CÁC CHUYÊN ĐỀ MÔN SINH HỌC ĐẠT GIẢI TẠI HỘI THẢO KHOA HỌC CÁC TRƯỜNG CHUYÊN KHU VỰC DUYÊN HẢI VÀ ĐỒNG BẰNG BẮC BỘ NĂM 2022

1 CÁC CHUYÊN ĐỀ MÔN SINH HỌC ĐẠT GIẢI TẠI HỘI THẢO KHOA HỌC CÁC TRƯỜNG CHUYÊN KHU VỰC DUYÊN HẢI VÀ ĐỒNG BẰNG BẮC BỘ NĂM 2022 Giải Nhất Chuyên đề Tích hợp di truyền hoá sinh vi sinh vật, tác giả Đỗ Thu.

1

CÁC CHUYÊN ĐỀ MÔN SINH HỌC ĐẠT GIẢI TẠI HỘI THẢO KHOA HỌC CÁC TRƯỜNG CHUYÊN KHU VỰC DUYÊN HẢI VÀ ĐỒNG BẰNG BẮC BỘ

NĂM 2022

- Giải Nhất: Chuyên đề Tích hợp di truyền hoá sinh vi sinh vật, tác giả Đỗ Thuỳ

Dung, Trần Thị Loan, trường THPT Chuyên Lào Cai (trang 2 – 132)

- Giải Nhì: Chuyên đề Một số vấn đề Tích hợp Hóa sinh – vi sinh – di truyền học vi

khuẩn, tác giả Nguyễn Thị Cúc, trường THPT Chuyên Biên Hòa, Hà Nam (trang 133 – 234)

- Giải Nhì: Chuyên đề Tích hợp di truyền hóa vi sinh vật, tác giả Nguyễn Mạnh

Quỳnh, Nguyễn Thị Thu Trang, trường THPT Chuyên Thái Nguyên, Thái Nguyên (trang 235 – 324)

- Giải Ba: Chuyên đề Một số nội dung tích hợp hóa sinh, vi sinh và di truyền, tác giả

Nguyễn Thị Thu, trường THPT Chuyên Bắc Giang, Bắc Giang (trang 325 – 411)

- Giải Ba: Chuyên đề Tích hợp hóa sinh, vi sinh và di truyền, trường THPT Chuyên

Hoàng Văn Thụ, Hòa Bình (trang 412 – 482)

- Giải Ba: Chuyên đề Hệ thống Lý thuyết và bài tập tích hợp hóa sinh, vi sinh, di

truyền, trường THPT Chuyên Lê Khiết, Quảng Ngãi (trang 483 – hết)

2

Chuyên đề TÍCH HỢP DI TRUYỀN HOÁ SINH VI SINH VẬT

Đỗ Thuỳ Dung, Trần Thị Loan - Trường THPT Chuyên Lào Cai

Chuyên đề đạt giải Nhất

1 Lí do tiếp cận chuyên đề

Vi sinh vật không phải là một khái niệm phân loại, các vi sinh vật có thể thuộc

những nhóm phân loại rất xa nhau Chúng thường có một số đặc điểm chung như có

kích thước hiển vi, cơ thể đơn bào, sinh trưởng nhanh, phân bố rộng, thích ứng cao với

môi trường Thuộc nhóm Vi sinh vật có vi khuẩn (thuộc Giới Vi khuẩn), động vật

nguyên sinh và vi tảo (thuộc Giới Nguyên sinh) và Vi nấm (thuộc Giới Nấm), vi sinh

vật cổ (thuộc lãnh Giới Vi sinh cổ theo quan điểm phân chia 3 lãnh Giới) Ngoài ra,

người ta còn xếp virut vào nhóm Vi sinh vật mặc dù hiện nay virut không được xem là

cơ thể sống vì chúng không có cấu tạo tế bào và có đời sống kí sinh bắt buộc trong tế

bào Virut không tồn tại và sống trong môi trường tự nhiên khi ở ngoài tế bào Vi sinh

vật có vai trò quan trọng đối với hệ sinh thái cũng như đời sống con người

Việc nghiên cứu di truyền học trên các đối tượng vi sinh vật chưa được tiến

hành cho mãi đến những năm 40 Tuy ra đời chậm nhưng di truyền học vi sinh vật đã

đóng vai trò “cách mạng hoá” tạo ra những bước tiến nhảy vọt cho di truyền học nói

riêng và sinh học nói chung về cả phương diện lí thuyết và ứng dụng thực tiễn Các

nghiên cứu di truyền được tiến hành một mặt trên các vi sinh vật nhân thực như nấm

men, nấm mốc, vi tảo có sinh sản hữu tính, mặt khác trên các vi khuẩn và virut Di

truyền học của virut và vi khuẩn đã góp phần đáng kể cho sự ra đời của kĩ thuật tái tổ

hợp DNA dẫn đến kĩ thuật di truyền làm bùng nổ Công nghệ sinh học

Hoá sinh học là ngành khoa học nghiên cứu đến cấu trúc và quá trình hoá học

diễn ra trong cơ thể sinh vật Đây là nội dung có liên quan chặt chẽ với các kiến thức

hoá học, sinh học, mà phần lớn là sinh học tế bào, sinh học phân tử và di truyền Kiến

thức phần hoá sinh học có ý nghĩa tiên quyết tạo nền tảng đi sâu vào giải quyết các vấn

đề đặc biệt quan trọng trong y dược và công nghệ sinh học Hoá sinh học được chia

thành hai lĩnh vực chính: Hoá sinh tĩnh và hoá sinh động Hoá sinh tĩnh nghiên cứu các

vấn đề thuộc về enzyme và các hợp chất hữu cơ Tế bào chính là đơn vị nhỏ nhất của

sự sống - nơi diễn ra hoạt động hoá sinh to lớn được gọi là sự trao đổi chất Đây là quá

trình thay đổi hoá học và vật lí diễn ra liên tục trong sinh vật sống bao gồm quá trình

xây dựng mô mới, thay thế mô cũ, chuyển đổi thức ăn thành năng lượng, xử lý chất

thải, sinh sản, Để quá trình trao đổi chất được diễn ra thuận lợi thì vai trò của enzyme

là không thể thiếu Sự hoạt động của hợp chất có hoạt tính sinh học cao này giúp cho

các phản ứng diễn ra trong quá trình trao đổi chất diễn ra dễ dàng và thuận lợi hơn, tạo

thành một hệ thống hoàn chỉnh Các phản ứng hoá học diễn ra trong tế bào có sự tham

gia của các hợp chất hữu cơ: protein, cacbonhidrat, lipid và axit nucleic, Một khía

cạnh khác của hoá sinh học là nghiên cứu về tính chất và các đặc tính sinh học của các

đại phân tử đó Đó là xác định các thành phần tạo nên những cấu trúc lơn hơn phân tử,

3

mô tả cách lắp ráp, quan sát không gian ba chiều và mô tả vai trò của chúng trong sự sống sinh vật Hoá sinh động nghiên cứu các quá trình trao đổi saccarit, lipit, tổng hợp DNA, RNA, protein Một trong những dấu hiệu đặc trưng cơ bản của sinh vật sống là

sự trao đổi chất và năng lượng Như đã nói ở trên, hoá sinh động sẽ xem xét cách thức các tế bào sản xuất ra năng lượng từ các hợp chất hữu cơ Thông qua nguyên tắc của sự biến đổi năng lượng trong tế bào, các con đường dị hoá phân tử glucose sẽ được mô tả trong sự có mặt hoặc vắng mặt oxi phân tử Cùng với đó, vai trò của lipit trong cung cấp và dự trữ năng lượng cho sinh vật cũng được làm sáng tỏ, thông qua đó xây dựng mối quan hệ trong con đường trao đổi chất giữa lipit và saccarit Trong tế bào, quá trình tổng hợp DNA, RNA, protein là yếu tố cơ bản cấu thành nên toàn hệ sinh vật Hoá sinh động cũng đề cập đến những nét cơ bản của nhân đôi DNA, phiên mã, dịch

mã

Nhân loại đang sống ở thời kì Công nghệ sinh học Di truyền học đi sâu vào các vấn đề cơ bản của sự tồn tại và lưu truyền sự sống nên nó giữ một vị trí đặc biệt quan trọng, có người ví "Di truyền học là trái tim của Sinh học", vì không ít thì nhiều, nó liên quan và chi phối bất kì lĩnh vực nào của sinh học, từ các cơ chế phân tử của sự sống cho đến sự tiến hóa của toàn bộ thế giới sinh vật trên hành tinh của chúng ta Những phát minh lớn với số lượng tăng vọt của di truyền học đã có tác dụng cách mạng hóa sinh học, biến sinh học từ mô tả thành thực nghiệm chính xác Hội nghị

Di truyền học thế giới ở Toronto (Canada) năm 1988 đã nêu phương châm "Di truyền

học hóa" Sinh học Các đối tượng vi sinh vật đã góp phần chủ yếu vào các phát minh nền tảng không những của di truyền học phân tử, mà của sinh học phân tử và sinh học hiện đại nói chung

Đối với các trường THPT Chuyên, việc lựa chọn, phát hiện và bồi dưỡng học sinh giỏi, học sinh năng khiếu là một trong những nhiệm vụ then chốt Với nguồn học liệu dồi dào và mở như hiện nay, học sinh khối lớp Chuyên Sinh có thể tiếp cận được nguồn tri thức nhanh chóng và hiệu quả, tuy nhiên việc lựa chọn những nội dung kiến thức trọng tâm, có tính chất hệ thống làm cơ sở nền tảng phát huy khả năng tự học, tự đọc của học sinh vẫn đang là vấn đề cần được quan tâm đầu tư

Qua quá trình tự nghiên cứu, tôi tự nhận thấy mức độ tích hợp các nội dung kiến thức Sinh học trong các câu hỏi ở đề thi học sinh giỏi các cấp, đặc biệt là kì thi học sinh giỏi Quốc gia ngày càng tăng lên về số lượng và độ “khó” Vì vậy, với mục đích bổ sung thêm nguồn học liệu có tính chất hệ thống, định hướng cho học sinh cách thức tiếp cận và tư duy logic đối với kiến thức phần Hoá sinh, vi sinh và di truyền, tôi lựa chọn và tiếp cận chuyên đề “Tích hợp di truyền hoá sinh vi sinh vật”

2 Mục đích của chuyên đề

- Hệ thống hoá nội dung kiến thức phần hoá sinh, vi sinh và di truyền trên phương diện tiếp cận “sự tích hợp”

4

- Biên soạn chuyên đề để nâng cao hiệu quả tự học của cá nhân, cung cấp thêm nguồn tài liệu cho học sinh trong đội tuyển

- Rèn luyện khả năng tự học, tự đọc tài liệu và khai thác kiến thức

- Hướng dẫn học sinh cách thức phân tích nội hàm trong các câu hỏi, tránh trả lời không đúng trọng tâm

3 Khái quát nội dung chuyên đề

Chuyên đề được biên soạn thành 2 phần: Phần A: Cơ sở lý thuyết và phần B: Câu hỏi, bài tập vận dụng

Phần Cơ sở lí thuyết chuyên đề nghiên cứu các nội dung phần hoá sinh tế bào vi sinh vật và hiện tượng di truyền ở vi sinh vật

Phần Câu hỏi, bài tập vận dụng sưu tầm chủ yếu trong các đề thi học sinh giỏi Quốc gia các năm, hướng dẫn phân tích kiến thức lí thuyết và trả lời

5

NỘI DUNG PHẦN A: CƠ SỞ LÝ THUYẾT

I THÀNH PHẦN HOÁ SINH TẾ BÀO VI SINH VẬT

1 Enzyme

1.1 Cấu trúc enzyme

Enzyme có bản chất là protein (một số ít là RNA - ribozim), có tác dụng xúc tác, làm tăng tốc độ phản ứng một cách đặc hiệu Enzyme có mặt trong tất cả các hoạt động sống của tế bào, có đầy đủ đặc tính lý hoá của một chất xúc tác

- Tính đặc hiệu cao: enzyme thường đặc trưng cho một phản ứng nhất định Ví

dụ enzyme ureaza chỉ xúc tác phản ứng phân giải ure Một số enzyme khác cũng có tính đặc hiệu tương đối, chẳng hạn enzyme lipase có khả năng phân huỷ nhiều loại este khác nhau

- Hiệu suất xúc tác lớn: tốc độ phản ứng có thể tăng lên 105 - 107 lần so với khi không có chất xúc tác Ví dụ enzyme catalase xúc tác phản ứng phân huỷ H2O2 -> H2O + O2 chỉ trong một giây nhưng với chất xúc tác là Fe thì cần đến 300 năm

- Tác dụng xúc tác ở điều kiện bình thường: pH môi trường gần trung tính, áp suất và nhiệt độ bình thường

Enzyme được chia thành 6 lớp dựa vào kiểu xúc tác (theo thống nhất của Hội hoá sinh học quốc tế năm 1961)

A - Oxidoreductase: xúc tác cho phản ứng oxi hoá khử (vận chuyển điện tử, các ion hydride hoặc nguyên tử hidro)

B - Transferase: xúc tác cho phản ứng chuyển vị các nhóm từ một phân tử này đến một phân tử khác

C- Hydrolase: Xúc tác các phản ứng thuỷ phân (cũng là phản ứng vận chuyển các nhóm chức năng)

D - Lyase: xúc tác cho các phản ứng thêm các nhóm vào nối đôi, hoặc tạo thành nối đôi bằng cách loại các nhóm

E - Isomerase: xúc tác cho các phản ứng đồng phân hoá, hoặc chuyển vị các nhóm trong nội bộ phân tử thành các dạng đồng phân

F - Ligase: xúc tác cho các phản ứng tạo thành liên kết C-C, C-O, C-S và C-N bằng phản ứng ngưng tụ, kèm theo phản ứng cắt đứt các liên kết giàu năng lượng của các nucleoside triphotphate, thường dấu hiệu nhận biết của kiểu enzyme này với lyase

có sự xuất hiện của ATP

Cấu trúc enzyme: Enzyme là các đại phân tử có khối lượng phân tử từ 12000 đến hàng triệu đơn vị Dalton (Da) Cũng như các protein, về thành phần cấu tạo, enzyme chia thành 2 loại: enzyme một thành phần và enzyme hai thành phần Enzyme

6

một thành phần: chỉ có một thành phần duy nhất là protein như enzyme pepsin của dạ dày Enzyme hai thành phần (haloenzyme) gồm 2 thành phần: phần protein gọi là apoenzyme, phần không phải protein là cofactor (hoặc coenzyme) Hầu hết phần ngoại protein có chức năng xúc tác apoenzyme Coenzyme là các dẫn xuất của vitamin hoà tan trong nước (ví dụ NAD+) vì vậy khi thiếu một vitamin nào đó, gây nên những bệnh đặc trưng (chẳng hạn như bệnh pellagra, Scorbut, ) Cofactor là các ion kim loại với hàm lượng nhỏ (các nguyên tố vi lượng như Cu2+ có trong cytocrom oxidase, carbonic anhydrase, alcohol dehydrogenaza chứa Zn2+, hexokinase, glucose - 6 - phosphatease, pyruvate kinase chứa Mg2+, )

Trung tâm hoạt động là một vùng đặc biệt của enzyme có tác dụng gắn với cơ chất để xúc tác cho phản ứng biến đổi cơ chất thành sản phẩm Mỗi enzyme có thể có một hoặc hai hay nhiều trung tâm hoạt động Tại đây sẽ chứa những nhóm hoá học và những liên kết tiếp xúc trực tiếp với cơ chất hoặc không tiếp xúc trực tiếp nhưng có chức năng trực tiếp trong quá trình xúc tác

Về thành phần cấu tạo: Trung tâm hoạt động của enzyme thường bao gồm các axit amin có các nhóm hoá học có hoạt tính cao như serine (có nhóm -OH), cystein (có nhóm SH), glutamate có nhóm y-COO), lysine (có nhóm S-NH3+) histidine có nhóm imidazol+, tryptophan có nhóm indol+, đây là những nhóm phân cực hoặc ion hoá,

có khả năng tạo liên kết hidro hoặc ion với cơ chất

Để mô tả sự liên kết giữa enzyme và cơ chất, đã có nhiều giả thuyết được đưa ra: Thuyết “mô hình cảm ứng không gian” được Koshland D đưa ra năm 1958 đã giải thích tính đặc hiệu tương đối của enzyme Theo thuyết này, trung tâm hoạt động của enzyme có tính mềm dẻo và linh hoạt, có thể biến đổi về cấu hình không gian trong quá trình hoạt động tương tác với cơ chất sao cho phù hợp với cấu hình không gian của cơ chất, để có thể hình thành phức hợp enzyme cơ chất (ES)

Enzyme dị lập thể (Enzyme allosteric)

Đây là loại enzyme ngoài trung tâm hoạt động còn có một vài vị trí dị lập thể, trung tâm hoạt động tiếp nhận cơ chất để xúc tác cho phản ứng enzyme trong khi vị trí

dị lập thể tiếp nhận yếu tố dị lập thể để điều chỉnh hoạt động xúc tác của enzyme Phân

tử enzyme dị lập thể có thể có thể có vị trí dị lập thể dương, vị trí lập thể âm hoặc chứa

cả hai Khi vị trí dị lập thể dương tiếp nhận yếu tố dị lập thể dương A (chất hoạt hóa) thì cấu hình enzyme thay đổi theo hướng có lợi hơn, enzyme được hoạt hóa, ái lực enzyme với cơ chất tăng lên, tăng tốc độ phản ứng Khi vị trí dị lập thể âm tiếp nhận yếu tố dị lập thể âm (chất ức chế) thì cấu hình enzyme thay đổi theo hướng có hại, enzyme bị ức chế, ái lực enzyme với cơ chất giảm nên tốc độ phản ứng giảm đi

Thông thường, những chất hoạt hóa dị lập thể là những chất đứng trước cơ chất trong chuỗi phản ứng, trong khi những chất ức chế dị lập thể là những chất đứng sau chuỗi phản ứng hoặc là sản phẩm cuối cùng của chuỗi phản ứng Chẳng hạn, trong con đường đường phân, enzyme phospho fructokinase là một enzyme dị lập thể được hoạt

7

hóa bởi yếu tố dị lập thể dương là ADP và AMP, nhưng bị ức chế bởi yếu tố dị lập thể

âm là ATP và citrate

1.2 Cơ chế tác động

Enzyme thực hiện chức năng xúc tác làm tăng tốc độ phản ứng bằng cách giảm năng lượng hoạt hóa gồm 2 giai đoạn chính:

- Tạo thành phức ES

- Phân ly phức ES giải phóng E ở trạng thái ban đầu, giải phóng sản phẩm

Hình 1: Cơ chế tác động của enzyme

Khi có mặt cơ chất, cơ chất cảm ứng sự định hướng không gian của các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của E, tạo nên sự định hướng tương ứng thích hợp giữa các nhóm chức trong TTHĐ của E và các nhóm chức của cơ chất, dọn đường cho

S kết hợp vào TTHĐ của E, tạo thành phức ES, đồng thời loại các phân tử nước ra ngoài Tương tác giữa các gốc amino acid của E với cơ chất, thay đổi đám mây electron, giảm năng lượng hoạt hóa cần thiết để đưa đến trạng thái chuyển tiếp

Hình 2: Enzyme làm giảm năng lượng hoạt hoá

Phức ES sau khi tạo thành kém bền, chỉ tồn tại trong thời gian ngắn và nhanh chóng chuyển hóa thành sản phẩm và giải phóng E tự do, E lại quay vòng xúc tác như ban đầu

8

Năng lượng hoạt hóa là sự sai khác giữa mức năng lượng tự do của trạng thái cơ bản (ground state) và trạng thái chuyển tiếp (transition state), được hình thành do sự tiếp xúc, và chạm giữa các phân tử làm tăng tốc độ phản ứng

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc của enzyme

1.3.2 Độ pH

Mỗi loại enzyme có một độ pH tối ưu, pH trên hay dưới ngưỡng tối ưu đều làm cho hoạt tính enzyme bị giảm hoặc mất hoạt tính pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa các gốc R của các gốc amino acid trong phân tử E, ion hóa các nhóm chức trong trung tâm hoạt động, ion hóa cơ chất, do đó ảnh hưởng đến hai tham số động học Km và V

Hình 3: Ảnh hưởng của độ pH đến hoạt tính enzyme

1.3.3 Nồng độ cơ chất

Cơ chất là chất mà enzyme xúc tác Sự thay đổi nồng độ cơ chất khác nhau sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt độ của enzyme Khi nồng độ cơ chất thấp, nhiều phân tử enzyme có trung tâm hoạt động tự do và sự cung cấp hạn chế có chất sẽ xác định tốc

độ phản ứng Ngược lại nồng độ cơ chất cao, hầu hết các trung tâm hoạt động bị chiếm lĩnh do đó lúc này số lượng phân tử enzyme lại là yếu tố quyết định phản ứng Trong hoạt động trao đổi chất của tế bào mối tương quan này có tầm quan trọng như những phương thức kiểm soát tốc độ phản ứng khác nhau

* Kìm hãm hỗn hợp

- Kìm hãm kiểu hỗn hợp: Chất ức chế đồng thời liên kết được vào cả tâm hoạt động và vị trí khác (enzyme tự do và phức hợp enzyme - cơ chất) Nhận biết: đồng thời Km tăng (hoặc ái lực giảm) và Vmax giảm

10

1.4 Điều hoà hoạt độ của enzyme

Hoạt độ của enzyme, cũng như hoạt độ của các protein có hoạt tính sinh học khác trong tế bào Chúng phải được điều hòa nghiêm ngặt, tiến hành đúng chỗ, đúng lúc và với mức vừa đủ theo yêu cầu của cơ thể

Hoạt độ của E được điều hòa cả về số lượng và hoạt độ phân tử Gọi là điều hòa hoạt độ phân tử có nghĩa là số lượng phân tử protein E được tổng hợp là không thay đổi Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi bằng cách kết hợp với chất điều hòa (điều hòa allosteric); hoặc cải biến cộng hóa trị thuận nghịch; hoặc thay đổi tỷ lệ giữa các dạng phân tử enzyme có mức độ hoạt động khác nhau,

1.4.1 Điều hòa Allosteric

Kiểu điều hòa này hoạt động dựa trên nhu cầu của tế bào Khi lượng sản phẩm cuối cùng của chu trình đáp ứng đủ cho tế bào, nó sẽ quay ngược trở lại kìm hãm hoạt

độ enzyme

Hình 5: Mô hình điều hòa allosteric dưới tác dụng của sản phẩm cuối cùng khi

nồng độ các chất này đã đáp ứng nhu cầu

1.4 2 Điều hòa tỷ lệ các dạng khác nhau của enzyme có hoạt độ khác nhau Isozyme (hay còn gọi là isoenzyme) là các enzyme khác nhau trong chuỗi amino acid nhưng xúc tác cho phản ứng hóa học tương tự Các enzyme này thường hiển thị các thông số động học khác nhau (ví dụ các giá trị K và V khác nhau) hoặc các đặc tính điều chỉnh khác nhau Sự tồn tại của isozyme cho phép tinh chỉnh sự trao đổi chất để đáp ứng nhu cầu cụ thể của một mô hoặc giai đoạn phát triển

11

Hình 6: Enzyme hexokinase xúc tác phản ứng

Enzyme hexokinase xúc tác cho phản ứng trên gồm 4 isoenzyme (kí hiệu I, II, III và IV) Khi nồng độ glucose trong mức bình thường, các isoenzyme III hoạt động với tốc độ cực đại, còn IV chỉ làm việc 25%

1.4 3 Cải biến cộng hóa trị

Chủ yếu hoạt động cải biến hóa trị là kết hợp thuận nghịch với nhóm phosphate Với các đặc điểm phổ biến:

- Phản ứng chuyển nhóm phosphoryl từ ATP đến enzyme do protein kinase xúc tác còn phản ứng tách phosphate khỏi enzyme do protein phosphatase xúc tác

- Các gốc amino acid của enzyme kết hợp với nhóm phosphoryl là: Tyr, Ser, Thr, His

- Việc kết hợp với nhóm phosphate có thể chuyển enzyme từ dạng có hoạt động thấp thành dạng có dạng hoạt động cao hay ngược lại Ví dụ: Cơ chế điều hòa của glycogen phosphorylase Protein kinase (PKA) có vai trò điều hòa hoạt độ enzyme bằng cách phosphoryl hóa Với cách điều hòa này, tín hiệu điều hòa có thể khuếch đại nhiều lần vì protein kinase có thể tác dụng lên nhiều phân tử mục tiêu khác nhau

2 Các hợp chất hữu cơ

2.1 Saccharide

Saccharide là một chất hữu cơ chứa 3 nguyên tử là carbon (C), oxy (O) và hydro (H) Các đơn vị cơ bản của saccaride được gọi là monosaccharide, ví dụ như glucose, galactose, và fructose Công thức thu gọn tổng quát của một monosaccaride là (CH2O)n với n lớn hơn hoặc bằng 3; tuy nhiên, không phải tất cả saccharide đều tuân theo công thức này (như acid uronic), hoặc không phải tất cả các chất hóa học có công thức như trên thì được xếp vào nhóm saccharide Monosaccharide có thể được liên kết với nhau để tạo thành polysaccharide (hay oligosaccharide) theo nhiều cách khác nhau

Saccharide giữ nhiều vai trò quan trọng trong cơ thể sống như:

- Chúng tồn tại ở dạng dự trữ năng lượng, nhiên liệu và chất trao đổi trung gian (glucose, glycogen, )

- Một số loại đường như ribose và deoxyribose tạo thành một phần trong cấu trúc của RNA và DNA (vật chất di truyền của hầu hết sinh vật trên Trái Đất)

a Đường đơn (Monosaccharide): là dẫn xuất của aldehyde, hoặc ketone và hai hay nhiều nhóm hydroxyl (-OH) Mỗi phân tử có từ 3 đến 7 cacbon và chia thành hai nhóm chính là đường aldose và ketose

- Đường aldose: là đường chứa nhóm carbonyl là aldehyde (-CHO)

- Đường ketose: là đường chứa nhóm carbonyl là ketone (-CO-)

Hình 7: Đường aldose và ketose

- Tính chất: vị ngọt, tan nhiều trong nước, có tính khử mạnh, tham gia các phản ứng oxi hoá-khử

- Vai trò:

+ Cung cấp năng lượng cho tế bào, ví dụ đường glucose

+ Là nguyên liệu để tạo đường đôi, đường đa; tham gia cấu tạo các thành phần của tế bào, ví dụ đường pentose tham gia cấu tạo DNA, RNA

+ Dùng trong các sản phẩm chữa bệnh như xylitol hay chẩn đoán bệnh như xác định lượng glucose trong máu

b Đường đôi (Disaccharide)

Disaccharide được cấu tạo từ hai monosaccharide, ví dụ như sucrose và lactose Chúng liên kết với nhau bằng một liên kết cộng hóa trị tạo thành từ phản ứng khử nước (hydrolase), theo đó sẽ tách ra một nguyên tử hydro của một monosaccharide và một nhóm hydroxyl của monosaccharide còn lại Mặc dù có nhiều disaccharide, chỉ một số ít disaccharide là được chú ý

13

* Maltose:

- Cấu trúc từ một phân tử anpha-glucose (1->4) glucose

- Có tính khử nhưng yếu hơn so với glucose

- Đường chủ yếu là mạch nha, có ít ở thực vật bậc cao

- Bị thuỷ phân bởi maltase ở hoặc acid loãng nhiệt độ cao

* Lactose

- Cấu tạo từ beta-galactose (1-4) Beta-glucose

- Đường chủ yếu của sữa, có một ít trong hoa

- Có nhiều trong mía, củ cải đường

- Bị thuỷ phân bởi saccaraza, axit loãng

c Đường đa (Polysaccharide)

Polysaccharide là phân tử carbohydrate cao phân tử gồm chuỗi dài của đơn vị monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycosidic và thủy phân cung cấp cho các thành phần hoặc monosaccharide, oligosaccharide Ví dụ polysaccharide lưu trữ như tinh bột và glycogen, và polysaccharide cấu trúc như cellulose và chitin

Tinh bột

Glicogen Xenlulozo Amilozo Amilopectin

Anpha (1->6) glicozit

Phân nhánh nhiều hơn

Không phân nhánh, xếp thành bó sợi, có

14

hidro giữa các nhóm OH

nhiều liên kết hidro giữa các

bó sợi Nơi tích luỹ

chủ yếu

Thực vật, mô dự trữ (hạt, củ) Tế bào gan

động vật, vi khuẩn

Thành tế bào thực vật bậc cao, vỏ ngoài cứng của một

số động vật không xương sống

Enzyme thuỷ

phân

a Phân loại dựa theo thành phần cấu tạo

- Lipid đơn giản: là ester của alcohol và acid béo – triacylglycerol, sáp, steride

- Lipid phức tạp: ngoài các thành phần của lipid đơn giản còn chứa các gốc phosphoric, choline, saccharide

Ví dụ glycolipid, glycerolglycolipid

b Tính chất vật lí – hóa học

- Không tan trong nước nhưng tan trong dung môi hữu cơ như benzen, acetone,

…

- Mạch hydrocacbon càng dài, ít nối đôi, độ hòa tan trong nước càng kém, nhiệt

độ nóng chảy càng cao do giữa chúng hình thành các tương tác Van der Waals làm bến cấu trúc ở mạch dài

- Acid béo không no dạng cis thường bị uốn cong nên kém bền hơn so với dạng trans Vì vậy khi dầu đã rán nhiều lần, lượng acid béo trans tăng cao làm cho lượng cholesterol tỉ trọng thấp (LDL) nhiều gây tăng nguy cơ tim mạch, làm yếu cấu trúc màng, dễ bị nhiễm khuẩn và Cis Trans hóa chất độc

- Là chất mang điện tử, sắc tố hấp thụ ánh sáng, thành phần cấu tạo hormone, chất truyền tin nội bào, hay bảo vệ (glycoprotein tham gia nhận biết đính trên mặt ngoài màng sinh chất; các hormone steroid vận chuyển các chất đến toàn bộ cơ thể)

2.3 Acid nucleic

2.3.1 Nucleotit - đơn phân của axit nucleic

Mỗi nucleotit được cấu tạo từ 3 thành phần: một gốc base nitro gen, một gốc pentose và một gốc photphat Nucleotit có vai trò tham gia vào cấu trúc nên các hợp chất sống hữu cơ (DNA, RNA), là thành phần cấu tạo của các coenzyme quan trọng như NAD+, cấu trúc nên phân tử ATP,

2.3.2 DNA

Mô hình cấu trúc

Theo J Waston và F Crick, phân tử DNA là chuỗi xoắn kép gồm hai mạch polinucleotit xoắn đều quanh một trục theo chiều từ trái sang phải như một thang dây xoắn, mà hai tay thang là các phân tử đường (C5H10O4) và axit photphoric sắp xếp xen

kẽ nhau, còn mỗi bậc thang là một cặp bazo đối diện và liên kết với nhau bằng các liên kết hidro theo nguyên tắc bổ sung, nghĩa là một bazo lớn (A hoặc G) được bù bằng một base nhỏ (T hoặc X) hay ngược lại Do đặc điểm cấu trúc, A liên kết với T bằng 2 liên kết hidro, G liên kết với X bằng 3 liên kết hidro Do các cặp nucleotit liên kết với nhau theo nguyên tắc bổ sung đã đảm bảo cho chiều rộng của chuỗi xoắn kép bằng 20Ao, khoảng cách giữa các bậc thang trên chuối là 3,4Ao, phân tử DNA xoắn theo chu

kì xoắn, mỗi chu kì xoắn có 10 cặp nucleotit có chiều cao 34Ao Ở một số loài virus và

16

thực khuẩn thể, DNA của lạp thể, ty thể lại có dạng vòng khép kín Ngoài mô hình của Waston Crick cho đến nay người ta còn phát hiện ra 4 dạng khác nhau là A, C, D, Z Các mô hình này khác với dạng B ở một vài chỉ số: số cặp nucleotit trong một chu kì xoắn, đường kính, chiều xoắn

Thông tin trong axit nucleic được mã hóa bởi trình tự sắp xếp của các nucleotide dọc theo chuỗi polynucleotide, và trong DNA sợi đôi, trình tự của mỗi sợi xác định trình tự của chuỗi bổ sung phải như thế nào Mức độ tương đồng về trình tự giữa các DNA từ các vi sinh vật khác nhau là tiêu chí nghiêm ngặt nhất để xác định mức độ liên quan chặt chẽ của chúng

* Chức năng của DNA:

- Tự nhân đôi trong qúa trình phân chia tế bào, tạo thành 2 bản sao từ một phân

tử DNA ban đầu

- Là khuôn để tạo thành các bản phiên mã khác nhau, các RNA, protein

-> DNA là vật chất di truyền có chức năng lưu giữ, bảo quản và truyền đạt thông tin di truyền qua các thế hệ, đảm bảo cho sự di truyền giữa các thế hệ đời sau

2.3.3 RNA

Những nghiên cứu cho thấy, các phân tử RNA xuất hiện sớm hơn DNA và protein trong lịch sử tiến hoá Các phân tử RNA có nhiều điểm cấu trúc giống với DNA nhưng làm chức năng trung gian trong qúa trình sinh tổng hợp protein với ba dạng khác nhau (rRNA, tRNA, mRNA) Tuy nhiên, trong hai thập niên gần đây, nhiều loại RNA mới được phát hiện cho thấy vai trò đa dạng và quan trọng của chúng trong

tế bào Đáng chú ý có gRNA với vai trò dẫn đường được ứng dụng trong cơ chế chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas 9 - một bước đột phá của kĩ thuật thao tác DNA bộ gen

b Cấu trúc và chức năng của các loại RNA

RNA thông tin, mã hoá cho protein

rRNA RNA ribosome, tạo cấu trúc căn bản của ribosome và xúc tác

17

tổng hợp protein tRNA RNA vận chuyển, làm cầu nối giữa mRNA và axit amin

RNA nhỏ hạch nhân (sno RNA - small nucleolar RNA) chế biến

và biến đổi hoá học các rRNA miRN

Bảng 2: Cấu trúc và chức năng của các loại RNA

RNA ribosome (rRNA)

rRNA là thành phần cấu tạo, chiếm phân nửa khối lượng riboxom Tế bào có số lượng lớn ribosome, nên rRNA chiếm tỉ lệ cao, có thể lên tới 75% của tổng số RNA tế bào Đối với tế bào vi khuẩn, rRNA được tổng hợp ở tế bào chất, ở đây, nó kết hợp với protein thành các tiểu phần của riboxom Các tiểu phần (rRNA) khác nhau được đánh giá và đặt tên theo hệ số lắng khi siêu li tâm là S (Svedberg - đơn vị đánh giá tốc độ lắng xuống đáy Sedimentation của ống li tâm, S = 1cm3 x 10-13) S càng lớn thì phân tử RNA càng dài Các riboxom của lục lạp, ti thể và vi khuẩn đều là các riboxom có hệ số lắng li tâm là 70S, gồm hai tiểu đơn vị: Tiểu đơn vị lớn 50S có 1 rRNA 23S và 1 rRNA 5S; tiểu đơn vị nhỏ 30S chỉ có 1 rRNA 16S

Các ribosome của sinh vật nhân chuẩn thuộc loại 80S, gồm 2 tiểu đơn vị: Tiểu đơn vị lớn 60S có 1 rRNA 28S, 1 rRNA 5,8S và 1rRNA 5S, tiểu đơn vị nhỏ 40S chỉ có

1 rRNA 18S

RNA vận chuyển (transfer RNA)

Trong tế bào có đến hơn 50 loại tRNA khác nhau và ít nhất mỗi loại RNA đặc hiệu cho mỗi loại axit amin Các tRNA có cấu trúc chung: chiều dài khoảng 70-90 nucleotit, gồm một mạch cuộn lại nhu hình lá chẻ ba nhờ các bắt cặp bổ sung bên trong phân tử, đầu mút 3’ có trình tự kết thúc Đầu 3’ là nơi gắn vào của axit amin, một thuỳ sẽ mang bộ ba đối mã (anti codon) khớp bổ sung với bộ ba mã hoá trên

18

mRNA là Bằng cách đó tRNA dịch ngôn ngữ (các codon) trên mRNA thành chuỗi axit amin của mạch polipeptit

RNA thông tin (mRNA)

mRNA có kích thước rất khác nhau, thời gian sống ngắn, bị phân giải nhanh sau khi dịch mã Chiều dài trung bình của phân tử mRNA vào khoảng 1,2kilobase mRNA

là một giai đoạn trung gian trong quá trình biểu hiện gen Các trình tự trên DNA mã hoá cho protein được phiên mã quá tổng hợp phân tử mRNA Enzyme RNA-polymerase dựa vào mạch khuôn mã của DNA mã hoá tạo phân tử mRNA Bản phiên

mã sơ cấp của mRNA tế bào vi khuẩn và cả sinh vật nhân chuẩn chứa trình tự nucleotide nhiều hơn số bộ ba dùng mã hoá protein

- mRNA vi khuẩn (nhân sơ) mang trình tự mã hoá nhiều gen, mà đầu mỗi đoạn gen có trình tự điển gắn với ribosome, còn gọi là shine-dalgRNAo, để bắt cặp với trình

tự bổ sung trên RNA 16S và ở cuối sau dấu dừng có trình tự không mã hoá

- mRNA trưởng thành của sinh vật nhân chuẩn có cấu trúc phức tạp hơn: đầu 5’

có mũ cap (methyl guanine triphosphate, tiếp theo là các đoạn mã hoá, sau tín hiệu kết thúc là đoạn 3’ không mã hoá, và cuối cùng là đuôi poly-A (150-200 đơn phân adenine) Cấu trúc phức tạp hơn của mRNA nhân chuẩn có lẽ liên quan đến thời gian tồn tại ngắn hay dài để biểu hiện gen

Chức năng: Làm trung gian truyền đạt thông tin di truyền từ DNA đến protein Xúc tác cho việc cắt đứt các liên kết phosphodieste của các axit nucleic (ribozim) Ngoài ra, ở virus, RNA còn là các vật chất di truyền

2.4 Protein

- Thành phần hoá học: bao gồm các nguyên tố C, H, O, N và một số protein ó lượng nhỏ S Ngoài các nguyên tố trên còn có một lượng rất ít các nguyên tố khác như

Fe, Cu, Mn, Ca, …

- Cấu trúc đơn phân: Mỗi acid amin được cấu tạo từ 3 thành phần: Nhóm amino (-NH2), nhóm Carboxyl (-COOH), gốc hữu cơ (R-CH)

- Cấu trúc không gian: Protein gồm 4 bậc cấu trúc, trong đó cấu trúc bậc III, bậc

IV là các cấu trúc không gian

* Chức năng

Protein là cấu trúc sinh học rất đa dạng và linh hoạt nhất trong hệ thống sống Chính vì vậy, protein có rất nhiều chức năng quan trọng như sau:

- Xúc tác: enzyme tham gia nhiều phản ứng xúc tác trong cơ thể

- Vận tải: hệ thống hemoglobin tham gia vận chuyển oxi, cung cấp cho toàn bộ

cơ thể

- Vận động: actin và myosin đảm nhận vai trò vận động

- Cấu trúc bậc 1 được tạo ra bởi liên kết peptide là liên kết cộng hóa trị

- Cấu trúc bậc 2 được hình thành chủ yếu nhờ liên kết hydro giữa các nguyên tử

H với N hoặc O là thành phần của các liên kết peptide (khung polipeptide)

- Cấu trúc bậc 3 được hình thành chủ yếu nhờ tương tác kỵ nước giữa các nhóm

R không phân cực và nhờ liên kết hydro giữa các nhóm R phân cực hoặc tích điện (các acid amin có tính kiềm và acid) của các acid amin

- Cấu trúc bậc 4 phổ biến được hình thành chủ yếu do các tương tác Van der Waals giữa các tiểu phần (chuỗi polipeptide với nhau Cầu disulfide (-S - S-) được hình thành giữa các acid amin cystein là thành phần của các protein có vai trò hình thành ổn định ở các cấu trúc bậc 3 hoặc 4 của các protein nhất định

3 Các quá trình trao đổi chất

3.1 Trao đổi saccharide

Phân giải Saccharide

Có hai cách phân giải polysaccharide và disaccharide tạo thành monosaccharide; thủy phân và phosphoryl phân

- Thủy phân là quá trình phân giải các chất nhờ sự có mặt của enzyme và có sự tham gia của nước tạo thành các phân tử nhỏ

Tinh bột + H2O glucose + dextrin

- Phosphoryl phân: acid phosphoric thay thế vai trò của nước trong quá trình thủy phân Vai trò của phosphorylase là cắt liến kết glycoside của tinh bột hoặc glycogen

a) Phân giải monosaccaride

Quá trình đường phân

Đường phân hay còn gọi là con đường Embden-Meyerhof xảy ra ở tất cả các sinh vật Quá trình đường phân xảy ra trong bào tương, sử dụng nguồn nguyên liệu glucose tạo thành 2 phân tử acid pyruvic, tích lũy 2 NADH và kèm theo 2 ATP được giải phóng bằng cách oxy hóa phosphoryl hóa ở mức cơ chất

Phương trình tổng quát:

C6H12O6 + 2ADP + 2NAD+ + 2P -> 2C3H4O3 + 2ATP + 2H+ + 2H2O

Amylase

20

- Giai đoạn tiêu tốn năng lượng gồm 5 phản ứng:

+ Bước 1: là sự phosphoryl hóa glucose, tạo glucose-6-phosphate Phản ứng cần ATP và Mg2+ tham gia

+ Bước 2: là sự đổng phân hóa glucose-6-phosphate chuyển thành phosphate

fructose-6-+ Bước 3: là sự phosphoryl hóa lần thứ 2 giữa 2 dạng đường aldose và ketose + Bước 4: là phản ứng cắt mạch carbon, biến fructose 1,6-bisphosphate thành dihydroxyacetone phosphate và glyceraldehyde-3-phosphate

+ Bước 5: là phản ứng chuyển hóa nội phân tử giữa dihydroxyacetone phosphate và glyceraldehyde-3-phosphate Kết quả tạo 2 phân tử glyceraldehyde-3-phosphate

- Giai đoạn tái tạo năng lượng

+ Bưóc 6: phản ứng oxy hóa kèm theo sự phosphoryl hóa ở cơ chất biến glyceraldehyde-3- phosphate thành 1,3-bisphosphate

+ Bước 7: là chuyển gốc phosphate cao năng cho ADP tạo thành 2ATP và phosphoglycerate

3-+ Bước 8: cũng là phản ứng đồng phân hóa, biến đổi 3-phosphoglycerate thành 2-phosphoglycerate

+ Bước 9 là phản ứng loại nước của 2-phosphoglycerate tạo thành phosphoenolpyruvate

+ Bước 10: là phản ứng tạo pyruvate từ phosphoenolpyruvate và 2 phân tử ATP

độ của các enzyme này tăng cao Hoặc, với nồng độ citrate cao, phosphofructo kinase

bị ức chế vì vậy quá trình đường phân sẽ bị ức chế Quá trình đường phân bị ức chế glucose sẽ được vận chuyển nhò các đơn chuyển glucose vào các tế bào gan và dự trữ dưới dạng glycogen Ngoài ra, glucose-6-phosphatase là enzyme xúc tác phản ứng tách glucose khỏi glucose 6-phosphate từ gan vào vòng tuần hoàn Khi nồng độ glucose 6-phosphate tăng, glycogen phosphorylase bị ức chế và glycogen synthase được hoạt hóa, hậu quả là nồng độ glucose trong máu không tăng khi đáp ứng glucagon và epinephrine (Thiếu hụt glucose-6-phosphatase (bệnh Von Gierke))

Fructose 2,6-bisphosphate là một chất hóa học có khả năng hoạt hóa enzyme phosphofructo kinase-1 bằng cách tăng ái lực giữa enzyme này với fructose 6-phosphate Chẳng hạn, khi nồng độ insulin tăng cao, dưới sự xúc tác của enzyme phosphofructo kinase-2, sản phẩm từ fructose 6-phosphate là fructose 2,6-bisphosphate Quá trình này sử dụng năng lượng ATP, có thể thấy fructose 2,6-bisphosphate còn có khả năng giảm hiệu ứng ức chế khi nồng độ ATP cao và thúc đẩy quá trình đường phân diễn ra nhanh chóng một cách gián tiếp Ngược lại, khi glucagon được giải phóng từ lá lách, chúng sẽ thúc đẩy hoạt tính phosphatase của phosphofructo kinase-2 làm chậm quá trình đường phân

Biến đổi pyruvate thành các sản phẩm trong điêu kiện thiếu oxy

- Sự tạo thành lactate do xúc tác của lactate dehydrogenase

Trong mô động vật, lactate được tạo ra trong điều kiện oxy cung cap không đủ

Để duy trì hoạt động sống, lactate được tạo ra nhằm cung cấp một nguồn năng lượng tạm thời cho cơ thể Ngoài ra, một số vi sinh vật có khả năng tạo lactate như lên men sữa chua, muối dưa, cà,

C6H12O6 + 2ADP + 2NAD+ + 2P -> 2 lactate + 2ATP + 2H2O

- Quá trình lên men rượu do một số vi sinh vật khác, chẳng hạn nấm men có khả năng khử nhóm carboxyl thành acetaldehyde và CO2 nhờ xúc tác của pyruvate decarboxylase Trong bước thứ hai, acetaldehyde bị khử thành ethanol do xúc tác của alcohol dehydrogenase (ADH)

cơ cung cấp trở lại ATP cho hoạt động Chu trình này đã giải thích vì sao lượng lactate trong cơ bắp của vận động viên khi tập luyện căng thẳng hay khi thi đầu không ở mức quá cao

Hình 11: Chu trình Cori

Từ pyruvate đến acetyl CoA

Oxy hóa acetyl CoA trong chu trình acid citric

Oxy hóa các coenzyme khử qua chuỗi hô hấp

23

Hình 12: Sự khử caroboxyl hóa pyruvate tạo thành acetyl CoA

Kết quả của phản ứng: từ pyruvate chứa 3 carbon và kém hoạt động đã biến thành hợp chất 2 carbon ở dạng hoạt hóa là acetyl coenzyme A có chứa liên kết cao năng trong phân tử Đồng thời, do quá trình oxy hóa nguyên tử hydro của cơ chất được chuyển đến coenzyme NAD+ tạo thành coenzyme dạng khử NADH

Chu trình acid citric (Chu trình Krebs)

Chu trình acid citric xảy ra ở ty thể thông qua 8 phản ứng đã tạo ra nhiều sản phẩm trung gian là các chất hữu cơ như acid fumarate, acid succinate, acid a-ketoglutarate, … Các sản phẩm trung gian này sẽ được chuyển hóa thành sản phẩm cuối cùng là CO2, hoặc được vận chuyển ra khỏi ty thể cung cấp cho việc tổng hợp các hợp chất hữu cơ trong tế bào

- Phân tử glucose bị oxy hóa hoàn toàn đến CO2 và H2O và giải phóng toàn bộ năng lượng

- Tạo ra nhiều coenzyme khử

- Nguồn carbon cho các quá trình sinh tổng hợp khác nhau

- Là mắt xích liên hợp, là điểm giao lưu của nhiều đường hướng phân giải và tổng hợp các chất khác nhau trong tế bào, đồng thời cũng là đường hướng chính để phân giải các hợp chất hữu cơ

24

Hình 13: Chu trình axit citric

Chuỗi vận chuyên điện tử - sự phosphoryl hóa

NADH và FADH2 được sinh ra từ giai đoạn đường phần, chu trình Krebs sẽ được đưa đến màng trong ty thể để thực hiện việc vận chuyển điện tử cho các chất nhận điện tử trên màng ty thể

Khi một cơ chất bị oxy hóa trong chất nền ty thể, dòng electron sẽ được vận chuyển trong chuỗi hô hấp, tạo sự chênh lệch proton giữa hai bên màng trong ty thể

Đó là động lực để tổng hợp ATP từ ADP và P thông qua kênh ATP synthase Khi H+ được vận chuyển từ xoang ty thế vào chất nền (ngược trở lại) theo tỷ lệ: cứ 4H+ sẽ tổng hợp 1 ATP Vì vậy NADH cho 10H+ và FADH2 cho 6H+ (do FADH2 đi vào phức

hệ II nên bỏ qua phức hệ I dẫn đến lượng proton H+ tạo ra ít hơn)

Hình 14: Chuỗi vận chuyển điện tử trên màng trong ty thể

3.2 Trao đổi lipid

Tế bào có thể phân giải từ 3 nguồn: lipid thức ăn, lipid dự trữ và lipid tổng hợp diễn ra ở các cơ quan trong cơ thể

Sự phân giải lipid bắt đầu là sự thủy phân các liên kết ester, giải phóng các hợp phần cấu tạo như acid béo, glycerol Sau đó, acid béo và glycerol bị phân giải theo các con đường khác nhau, tạo ra năng lượng hoặc tham gia vào quá trình tổng hợp các chất trung gian trong cơ thể

25

3.2.1 Thuỷ phân các liên kết ester trong lipid

Ở động vật có xương sống, triacylglycerol từ thức ăn được nhũ tương hóa nhờ muối mật thành các hạt micelle nhỏ dễ khuếch tán và bị thủy phân dưới tác dụng của lipase tuyến tụy cắt liên kết ester, tạo thành 2- monoacylglycerol và hai gốc acid béo

Các acid béo tự do và monoacylglyecrol được chuyển đến các tế bào niêm mạc ruột để tái tạo triacylglycerol rồi được chuyển đến các mô và bị phân giải tại đó Các acid béo được biến đổi thành acetyl - CoA Ba phân tử acetyl - CoA có thể kết hợp với glycerol, hoặc hai phân tử có thể kết hợp với một monoacylglyecrol để tạo thành triacylglycerol Triacylglycerol kết hợp với cholesterol và các apoprotein tạo thành chylomicron và được chuyển từ ruột non qua hệ bạch huyết và máu đến mô cơ và mô

mỡ Tại mao mạch của các mô này, enzyme ngoại bào lipoprotein lipase sẽ phân giải triacylglycerol thành acid béo và glycerol đi vào trong tế bào để oxy hóa tạo năng lượng (mô cơ), hoặc để tổng hợp triacylglycerol dự trữ (mô mỡ)

Chylomicron vận chuyển triacylglycerol đến các mô ngoại biên như mô mỡ và

mô cơ Phần còn lại của nó sẽ đến gan, VLDL được hình thành tại gan và vận chuyển lipid nội sinh đến các mô ngoại biên VLDL bị phân giải thành IDL, kết hợp với cholesterol và cholesteryl ester từ HDL tạo nên LDL, mang cholesterol đến các mô khác HDL vận chuyển cholesterol từ huyết thanh và các mô ngoại biên đến gan Tại gan, cholesterol có thê biến đổi thành muối mật và đi vào túi mật

3.2.2 Chuyển hoá glyxerol

Quá trình phân giải triacylglycerol nhờ hệ thống enzyme thủy phân liên kết ester tạo thành glycerol và acid béo Glycerol được phosphoryl hóa thành L-glycerol-3-phosphate (glycerol-3- phosphate ở quá trình đường phân dạng D), rồi oxy hóa thành dihydroxyacetone phosphate và sau đó chuyên thành D-glycerol-3-phosphate D-glycerol-3-phosphate có thể tiếp tục oxy hóa theo con đường đường phân và chu trình acid citric để tạo thành CO2, H2O và năng lượng, hoặc tham gia tổng hợp glucose

3.2.3 Oxi hoá axit béo

a Acid béo được hoạt hoá thành acetyl - CoA ở bào tương

Acid béo được hoạt hóa thành acetyl - CoA với sự xúc tác của acetyl - CoA synthetase và sự tham gia của ATP Pyrophosphate được hình thành sẽ bị thủy phân bởi pyrophosphate từ hai phân tử phosphate

26

Hình 15: Hoạt hoá axit béo

b Acetyl-CoA được vận chuyển vào ty thể

Ở tế bào sinh vật nhân thực, acid béo thường được hoạt hóa ở bào tương gần màng ngoài ty thể và được vận chuyển vào ty thể Các acetyl có từ 12 carbon trở xuống sẽ trực tiếp đi qua màng ty thể Acetyl-CoA được ester hóa với cRNAitine thành acetyl-cRNAitine giải phóng HS-CoA dưới sự xúc tác của cRNAitine acyltransferase I và đi qua các lỗ lớn ở màng ngoài ty thể Acetyl-cRNAitine có thể được hình thành ngay ở khoang gian màng Sau đó acyl-cRNAitine được chuyển vào bên trong ty thê nhờ chầ't vận chuyển acetyl-cRNAitine Gốc acetyl - CoA được tái tạo nhờ cRNAitine acetyltransferase II và cRNAitine và được giải phóng, quay trở lại khoang gian màng đê tham gia vận chuyển tiếp các gốc acid béo khác

Hình 16: Sự vận chuyển Acetyl-CoA vào hệ thống

Quá trình oxy hoá acetyl - CoA

Acid béo (ROOH) được oxy hóa qua một chuỗi 4 phản ứng tạo sản phẩm Acetyl-CoA và Acetyl-CoA ngắn hơn 2 carbon Acetyl-CoA di chuyển vào ty thể tham gia vào chu trình citric tiếp tục oxy hóa cung cấp năng lượng cho cơ thể Trong khi đó, Acetyl-CoA tiếp tục phân cắt theo con đường 3-oxy hóa tạo Acetyl-CoA

27

Hình 17: Quá trình oxi hoá của Palmitoy-CoA

Phương trình tổng quát:

Cn-acetyl CoA + CoA + FAD+ + NAD+ + H2O->

Cn2-acetyl CoA + acetyl - CoA + FADH+ + NADH + + H+

II ƯU THẾ CỦA CÁC ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT TRONG NGHIÊN CỨU HOÁ SINH VÀ DI TRUYỀN HỌC

Trong nghiên cứu di truyền học, các đối tượng vi sinh vật có nhiều ưu thế hơn hẳn các động vật thực vật bậc cao

1 Thời gian thế hệ ngắn, tốc độ sinh sản nhanh

Trong điều kiện thuận lợi, tế bào E coli có thể phân chia một lần trong 20 phút,

còn bacteriophage có thể trong 30 - 40 phút tạo ra hàng trăm cá thể, nấm men có thể phân chia tế bào trong 2 giờ Đặc điểm của nghiên cứu di truyền học là theo dõi qua nhiều thế hệ nên các đối tượng vi sinh vật giúp rút ngắn đáng kể thời gian thí nghiệm

Ví dụ, với E coli, thí nghiệm hôm trước, qua ngày sau đã có thể đánh giá kết quả

2 Số lượng cá thể tăng nhanh

Các vi sinh vật đơn bào, mỗi tế bào là một cá thể Nếu đủ dinh dưỡng các vi sinh vật sinh sản nhanh tạo quần thể có số lượng cá thể lớn có thể khoảng 1010 - 1012

tế bào/ml Tế bào E coli có đường kính 1 µm (micromet) nếu đủ dinh dưỡng và mọi

điều kiện thuận lợi khác thì sau 44 giờ có thể tạo ra một lượng sinh khối nặng bằng Trái Đất Như vậy, số lượng cá thể lớn giúp nâng cao năng suất phân giải di truyền, tức khả năng phát hiện các đột biến và tái tổ hợp có tần số xuất hiện rất nhỏ

Ưu thế này lại được tăng thêm nhờ môi trường nuôi đơn giản, dễ nuôi cấy, dễ nhân giống, mà điều kiện nuôi cấy không cồng kềnh, ít tốn diện tích, dễ kiểm soát theo công thức chặt chẽ như khi làm thí nghiệm hóa học

3 Cấu tạo bộ gen đơn giản

Vi khuẩn và virut có bộ gen là DNA trần dễ tiến hành thí nghiệm trực tiếp trên DNA cũng như chiết tách tinh sạch Số locus cũng ít hơn so với các sinh vật khác Các

vi nấm và vi tảo có thể tồn tại ở dạng đơn bội (n) với thời gian dài, nên các gen lặn có thể biểu hiện ngay, mà không cần phải tiến hành lai phân tích hay đưa về dạng đồng hợp tử lặn Tuy nhiên, các vi sinh vật kể trên có trạng thái lưỡng bội (2n) nên cũng dễ dàng thực hiện phân tích tái tổ hợp

28

Các tính trạng ở vi sinh vật cũng đơn giản hơn, xác định di truyền các tính trạng này ít phức tạp hơn, nên dễ nghiên cứu Đối với các tính trạng sinh hóa hay tính đề kháng thì có thể dễ dàng sử dụng môi trường chọn lọc để phát hiện

4 Dễ phát sinh và thu nhận các đột biến

Các phân tích di truyền học phần lớn dựa vào những khác biệt của dạng bình thường so với đột biến Tần số đột biến ở thực vật và động vật khoảng 10–5 – 10–7, khó thu nhận và cần thời gian dài khoảng vài thế hệ để khẳng định đúng là dạng đột biến Nhiều đột biến ở động vật dễ gây chết nên số lượng đột biến thu nhận được ở động vật rất hạn chế

- Các đột biến ở vi sinh vật có thể thu nhận dễ dàng, thậm chí có tần số xuất hiện thấp 10–10, mà việc xác nhận dạng đột biến cũng rất nhanh

- Nhờ ưu thế này mà di truyền học vi sinh vật phát triển rất nhanh hình thành nên di truyền học phân tử và sinh học phân tử

- Dễ nghiên cứu bằng các kỹ thuật vật lý hóa học

Đa số các vi sinh vật có cấu tạo đơn bào nên quần thể của chúng có độ đồng nhất cao hơn so với các tế bào sinh vật đa bào bậc cao bắt nguồn từ nhiều loại mô khác nhau Cấu tạo tế bào vi sinh vật đơn giản, dễ chiết tách, tinh sạch DNA Có thể nuôi vi sinh vật đồng nhất (synchronous culture) tức là đa số các tế bào ở những giai đoạn phát triển gần giống nhau Độ đồng nhất cao của vật liệu thí nghiệm tạo thuận lợi cho việc sử dụng các phương pháp vật lý hóa học trong nghiên cứu di truyền

Do những ưu điểm kể trên, với việc sử dụng các đối tượng vi sinh vật, di truyền học đã bước vào giai đoạn nghiên cứu di truyền “trong ống nghiệm” (in vitro)

Mặc dù các vi sinh vật có những đặc điểm riêng nhưng chúng vẫn tuân theo các quy luật di truyền chung, các kết quả thu được có thể đối chiếu áp dụng cho các vi sinh vật bậc cao

III CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA DI TRUYỀN HỌC VI SINH VẬT

1 Thông tin di truyền trong vi sinh vật

Thông tin di truyền ở vi khuẩn và nhiều loại virus được mã hóa trong DNA, nhưng một số loại virus sử dụng RNA Sao chép bộ gen là cần thiết để thừa kế các tính trạng do di truyền xác định Sự biểu hiện gen thường bao gồm phiên mã DNA thành RNA thông tin và dịch mã mRNA thành protein

2 Tổ chức bộ gen

Nhiễm sắc thể vi khuẩn là một phân tử DNA dạng tròn có chức năng như một yếu tố di truyền tự sao chép (bản sao) Các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể như plasmid và vi khuẩn là những bản sao không cần thiết thường xác định khả năng chống lại các chất kháng khuẩn, sản xuất các yếu tố độc lực hoặc các chức năng khác Nhiễm

ra bởi các biện pháp xử lý hóa học hoặc vật lý Các vi sinh vật được chọn làm dòng tham chiếu được gọi là kiểu hoang dại, và thế hệ con cháu của chúng có đột biến được gọi là thể đột biến Các phương tiện chọn lọc phân biệt giữa chủng loại hoang dại và chủng đột biến dựa trên tốc độ tăng trưởng; môi trường phân biệt giữa chúng dựa trên các đặc tính kiểu hình khác

4 Trao đổi thông tin di truyền

Trao đổi gen giữa các vi khuẩn xảy ra theo một số cơ chế Trong quá trình biến nạp, vi khuẩn nhận lấy DNA của người cho ngoại bào Trong quá trình tải nạp, DNA của vi khuẩn cho được đóng gói trong một thực khuẩn sẽ lây nhiễm sang vi khuẩn nhận Trong tiếp hợp, vi khuẩn cho truyền DNA cho thể nhận bằng cách giao phối Tái

tổ hợp là sự sắp xếp lại các bộ gen của người cho và người nhận để tạo thành các bộ gen mới, lai Transposon là các đoạn DNA di động di chuyển từ nơi này sang nơi khác trong hoặc giữa các bộ gen

5 DNA tái tổ hợp và nhân bản gen

Nhân bản gen là sự kết hợp gen ngoại lai vào vectơ để tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp sao chép và biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào nhận Các gen nhân bản được phát hiện bằng kiểu hình mà chúng xác định hoặc bằng trình tự nucleotit cụ thể mà chúng chứa DNA tái tổ hợp và nhân bản gen là những công cụ cần thiết cho nghiên cứu vi sinh phân tử và y học Chúng có nhiều ứng dụng y tế, bao gồm phát triển vắc-xin mới, sinh học, xét nghiệm chẩn đoán và phương pháp điều trị

6 Quy chế biểu hiện gen

Các đặc tính kiểu hình của vi khuẩn được quyết định bởi kiểu gen và điều kiện sinh trưởng của chúng Đối với vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy thuần khiết, những thay đổi trong điều kiện sinh trưởng thường dẫn đến sự thích nghi sinh lý có thể dự đoán được ở tất cả các thành viên của quần thể Thông thường, các sản phẩm gen thiết yếu được tạo ra với số lượng cho phép phát triển nhanh nhất trong môi trường nhất định và các sản phẩm cần thiết trong chỉ được sản xuất khi cần thiết

Sự thích nghi sinh lý thường gắn liền với những thay đổi trong các hoạt động trao đổi chất Dòng chảy của các chất chuyển hóa thông qua các con đường sinh hóa

cụ thể có thể được kiểm soát bằng cách điều chỉnh quá trình tổng hợp các enzym cụ thể và bằng cách thay đổi hoạt động của các enzym hiện có Các cơ chế điều chỉnh sự

vi khuẩn và được cảm ứng hoặc phối hợp với nhau

Sự biểu hiện của gen ở vi sinh vật thường do điều kiện nội bào hoặc môi trường quy định Quá trình điều tiết có thể ảnh hưởng đến bất kỳ bước nào trong biểu hiện gen, bao gồm bắt đầu hoặc kết thúc phiên mã, dịch mã hoặc hoạt động của các sản phẩm gen Operon là một tập hợp các gen được phiên mã thành một đơn vị duy nhất

và được biểu hiện một cách phối hợp Cơ chế điều hòa cụ thể tạo ra hoặc kìm hãm một gen hoặc operon cụ thể Tất cả các operon trong cơ quan điều hòa được điều khiển một cách phối hợp bởi cùng một cơ chế điều chỉnh

Sự biểu hiện của các yếu tố quyết định di truyền ở vi khuẩn liên quan đến dòng thông tin một chiều từ DNA đến RNA đến protein Trong thực khuẩn, DNA hoặc RNA đều có thể đóng vai trò là vật chất di truyền Trong quá trình lây nhiễm vi khuẩn bởi RNA thực khuẩn, các phân tử RNA đóng vai trò như khuôn mẫu để sao chép RNA

và như mRNA Các nghiên cứu với nhóm virus động vật retrovirus cho thấy rằng các phân tử DNA có thể được tổng hợp từ các khuôn mẫu RNA bằng các enzym được chỉ định là các polymerase DNA phụ thuộc RNA (sao chép ngược) Sự đảo ngược hướng thông thường của dòng thông tin di truyền, từ RNA sang DNA thay vì từ DNA sang RNA, là một cơ chế quan trọng để cho phép thông tin từ retrovirus được mã hóa trong DNA và được tích hợp vào bộ gen của tế bào động vật

7 Vật chất di truyền trong vi sinh vật

Vật chất di truyền của vi khuẩn và plasmid là DNA Vi rút vi khuẩn (thực khuẩn thể hoặc thể thực khuẩn) có DNA hoặc RNA làm vật liệu di truyền Hai chức năng thiết yếu của vật chất di truyền là sao chép và biểu hiện Vật chất di truyền phải sao chép chính xác để thế hệ con cháu thừa hưởng tất cả các yếu tố quyết định di truyền cụ thể (kiểu gen) của sinh vật bố mẹ Sự biểu hiện của vật chất di truyền cụ thể trong một tập hợp các điều kiện sinh trưởng xác định các đặc điểm quan sát được (kiểu hình) của sinh vật Vi khuẩn có ít đặc điểm cấu trúc hoặc phát triển có thể được quan sát dễ dàng, nhưng chúng có một loạt các khả năng sinh hóa và mô hình nhạy cảm với các chất kháng khuẩn hoặc thực khuẩn Các đặc điểm sau này thường được chọn làm các đặc điểm di truyền để phân tích trong các nghiên cứu về di truyền vi khuẩn

- Xác định các gen

- Xác định trật tự của các locus trên nhiễm sắc thể

- Xác đinh cấu trúc tinh vi của gen

1 Nghiên cứu trực tiếp ở cấp độ tế bào và cấp độ phân tử

Di truyền học cổ điển sử dụng các mô hình đối tượng như đậu Hà Lan Pisum

sativum, cây bắp (ngô) Zea mais, ruồi giấm Drosophila melanogaster và chuột nhắt Mus musculus, là những sinh vật đa bào mà sự biểu hiện tính trạng phải trải qua một

quá trình phát triển phức tạp và kèm theo biệt hóa, việc quan sát trên các đối tượng này được thực hiện gián tiếp Trong khi đó, nhiều đối tượng vi sinh vật như vi khuẩn

Escherichia coli, nấm men Saccharomyces cerevisiae là sinh vật đơn bào nên các quan

sát thực hiện trực tiếp hơn ở mức tế bào Ví dụ, trên môi trường tối thiểu với lượng

muối hữu cơ và glucoz cho trước, một tế bào E coli có thể tổng hợp tất cả các hợp

chất cần thiết cho sự tăng trưởng, sống sót và sinh sản Nếu tế bào bị đột biến mất khả năng tổng hợp một chất nào đó như một loại axit amin thì nó không mọc được trên môi trường tối thiểu Trên môi trường có bổ sung thuốc kháng sinh thì chỉ có các tế bào đề kháng mới mọc được

Hơn nữa, các tế bào vi sinh vật có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản dễ kiểm soát thành phần môi trường nuôi, dễ nuôi cấy, dễ nhân giống, dễ dàng thu nhận nhiều loại đột biến phục vụ cho nghiên cứu trực tiếp và nhanh chóng ở cấp độ tế bào, phân tử Do vậy, chúng là những đối tượng lý tưởng cho nghiên cứu di truyền học phân tử

Cấu trúc bộ gen

DNA hiện diện trong bộ gen (Genome) của tất cả các loại tế bào từ vi khuẩn

đến người Giữa các sinh vật nhân sơ Prokaryota và nhân chuẩn Eukaryota có sự khác

nhau đáng kể về kích thước, thành phần cấu tạo và tổ chức của DNA trong tế bào

Bộ gen của vi khuẩn E coli và đa số các sinh vật nhân sơ là một phân tử DNA

có dạng vòng tròn kín Khái niệm nhiễm sắc thể hiện nay được dùng cho cả vi khuẩn, nên nói nhiễm sắc thể vi khuẩn ta hiểu đó là sợi DNA Ty thể và lục lạp cũng có DNA riêng, mà cấu trúc bộ gen cũng tương tự vi khuẩn

Đa phần DNA của Eukaryota như nấm sợi, nấm men, vi tảo được tổ chức thành

nhiều nhiễm sắc thể trong nhân tế bào Mỗi nhiễm sắc thể chứa 1 phân tử DNA thẳng

Sự biến đổi hình thái ở vi sinh vật bao gồm các biến đổi về kích thước, hình dạng và sự hình thành sắc tố của các khuẩn lạc do các tế bào bị đột biến tạo nên trên các môi trường dinh dưỡng đặc cũng như sự biến đổi của bản thân các phân tử của tế bào (gia tăng kích thước, thay đổi hình thái, ) Sự biến đổi hoá sinh bao gồm các biến đổi liên quan đến việc tế bào mất khả năng tổng hợp các amino axit hoặc vitamin hoặc mất khả năng chuyển hoá các hợp chất cacbonhydrat Các biến đổi về kháng nguyên thể hiện ở chỗ vi khuẩn bị mất đi những kháng nguyên nhất định Các biến đổi trong tính bền vững của vi khuẩn đối với các tác nhân khác nhau liên quan đến sự xuất hiện của chúng trong các khả năng đề kháng đối với sự chiếu xạ, với các hoá chất khác nhau (kể cả các loại thuốc kháng sinh) hoặc với phage

Do tần số đột biến ở vi khuẩn là rất thấp nên việc phân lập các tế bào bị đột biến chỉ có thể thực hiện được trong các thí nghiệm với các quần thể tế bào Như vậy, về nguyên tắc, trong trường hợp này có thể sử dụng bất kỳ phương pháp nào cho phép tách được các thể đột biến từ các quần thể Việc xác định số lượng các đột biến dựa trên các phương pháp xác định tần số đột biến Thông thường, để phân tích di truyền

cần có các nòi đột biến mang các đột biến vị trí cho trước, chẳng hạn, đối với B subtilis, có thể xử lí sơ bộ DNA gây biến nạp bằng các tác nhân gây đột biến Ở E coli, có thể gây các đột biến có vị trí xác định bằng cách đưa vào tế bào vi khuẩn các

gen đột biến nhờ các phage tải nạp

1.2 Phân tích tái tổ hợp

Đây là phương pháp đặc trưng được dùng để xác định vị trí và trật tự của các gen trên nhiễm sắc thể Đối với vi khuẩn, việc phân tích di truyền dựa vào các quá trình trao đổi vật liệu di truyền như biến nạp, tải nạp, tiếp hợp hay còn gọi là giao nạp

Ở các vi nấm, việc phân tích di truyền được tiến hành bằng phân tích phép phân tích

bộ bốn và dựa trên chu trình cận hữu tính

Nói chung, sự trao đổi di truyền ở các vi khuẩn và quá trình hữu tính ở các cơ thể bậc cao là không giống nhau Việc truyền vật liệu di truyền từ vi khuẩn thể cho (donor) sang vi khuẩn thể nhận (recipient) có thể coi như sự kết hợp nhân của các tế bào sinh dục (ở đây là sự tạo thành các thể lưỡng bội từng phần), còn sự sát nhập của

33

vật liệu di truyền vào bộ gen của vi khuẩn thể nhận, và sự hình thành nhiễm sắc thể tái

tổ hợp sau đó, có thể so sánh với các kết quả của giảm phân Chính các hệ thống tái tổ hợp này là cơ sở cho phương pháp phân tích tái tổ hợp và lập bản đồ di truyền ở vi

khuẩn Ví dụ, trật tự của hấu hết các gen trên nhiếm sắc thể E coli được xác định là nhờ sử dụng tiếp hợp và tải nạp, ở B subtilis nhờ tải nạp và biến nạp, còn ở Samonela typhimurium chủ yếu là nhờ tải nạp Ngoài ra, phép phân tích tái tổ hợp này còn dược

sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tinh vi của gen

1.3 Phân tích sao chép

Phương pháp này cho phép xác định trật tự các gen trên nhiễm sắc thể dựa trên

sự tính toán các số liệu về sự bắt đầu sao chép (tái bản) của nhiễm sắc thể từ một điểm xác định Do thời gian sao chép của một phần nhiễm sắc thể nhất định phụ thuộc vào khoảng cách từ phần đó đến điểm khởi đầu sao chép nên thứ tự sao chép phản ánh trình tự sắp xếp của các gen Như vậy, bản đồ NST chỉ có thể được xây dựng dựa trên các dẫn liệu về trật tự sao chép của các phần riêng biệt của nhiễm sắc thể

1.4 Phân tích đoạn khuyết

Phép phân tích đoạn khuyết được sử dụng để xác định vị trí của các gen trên nhiễm sắc thể cũng như để nghiên cứu cấu trúc tinh vi của các gen Nó dựa trên việc tính toán các đoạn khuyết trên nhiễm sắc thể Nhờ sự phân tích này người ta đã phát

hiện được vị trí cuả hàng loạt gen ở E coli và S typhimurium, hiểu biết được cấu trúc tinh vi của các gen trên operon lactose ở vi khuẩn E coli Phương pháp này cũng được

sử dụng rộng rãi để nghiên cứu cấu trúc tinh vi ở phage

1.5 Phân tích bổ sung

Phương pháp này được sử dụng để phát hiện chức năng của các gen nhất định tham gia vào việc xác định một đặc tính nào đó của vi khuẩn, dựa trên hiện tượng bổ sung của các gen (nghĩa là sự tương tác của các sản phẩm gen)

Bằng cách lai các thể đột biến của cùng một gen có nguồn gốc độc lập nhau trong khi cho lây nhiễm các phage, đã làm xuất hiện các phage kiểu dại Điều này chỉ

có thể xảy ra bởi sự tái tổ hợp bên trong gene, nếu như các phần nhỏ riêng biệt của gen đều bị đột biến

Đơn vị chức năng di truyền không chia nhỏ (cistron) có thể xác định được bằng

sự phân tích bổ sung (complementation analysis), trong đó gen mà cụ thể là sản phẩm của nó được trắc nghiệm về khả năng bù đắp cho một đột biến tại một gen tương đồng trong cùng tế bào Sự bổ sung liên tiếp làm phục hồi kiểu hình dại

34

Hình 18: Sơ đồ minh hoạ trắc nghiệm cis-trans

1.5 Năng suất phân giải

Năng suất phân giải của di truyền học được xác định bởi khoảng cách giữa các cấu trúc di truyền (gene) cần phân tích trên nhiễm sắc thể Đại lượng này phụ thuộc vào số lượng cá thể đời con nghiên cứu được từ một phép lai cụ thể, số con cháu thu được càng lớn thì khả năng phát hiện các thể tái tổ hợp hiếm càng lớn, tức năng suất phân giải của phân tích di truyền học càng cao Theo luật số lớn này, các vi khuẩn tỏ ra rất thuận lợi trong phân tích di truyền học, vì trong một thời gian ngắn có thể thu được một số lượng cực kì lớn con cháu từ một tế bào vi khuẩn, cũng như có thể sử dụng các môi trường nuôi cấy khác nhau để chọn lọc các cá thể tái tổ hợp

2 Dòng tế bào

Đặc điểm của các tế bào vi sinh vật là rất nhỏ bé, phải nhìn dưới kính hiển vi mới thấy được Do vậy khó có thể quan sát từng tế bào riêng lẻ, hơn nữa, bằng cách này cũng không ghi nhận được các tính trạng biến dưỡng, tính đề kháng và nhiều tính trạng khác Do vậy, di truyền vi sinh vật không nghiên cứu từng tế bào riêng lẻ mà là dòng của tế bào, tức tập hợp của nhiều tế bào bắt nguồn từ một tế bào ban đầu nhờ sinh sản vô tính Thông thường, tế bào vi sinh vật được cấy lên môi trường thạch đặc, rồi trải đều để các tế bào nằm rời xa ra thì mỗi tế bào mọc lên thành một cụm rời gọi là khuẩn lạc (colony) Mỗi khuẩn lạc cũng là một dòng tế bào (clone) gồm các tế bào bắt nguồn tự sự phân chia của một tế bào ban đầu

Hình 19: Khuẩn lạc (colony) của vi sinh vật

Mỗi khuẩn lạc dễ nhìn thấy bằng mắt thường, có tối thiểu 107 tế bào Như vậy, các tính trạng ở vi sinh vật được ghi nhận qua một quần thể gồm hàng trăm triệu, hàng

tỉ tế bào

Dòng tế bào mang một đặc tính di truyền nào đó gọi là chủng (strain) Ví dụ: chủng vi khuẩn tạo nhiều vitamin B12 hay chủng vi khuẩn mất khả năng tổng hợp một axit amin nào đó

3 Các tính trạng

Các đột biến ở vi sinh vật thường được phát hiện theo sự biến đổi các tính trạng sau:

35

Hình thái: kích thước, hình dạng tế bào hay khuẩn lạc, có màng nhân hay không, khả năng di động,

Sinh hóa: sự hiện diện của các sắc tố, màu sắc đặc trưng

Nuôi cấy: như kiểu hô hấp, kiểu dinh dưỡng (khuyết dưỡng - auxotroph) hoặc nhu cầu đòi hỏi các nhân tố tăng trưởng

Tính đề kháng: như kháng thuốc, kháng phage, chịu nhiệt,

Miễn dịch: như các phản ứng kháng thể, kháng nguyên,

Các đột biến có thể xuất hiện ngẫu nhiên hay do gây tạo ra nhờ các tác nhân gây đột biến Mỗi gen có tần số đột biến đặc trưng

Các tính trạng ở vi sinh vật được kí hiệu bằng 3 chữ tắt tiếng Anh hoặc đôi khi chữ hoa đầu tiên Kèm theo kí hiệu còn thêm dấu + hoặc – hoặc chữ tắt để giải thích rõ thêm tính trạng Ví dụ: lac– để chỉ mất khả năng tổng hợp lactoz; his+ - tổng hợp histidin; strS – nhạy cảm (Sensible) với Streptomycin, strR – đề kháng (Resistant) với Streptomycin

Để chỉ hai giới tính khác nhau không dùng hai kí hiệu ♀ và ♂ thay vào đó là

các chữ như mt (+), mt (-) (mating typ) (ở Chlamydomonas reinhardi), hoặc A, a (ở Neurospora crassa)

Các nấm sợi, nấm men, vi tảo có các quá trình sinh sản vô tính và hữu tính về căn bản giống các sinh vật bậc cao, thực hiện qua nguyên phân và giảm phân

V BIẾN DỊ Ở VI SINH VẬT

Biến dị ở vi sinh vật cũng tuân theo quy luật di truyền chung

Biến dị và đột biến có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu di truyền học Các đột biến gồm nhiều loại khác nhau và chúng được thu nhận dễ dàng từ các vi sinh vật nhờ các phương pháp phát hiện chuyên biệt Các đột biến gen bắt nguồn từ những biến đổi phân tử trên DNA Con người có thể sử dụng các tác nhân vật lí và hóa học gây nên các đột biến nhân tạo hay cảm ứng

Biến dị ở vi sinh vật cũng tuân theo các quy luật di truyền như ở sinh vật bậc cao Nó có nhiều loại và số lượng rất lớn, cung cấp nguyên liệu thường xuyên cho quá trình tiến hóa và nghiên cứu di truyền học Nhiều phương pháp phát hiện và chọn lọc các đột biến khác nhau được sử dụng để thu nhận các đột biến có tần số xuất hiện rất

36

thấp Chúng góp phần đáng kể cho các nghiên cứu di truyền Các thay đổi thêm, mất hay thay thế các nucleotit trên phân tử DNA dẫn đến các biến đổi phân tử, gây ra các đột biến gen như: lệch khung, sai hay nhầm nghĩa và im lặng Việc phát minh ra các tác nhân gây đột biến vật lí và hóa học làm tăng đáng kể nguồn đột biến phục vụ cho nghiên cứu và chọn giống Con người có thể tăng nguồn biến dị bằng lai tạo hay sử dụng các tác nhân gây đột biến

Vi sinh vật cũng có các loại đột biến như ở sinh vật bậc cao Ở đây chỉ nêu các đột biến thường gặp ở vi sinh vật và có ý nghĩa quan trọng đối với di truyền phân tử

1 Quá trình đột biến tự nhiên

Đột biến gen là đột biến được hiểu theo nghĩa hẹp, là chỉ những biến đổi xảy ra bên trong cấu trúc gen Mỗi đột biến gen dẫn đến sự thay đổi trình tự nucleotit tạo ra các alen khác nhau Đột biến có thể xảy ra do biến đổi nhiều nucleotit, có thể do 1 nucleotit Đột biến gen không phát hiện được khi quan sát tế bào học

Các gen khác nhau của cùng 1 sinh vật có thể có tần số đột biến khác nhau Nhưng tần số đột biến tự nhiên đối với mỗi gen là một số ổn định

Tần số đột biến được đánh giá theo các căn cứ khác nhau như: trên 1 lần sao chép, 1 lần phân bào hay trên 1 giao tử và trên 1 tế bào/1 thế hệ

Ví dụ: Ở E coli đột biến từ nhạy cảm với streptomycin sang kháng tức StrS

-StrR với tần số 4.10-10 đột biến tính trên 1 tế bào/1 thế hệ Để dễ hiểu ta có thể tính ngược lại tức trong 10 tỉ tế bào của một thế hệ có 4 đột biến StrR (resistance) kháng streptomycin xuất hiện ngẫu nhiên

Tuy tần số đột biến của từng gen là rất thấp, nhưng tổng các đột biến của nhiều gen là một số đáng kể, có ý nghĩa quan trọng cho tiến hóa Đột biến ảnh hưởng đến mọi tính trạng khác nhau của sinh vật và tác động theo mọi hướng

2 Đột biến gen hay đột biến điểm

Đột biến điểm là những biến đổi rất nhỏ trên một đoạn DNA, thường liên quan đến 1 nucleotit hay 1 cặp nucleotit

Đột biến đồng nghĩa (Samesense) còn gọi là trung tính (neutral) hay im lặng (silent), khi codon mã hóa cho một axit amin bị biến đổi, thường ở bazơ thứ ba nên vẫn mã hóa cho axit amin đó (do tính thoái hoá của mã di truyền)

Đột biến vô nghĩa (Non-sense) khi codon mã hóa cho một axit amin biến thành một trong ba codon UAA, UAG và UGA là các codon kết thúc không mã hóa cho axit amin nào

Đột biến sai nghĩa (Mis-sense): Khi codon của axit amin này biến thành codon

mã hóa cho axit amin khác, làm thay đổi axit amin tương ứng trên phân tử protein

- Biến đổi trên 1 nhiễm sắc thể: mất đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn

- Biến đổi giữa các nhiễm sắc thể: chuyển đoạn

- Đột biến bộ gen (genome mutation)

Đa bội thể (Polyploidy) hiểu theo nghĩa rộng là sự thay đổi số lượng nhiễm sắc thể gồm: Đa bội thể nguyên (Polyploidy hay Euploidy) (2n –> 3n, 4n, …), đa bội thể lai còn gọi dị bội thể (Alloploidy) (2nA + 2nB) và đa bội lệch (Aneuploidy), hay đa nhiễm: (ví dụ: 2n + 1 hoặc 2n – 1)

4 Các biến đổi vi cấu trúc

Các thay đổi thành phần nucleotit của gen

Đột biến thay thế: Thay một nucleotit này bằng nucleotit khác

- Đồng chuyển (Transition) khi pyrimidin được thay thế bởi pyrimidin hay purin bởi purin Ví dụ: T thay cho C hoặc ngược lại

- Đảo chuyển (Transversion) khi pyrimidin được thay thế bởi purin hay purin bởi pyrimidin Ví dụ: T hay C thay cho A hoặc G và ngược lại

Mất nucleotit (Deletion): Mất một phần nucleotit của gen

Đột biến xen nucleotit (Insertion mutant): Thêm 1 hay nhiều nucleotit vào gen

5 Các đột biến kiểu hình

Các đột biến hình thái: Các biến đổi ảnh hưởng đến hình dạng, màu sắc và kích thước

Đột biến sinh hóa:

- Các đột biến khuyết dưỡng (Auxotrophe mutation) làm mất khả năng tổng hợp các chất

- Các đột biến có điều kiện: Các đột biến có thể không có biểu hiện trong những điều kiện giới hạn nhất định (restrictive condition) và có biểu hiện trong các điều kiện cho phép (permissive condition) Ví dụ, các đột biến nhạy cảm với nhiệt độ cao có biểu hiện ở nhiệt độ tương ứng

- Đột biến đề kháng: Các biến đổi sinh hóa giúp kháng lại được các tác nhân bất lợi

38

6 Đột biến thuận và đột biến nghịch

Đột biến thuận hay trực tiếp (Direct mutation): Biến đổi từ kiểu hình hoang dại sang khác thường

Hồi biến (Reversion): Đột biến từ kiểu hình đột biến quay về kiểu hình hoang dại

Hồi biến thật hay đột biến nghịch Đột biến trở lại y như ban đầu

Ví dụ: adenin -> guanin -> adenin

Đột biến ức chế hay kìm hãm (Supressor): Đột biến ở một điểm khác Cả hai cùng tạo kiểu hình gần như hoang dại

Đột biến kìm hãm ngoài gen: Xảy ra ở gen khác với gen bị đột biến

Đột biến kìm hãm trong gen: Xảy ra ở nucleotit khác trong gen đưa gen trở về trạng thái tạo kiểu hình hoang dại

Nói chung, các đột biến là các biến đổi rất đa dạng của vật chất di truyền và có nhiều tác động khác nhau

6.1 Cơ chế phân tử của đột biến

6.1.1 Các biến đổi trên DNA

Tất cả các đột biến đều do những thay đổi trình tự nucleotit trên DNA Các đột biến có thể xảy ngẫu nhiên (spontaneously) hay gây tạo (cảm ứng - induced) bởi các tác nhân gây đột biến (mutagens) Các đột biến có thể do thay đổi từng cặp bazơ hay những trình tự dài hơn

Đột biến điểm (Point mutation) là biến đổi trình tự của một cặp bazơ Đột biến điểm có thể do chuyển đổi hoá học bazơ này thành bazơ khác hoặc do bắt cặp sai trong sao chép Sự biến đổi gồm nhiều kiểu:

Sự đồng chuyển: thay cặp G-C bằng A-T và ngược lại

Sự đảo chuyển: thay A-T bằng T-A và ngược lại

– Sự bắt cặp sai (Bazơ mispairing) là sự bắt cặp không theo đúng nguyên tắc của mô hình Watson-Crick, mà là adenin với cytosin, thymine với guanin

Xen đoạn (Insertion) là sự thêm vào một đoạn cặp bazơ vào DNA Tăng đôi đoạn (Duplication) là một dạng đặc biệt của xen đoạn

Mất đoạn (deletion) là sự mất đi một trình tự DNA, mà trình tự hai bên nối lại với nhau trừ trường hợp mất đầu mút nhiễm sắc thể

Transposon hay phần tử di động là trình tự DNA có khả năng tự xen vào (hay bản sao chính nó) ở vị trí mới trên bộ gen (genome), mà không cần có quan hệ gì với locus mục tiêu Xen đoạn là kiểu đột biến phổ biến nhất và do sự di chuyển của các phần tử di động

39

Phần lớn đột biến ngẫu nhiên do sự hiện diện của các bazơ bất thường trên DNA Ngoài ra, một số bazơ bị biến đổi (modified) như thường gặp hơn cả là 5-metylcytosin, được tạo ra do enzym metylaz thêm nhóm metyl vào một số cytosin ở những điểm đặc biệt trên DNA

6.1.2 Các sai hỏng trong sao chép DNA

Các đột biến có thể xảy ra do sai lầm khi sao chép DNA

Mỗi bazơ tồn tại ở 2 dạng cấu trúc được gọi là tautomer Ví dụ, adenin bình thường mang nhóm NH2 cung cấp nguyên tử hydro cho sự bắt cặp bổ sung với dạng keto (C = O - keto form) của thymine Khi có biến đổi tautomer, adenin chuyển sang cấu trúc hiếm là dạng imino NH sẽ bắt cặp bổ sung với cytosin Thymine có thể chuyển sang dạng enol (COH) không có trong DNA bình thường và bắt cặp với guanin

Sự bắt cặp sai này có thể là các đột biến đồng chuyển, trong đó purin thay bằng purin khác và pyrimidin thay bằng pyrimidin khác

Các biến đổi trên, ngoài việc thay thế các nucleotit trên mạch DNA còn có thể làm tăng thêm hay khuyết các nucleotit gây nên các kiểu đột biến ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protein

6.1.3 Ảnh hưởng của đột biến gen đến sinh tổng hợp protein

Đột biến lệch khung

Hai kiểu đột biến có hiệu quả nặng là thêm bazơ (addition) và mất bazơ (delection) Các biến đổi này thường làm enzym mất hoạt tính Sự thêm 1 bazơ hay làm mất 1 bazơ dẫn đến sự dịch mã lệch khung Từ điểm biến đổi về sau, từ bộ ba bị sai cái sai sẽ kéo dài liên tục đến cuối mạch polypeptit

Đột biến thay thế (Bazơ substitution)

Đột biến thay thế bazơ nếu là đột biến sai nghĩa (mis-sense) sẽ có hiệu quả thay đổi từ axit amin này thành axit amin khác trong mạch polypeptit, còn nếu là đột biến

vô nghĩa (non-sense) hay đột biến trung tính (hay im lặng) sẽ không ảnh hưởng đến mạch polypeptit

6.1.4 Sai hỏng ngẫu nhiên

Ngoài các sai hỏng trong sao chép, phân tử DNA còn chịu các sai hỏng ngẫu nhiên có thể dẫn đến đột biến Hai kiểu sai hỏng ngẫu nhiên thường gặp là mất purin (depurination) và mất amin (desamination) Mất purin là kiểu sai hỏng thường hơn, xảy ra khi liên kết glycosidic giữa C1 của pentoz với bazơ bị đứt và làm mất A hoặc

G

Sự mất amin của cytosin tạo ra uracil Các gốc U không được sửa sai sẽ bắt cặp

bổ sung với A trong sao chép, gây ra đồng chuyển G-C ->A-T Trong các enzym sửa

6.1.5 Đột biến nhân tạo hay cảm ứng

Các tác nhân làm tăng tần số đột biến cao hơn mức tự nhiên được gọi là các tác nhân gây đột biến (mutagen) Các tác nhân vật lí như phóng xạ, tia X, tia tử ngoại gây đột biến Nhiều hóa chất là tác nhân gây đột biến như các đồng đẳng của các bazơ nitric, HNO2 (nitrous axit), các chất alxyl hóa mạch Các đột biến loại này được gọi là đột biến nhân tạo hay đột biến cảm ứng (induced mutation)

Đối với các vi sinh vật, các tác nhân gây đột biến chủ yếu là tia tử ngoại và một

6.2.1 Các đột biến nghịch

Đột biến nghịch có được khi gen đột biến có sự biến đổi quay trở lại có cấu trúc như gen hoang dại ban đầu Trường hợp này khó xảy ra và khi lai trở lại với dòng hoang dại thì thế hệ con tất cả đều có kiểu hình hoang dại

Ví dụ: Đột biến nghịch: m– –> m+, khi lai với dạng hoang dại cho thế hệ con đều hoang dại

Đột biến ức chế: m–su+ –> m–su–, khi lai với dạng hoang dại trong thế hệ con sẽ