên bề mặt thanh kháng thể tương ứng Mục đích của luận văn này là dò tìm Alpha-fetoprotein (AFP) và Dickkopt-1 (DKK1) là hai chất chỉ thị ung thư gan Do đó cần phải gắn được kháng thể của AFP và DKK1 lên bề mặt thanh dao động Thanh có 2 mặt là Au (mặt trên) và SiNx (mặt dưới) Hai mặt này không phản ứng với các phân tử sinh học như protein, DNA v.v do đó không gắn với kháng thể được, mà cần phải trải qua biến đổi hóa học để trên bề mặt xuất hiện các nhóm chức có thể gắn với protein Có hai hướng biến đổi bề mặt để cố định các phần tử sinh học là: liên kết giữa vàng với các hợp chất thiol hoặc liên kết giữa bề mặt SiNx với với các hợp chất silane

1.1.2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động

Dựa vào cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cảm biến sinh học thanh dao động, hiệu quả của cảm biến được quyết định bởi hai yếu tố cơ bản nhất đó là hiệu quả bắt giữ chất phân tích và hiệu quả truyền dẫn

Hiệu quả bắt giữ chất phân tích được quyết định bởi quá trình biến đổi bề mặt của thanh dao động Nếu quá trình biến đổi bề mặt thanh dao động đạt hiệu quả cao thì khả năng cố định các phần tử sinh học sẽ cao sẽ làm tăng độ nhạy của cảm biến Do đó, vấn

đề biến đổi bề mặt thanh dao động có ý nghĩa rất quan trọng quyết định hiệu quả sử dụng của cảm biến

1.2 Ung thƣ gan

Ung thư gan là một bệnh ác tính của gan do sự tăng sinh ồ ạt tế bào gan hoặc tế bào đường mật gây hoại tử và chèn ép trong gan

Hình 1.2.1: Hình ảnh lá gan bình thường và lá gan bị ung thư

Ung thư gan được chia làm bốn giai đoạn phát triển chính:

Giai đoạn 1: khối u đơn lẻ chưa xâm lấn vào bất kỳ mạch máu nào Nếu phát hiện ở

giai đoạn này thì sẽ có nhiều cơ hội kéo dài sự sống

Hình 1.2.2: Giai đoạn 1 của ung thư gan

Giai đoạn 2: khối u đơn lẻ đã xâm lấn vào mạch máu lân cận, hoặc có thể có nhiều

khối u nhỏ trong gan Ở giai đoạn này, nguy cơ ung thư di căn thông qua các mạch

máu là rất cao

Hình 1.2.3: Giai đoạn 2 của ung thư gan

Giai đoạn 3: nhiều khối u lớn, hoặc một khối u lớn đã xâm lấn tĩnh mạch chính của

gan hoặc xâm lấn các tổ chức lân cận, chẳng hạn như túi mật Lúc này, sức khoẻ của

gan bị tổn thương nghiêm trọng

Hình 1.2.4: Giai đoạn 3 của ung thư gan

Giai đoạn 4: ung thư đã lan ra ngoài gan đến các vùng khác của cơ thể Ở giai đoạn

này, việc điều trị chỉ mang tính chất giúp giảm các triệu chứng của bệnh để người

bệnh cảm thấy dễ chịu hơn

Hình 1.2.5: Giai đoạn 4 của ung thư gan

1.2.1 Thực trạng về bệnh ung thƣ gan trên thế giới

Trên thế giới, ung thư gan là bệnh ung thư phổ biến thứ 5 ở nam giới và thứ 9 đối với

nữ (hình 1.2.6) Vì việc chẩn đoán và điều trị trễ nên trong nhiều trường hợp, tỷ lệ tử

Hình 1.2.6: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mắc bệnh và chết vì các loại ung thư trên thế

giới trung bình trong 100 người dân: a) nam; b) nữ [26]

vong gần như cao bằng tỷ lệ mắc bệnh (tỷ lệ tử vong/mắc là 0,93) Trên thế giới, ung thư gan đứng thứ ba về tử vong liên quan đến ung thư Trong năm 2008, đã có 748.300 ca mắc mới và 695.900 trường hợp tử vong đã được thống kê 85% tất cả các trường hợp

xảy ra ở các nước đang phát triển (hình 1.2.7) [26] Các vùng có tỷ lệ mắc ung thư gan

cao là Đông và Đông Nam Á, Trung và Tây Phi

Hình 1.2.7: a) Biểu đồ số người mắc bệnh và chết vì các loại ung thư ở một số vùng

trên thế giới; b) Bản đồ mô tả phân bổ bệnh nhân ung thư trên toàn thế giới [26]

a)

b)

với tỷ lệ 35,2/100.000 người Trong khi ở Bắc Mỹ, Úc và Bắc Âu thuộc khu vực có tỷ lệ mắc HCC thấp và thấp nhất là ở khu vực Nam châu Âu (tỷ lệ 10,5/100.000) (hình 1.2.7)

Tỷ lệ HCC tăng theo tuổi Chỉ có những vùng có tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan B cao, như ở Trung Quốc, bệnh nhân được chẩn đoán trẻ hơn, đa phần ở độ tuổi 55-59 Ngược lại, ở Nhật Bản, nơi mà tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan C (HCV) mạn tính là yếu tố nguy cơ nhất với HCC, tuổi mắc bệnh cao nhất trong khoảng 70 và 79 Tại châu Âu và Bắc Mỹ hầu hết bệnh nhân được chẩn đoán ở độ tuổi giữa 60 và 65

Trên thế giới, tỷ lệ mắc HCC ngày càng tăng Tại châu Âu và Hoa kỳ, dự kiến sẽ đạt đỉnh điểm vào năm 2020 Trong hai thập kỷ qua, tỷ lệ tử vong đã tăng lên ở một số nước châu Âu (ví dụ nhứ Đức, Áo) và ở Mỹ, nơi mà tỷ lệ tử vong đã tăng lên 40% từ năm

1994 đến 2004 Mặt khác, ở một số quốc gia, như Pháp và Ý, đã cho thấy một sự tăng mạnh mẽ về tỷ lệ tử vong trong giữa những năm 90 và giảm đi sau đó

Xét toàn bộ dân số, nam giới bị bệnh ung thư gan nhiều hơn nữ giới Tỷ lệ nam/nữ là 2:1 đến 4:1 ở những khu vực có nguy cơ cao Một điều chắc chắn là nam giới thường tiếp

xúc nhiều hơn với các yếu tố nguy cơ gây bệnh[26]

1.2.2 Phòng tránh, chẩn đoán và điều trị bệnh ung thƣ gan 1.2.2.1 Phòng tránh bệnh ung thƣ gan

Ung thư gan là căn bệnh cực kỳ nguy hiểm, gây tử vong cao Mặc dù các tiến bộ y học hiện nay đã phát triển mạnh nhưng đối với bệnh ung thư gan, nhất là đã ở giai đoạn cuối thì việc chữa trị vẫn gặp rất nhiều khó khăn và đạt hiệu quả điều trị thấp Vì vậy, đối với căn bệnh này, việc phòng bệnh vẫn được coi là biện pháp tối ưu nhất

Ở thời kỳ đầu đa số bệnh nhân hoàn toàn không có triệu chứng gì, thường bệnh được phát hiện qua siêu âm định kỳ hoặc xét nghiệm AFP tăng cao

Khi khối u lớn dần, có thể thấy một hay nhiều triệu chứng dưới đây: mệt mỏi, sụt cân, gầy sút nhanh; đau âm ỉ, cảm giác tức nặng khó chịu vùng hạ sườn phải; chán ăn, ăn chậm tiêu; sốt; vàng da; cổ chướng; có thể bệnh nhân tự sờ thấy khối u ở vùng hạ sườn phải…Lúc này phần lớn người bệnh đã ở giai đoạn cuối, việc chữa trị cũng gặp rất nhiều khó khăn và hiệu quả điều trị thấp Phần lớn các biện pháp điều trị lúc này chỉ là kéo dài

sự sống cho người bệnh chứ không thể chữa khỏi hoàn toàn cho người bệnh được[29]

Để phòng ngừa nguy cơ mắc bệnh ung thư gan, chúng ta nên giảm thiểu rủi ro bằng cách giữ cho bản thân không bị lây các bệnh viêm gan B và C, bệnh chai gan và một số bệnh gan khác

Cách hữu hiệu nhất để phòng ngừa viêm gan B là tiêm phòng vacxin phòng ngừa

Vacxin này có thể bảo vệ bạn trong nhiểu năm hoặc cũng có thể cả đời nếu việc tiêm chủng thành công, cơ thể bạn có kháng thể chống lại sự xâm nhập của virus viêm gan B

Chúng ta cần phải hiểu rõ về bệnh viêm gan do virus và các con đường lây truyền của nó

để có được các biện pháp phòng ngừa bệnh hiệu quả, tránh để bị lây nhiễm bệnh

Không uống rụợu hoặc nên uống rươu có giới hạn cũng là biện pháp để phòng ngừa nguy cơ mắc bệnh ung thư gan Rượu tăng nhanh sự lan truyền của bất cứ căn bệnh gan nào và là nguyên nhân chính của bệnh chai gan dẫn đến ung thư gan

Tránh uống những thuốc có thể hại cho gan Tốt nhất người bệnh nên hỏi trực tiếp bác sĩ trước khi dùng một loại thuộc nào đó có thể gây độc cho gan Ngoài ra cần tránh trộn lẫn rượu với thuốc acetaminophen (tylenol…), vì sự phối hợp hai thứ này có thể gây tổn thương gan Gan phải lọc mọi chất mà bạn nuốt, hít vào hoặc bôi trên da, vì vậy,

đừng nên để gan chiu ảnh hưởng không cần thiết của các hoá chất [7],[8]

1.2.2.2 Các phương pháp chẩn đoán bệnh ung thư gan Kiểm tra sức khoẻ Nếu một người có triệu chứng của HCC, các bác sĩ sẽ khám

bụng để kiểm tra gan, lá lách, và các cơ quan lân cận có cục u, sưng, hoặc thay đổi khác

Bác sĩ cũng sẽ tìm kiếm một sự tích tụ bất thường của chất lỏng trong bụng và các dấu hiệu của bệnh vàng da, bao gồm vàng da và lòng trắng của mắt

Xét nghiệm máu Đồng thời với việc kiểm tra sức khỏe, bác sĩ có thể làm xét

nghiệm máu để tìm một số chất chỉ thị ung thư gan như là GP73, DKK1, AFP-L3, AFP

Bình thường, mức AFP là dưới 10ng/ml nhưng với những người mắc bệnh HCC thì hàm lượng AFP có thể lên đến 400ng/ml Tại Mỹ, hàm lượng AFP được tìm thấy trong máu của những bệnh nhân HCC ở nồng độ cao hơn khoảng 50% đến 70% so với người không mắc bệnh ung thư biểu mô gan Tuy nhiên, các bệnh nhân với hàm lượng AFP tăng cao nên được kiểm tra lại bằng phương pháp khác như siêu âm bụng, chụp cắt lớp hay chụp cộng hưởng từ hạt nhân để cho kết luận chính xác cuối cùng Bởi vì, thực tế thì các bệnh nhân nhiễm vi rút viêm gan C cũng có hàm lượng AFP trong máu cao hơn bình thường (10-100ng/ml)

Ngoài ra, các xét nghiệm khác cũng cần thiết để chẩn đoán HCC và tìm nơi khối u

nằm trong gan và ở các phần khác của cơ thể [29],[9]:

và các khối u tạo ra một hình ảnh khác nhau trên một màn hình máy tính

Phương pháp chụp cắt lớp vi tính (CT- Computerized Tomography hay Computerized Axial Tomography) cho phép chụp hàng loạt hình rất rõ và chính xác

CAT-theo lớp cắt ngang của cơ thể mô tả hình khối ba chiều của các cơ quan trong cơ thể

Phương pháp chụp cắt lớp có khả năng phát hiện các khối u đường kính xấp xỉ 1cm trong nhiều cơ quan, kể cả các cơ quan nằm sâu trong cơ thể như: não, gan, thận và tuỵ tạng

Chụp cộng hưởng từ (MRI-Magnetic Resonance Imaging) Cộng hưởng từ hạt

nhân phụ thuộc vào từ học của tế bào, nhất là ở độ tập trung của ion hydrô cho phép phân biệt được một số tổn thương tuỳ theo mức độ cộng hưởng từ trường của hạt nhân Đây là

"tiếng nói phân tử" vì diễn đạt cấu trúc hoá học của tổn thương ung thư Kỹ thuật này mở

ra khả năng hoàn toàn mới để nghiên cứu về sinh học của khối u và giám sát về phương diện hoá sinh hiệu quả của điều trị ung thư

Chụp mạch (Angiogram) Là phương pháp chụp hình X-quang các mạch máu Một

loại thuốc nhuộm được tiêm vào mạch máu để mạch máu của gan hiển thị trên X quang

Nội soi chẩn đoán (Laparoscopy) Phương pháp này cho phép bác sĩ nhìn thấy bên

trong cơ thể với một ống dẻo, phát sáng và mỏng gọi là thiết bị nội soi

Chẩn đoán mô bệnh học ung thư Đây là phương pháp tối quan trọng Sau khi chẩn

đoán bệnh nhân có khả năng mắc bệnh ung thư, bác sỹ phải xác định được loại ung thư (típ vi thể hay típ mô học), vì việc điều trị, nhất là hoá trị và xạ trị hoàn toàn phụ thuộc vào kết quả này Chẩn đoán mô bệnh học cho phép bác sỹ xác định chính xác loại ung thư Việc sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch và kính hiển vi điện tử đã mở rộng việc đánh giá các tổn thương vi thể bao gồm các đặc điểm về sinh hóa và siêu cấu trúc của tế bào góp phần cho chẩn đoán mô bệnh học chính xác hơn

1.2.2.3 Một số phương pháp điều trị ung thư gan

Sau khi chẩn đoán bệnh nhân mắc ung thư gan thì các phác đồ điều trị được đưa ra phù hợp với từng giai đoạn cụ thể của bệnh Có một số phương pháp điều trị bệnh ung

thư gan hiện đang được áp dụng trên thế giới [29], [27]

Điều trị phẫu thuật Đây là phương pháp phẫu thuật cắt rộng, lấy toàn bộ khối ung

thư và một phần tổ chức lành bao quanh u Nếu có hạch vùng khả nghi di căn, cần vét toàn bộ hạch vùng với mục đích không còn để sót lại tế bào ung thư U, hạch và phần tổ chức lành xung quanh được lấy gọn thành một khối Phương pháp này có khả năng chữa

khỏi nhiều loại ung thư khi còn ở giai đoạn sớm với khối u nhỏ (nhỏ hơn 5cm) Trường hợp khối u đã lan ra ngoài, hoặc nếu bệnh nhân có các bệnh nghiêm trọng khác thì phẫu thuật có thể không phải là một lựa chọn tốt

Điều trị bằng tia xạ Xạ trị là dùng tia phóng xạ để tiêu diệt các tế bào ung thư

Cùng với phẫu thuật, xạ trị là một trong hai phương pháp điều trị ung thư phổ biến nhất

và hiệu quả nhất Chỉ dùng phương pháp xạ trị đơn thuần có thể chữa khỏi nhiều loại ung thư khi còn ở giai đoạn cư trú tại chỗ, nhất là đối với các bệnh ung thư hạch bạch huyết, ung thư da, ung thư cổ tử cung, ung thư vòm họng, một số ung thư vùng đầu cổ… Điều trị bằng tia xạ phối hợp với phẫu thuật thường được áp dụng trong nhiều trường hợp khi ung thư đã phát triển tương đối lớn hơn Có khi xạ trị trước mổ nhằm giảm bớt thể tích u

để dễ mổ, hạn chế di căn xa trong lúc mổ Có khi dùng phương pháp này sau mổ nhằm diệt nốt những tế bào ung thư còn sót lại Có khi xạ trị cả trước mổ và sau mổ hoặc xạ trị phối hợp với hoá trị để tăng khả năng diệt tế bào ung thư tại một khu vực mà hoá trị không đủ khả năng diệt hết Tuy vậy, tia phóng xạ không chỉ diệt tế bào ung thư mà còn diệt luôn tế bào lành ở vùng bị chiếu gây ra các biến chứng phụ

Có 3 phương pháp điều trị bằng tia xạ:

- Chiếu xạ từ ngoài vào (máy Cobalt, tia X, máy gia tốc), là phương pháp áp dụng rộng rãi nhất Tia X có năng lượng tương đương kilovôn dung để xạ trị các bệnh

về da hoặc nằm ở vùng nông gần bề mặt da Tia X có năng lượng tương đương megavôn được dung để chiếu sâu vào các cơ quan trong cơ thể người như phổi, ruột, não bộ…

- Chiếu xạ từ bên trong cơ thể: nguồn phát bức xạ đặt trong ống, kim radium, kim Cobalt60, Cesium, Yridium, sợi Yridium…) đặt vào các hốc tự nhiên của cơ thể hoặc cắm vào các bộ phận mang ung thư

- Sử dụng thuốc có gắn đồng vị phóng xạ: Uống hoặc tiêm các thuốc có đồng vị phóng xạ (ví dụ 131I) hoặc kháng thể đặc hiệu có gắn đồng vị phóng xạ để diệt tế bào ung thư trong quá trình chuyển hoá và kết hợp chọn lọc

Iod có cả thảy 37 đồng vị, nhưng chỉ có đồng vị 127I là bền (chu kì bán rã 15,7 triệu năm) Đồng vị 125

I có thời gian sống ngắn đứng thứ hai trong số các đồng vị của iod (chu

kì bán rã 59 ngày, phân rã gamma-phát ra tia gamma), được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán phóng xạ (radioimmunoassay) (các chất sinh học được gắn với 125I, và sử dung máy

dò phóng xạ để phát hiện) Đồng vị 131I có ứng dụng trong xạ trị, thường được dùng với liều cao Nó có chu kì bán rã 8 ngày, thuộc dạng phân rã beta - và gamma (bước đầu tiên

nó phân rã nhanh thành Xe*, electron và phản nơtrino, sau đó Xe* phân rã thành Xe và tia gamma) Trong đó, hạt beta – (electron) sinh ra từ bước đầu tiên có năng lượng cao và có

chỉ đắt mà còn có nhiều tác dụng độc hại đối với các tế bào lành trong cơ thể nhưng có tính tăng sinh nhanh như tế bào tủy xương, tế bào ở hệ tiêu hóa, nang tóc dẫn đến suy tủy, viêm niêm mạc và rụng tóc Hoá trị thường kèm theo nhiều tác dụng phụ như buồn nôn và ói mửa, rụng tóc, chán ăn, tiêu chảy, mệt mỏi, tê và ngứa ran ở tay hoặc chân, đau đầu, Hiện nay, hoá trị ít được sử dụng để điều trị ung thư gan

Điều trị miễn dịch Trong khoảng 20 năm gần đây, những hiểu biết về hệ thống

miễn dịch ở người ngày càng tiến bộ Đã sử dụng các cytokin và kháng thể đơn dòng điều hòa hoạt động của hệ miễn dịch trong điều trị ung thư và một số bệnh lý khác Các chất

miễn dịch không đặc hiệu có nguồn gốc sinh học như: BCG và Carynebacterium barvum

đã được sử dụng trên thực nghiệm và trên người Các chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu có nguồn gốc hoá học như LH1… cũng đang được nghiên cứu

Kháng thể còn được gọi là các globulin miễn dịch hay immunoglobulin, kí hiệu là Ig

Ig được sinh ra khi cơ thể bị kháng nguyên kích thích, chúng có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên kích thích sinh ra chúng Cấu trúc của một kháng thể được thể hiện trong hình 1.2.8

Hình 1.2.8: Cấu trúc điển hình của một kháng thể

Phân tử kháng thể được cấu tạo từ bốn chuỗi polypeptide, liên kết với nhau bằng cầu

nối dissulfur (-s-s), trong đó có hai chuỗi nặng H giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ L cũng

giống hệt nhau Kháng thể được chia thành nhiều lớp khác nhau: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD Trong các lớp globulin miễn dịch có IgG chiếm khoảng 75-85% tổng số globulin miễn dịch của cơ thể Chúng có cấu trúc gần giống nhau gồm chuỗi nặng và nhẹ, cấu trúc chuỗi nhẹ của các loại kháng thể này nói chung là như nhau, chúng chỉ có khác nhau ở chuỗi nặng Bề mặt của kháng thể IgG được mô tả như trong hình 1.2.9

Hình 1.2.9: Bề mặt của kháng thể IgG

tương ứng nhờ các vùng biến đổi Khi kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể do kháng nguyên đã kích thích sinh ra thì phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể xảy ra một cách đặc hiệu.(hình 1.2.10)

Hình 1.2.10: Sự gắn kết kháng nguyên-kháng thể

Phản ứng kháng nguyên - kháng thể là cơ sở để xây dựng những phương pháp, kỹ thuật miễn dịch học thường sử dụng trong mục đích y học như chẩn đoán các bệnh ung thư, bệnh truyền nhiễm, bệnh kí sinh trùng, kỹ thuật xét nghiệm y học, thú y học, sinh học

1.2.4 Chất chỉ thị ung thƣ gan AFP và DKK1

1.2.4.1 Chất chỉ thị AFP

Alpha-fetoprotein (AFP) là một chất chỉ thị được các nhà khoa học nghiên cứu, căn

cứ để chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh ung thư biểu mô gan từ lâu Hàm lượng AFP trong máu của những người khoẻ mạnh bình thường nằm trong khoảng từ 0 đến 10

ng/ml Hàm lượng này tăng lên bất thường (vượt quá 400ng/ml)[5] ở những bệnh nhân

mắc bệnh HCC, lúc này bác sỹ có thể kết luận bệnh nhân bị ung thư gan Theo dõi hàm lượng AFP trong máu cũng giúp bác sỹ kiểm tra hiệu quả chữa trị bệnh nhân ung thư biểu

mô gan Nếu tình trạng bệnh nhân thuyên giảm thì hàm lường AFP cũng giảm dần và ngược lại Tuy nhiên, ở người bị nhiễm virút viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi C thì hàm lượng AFP luôn cao hơn mức bình thường (10-100ng/ml) Trong trường hợp này, cần thực hiện thêm một số phương pháp kiểm tra khác nữa để có kết luận có mắc ung thư gan hay không

AFP là một glycoprotein với cấu trúc gồm 590 amino acid và một phân tử carbohydrate, với khối lượng phân tử cỡ 70 kDa AFP là một protein quan trọng của huyết tương và do túi phôi của phôi thai hay theo một số tài liệu thì do gan của phôi sản sinh ra Protein này được cho là bản sao của albumin huyết thanh Gen mã hóa AFP và albumin cùng có mặt ở vị trí đối diện trên nhiễm sắc thể số 4 AFP được tìm thấy ở các dạng cấu trúc bậc 1, bậc 2, bậc 3 và gắn kết với nguyên tố đồng (Cu), niken (Ni), acid

béo và bilirubin [10],[11]

Trong giai đoạn phôi thai, AFP gắn với hormone estradiol và được định lượng thông qua máu của người mẹ hoặc dịch màng ối Trường hợp hàm lượng AFP tăng cao bất thường thì nhiều khả năng là phôi thai có vấn đề liên quan đến sự phát triển của hệ thần kinh hay thoát vị rốn hoặc hội chứng Down Sau khi được sinh ra, hàm lượng AFP của bé mới sinh giảm dần cho tới khi đạt mức chuẩn của người lớn bình thường trong khoảng từ 8-12 tháng tuổi

1.2.4.2 Chất chỉ thị DKK1

Mặc dù chỉ thị AFP được nghiên cứu từ rất lâu trong chẩn đoán ung thư gan nhưng trong một số trường hợp giá trị của nó không cho ta kết luận chính xác Gần đây, một số nhà khoa học đã bắt đầu quan tâm đến chất chỉ thị Dickkopf-1 (DKK1) trong chẩn đoán ung thư biểu mô gan

DKK1 là một thành viên trong gia đình protein DKK bao gồm DKK1, DKK2, DKK3

và DKK4 Protein DKK1 là một glycoprotein có khối lượng phân tử 35-40 kDa bao gồm

235 amino axít [28]

Hàm lượng DKK1 cao là tiên lượng xấu cho khả năng mắc bệnh HCC, hàm lượng DKK1 tăng cao với những người mắc HCC giai đoạn đầu, ngay cả khi hàm lượng AFP

đang ở mức bình thường [12] Theo công trình nghiên cứu [12], hàm lượng DKK1 được

tìm thấy ở mức độ cao trong dòng tế bào di căn của HCC là MHCC97-L và HCCLM3

Hình 1.2.11: Sự phụ thuộc của khả năng sống sót theo thời gian sau khi phẫu thuật liên

hệ với hàm lượng DKK1 của những bệnh nhân HCC [12]

1.3 Các phương pháp biến đổi bề mặt để ứng dụng cảm biến thanh dao động trong việc phát hiện ung thư gan

Như đã mô tả về cấu trúc thanh dao động nghiên cứu trong luận văn này, thanh dao động là vật liệu SiNx được phủ một lớp màng mỏng Au Để bắt giữ được các chất chỉ thị sinh học phải tiến hành biến đổi bề mặt của thanh dao động theo hai hướng: liên kết giữa vàng với các hợp chất thiol hoặc liên kết giữa bề mặt SiNx với với các hợp chất silane

1.3.1 Biến đổi bề mặt Au

Đối với bề mặt Au, trong luận văn này sử dụng các hợp chất thiol và các chất kết nối

để biến đổi bề mặt sau:

- Trước tiên cho cysteamine (SHCH2CH2NH2) phản ứng với bề mặt Au

Cysteamine sẽ gắn với Au thông qua nhóm thiol (-SH)

- Tiếp theo cho chất glutaraldehyde (CHO(CH2)3CHO) gắn với cysteamine thông qua nhóm chức aldehyde của GAD và -NH2 của cysteamine Kết quả thu được, bề mặt Au gắn GAD chứa nhóm chức aldehyde sẵn sàng để gắn các phần tử sinh học

Thông thường, người ta sử dụng các hợp chất thiol để cổ định trên bề mặt vàng thông qua phản ứng Au-thiol Cơ chế của phản ứng được thể hiện trong hình 1.3.1:

Au Hợp chất thiol Liên kết cho nhận giữa Au và nhóm -SH

Hình 1.3.1: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au.[21]

Một chất thường dùng trong biến đổi bề mặt Au của thanh dao động là cysteamine,

có công thức phân tử là C2H7NS, công thức cấu tạo như thể hiện trong hình 1.3.2:

Hình 1.3.2 : Công thức cấu tạo của cysteamine

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng cysteamine cùng với một chất tạo kết nối là GAD

để biến đổi bề mặt Au của thanh dao động

1.3.2 Biến đổi bề mặt SiN x

1.3.2.1 Phương pháp biến đổi và vấn đề đối với SiN x

Tương tự với bề mặt Au, SiNx cũng là một hợp chất khá trơ và không phản ứng với các hợp chất sinh học Để cố định các phần tử sinh học trên bề mặt SiNx thì phải biến đổi

nó

Đối với bề mặt SiNx, trong luận văn này sử dụng các hợp chất silane và các chất kết nối để biến đổi bề mặt sau:

- Tiếp theo cho chất glutaraldehyde (CHO(CH2)3CHO) gắn với APTES thông qua nhóm chức aldehyde của GAD và –NH2 của APTES Kết quả là thu được bề mặt SiNx gắn GAD chứa nhóm chức (-CHO) sẵn sàng để gắn các phần tử sinh học

Mục đính của việc biến đổi bề mặt SiNx là tạo ra các nhóm silanol (SiOH) trên bề mặt, từ đó có thể phản ứng với các hợp chất silane (Si(OR)3) (như là GOPTS hay APTES ) Đối với SiO2 thì việc tạo ra các nhóm chức silanol có thể thực hiện đơn giản bằng cách ngâm trong dung dịch piranha Tuy nhiên, với SiNx lại không tạo ra được nhóm silanol bằng cách này

Có một số phương pháp biến tính bề mặt SiNx để gắn các phần tử sinh học đã được

nghiên cứu và báo cáo như phương pháp sử dụng bức xạ tử ngoại ở nhiệt độ phòng [13],

sử dụng hoá chất như dung dịch NaOH, HF, phương pháp xử lý bằng plasma oxy [13],

[14], [15] Trong đề tài này, bề mặt thanh dao động của chíp có phủ một lớp vàng nên

cần hạn chế sử dụng hoá chất ăn mòn mạnh như HF Hơn nữa, với những điều kiện về trang thiết bị hiện có chúng tôi chọn phương pháp xử lý plasma oxy để biến tính bề mặt SiNx trong đề tài này

1.3.2.2 Vai trò của xử lý bề mặt SiN x bằng plasma O 2

1.3.2.2.1 Giới thiệu về plasma O2

Plasma O2 là một hỗn hợp gồm các hạt phân tử oxy trung hoà, các điện tử, các iôn

âm, và các iôn dương oxy Chúng được tạo ra do quá trình iôn hoá các phân tử oxy dưới tác dụng của điện trường, từ trường hay những tia lửa điện Các phân tử oxy trong môi trường plasma tồn tại ở các mức năng lượng khác nhau, do nhận thêm năng lượng nên một số phân tử oxy ở trạng thái kích thích Những phân tử này trở nên hoạt hoá hơn bình thường, dó đó có thể xảy ra một số phản ứng hoá học mà ở trạng thái không kích thích không thể xảy ra

1.3.2.2.2 Một số kỹ thuật tạo plasma

Có nhiều kỹ thuật khác nhau để tạo plasma Tuy nhiên, tất cả chúng đều có chung một nguyên tắc đó là phải cung cấp một năng lượng đủ lớn để tạo ra và duy trì plasma