ÔN TẬP LÊN MEN CHƯƠNG 6 PHƯƠNG PHÁP THU HỒI, TINH SẠCH

CHƯƠNG 6 CÁC PHƯƠNG PHÁP THU HỒI, TINH SẠCH VÀ THU HỒI SẢN PHẨM SAU LÊN MEN Nội dung ‘1 Các phương pháp thu hồi sản phẩm Phương pháp loại bỏ tế bào vi sinh vật và chất rắn 4 phương pháp Lọc, ly tâm, T.

CHƯƠNG 6: CÁC PHƯƠNG PHÁP THU HỒI, TINH SẠCH VÀ THU HỒI SẢN PHẨM SAU LÊN MEN

2.1 Giai đoạn đầu của tinh sạch:

- PP phá vỡ tế bào (dùng cho sp nội bào): pp vật lý, hóa học, cơ học

- PP thu hồi và tách sp (dùng cho sp ngoài bào): Kết tủa, chiết chất lỏng – lỏng, thu hồi dung môi và chất dễ bay hơi

2.2 Giai đoạn tinh sạch bằng kỹ thuật sắc ký: → Phương pháp hiện đại nhất và cho sản phẩm tinh khiết → CNSH để sx thuốc

hoặc đưa vào bảo

quản lâu dài

PP kết tinh, sấy phun, đông khô

1 Các Phương pháp thu hồi sản phẩm:

Mục đích: Mục đích thu hồi sản phẩm là tách được sản phẩm mong muốn ra khỏi môi trường lên men Công đoạn xử lý có thể được thực

hiện như lọc, ly tâm (tách chất rắn có kích thước lớn và tế bào vi sinh vật), dùng enzyme phá thành tế bào, tách phân đoạn, bay hơi, sấy…

Cách thức thu hồi

phụ thuộc:

Cách thức thu hồi phụ thuộc vào thời gian thu hoạch, đặc điểm hóa học của chất thu hồi, lực ion, thành phần môi trường nuôi cấy Trong dịch lên men thường chứa sản phẩm trao đổi chất, trong đó có sản phẩm mục tiêu với nồng độ thấp (nếu là sản phẩm ngoại bào), các tế bào sống, tế bào tự phân, các chất còn lại trong môi trường nuôi cấy Vì thành phần các chất trong dịch lên men rất đa dạng, lại nhạy cảm với các yếu tố bên ngoài nên gây khó khăn cho quá trình thu hồi Nếu thu enzyme ngoại bào thì lượng dịch nổi có chứa enzyme cần phải được xử lý ngay sau khi thu nhận dịch lên men, hiệu suất thu hồi enzyme khó phán đoán sẽ gây hạn chế cho việc tính toán phương thức thu hồi Sự hình thành chất màu trong quá trình lên men cũng gây trở ngại cho thu hồi do chúng liên kết với resin giống như các enzyme Nếu còn dư chất phá bọt trong dịch lên men cũng gây ảnh hưởng đến hệ thống lọc tinh Khi lượng ion trong môi trường sản xuất quá cao dẫn đến việc cần phải pha loãng dịch nổi trước khi đưa vào công đoạn xử lý

Để tránh sự biến đổi về chất lượng, quá trình thu hồi cần được thực hiện nhanh Kỹ thuật và thiết bị được lựa chọn cần dựa trên đặc điểm của môi trường lên men, nồng độ và đặc tính lý hóa của sản phẩm lên men, yêu cầu của thị trường về mục đích sử dụng, chất lượng sản phẩm và năng lực công nghệ, năng lực tài chính của nhà sản xuất

Trong một số quá trình lên men thu hồi sản phẩm là protein tái tổ hợp và kháng thể đơn dòng, chi phí thu hồi sản phẩm có thể chiếm 80-90% tổng chi phí xử lý Chi phí cao đôi khi ảnh hưởng đến mục tiêu chung trong một số quá trình lên men Tại thời điểm thu hồi sinh khối, trong môi trường còn có thể chứa các vi sinh vật, mảnh tế bào và một số sản phẩm trao đổi chất khác Tất cả các yếu tố này có xu hướng làm tăng những khó khăn trong việc phục hồi sản phẩm Để đảm bảo cho việc thu hồi tốt các sản phẩm, tốc độ hoạt động có thể là yếu tố quan trọng do các sản phẩm lên men có tính chất không bền Do đó, thiết bị chế biến phải đúng loại và có kích thước phù hợp để đảm bảo môi trường dùng để thu hoạch có thể được xử lý trong một khoảng thời gian nhất định thích hợp Cũng cần lưu ý rằng mỗi bước hoặc mỗi thiết bị được sử dụng sẽ không đạt được hiệu quản 100% và có cả

sự xuống cấp của các sản phẩm Ngay cả khi tỷ lệ thu hồi tại mỗi bước là rất cao, ví dụ 90% thì sau 5 bước chỉ thu được khoảng 60% sản phẩm ban đầu Vì vậy, số lượng các bước cũng như máy móc thiết bị sử dụng cần đạt số lượng tối thiểu để thu hồi sản phẩm

2 Nồng độ của sản phẩm trong dịch lên men;

3 Các tính chất vật lý và hóa học của sản phẩm (để đưa ra phương án thu hồi tối ưu cả cho quá trình tinh sạch về sau);

4 Mục đích sử dụng của sản phẩm;

5 Độ tinh khiết thấp nhất có thể chấp nhận được;

6 Mức độ nguy cơ sinh học của sản phẩm hoặc môi trường lên men;

7 Các tạp chất trong môi trường lên men;

8 Giá thị trường của sản phẩm

Loại bỏ tế bào vi sinh vật và các chất rắn có kích thước lớn chính là mục đích chính của giai đoạn đầu trong quá trình thu hồi sản phẩm ngoại bào Hệ thống máy lọc hoặc máy ly tâm thường được sử dụng cho mục đích này Tiếp theo dịch lên men sẽ được phân đoạn hoặc chiết tách nhờ đưa vào hệ thống phân đoạn chính, có thể là hệ thống lọc tinh, hệ thống đảo chuyển áp suất thẩm thấu, hấp phụ, trao đổi ion, lọc gel, sắc ký, chiết tách hệ dịch lỏng - lỏng, chiết tách dịch lỏng hai pha hoặc đông tụ Sau cùng các phân đoạn có chứa sản phẩm mong muốn sẽ được tinh chế bằng cách đông tụ phân đoạn Để đạt được độ tinh sạch cao nên dùng kỹ thuật sắc ký và kết tinh để thu hồi sản phẩm

Để vận hành và xử lý nhanh với quy trình đơn giản hơn có thể thay đổi một số đặc tính của dịch lên men nhờ một số kỹ thuật sau:

Tuyển chọn những chủng vi sinh vật không sinh sắc tố hoặc tạo ra các sản phẩm trao đổi không mong muốn;

Tối ưu các điều kiện lên men để làm giảm sản xuất các sản phẩm trao đổi chất không mong muốn

Thu hồi chính xác thời điểm sinh tổng hợp sản phẩm cao;

Kiểm soát pH sau khi thu hồi;

Xử lý nhiệt độ sau khi thu hồi;

Bổ sung các chất gây kết tụ;

Dùng enzyme phân hủy thành tế bào

Lưu ý rằng lên men và thu hồi sản phẩm là hai giai đoạn liên tục của một quá trình và có tác động tương hỗ Các yếu tố liên quan bao gồm thời gian thu hoạch, sự sản xuất các phân tử màu, lực ion và thành phần môi trường nuôi cấy Dịch nổi với khối lượng lớn cần phải được xử lý ngay sau khi thu nhận dịch lên men, hiệu suất thu hồi enzyme

có thể không dự đoán được, điều này gây khó khăn cho việc thiết lập kế hoạch thu hồi sản phẩm Các sắc tố gây trở ngại lớn cho quy trình thu hồi do chúng liên kết với resin giống như các enzyme Chất phá bọt còn lại trong dịch lên men làm ảnh hưởng đến

hệ thống lọc tinh hoặc nhựa trao đổi ion được sử dụng trong giai đoạn của quá trình thu hồi và tinh sạch Cần có thử nghiệm để lựa chọn chất phá bọt thích hợp cho lên men

Phần tiếp theo sẽ giới thiệu các hình thức thu hồi sản phẩm lên men thông qua việc loại bỏ tế bào vi sinh vật và chất rắn (bằng phương pháp lọc, ly tâm, tách bọt, kết tủa), (ii) bảo quản vi sinh vật sau khi tách

(iii) cô đặc , tinh sạch , bảo quản và thu hồi sản phẩm lên men ở các dạng khác nhau

Các phương pháp

thu hồi sản phẩm

Các tế bào vi sinh vật và các chất không hòa tan sẽ được tách ra khỏi môi trường nuôi cấy bằng cách lọc hoặc ly tâm Do tế bào

vi khuẩn có kích thước nhỏ nên có thể sử dụng thêm các chất trợ lọc để cải thiện tốc độ lọc Phương pháp xử lý nhiệt và keo tụ được sử dụng như kỹ thuật để tăng tốc độ lắng trong ly tâm Chất keo tụ được dùng để hỗ trợ thu hồi sản phẩm Chitosan và polyacrylamide được sử dụng làm đông tụ mảnh vụn tế bào và protein hòa tan trong dịch lên men

1.1 Lọc: Lọc là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất về mặt kích thước qua lớp lọc Các phân tử có kích thước lớn hơn kích

thước lỗ lớp lọc thì được giữ lại bên trên, dung dịch đi xuyên qua lọc dưới một áp suất dư so với áp suất bên dưới vật ngăn Phương pháp này được sử dụng để thu sinh khối các chủng vi sinh vật có kích thước tế bào lớn Tế bào vi sinh vật càng lớn, lọc càng nhanh và hiệu suất lọc càng cao Tuy nhiên phương pháp lọc thường chỉ áp dụng trong trường hợp thu nhận sinh khối tảo do kích thước lớn, còn các chủng vi sinh vật khác kích thước nhỏ, lọc không hiệu quả

Lọc là một trong những quá trình phổ biến nhất được sử dụng ở tất cả các quy mô để tách các hạt lơ lửng khỏi chất lỏng hoặc

khí, sử dụng môi trường xốp giữ lại các hạt nhưng cho phép chất lỏng hoặc khí đi qua

tối thiểu, bao gồm:

‘1 Các tính chất của dịch lọc, đặc biệt là độ nhớt và mật độ của nó;

‘2 Bản chất của các hạt rắn, đặc biệt là kích thước và hình dạng của chúng, đặc điểm phân bố kích thước;

‘3 Tỉ lệ chất rắn/lỏng;

‘4 Sự cần thiết phải thu hồi phần rắn hoặc lỏng hoặc cả hai;

‘5 Quy mô hoạt động;

‘6 Điều kiện vô trùng hay không;

‘7 Áp suất hoặc chân không để đảm bảo tốc độ dòng chảy của chất lỏng

Phân loại: Dựa trên hoạt động của quá trình lọc, có thể chia ra 2 loại lọc là lọc liên tục và lọc không liên tục - Trong đó lọc liên tục là chất

cặn và dịch lọc được xả ra liên tục và không bị gián đoạn

- Lọc không liên tục là chất cặn và dịch lọc được thu theo từng đợt của quá trình lọc

Để quá trình lọc đạt hiệu quả, tùy thuộc vào loại sản phẩm mà có thể sử dụng các cấp lọc khác nhau

Dựa trên tính chất của quá trình lọc có thể chia ra 2 cấp lọc là:

- Lọc thô là loại bỏ một lượng lớn chất rắn

- Lọc tinh, lọc khuẩn, siêu lọc, lọc nano, lọc thẩm thấu ngược là loại một lượng nhỏ chất rắn

Lọc thô: Lọc thô: Mục đích loại bỏ các chất rắn lơ lửng thô có trong dung dịch lỏng Cơ sở hoạt động dựa trên áp lực đẩy qua màng lọc

với một dòng chảy cố định để thu giữ và tái tạo nguồn chất lỏng trong việc loại bỏ cặn Kích thước hạt loại bỏ từ 50-2000 micron (là dạng hạt mà mắt thường có thể nhìn thấy được)

Lọc tinh Lọc tinh: Mục đích là loại bỏ hạt và chất rắn lơ lửng có kích thước nhỏ hơn so với giai đoạn lọc thô Quá trình xử lý này dùng

cho các kích thước hạt loại bỏ dao động từ 1-50 micron

Lọc MF Lọc khuẩn hay còn được gọi là vi lọc (MF - Micro Filtration): Là quá trình lọc vật lý, khi chất lỏng bị ô nhiễm được truyền qua

một lớp màng có kích thước lỗ đặc biệt nhỏ để ngăn chặn tạm thời, loại bỏ vi sinh vật và hạt lơ lửng từ quá trình tinh sạch chất lỏng Quá trình này thường được sử dụng kết hợp với các quy trình tách khác nhau như siêu lọc và thẩm thấu ngược để cung cấp một dòng sản phẩm mong muốn Kích thước hạt loại bỏ từ 0,1-0,9 micron

Siêu lọc Siêu lọc (UF - Ultra Filtration): Là một loạt các màng lọc có khả năng chịu áp lực và làm giảm gradient nồng độ thông qua một

màng bán thấm Chất rắn lơ lửng hòa tan cùng một số phân tử có kích thước lớn được giữ lại, trong khi nước và chất tan với trọng lượng phân tử thấp được lọc qua màng bán thấm Quá trình tách này được sử dụng trong ngành công nghiệp, tập trung cho các giải pháp phân tử, đặc biệt là giải pháp protein Công nghệ này không khác so với công nghệ vi lọc, cả hai đều thực hiện quá trình lọc dựa trên khả năng giữ lại các hạt Điểm khác nhau là khả năng tách màng, tạo khả năng hấp thụ, khuếch tán các chất Màng này được xác định bằng khối lượng phân tử cắt (MWCO -) của màng tế bào được sử dụng Kích cỡ hạt loại bỏ từ 0,01-0,09 micron

Lọc Nano Lọc nano: Là quá trình sử dụng màng lọc loại bỏ các chất rắn hòa tan trong nước với mục đích làm mềm nước và loại bỏ việc

khử trùng sản phẩm Đây là phương pháp đang được sử dụng rộng rãi trong ứng dụng chế biến thực phẩm như sữa cũng như khả

năng khử khoáng Kích thước hạt loại bỏ từ 0,001-0,009 micron

Lọc thẩm thấu

ngược Lọc thẩm thấu ngược (RO-): Là công nghệ sử dụng để loại bỏ phần lớn các chất gây ô nhiễm từ nguồn nước bằng cách đẩy nước dưới áp lực qua một màng bán thấm Quá trình này có thể loại bỏ nhiều loại phân tử và ion, bao gồm vi khuẩn Được sử dụng

trong cả quá trình công nghiệp và sản xuất nước uống Kết quả là chất tan được giữ lại ở phía áp lực của màng và các sản phẩm tinh khiết được phép sang phía bên kia của màng Để có tính chọn lọc, lớp màng này không cho phép các phân tử lớn hoặc các ion đi qua lỗ màng nhưng cho phép các thành phần nhỏ hơn (dung môi) đi qua màng một cách tự do Sự chuyển động của dung môi tinh khiết được điều khiển để giảm năng lượng tự do của hệ thống bằng cách cân bằng nồng độ chất tan mỗi bên của màng,

tạp ra áp suất thẩm thấu Kích thước hạt loại bỏ là 0,0001-0,0009 micron

Chất trợ lọc: Chất trợ lọc được sử dụng phổ biến để lọc vi khuẩn hoặc các chất lơ lửng mịn hoặc gel Khi trộn với huyền phù tế bào ban đầu,

nó sẽ giúp cải thiện độ xốp của lớp lọc giúp tốc độ dòng chảy nhanh hơn Ngoài ra, nó còn có tác dụng như tác nhân giúp các lỗ lọc được thông thoáng hơn, ngăn ngừa hiện tượng bít tắc lỗ lọc

Chất trợ lọc là một loại bột mịn dùng để hỗ trợ quá trình lọc bằng cách tạo thành một lớp bã bổ sung trên bề mặt lọc, làm tăng

khả năng giữ pha rắn và giảm trở lực của pha lỏng

Các yêu cầu chất

trợ lọc:

‘1 Trên bề mặt lọc phải tạo một lớp bã có độ xốp lớn (e = 0.85 – 0.90), nhưng kích thước lỗ xốp bé

‘2 Bề mặt riêng của bột trợ lọc không quá lớn (vì bề mặt riêng lớn thì kích thước hạt bé và trở lực lớn)

‘3 Giới hạn thành phần cỡ hạt trong bột trợ lọc trong phạm vi hẹp (hạt đồng nhất)

‘4 Khối lượng riêng của bột trợ lọc không quá lớn (KLR lớn sẽ làm phân lớp trong dịch huyền phù)

‘5 Độ nén dưới áp suất không cao

‘6 Không hòa tan và phải trơ về mặt hóa học của pha lỏng của dịch huyền phù

Cách sử dụng chất

trợ lọc: theo 2 cách

‘1 Hoà bột trợ lọc vào huyền phù (khoảng 0,01-4%), cách này thường dùng cho hệ thống lọc liên tục

‘2 Phủ một lớp bột trợ lọc lên trên bề mặt của màng lọc với độ dày khoảng từ 0,8-2,5mm tương ứng với khối lượng khoảng 0,75kg/m2 Cách này thường được dùng trong trường hợp lọc gián đoạn (theo mẻ)

‘1 Diatomit: Được sử dụng rất rộng rãi để dùng cho quá trình trợ lọc Do cấu trúc của diatomit có các lỗ xốp lớn và nhiều khoảng

trống nên vật liệu này có khả năng thấm hút cao Diatomit có tính trơ về mặt hoá học, năng suất lọc cao (tốc độ lọc lớn), có khả năng tách các hạt chất rắn có kích thước < 0,5mm Diatomit rất nhẹ và có thể chịu nén, trong khi đó vẫn có thể giữ được 90% các khoảng trống do vậy thường được dùng hơn perolit

‘2 Perolit: Là loại khoáng chất gốc dung nham núi lửa trông giống như thủy tinh, perolit được sử dụng làm chất trợ lọc Perolit

đặc và thô hơn diatomit nên chỉ có thể giữ lại các hạt tạp chất có kích thước >1 mm

‘3 Nhóm zeolit: Clinoptilolit là loại zeolit được sử dụng nhiều nhất trong các quá trình lọc do có khả năng giữ các hạt tạp chất ở

trong lỗ xốp hay trên bề mặt thô ráp của nó

‘4 Cellulose: Là vật liệu hữu cơ phù hợp cho việc lọc sơ bộ các chất lỏng đòi hỏi độ trong tối ưu, được sử dụng làm chất kết

dính Cấu trúc sợi của cellulose tạo thành bánh lọc thấm tốt, có khả năng hấp thụ trầm tích, các hạt rất mịn một cách an toàn và hiệu quả Hỗ trợ bộ lọc cellulose có các ưu điểm sau: khả năng hấp phụ cao, tính thấm cao, tuổi thọ dài

‘5 Amiang (hay còn gọi là asbestos) là tên gọi chung của loại sợi khoáng silicat, thường hay dùng làm bánh lọc cho môi trường

có chứa citric acid Do có nhiều khuyến cáo không an toàn khi sử dụng vật liệu này nên chúng ít được lựa chọn hơn

‘6 Bột talc là một silicat magie hydrat tự nhiên, đôi khi có chứa một lượng nhỏ silicat nhôm Bột talc thường được sử dụng

trong dược phẩm như một chất trợ lọc, thường được làm như dạng phụ gia trộn tạo huyển phù trước quá trình lọc

Cách bổ sung chất

trợ lọc vào dịch lên

men:

Bổ sung chất trợ lọc vào dịch lên men có thể thực hiện theo 2 cách: kỹ thuật phủ (pre- coating) và kỹ thuật trộn (body mix)

‘- Kỹ thuật phủ là chất trợ lọc được trộn lên tạo thành dịch huyền phù rồi lọc trước sau đó dịch cần lọc mới tiến hành lọc

‘- Kỹ thuật trộn là một tỷ lệ nhỏ của chất trợ lọc (0,1-,.5%) được thêm vào bùn lọc Bùn này sẽ được tuần hoàn qua bộ lọc cho đến khi

thu được dịch lọc trong suốt

Các thiết bị lọc: ‘1 Lọc theo mẻ dựa trên nguyên lý áp suất: bộ lọc lá, lọc tấm và lọc khung

‘2 Lọc theo mẻ dựa trên nguyên lý trọng lực: bộ lọc trống quay, đĩa quay

‘3 Nguyên lý chân không: trống quay, đai, đĩa quay

1.2 Ly tâm ‘- Trong quá trinh thu hồi, tốc độ và thời gian ly tâm cần được quan tâm

‘- Mặc dù lọc là một phương pháp dễ sử trong phòng thí nghiệm hoặc quy mô sản xuất, nhưng có một nhược điểm là vi khuẩn được giữ lại trên bánh lọc được trộn với một lượng đáng kể chất trợ lọc Do đó, việc thu hồi vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy

mà không có tạp nhiễm của chất trợ lọc rất được quan tâm Mặt khác, ly tâm cho phép thu được cả chất lỏng nuôi cấy và các sinh vật, không bị thay đổi bởi sự hiện diện của vật liệu ngoài

‘- Trong quá trình thu hồi, tốc độ và thời gian ly tâm cần được quan tâm Máy ly tâm thường được chạy ở tốc độ tối đa cho phép làm tăng hiệu quả phân tách Tuy nhiên, vì lý do kinh tế, điều này không phải lúc nào cũng thực hiện được, đặc biệt khi thu hồi sản phẩm với thể tích lớn

Phân loại:

Máy ly tâm chia

thành 2 loại: máy ly

tâm liên tục và máy

ly tâm gián đoạn

‘- Máy ly tâm liên tục hoạt động bằng cách một dòng vật chất liên tục vào máy cặn lắng được thu thập và chất nổi trên bề mặt được thải ra liên tục

‘- Máy ly tâm không liên tục và những loại hoạt động không liên tục, được nạp lại giữa các lần chạy với môi trường lên men được thu hồi

Máy ly tâm sử dụng

cho phòng thí

nghiệm:

Máy ly tâm dùng cho lên men phòng thí nghiệm với dung tích từ dưới 10 ml đến 6 lít đối với loại không liên tục và từ khoảng

200 ml đến nhiều lít cho loại máy ly tâm liên tục Các nhà sản xuất đã có xu hướng cung cấp các máy đa năng, được làm lạnh,

có khả năng sử dụng một loạt các góc và đầu xoay, và trong một số trường hợp có thể sử dụng các rotor hoạt động liên tục

Sử dụng ly tâm khi

một số dịch lọc có

đặc tính như:

Vi sinh vật và các hạt có kích thước nhỏ có thể được tách khỏi môi trường lên men bằng cách sử dụng máy ly tâm Mặc dù máy

ly tâm có chi phí cao hơn nhiều so với các bộ lọc, tuy nhiên lại cần thiết khi lọc một số dịch lọc có đặc tính như:

‘- Lọc chậm và khó khăn;

‘- Các tế bào hoặc vật chất lơ lửng khác phải được thu lại mà không được phép sử dụng các chất trợ lọc;

‘- Cần phải phân tách liên tục theo tiêu chuẩn vệ sinh cao

1.3 Tách bột: ‘- Phương pháp này đã được một số nhà nghiên cứu sử dụng để thu thập các sinh vật từ môi trường

‘- Vi sinh vật được đưa lên bề mặt bằng không khí và bị vướng vào bọt và bọt liên tục được hình thành

‘- Sau khi thu thập, bọt có thể được thu gọn và các sinh vật được phục hồi dưới dạng huyền phù tập trung

‘- Bằng cách sử dụng chất hoạt động bề mặt cation ethyl hexadecyl dimethylammonium bromide, Grief và Wang (1967) đã

nghiên cứu sự phân tách bọt của sáu loài vi khuẩn, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Serratia marcescens, Bacillus cereus và Bacillus subtilis Thiết bị được sử dụng cho kỹ thuật phá bọt này là đơn giản và giá thành thấp bao gồm một ống trụ Pyrex 9,6cm

x 82cm (Hình 6.1) Khí nitơ được phun vào xi lanh thông qua các thiết bị sục khí thủy tinh thiêu kết có độ xốp 50m Bọt hình thành được loại bỏ liên tục từ một cổng nằm ở độ cao khoảng 20cm so với mức huyền phù vi khuẩn ban đầu, tức là khoảng 35cm so với đáy của xi lanh Bước tiếp theo được thực hiện theo kỹ thuật của Rubin &cs (1966) bằng cách sử dụng một loại máy làm lạnh để tinh chỉnh kích thước của bong bóng khí được tạo ra bởi máy phun nước và một chất keo tụ (như phèn) để làm đông

tụ vi khuẩn trước khi thu thập Gaudin & cs (1962) đã nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl và các muối vô cơ khác trong quá trình

tuyển nổi E coli và tìm thấy những chất này để hỗ trợ việc thu nhận vi sinh vật đáng kể

Sau quá trình lên men công nghiệp, việc thêm các chất keo tụ vào môi trường lên men để hỗ trợ khử nước là điều khá phổ biến

‘- Việc sử dụng các chất keo tụ được thực hiện rộng rãi trong các ngành xử lý nước thải để loại bỏ các tế bào vi sinh vật và chất keo lơ lửng

‘- Khi các tế bào vi sinh vật tụ lại thành khối, mặc dù có cùng mật độ với các tế bào riêng lẻ, chúng sẽ lắng đọng nhanh hơn do đường kính của các hạt tăng lên (định luật Stokes) Quá trình lắng đọng này có thể đạt được một cách tự nhiên với các chủng men bia được lựa chọn, đặc biệt là thùng lên men được làm lạnh vào cuối quá trình lên men, dẫn đến việc làm trong bia một cách tự nhiên

Bản chất: Vi sinh vật trong dung dịch thường được giữ như các đơn vị riêng biệt theo ba cách Đầu tiên, các bề mặt của chúng được tích

điện âm để đẩy nhau Thứ hai, thành tế bào ưa nước của chúng hình thành một lớp vỏ liên kết với tế bào hoạt động như một rào cản để tập hợp Cuối cùng, do hình dạng bất thường của thành tế bào (ở cấp độ phân tử), trở ngại không gian cũng sẽ đóng góp một phần

Phần lớn các chất keo tụ hiện đang được sử dụng là đa điện giải, hoạt động bằng cách trung hòa điện tích và tương tác kỵ nước

để liên kết các tế bào với nhau

Kết tủa được thực hiện ở các giai đoạn khác nhau của quá trình thu hồi sản phẩm Đây là quá trình cần thiết để làm giàu các sản phẩm, làm giảm khối lượng vật liệu xử lý Từ đây có thể thu được một số sản phẩm hoặc loại bỏ được một số tạp chất từ dịch lên men

Tác nhân: Phương pháp kết tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử sinh học, đặc biệt là protein và enzyme Có nhiều

cách khác nhau để tủa, trong đó các tác nhân được sử dụng phổ biến để làm kết tủa các chất cần thiết bao gồm acid, bazơ, muối, dung môi hữu cơ, polymer không ion, điểm đẳng điện, ion kim loại

Kết tủa bằng axit và

bazo:

Acid và bazơ để sử dụng để thay đổi pH của dung dịch cho đến khi đạt đến điểm đẳng điện của hợp chất, và pH bằng pI Khi đó không có điện tích tổng thể trên phân tử và độ hòa tan của nó bị giảm

Kết tủa bằng muối ‘- Đây là phương pháp phổ biến để kết tủa protein và enzyme Một protein hoặc enzyme chứa các nhóm thay đổi khác nhau cho

nên khả năng hòa tan của protein, enzyme tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, enzyme như pH, nhiệt

độ, nồng độ muối, sự phân cực của dung môi…

‘- Các muối như amoni và natri sunfat được sử dụng để thu hồi và phân đoạn protein do vừa làm trung hòa điện vừa loại bỏ lớp

vỏ hydrate của phân tử protein mà không làm ảnh hưởng đến hoạt tính và cấu trúc enzyme và protein Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối ở các nồng độ khác nhau để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ Ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh

‘- Hiệu quả kết tủa protein của các muối anion khác nhau là khác nhau, có thể sắp xếp theo thứ tự tăng dần như sau: thiocyanate

→ nitrate → acetate/chloride → sulphate → phosphate → citrate

Kết tủa bằng dung

môi hữu cơ:

Dextran có thể được kết tủa ra khỏi nước dùng bằng cách thêm methanol Ethanol và acetone lạnh có thể được sử dụng cho kết

tủa của protein do sự thay đổi tính chất điện môi của dung dịch Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dựa vào quá trình solvat hóa của nước đối với những protein mang điện tích Sự ưa nước sẽ giảm khi nồng độ dung môi tăng, do sự giảm hằng số điện môi của dung dịch Các phân tử xung quanh vùng kỵ nước của phân tử protein bị thay thế bởi các phân tử dung môi, làm cho các phân tử protein tiến gần nhau hơn tạo nên lực tương tác tĩnh điện và lưỡng cực Phân tử protein sẽ tập hợp lại và kết tủa Lực đẩy do các phần kỵ nước của phân tử protein khi này là không đáng kể do chúng bị bao quanh các phân tử dung môi

Kết tủa bằng các

polymer không ion:

‘- Các polyme không ion như polyethylen glycol (PEG) có thể được sử dụng trong quá trình kết tủa protein và tương tự như trong các dung môi hữu cơ Nguyên tắc của phương pháp này là cho thêm chất không ion vào trong dung dịch protein làm cho

số lượng các phân tử nước có thể tương tác được với protein giảm xuống Các chất thường sử dụng là dextran và polyethylen

glycol

‘- Quá trình tương tác giữa các cấu tử trong protein chỉ xảy ra khi dung dịch protein có nồng độ cao, hay pH môi trường vượt ra ngoài điểm đẳng điện Tuỳ thuộc vào trọng lượng phân tử của protein đó mà chọn loại polymer không ion thích hợp bổ sung vào trong dung dịch protein Tương tự như trường hợp tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện, tại một giá trị pH nhất định (sau khi thêm polymer không ion) thì khả năng hòa tan của protein cũng giảm xuống

Kết tủa bằng

phương pháp điểm

đẳng điện:

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên nguyên tắc là mức độ kết tủa của protein phụ thuộc vào pH của dung dịch protein Ở

pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton), ở pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carboxyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+) Tại giá trị pI (Isoelectric point - điểm đẳng điện), protein không tích điện, điều này làm giảm tính tan của protein (độ hòa tan của protein là thấp nhất) vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường và kết tủa

Kết tủa bằng các

ion kim loại:

Ion kim loại sẽ được gắn với một phần của phân tử protein Ưu điểm của phương pháp là có thể kết tủa được protein trong một dung dịch rất loãng Các ion kim loại có thể chia làm ba nhóm: (1) Các ion như Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ và Cd2+ sẽ gắn chặt vào các acid carboxylic và các hợp chất có chứa nitrogen; (2) Các ion như Ca2+, Ba2+, Mg2+ và Pb2+ sẽ gắn với nhóm chức acid carboxylic; (3) Các ion như Ag2+, Hg2+, và Pb2+ sẽ gắn chặt với các nhóm có chứa lưu huỳnh

2 CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT TINH SẠCH SẢN PHẨM

Giới thiệu chung: Vào cuối quá trình lên men, môi trường lên men cuối cùng, còn được gọi là dịch lên men trong bình lên men chứa sản phẩm

đích được lưu trữ trong tế bào chủ (sản phẩm nội bào) hoặc lơ lửng trực tiếp trong môi trường nuôi cấy (sản phẩm ngoại bào) Dịch lên luôn luôn phải trải qua các giai đoạn lọc hay ly tâm để thu hồi dịch lọc hay sinh khối, sau đó sẽ thu hồi sản phẩm bằng cách chiết, siêu ly tâm hay kết tủa Giai đoạn này gọi là giai đoạn đầu thu hồi hay tinh sạch giai đoạn đầu Tổng quan:

Tinh sạch một sản phẩm sinh học cần xác định rõ là tinh sạch cho mục đích nghiên cứu hay tinh sạch để sản xuất thương mại Thông thường, sản phẩm cho các ứng dụng công nghiệp không yêu cầu độ tinh khiết cao Mặt khác, sản phẩm trị liệu trong y học cần phải đạt được độ chính xác và tiêu chuẩn cao về độ tinh khiết hoặc thậm chí lên đến độ đồng nhất Tùy thuộc vào mức độ tinh khiết cần thiết, các giao thức tinh sạch sản phẩm được phát triển Ngoài ra, việc lựa chọn các quy trình phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính của sản phẩm mục tiêu và các thành phần không mong muốn (tạp chất) Quy trình tách và tinh sạch lựa chọn phải không được ảnh hưởng đến bản chất và cấu trúc của sản phẩm mục tiêu

‘1 Tạp chất dễ loại bỏ nhất nên được loại bỏ trước tiên

‘2 Tạp chất nhiều nhất nên được loại bỏ đầu tiên

‘3 Quy trình phân tách phải có tính chọn lọc cao bằng cách tập trung vào sự khác biệt lớn nhất giữa tính chất của sản phẩm mục tiêu và tạp chất Các tính chất này bao gồm dạng vật lý (rắn hoặc lỏng), kích thước, mật độ, độ hòa tan (trong nước hoặc dung môi), điện tích ion, tính kỵ nước và liên kết thụ thể (ligand) đặc hiệu

‘4 Quy trình sử dụng lực tách khác nhau nên được chọn và thực hiện theo trình tự tối ưu

‘5 Các bước tinh sạch đòi hỏi khắt khe và tốn kém nhất nên được thực hiện sau cùng

Trong những năm qua, quy trình tinh sạch sản phẩm cụ thể được thực hiện rộng rãi theo các quy tắc kể trên Ngoài ra, quy trình thực hiện xuôi dòng này có thể được phân loại thành bốn nhóm được áp dụng tinh sạch sản phẩm từ trạng thái tự nhiên trong dịch lên men thông qua các cải tiến về độ tinh khiết và nồng độ, đó là: loại bỏ chất không hòa tan, tách và cách ly sản phẩm, tinh sạch sản phẩm, đánh bóng sản phẩm

(1) Loại bỏ chất không

hòa tan:

‘- Cách tiếp cận đầu tiên này nhằm mục đích tách toàn bộ tế bào (tức là sinh khối) và các thành phần không hòa tan khác khỏi dịch lên men Trong bước này, hoạt động tách chất lỏng-rắn xảy ra, bằng cách sử dụng các dạng vật lý khác nhau của sinh khối (ở dạng rắn) và nước dùng (ở dạng lỏng) Lọc và ly tâm là các phương pháp thường xuyên sử dụng

‘- Đối với sản phẩm nội bào, sinh khối chứa sản phẩm mục tiêu được thu thập cho quá trình tiếp theo, trong khi dịch lên men bị loại bỏ Đối với sản xuất ngoại bào, sinh khối bị loại bỏ, dịch lên men được thu hồi và giữ sản phẩm dưới dạng chất tan trong dịch lỏng không có tế bào

(2) Tách và cách ly sản

phẩm:

‘- Trong giai đoạn này, các tạp chất có tính chất hóa lý khác sản phẩm mục tiêu được loại bỏ Các quy trình phổ biến được thực hiện bao gồm kết tủa amoni sulfat, chiết dung môi, chiết lỏng- lỏng và siêu lọc

‘- Việc trích xuất sản phẩm nội bào liên quan đến các giao thức ly giải tế bào để phá vỡ thành tế bào, giải phóng các chất nội

bào Vì vậy, việc thu hồi sản phẩm nội bào là tương đối khó khăn so với sản phẩm ngoại bào Đó là do các biến đổi xảy

ra trong quá trình ly giải tế bào như biến tính sản phẩm khi sử dụng hóa chất Ngoài ra, các mảnh vụn tế bào được tạo ra có thể trở thành các ràng buộc quy trình cho các bước tinh chế tiếp theo, do đó, cần thêm các bước để loại bỏ chúng Thêm các bước bổ sung vào xử lý tinh sạch chắc chắn là không thuận lợi vì mỗi bước của quy trình có thể dẫn đến mất thêm hoặc xuống cấp sản phẩm, đồng thời làm tăng chi phí sản xuất

(3) Tinh sạch sản phẩm: ‘- Bước này liên quan đến việc loại bỏ các chất gây nhiễu hoặc gây ô nhiễm có tính chất vật lý và hóa học tương tự sản phẩm

mục tiêu Do đó, các kỹ thuật cần thiết cho việc thanh lọc hoàn toàn thường phức tạp và tốn kém

‘- Một số kỹ thuật sắc ký như trao đổi ion, lọc gel, sắc ký ái lực và tương tác kỵ nước được sử dụng riêng rẽ và kết hợp để đạt được mức độ tinh khiết mong muốn Các phương pháp, bao gồm sắc ký lỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phép độ tinh sạch cao nhưng có thể xử lý ở khối lượng thấp Do đó, các cách thức tinh sạch tiên tiến như tạo bọt, hệ thống micellar đảo ngược, hệ thống hai pha nước (ATPS) và tuyển nổi hai pha nước đã được đưa ra để khắc phục những hạn chế của quá trình

(4) Hoàn thiện sản

phẩm:

‘- Nhiệm vụ cuối cùng này liên quan đến việc chuẩn bị sản phẩm tinh khiết ở dạng ổn định để vận chuyển dễ dàng và thuận tiện Các hoạt động đơn vị điển hình bao gồm kết tinh, sấy phun và sấy đông khô

‘- Phần dưới đây sẽ giới thiệu các giai đoạn và các công đoạn thực hiện trong quá trình tinh sạch sản phẩm lên men

2.1 Giai đoạn đầu của

quá trình tinh sạch:

2.1.1 Phá vỡ tế bào: Với nhu cầu thương mại ngày càng tăng của các sản phẩm nội bào, quy trình phá vỡ tế bào đang trở nên quan trọng Sự phá

vỡ tế bào tế bào cho phép giải phóng các sản phẩm mục tiêu được lưu trữ bên trong tế bào Một số lượng đáng kể các kỹ thuật phá vỡ tế bào đã được phát triển và nghiên cứu để thu được các sản phẩm sinh học với năng suất và độ tinh khiết tối ưu Trong mọi trường hợp, bất kỳ phương pháp phá vỡ nào phải đảm bảo rằng các sản phẩm mục tiêu không bền vững sẽ không

bị suy giảm hoặc biến tính trong quá trình thực hiện

Các kỹ thuật phá vỡ tế

bào:

- Chủ yếu cho các sản

phẩm sinh học

Kỹ thuật phá vỡ tế bào được phân loại thành các phương pháp cơ học, vật lý và hóa học:

‘- Các phương pháp cơ học đề cập đến các kỹ thuật sử dụng lực được tạo ra bởi các thiết bị hoặc vật thể cơ học;

‘- Các phương pháp vật lý dựa trên các sửa đổi cấu trúc trong thành tế bào và / hoặc màng mà không gây ra thay đổi hóa

học và không có ứng dụng năng lượng;

‘- Các phương pháp hóa học sử dụng thuốc thử hóa học hoặc enzyme để thay đổi tính thấm của màng tế bào hoặc để phân huỷ các thành phần của thành tế bào

Hình 9.2 trình bày các kỹ thuật phá vỡ tế bào dựa trên ba loại này Các tế bào có thể bị ly giải cơ học bởi các lực cắt và lực cắt cơ học bên ngoài hoặc bị phá vỡ thông qua xử lý hóa học làm hòa tan các thành phần cấu trúc của thành tế bào và / hoặc màng Lý tưởng là sử dụng duy nhất một phương pháp ly giải, đôi khi hai hoặc nhiều phương pháp được thực hiện liên hợp để thu được kết quả mong muốn Ví dụ, sự kết hợp của các phương pháp vật lý, cơ học và hóa học có hiệu quả để phá

vỡ các tế bào có khả năng chống lại sự phá vỡ như nấm men, nấm mốc

Phương pháp cơ học: Phương pháp phá vỡ tế bào cơ học, dựa trên hoạt động nghiền, cắt, đập và nén, là một phương pháp truyền thống được lựa

chọn sử dụng cho sự phá vỡ tế bào và giải phóng sản phẩm nội bào Chúng không phá vỡ các tế bào chọn lọc và tạo ra một lượng đáng kể các mảnh vụn tế bào nhỏ và giải phóng đồng thời các thành phần nội bào với sản phẩm mục tiêu Nó thường yêu cầu sử dụng các thiết bị hoặc thiết bị cắt đắt tiền và cồng kềnh Ví dụ như máy phá vỡ, chày cầm tay hoặc động cơ, máy đồng hoá áp suất cao và máy nghiền hạt để tạo ra và tác động lực bên ngoài lên tế bào để xé rách tế bào Hình 6.4 là một bộ sưu tập minh họa của các thiết bị thường được sử dụng trong các quy trình phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học

(a)Cối chày sứ (b) Máy nghiền mô, tế bào Dounce, (c) Bơm áp lực French, (d) Khuấy với mài mòn, (e) Máy xay tế bào Waring, (f) Phương pháp rotor-stator,

(g) Máy siêu âm phá vỡ tế bào

Cối và chày Các tế bào bị phá vỡ bằng cách cắt

giữa hai bề mặt cứng (tinh thể băng trong màng nếu các tế bào được đông lạnh trong nitơ lỏng trước khi nghiền)

Không tốn kém, dễ sử dụng Lực ép thấp, khả năng nhiễm

bẩn cao

Máy nghiền mô Dounce

Nghiền mịn bằng cách đối ứng thủ công và xoay chày tròn vào ống thủy tinh

Không tốn kém, sạch sẽ, dễ sử dụng, hiệu quả cho tế bào mềm

Mong manh, không hiệu quả đối với mô rắn, phá lượng nhỏ

Bơm áp lực French Các tế bào bị phá vỡ khi chúng buộc

phải đi qua một lỗ hẹp dưới áp suất cao

Hiệu quả để tạo ra dịch lỏng đồng nhất

Đắt tiền, chi phí bảo trì cao do tắc nghẽn, khó làm sạch, phá lượng nhỏ

Máy khuấy hạt Sự nghiền nát các tế bào được gây ra

bởi sự va chạm với các hạt bị khuấy trộn trong huyền phù lỏng

Khả năng nhiễm chéo thấp Giới hạn cỡ mẫu, sinh nhiệt

quá mức

Máy xay tế bào Các tế bào được cắt nhỏ bằng lưỡi dao

sắc trong máy xay

Nhanh chóng, dễ sử dụng, xay lượng lớn

Mẫu tạo bọt, dịch lỏng đồng nhất thô

Động cơ đồng nhất cánh quạt

Tế bào bị phá vỡ bằng cách kéo huyền phù tế bào vào một trục dài chứa một rotor bên trong quay nhanh và một stator bên ngoài đứng yên

Nhanh chóng, hiệu quả cho mẫu đơn bào

Không phù hợp với đa mẫu, nhiễm chéo với việc sử dụng đầu dò, đắt tiền

Máy siêu âm tế bào Các tế bào bị vỡ do sóng âm thanh tần

số cao

Nhanh chóng, hiệu quả cho vách tế bào cứng

Làm nóng quá mức làm biến tính sản phẩm (ví dụ: protein)

Phương pháp vật lý: Số lượng phương pháp vật lý ly giải tế bào là hạn chế Các phương pháp này tương đối nhẹ nhàng vì chúng không yêu cầu

các thiết bị sử dụng nhiều năng lượng để tác động lực lên tế bào, cũng như không làm thay đổi thành phần thành tế bào Một

số phương pháp bao gồm: Phương pháp đông lạnh - rã đông, sốc thẩm thấu, giải nén

Đông lạnh và rã đông: Phương pháp này thường được sử dụng phổ biến để phá vỡ tế bào vi khuẩn và động vật có vú Kỹ thuật này liên quan tới

việc làm đông huyền phù vi khuẩn trong ethanol khô hay máy làm đông, sau đó rã động ở nhiệt độ phòng 37oC Nguyên lý của phương pháp là tế bào sẽ trương lên khi bị đông lạnh và vỡ ra khi các tinh thể đá được hình thành trong suốt chu trình đông và tan ra trong chu trình giải đông Cần phải lặp lại nhiều lần quá trình đông lạnh - rã đông để đạt hiệu quả phá vỡ tế bào cao Phương pháp này có ưu điểm là không gây biến tính protein cần thiết, không bổ sung bất kì loại hóa chất nào, tuy nhiên nhược điểm là hiệu quả phá vỡ tế bào không cao, mất nhiều thời gian Hơn nữa, kỹ thuật đóng băng sẽ kém hiệu quả hơn trong việc phá vỡ tế bào có thành tế bào cứng như tảo Một số nghiên cứu cho thấy, chu kỳ đóng băng và tan băng lặp

đi lặp lại là đủ để tạo điều kiện giải phóng các protein tái tổ hợp được biểu hiện khỏi môi trường tế bào của E Coli

Sốc thẩm thấu: Sốc thẩm thấu thường được sử dụng để giải phóng các sản phẩm khoang chu chất (periplasmic) tích tụ giữa màng tế bào và

thành tế bào Trong sốc thẩm thấu, các tế bào vi sinh vật trước tiên được ngâm và cân bằng trong môi trường có áp suất thẩm thấu cao (thường là dung dịch đệm sucrose được bổ sung ethylenediaminetetraacetate (EDTA)), sau đó chuyển nhanh

sang môi trường có độ thẩm thấu thấp (thông thường là nước) Quá trình chuyển đổi thẩm thấu dẫn đến việc nước xâm nhập nhanh vào tế bào, tích tụ áp suất trong tế bào và cuối cùng là vỡ tế bào EDTA, một tác nhân muối chaotropic, được thêm vào dung dịch sucrose đệm để tạo điều kiện giải phóng lipopolysaccharit từ vỏ tế bào vi khuẩn, làm tăng tính thấm của màng

tế bào bên ngoài để giải phóng thành phần periplasmic đích

Sốc thẩm thấu ít được ứng dụng trừ trường hợp thành tế bào bị suy yếu hoặc không có Đối với các tế bào có thành như tế bào thực vật, vi khuẩn, nấm men, không thể chỉ dùng dung dịch nhược trương để phá màng tế bào mà phải xử lý thêm bằng các enzyme phá thành tế bào như: lysosyme, celluloase, pectinase, hemicellulase để loại thành tế bào trước khi xử lý tiếp bằng phương pháp áp suất thẩm thấu Sau khi thành tế bào đã được loại ra, tiến hành ly tâm để thu phần cặn bên dưới, đó là những thành tế bào đã được loại ra và cả phần thành tế bào đã bị vỡ ra Có thể cho dung dịch nhược trương vào, hay là cho phần cặn này vào dung dịch nhược trương để phá màng thu dịch bên trong Để thu dịch nguyên chất không lẫn xác hay các mảnh vụn của tế bào hoặc nhân và một số bào quan không cần thiết, có thể ly tâm thu dịch và bỏ phần cặn bên dưới Dịch này bao gồm sản phẩm sinh học quan tâm và cả dung dịch nhược trương đã dùng để phá màng tế bào Do đó, để thu dịch dưới dạng cô đặc, có thể kết hợp phương pháp lọc để thu dịch dưới dạng cô đặc hơn

Ưu điểm của phương pháp này là thực hiện nhanh chóng, dễ làm, ít tốn chi phí, không cần tốn thời gian và công sức để loại

bỏ các tạp chất hóa học khác khi sử dụng các phương pháp hóa học khác, không cần dụng cụ hay máy móc phức tạp… Tuy nhiên, nhược điểm tồn tại là khi phá màng tế bào trực tiếp trong lên men, lượng dung dịch cần dùng rất lớn Do đó, khó có thể thu lại dịch tế bào với nồng độ cao, đậm đặc Áp dụng trên quy mô lớn bị hạn chế bởi chi phí hóa chất, nước và sản phẩm có thể bị pha loãng

Phương pháp này nhẹ nhàng và hiệu quả đối với các tế bào không có lớp vách hoặc peptidoglycan như tế bào động vật Kỹ thuật này đã được sử dụng để giải phóng các enzyme trong tế bào như kiềm phosphatase, cyclic phosphodiesterase và acid phosphatase từ E coli mà không làm suy yếu khả năng sống của tế bào hoặc gây bất hoạt enzyme

Phương pháp giải nén: Sự phá vỡ tế bào bằng cách giải nén từ một bình điều áp là một cách khác Sự phá vỡ tế bào ở quy mô phòng thí nghiệm

bằng cách giải nén đã được thực hiện cho E coli Trong kỹ thuật này, một lượng lớn nitơ không có oxy (hoặc carbon dioxide được sử dụng thay thế) được hòa tan trong các tế bào dưới áp suất cao trong bình áp lực Khi áp suất được giải phóng đột ngột, bọt nitơ thoát ra khỏi các tế bào trong các điểm đâm xuyên qua thành tế bào Sự xâm thực nitơ có thể được sử dụng cho các tế bào động vật có vú và vi khuẩn Tuy nhiên, phương pháp có ít hiệu quả hơn đối với nấm men, nấm sợi hoặc các loại tế bào khác có thành tế bào cứng

Phương pháp này có lợi thế hơn so với các kỹ thuật cơ học là không tạo ra nhiệt cục bộ, do sự xâm thực nitơ là kỹ thuật làm mát mẫu tế bào Kỹ thuật này phù hợp để tinh sạch sản phẩm nội bào không bền như protein và enzyme Lin và cs (1992)

đã cho rằng kỹ thuật giải nén sử dụng carbon dioxide có thể được sử dụng để phá vỡ các tế bào nấm men mà vẫn bảo tồn được tính chất chức năng của protein Ngoài ra, sử dụng nitơ trơ, pH của môi trường không thay đổi, do đó ngăn chặn quá trình oxy hóa hoặc biến đổi hóa học các thành phần của tế bào

Phương pháp hóa học: Thành tế bào của vi sinh vật có thể bị phá vỡ hoặc hòa tan bởi một loạt các tác nhân hóa học, chẳng hạn như kiềm, chất xúc

tác, dung môi và enzyme Trong nhiều trường hợp, các kỹ thuật hóa học được tích hợp với các phương pháp cơ học để quá

trình phá vỡ tế bào được tốt hơn Dung dịch đệm ly giải thường được thêm vào cùng với các tác nhân hóa học để cung cấp các điều kiện ly giải tế bào phù hợp, đồng thời, ngăn chặn sự xuống cấp của sản phẩm khi giải phóng khỏi tế bào Các phương pháp xử lý bao gồm: Xử lý bằng acid hoặc bazơ, hoạt chất, dung môi, enzyme

Xử lý bằng axit và

bazo:

Acid được sử dụng phổ biến để thủy phân các thành phần tế bào Tuy nhiên, hàm lượng acid quá nhiều có thể dẫn đến

những thay đổi về bản chất hóa học hoặc tính chất vật lý của các sản phẩm có trong tế bào

Quá trình phân cắt bằng chất kiềm liên quan đến quá trình hòa tan màng tế bào vi khuẩn thông qua quá trình xà phòng hóa bằng kiềm Chất kiềm được sử dụng phổ biến nhất là natri hoặc kali hydroxyde Chúng được hòa tan trong nước hoặc rượu như metanol, ethanol hoặc isopropanol để tạo thành dung dịch kiềm Sampathkumar và cs (2003) chứng minh rằng dung dịch trisodium phosphate có tính kiềm cao, dễ thẩm thấu và phá vỡ màng tế bào chất và màng ngoài của vi khuẩn Gram âm Đôi khi ở điều kiện pH cao, xử lý bằng chất kiềm (thường là trên pH 10) có thể không phù hợp với sản phẩm protein nội bào López-Abelairas và cs (2015) cho rằng, xử lý phân cắt tế bào bằng acid có hiệu quả hơn kiềm để chiết xuất chất nội bào 3-hydroxybutyrate từ Cupriavidus necator H16 về hiệu quả thu hồi và độ tinh khiết

Hoạt chất: Hoạt chất, còn được gọi là chất hoạt động bề mặt, là các phân tử lưỡng tính sở hữu một đầu hydrophilic phân cực và một

cái đuôi kỵ nước không phân cực Hoạt chất có thể tương tác với cả hợp chất ưa nước (ví dụ: nước) và kỵ nước (ví dụ: lipid) Khi chúng có mặt trên nồng độ nhất định trong nước (được gọi là nồng độ micelle quan trọng), chúng tập hợp lại để tạo thành các mixen bao gồm bên trong không phân cực được hình thành bởi đuôi hydrophobic và nhóm đầu cực cực hướng ra ngoài và tương tác với các phân tử nước Theo đặc tính ion của nhóm đầu cực, hoạt chất được phân loại là ion (anion hoặc cationic), không ion và zwitterionic Nhìn chung, hoạt chất không chứa ion và chất xúc tác zwitterionic (một đầu chất hoạt động bề mặt chứa hai nhóm tích điện ngược nhau) tác động nhẹ hơn, dẫn đến sự biến tính protein ít khi phân giải tế bào hơn các chất xúc tác ion, và được sử dụng để phá vỡ các tế bào khi nó cần để duy trì chức năng protein hoặc tương tác Một số hoạt chất sẽ làm phá hủy lipoprotein của màng tế bào vi khuẩn, dẫn đến việc giải phóng các thành phần nội bào Để phá vỡ tế bào vi khuẩn, hoạt chất có thể được sử dụng kết hợp với lysozyme Zwitterionic và các dòng Triton X (Triton X-100…) là các hoạt chất không chứa ion thường được sử dụng cho các mục đích này

Ngược lại, các hoạt chất ion như sodium lauryl sulphate hay còn gọi là sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium cholate (anion)

và cetyl trimethyl ammonium bromide (cation) là tác nhân hòa tan mạnh, có xu hướng biến tính protein, do đó phá hủy protein và chức năng hoạt động SDS là chất liên kết ion và biến tính protein, được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu đánh giá mức độ protein bằng điện di và Western Blot (kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi nhằm phát hiện các protein chuyên biệt trên các mẫu mô hay dịch chiết xuất mô)

Hoạt chất có thể gây ra một số biến tính protein và cần phải được loại bỏ trước khi các giai đoạn tinh chế tiếp theo Sự ổn định của sản phẩm mong muốn phải được xác định khi sử dụng bất kỳ hệ thống hoạt chất nào

Ngoài việc lựa chọn các hoạt chất, tác nhân quan trọng khác để tối ưu ly giải tế bào bao gồm các bộ đệm, pH, cường độ ion

và nhiệt độ Hoạt chất cần được loại bỏ khỏi sản phẩm, điều này liên quan đến việc khử lọc bổ sung, tinh sạch trong tiến trình Do đó việc sử dụng các hoạt chất được tránh nếu có thể

Việc sử dụng hoạt chất làm dung môi ly giải trong phá vỡ tế bào không phải là mới Các phân tử hoạt chất phá vỡ tế bào

bằng cách hòa tan các protein màng tế bào và phân chia thành màng đôi Hoạt chất ion là biến tính liên quan đến cấu trúc protein Chúng phá vỡ hoàn toàn màng tế bào bằng cách liên kết với cả màng kỵ nước và protein không màng

ưa nước, trong khi hoạt chất không ion cho phép phân tán các phần kỵ nước của protein màng vào môi trường nước Do

tính chất ít biến tính của chúng, các hoạt chất không ion được ưu tiên để có được sản phẩm ở dạng hoạt động và ổn định

Mặc dù hoạt chất mang lại những lợi ích có lợi như tính chọn lọc cao trong việc chiết xuất sản phẩm mục tiêu, việc sử dụng hoạt chất có thể gây trở ngại cho các bước tinh chế sản phẩm tiếp theo Do đó, điều quan trọng là phải loại bỏ tất cả các hoạt chất không tương thích trước khi tiến hành tinh chế Đối với những hoạt chất có micelle quá lớn phải được loại bỏ bằng cách

sử dụng siêu lọc Các phương pháp trao đổi gel hoặc trao đổi ion là những lựa chọn thay thế Ngoài ra, các phương pháp khác đã được đề xuất để loại bỏ hoạt chất cuối cùng, bao gồm hấp phụ hoạt chất vào môi trường kỵ nước như nhựa, than hoạt tính và hạt polystyrene; siêu lọc qua màng polyethersulfone kỵ nước; ethyl acetate, trichloroacetic acid và dung môi clo hóa; và kết tủa với polyethylene glycol

Dung môi: Việc sử dụng dung môi có thể được chọn lọc Một dung môi thích hợp có thể hoạt động để thay đổi tính thấm của màng tế

bào và sau đó chiết xuất được sản phẩm mục tiêu từ các ngăn của tế bào Sự phá vỡ tế bào sử dụng dung môi mang lại những lợi thế như tính chọn lọc cao trong việc thu hồi sản phẩm mục tiêu Bên cạnh đó, phương pháp này khả thi về mặt kinh tế khi xem xét tính sẵn có, phổ biến, chi phí thấp và khả năng tái chế của dung môi Tuy nhiên, việc sử dụng các dung môi hữu

cơ có thể hòa tan trong nước gặp một số hạn chế như nguy cơ an toàn cháy nổ do tính dễ cháy của các dung môi này Những hạn chế của việc sử dụng các dung môi hữu cơ cũng tương tự như với các hoạt chất, tức là sự cần thiết phải loại bỏ những

từ các sản phẩm và biến tính protein Tuy nhiên, dung môi hữu cơ được dễ dàng hơn để loại bỏ hơn so với hoạt chất Enzyme: Phương pháp ly giải tế bào bằng enzyme là một kỹ thuật phân huỷ các tế bào có nguồn gốc vi khuẩn Ly giải enzyme cho

phép phá huỷ các tế bào xảy ra trong điều kiện nhẹ theo cách chọn lọc Các enzyme như lysozyme, cellulose, protease, lysostaphin, zymolyase hoặc glycanase là những công cụ có giá trị để thu hồi các sản phẩm trong tế bào bằng cách phân giải thành tế bào vi sinh vật

Có một số enzyme thủy phân các liên kết cụ thể trong thành tế bào của một số vi sinh vật nhất định Các enzyme này bao gồm lysozyme, được sản xuất từ lòng trắng trứng gà và các nguồn tự nhiên khác như chiết xuất lysozyme từ bạch cầu, Streptomyces spp., Staphylococcus spp., Micromonospora spp., Penicillium spp., Trichoderma spp và ốc sên Lysozyme

thủy phân β-1-4 liên kết glucosidic trong chuỗi polysaccharid của peptidoglycan gây ra ly giải tế bào Ngoài ra, enzyme

cũng có thể được sử dụng như là một phương pháp tiền xử lý để thuỷ phân một phần thành tế bào trước khi phá vỡ tế bào bằng các phương pháp cơ học

Lysozyme, được biết đến với tên gọi khác là muramidase hay nacetylmuramide glycanhydrolase, là các glycoside hydrolase (EC 3.2.1.17) có khả năng phá hủy thành tế bào vi khuẩn thông qua việc xúc tác thủy phân liên kết 1,4-beta giữa N-acetylmuramic acid và dư lượng N-acetyl-D-glucosamine trong peptidoglycan (một loại polymer có khả năng kháng cơ học đối với tế bào) Sự thủy phân các liên kết này trong lớp peptidoglycan phá hủy thành tế bào vi khuẩn, tạo ra sự mất cân bằng

thẩm thấu, từ đó dẫn đến việc ly giải tế bào Lysozyme tồn tại trong một số chất tiết như nước mắt, nước bọt, sữa người và màng nhầy, trong các bào quan của bạch cầu trung tính nhân đa hình và trong lòng trắng trứng

Ngoài ra, zymolyase được sử dụng cho sự thoái hóa của thành tế bào của nấm men và nấm sợi

Mặc dù đây có lẽ là một trong những phương pháp đơn giản nhất hiện có, tuy nhiên, nó tương đối đắt tiền và sự hiện diện của enzyme có thể làm phức tạp thêm quá trình thanh lọc về sau

2.1.2 Thu hồi và

phẩm:

Nhiều bước trước tinh sạch được áp dụng để tách sản phẩm đích ra khỏi tạp chất sau khi tách tế bào (đối với sản phẩm ngoại

bào) và quá trình phân hủy (đối với sản phẩm nội bào) Những bước này thường đóng góp đáng kể vào tổng chi phí sản xuất Sơ đồ thu hồi sản phẩm thông thường thường bắt đầu bằng các bước tiền tinh chế như kết tủa amoni sunfat, chiết dung môi, chiết lỏng-lỏng, siêu lọc và tiếp theo là các kỹ thuật tinh chế dựa trên sắc ký và cuối cùng là các bước hoàn thiện như kết tinh, sấy phun và làm đông khô

Kết tủa amonium sufat: Cô đặc sản phẩm bằng kết tủa amonium sulfat là một trong những bước được sử dụng rộng rãi Protein mục tiêu và các đại

phân tử khác có các khả năng hòa tan khác nhau trong dung dịch amonium sulfat đậm đặc Ở lực liên kết ion của môi trường xung quanh, protein mục tiêu hoặc protein không quan tâm khác bị kết tủa ra khỏi dung dịch và do đó được tách ra khỏi nhau Sự khác biệt từ các nồng độ khác nhau của dung dịch amoni sulfat được sử dụng tạo ra khả năng kết tủa khác nhau, protein thu được người ta còn gọi là kết tủa phân đoạn protein

Phương pháp kết tủa amonium sunfat bằng cách tiến hành bổ sung amonium sunfat nghiền mịn theo tỷ lệ tăng dần ở 4oC, trong quá trình khuấy liên tục để tăng độ bão hòa phần trăm của dung dịch mẫu từ 0% đến 90% trong một vài bước của quy trình Kết tủa phân đoạn cho phép thu hồi mức độ tinh sạch sản phẩm mục tiêu khác nhau, bằng cách loại bỏ một số tạp chất

có các khả năng kết tủa ở các nồng độ muối ammonium sulfat khác ra khỏi sản phẩm mục tiêu Bên cạnh muối amonium sunfat, có thể thực hiện kết tủa bằng cách sử dụng dung môi hữu cơ như ethanol, acetone và polyme như dextran, polypropylen polypropylen (PPG) và polyethylen glycol (PEG))

Chiết chất lỏng – lỏng: Chiết chất lỏng - lỏng (liquid-liquid extraction - LLE) là một hoạt động của kỹ thuật hóa học truyền thống, trong đó việc

thiết kế và mở rộng quy mô các quy trình đã được thực hiện liên tục Không giống như sắc ký ái lực và kết tủa, LLE được biết đến là hoạt động liên tục trên quy mô lớn với sản lượng lớn, dễ vận hành và linh hoạt trong phương thức hoạt động LLE sử dụng pha hữu cơ/ dung dịch nước đã được thực hiện trong lĩnh vực hóa học Tuy nhiên, kỹ thuật này với tất cả các

ưu điểm của nó đã không được công nhận rộng rãi trong lĩnh vực công nghệ sinh học, chủ yếu là do độ hòa tan kém của protein trong dung môi hữu cơ và xu hướng dung môi hữu cơ làm biến tính protein

Trong những năm gần đây, LLE sử dụng các hệ thống hai pha nước (aqueous two phase sytems - ATPS) đã được công nhận

là một kỹ thuật ưu việt và linh hoạt cho quá trình tinh sạch của các phân tử sinh học Rất nhiều thông tin đã được báo cáo

về khía cạnh khác nhau của tách chiết hai pha nước (aqueous two phase extraction - ATPE) để phân lập và cô đặc protein, enzyme và các vật liệu sinh học khác Ưu điểm chính của ATPE bao gồm công suất cao, môi trường tương thích sinh học, sức căng giữa các mặt thấp, năng suất cao, thời gian xử lý ngắn, năng lượng thấp hơn và tính chọn lọc cao Hơn nữa, nó dễ dàng mở rộng quy mô, hoạt động liên tục và quan trọng nhất là cho phép dễ dàng điều chỉnh thiết bị và các phương pháp chiết pha nước thông thường được sử dụng trong ngành hóa chất

ATPS có thể dễ dàng được nhân rộng mà không có sự thay đổi đáng kể về bản chất hoặc hiệu quả của quy trình Ngoài ra,

do không có pha rắn, nên việc trộn kỹ hai pha là dễ dàng, do đó vận chuyển giữa các pha rất nhanh Chỉ cần vài giây để đưa hầu hết các hệ hai pha về trạng thái cân bằng Một lợi ích khác là các pha tương thích với hầu hết các protein đã biết Chúng

là một phương pháp thay thế hấp dẫn để tách và tinh chế protein trên quy mô lớn Câu hỏi về tính chọn lọc trong phân vùng protein vẫn cần được hiểu rõ hơn Kiến thức về tác động protein tăng lên trong hệ thống hai pha nước cũng sẽ dẫn đến khả năng dự đoán phân vùng protein đích, thường được tìm thấy trong hỗn hợp protein không đồng nhất và phức tạp

Nhiều hệ thống ATPE có sẵn như:

1 Polyme không ion/polymer không ion/nước, ví dụ: polyethylen glycol/dextran

2 Muối poly (polysalt) / polymer không ion / nước,ví dụ: natri carboxymethyl cellulose/polyethylen glycol

3 Muối poly/muối poly /nước, ví dụ: natri dextran sulfate/ natri carboxymethyl cellulose

4 Polyme/thành phần trọng lượng phân tử thấp/nước, ví dụ: rượu dextran/propyl

Xu hướng khi cho hai polyme khác nhau vào nước như gelatine và agar, gelatin và tinh bột hòa tan, sau đó tách thành hai pha riêng biệt trong một dung môi chung đã được công nhận từ cuối thế kỷ trước Nó đã được chứng minh là quy tắc chung cho hầu hết các hệ thống polymer-polymer hòa tan trong nước

Quá trình hình chiết

lỏng-lỏng trong hai pha

IL và muối và pha

polymer và IL:

Dung môi: Thông thường không cần thiết phải loại bỏ tất cả các thành phần ra khỏi dung môi vì dung môi sẽ được tái chế thông qua hệ

thống Trong một số quy trình khắt khe hơn, cần loại bỏ tất cả dung môi ra khỏi các sản phẩm vì giá trị của dung môi và các vấn đề có thể phát sinh do nhiễm tạp chất Hình thức thu hồi được thực hiện là chưng cất

Chưng cất có thể đạt được trong ba giai đoạn:

- Bốc hơi, loại bỏ dung môi dưới dạng hơi từ dung dịch;

- Tách hơi lỏng trong một cột, để tách thành phần sôi dễ bay hơi thấp hơn khỏi các thành phần ít bay hơi khác;

- Ngưng tụ hơi, để thu hồi phần dung môi dễ bay hơi hơn;

Mô hình của tháp

chưng cất theo dung

môi theo mẻ:

(a) và tháp chưng cất dung môi liên tục (b) có chứa các khay hoặc tấm đục lỗ

Sự bay hơi là loại bỏ dung môi khỏi dung dịch bằng cách sử dụng nhiệt Trong các thiết bị bay hơi có sẵn, một số được vận hành trên cơ sở theo mẻ và những loại khác là liên tục (hình 6.6) Hầu hết các thiết bị bay hơi công nghiệp sử dụng bề mặt sưởi ấm hình ống Sự lưu thông của chất lỏng qua các bề mặt gia nhiệt có thể được tạo ra bằng cách đun sôi hoặc khuấy trộn

cơ học Trong chưng cất hàng loạt, hơi từ nồi hơi đi lên cột và được ngưng tụ Một phần của nước ngưng sẽ được hồi lại bằng cách trào ngược cho tiếp xúc ngược dòng với hơi tăng trong cột Tỷ lệ ngưng tụ trở lại cột như hồi lưu để rút sản phẩm,

số lượng tấm hoặc giai đoạn trong cột là phương pháp chính để kiểm soát độ tinh khiết của sản phẩm Việc chưng cất liên tục ban đầu được bắt đầu theo cách tương tự như với việc chưng cất hàng loạt, nhưng ban đầu không có nước ngưng được rút

Tiếp xúc ngược dòng của dòng hơi và chất lỏng đạt được bằng cách tạo ra:

- Hơi bị phân tán trong pha lỏng (cột hoặc cột khay);

- Chất lỏng được phân tán trong pha hơi liên tục (cột cố định vật liệu)

Đầu vào nhiệt cho cột chưng cất có thể là đáng kể Các cách đơn giản nhất để bảo toàn nhiệt là làm nóng sơ bộ dịch ban đầu bằng bộ trao đổi nhiệt sử dụng nhiệt từ:

- Hơi nóng ở đầu cột;

- Nhiệt từ phần đáy khi nó được loại bỏ trong một quá trình liên tục;

- Kết hợp của cả hai bộ trao đổi nhiệt trên

đó được ngưng tụ Các thành phần hóa học khác nhau sẽ có ái lực khác nhau đối với màng và tốc độ thẩm thấu khác nhau

và do đó với sự chọn lọc chính xác của màng, sản phẩm mong muốn có thể được chuyển vào vào pha hơi Ví dụ, nếu màng kỵ nước trong tự nhiên, nó sẽ tập trung các phân tử kỵ nước

Các kỹ thuật khác để thu hồi các sản phẩm dễ bay hơi bao gồm chiết xuất flash trong lên men acetone-butanol và loại khí trong lên men acetone-butanol-ethanol

- Phân loại sắc ký dựa vào trạng thái vật lí của pha động thì có sắc ký khí và sắc ký lỏng;

- Phân loại theo bản chất của tương tác giữa chất tan với pha tĩnh, gồm các loại sắc ký hấp phụ, phân bổ, trao đổi ion, lọc gel, ái lực, …

- Phân loại sắc ký theo hình dạng pha tĩnh thì có sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng, sắc ký cột,…

- Phân loại theo độ phân cực của pha động và pha tĩnh Nếu quá trình phân tách dùng pha động có độ phân cực lớn hơn nhiều so với pha tĩnh thì có sắc ký pha đảo, nếu ngược lại thì có sắc ký pha thường

Trong tinh sạch các sản phẩm lên men, các phương pháp sắc ký được dùng phổ biến nhất là sắc kí lọc gel, sắc ký ion, và sắc ký ái lực

Sắc ký thường được sử dụng để đạt được mức độ tinh khiết của sinh phẩm Trao đổi ion, lọc gel và ái lực là ba trong số các kỹ thuật sắc ký được áp dụng nhiều nhất Sắc ký trao đổi ion, nguyên lý hoạt động là cực, trong khi đó sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực có nguyên lý hoạt động lần lượt là kích thước và bám đặc hiệu Kết hợp hai hoặc nhiều kỹ thuật sắc ký sử dụng các tương tác hóa lý khác nhau làm cơ sở phân tách có thể là một cách tiếp cận hiệu quả trong tinh sạch sản phẩm Ví

dụ, sơ đồ tách kết hợp các bước của sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion trong chuỗi có thể là một sự kết hợp phù hợp 2.2.1 Phương pháp

sắc ký trao đổi

ion:

Phương pháp sắc ký trao đổi ion thường được áp dụng để tinh chế hầu hết các loại sinh khối tích điện bề mặt như protein lớn, kháng thể, DNA plasmid và kháng nguyên lõi viêm gan B Nó được thực hiện dưới dạng sắc ký cột Các vật liệu cột bao gồm các nhóm tích điện được liên kết cộng hóa trị với bề mặt của vật liệu không hòa tan

Sắc ký trao đổi ion là phương pháp tách riêng các chất khác nhau dựa vào hiện tượng trao đổi thuận nghịch các ion pha động với ion của pha tĩnh (chất trao đổi ion hay còn gọi là ionit) Sắc ký trao đổi ion thường được dùng để tinh sạch các chất có hoạt tính sinh học Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein enzyme Hay nói cách khác phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các nhân trao đổi ion Có hai loại sắc ký trao đổi ion: trao đổi cation và trao đổi anion (hình 9.7) Sắc ký trao đổi cation được áp dụng khi chế phẩm sinh học đích được tích điện dương Tương tự như vậy, các chế phẩm sinh học tích điện âm (có điểm đẳng điện dưới pH 7.0) được xử lý bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion có chứa hạt hấp thụ với các nhóm tích điện dương Các loại trao đổi ion cation và anion khác nhau với các loại vật liệu khác nhau có sẵn trên thị trường để phù hợp với nhiều loại sản phẩm có tính chất bề mặt khác nhau

Nhựa trao đổi anion thông thường - cellulose DEAE (diethylaminoethyl) - được sử dụng theo cách như mô tả trước đây để tách các chất hòa tan mang điện tích âm Các nhóm chức khác cũng có thể được gắn vào khung xương nhựa để tạo liên kết chọn lọc tương tự như sắc ký ái lực Nhựa thích hợp cho mục đích cụ thể sẽ phụ thuộc vào yếu tố như kích thước hạt, kích thước lỗ rỗng, tốc độ khuếch tán, công suất nhựa, phạm vi của các nhóm phản ứng và tuổi thọ của nhựa trước khi thay thế 2.2.2 Sắc ký lọc gel: Đây là kỹ thuật dùng để phân tách các hợp phần khác nhau trong hỗn hợp, dựa trên sự di chuyển khác nhau trong pha

động của các chất hòa tan trong hỗn hợp Cơ sở phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của phân tử có trong hỗn hợp để tách chúng ra Cấu tạo của hệ thống sắc kí lọc gel gồm pha động là dung môi chứa hỗn hợp chất cần phân tách và pha tĩnh là cột chứa gel

Nguyên lý lọc gel hay kích thước lỗ: Khi dung môi chuyển động chảy qua cột, các phân tử protein có kích thước lớn không

thể đi vào bên trong lõi của hạt gel, chúng theo dung môi đi vào các khoảng trống giữa các hạt gel và đi ra khỏi cột trước Phân tử có kích thước vừa sẽ bị giữ lại một khoảng thời gian và đi ra chậm hơn Phân tử nhỏ sẽ khuyếch tán vào trong các hạt gel theo lỗ khoang trên bề mặt gel, cần thời gian nhiều nhất để đẩy ra ngoài sau đó mới đi vào thể tích dung môi

Ưu điểm của phương pháp sắc ký lọc gel đon giản và chi phí thấp, giúp phân tách tốt phân tử lớn và phân tử nhỏ Do dung dịch đệm và hạt gel không tương tác với sản phẩm nên kỹ thuật này thường kết hợp với kỹ thuật khác có thêm các phần tử riêng biệt mang các đặc tính khác như độ acid, độ bazơ, sự tích điện và ái lực cho các hợp chất nhất định, do đó mẫu không bị mất đi

Nhược điểm của phương pháp là không áp dụng được cho lượng thể tích mẫu lớn, độ chính xác chưa cao, chỉ tách được sản phẩm có kích thước khác nhau còn sản phẩm có kích thước giống nhau thì phân tách chưa được

vì áp lực cao cần thiết để đưa dung môi đi qua bộ ống phức hợp Những hiệu quả trong hiệu suất dẫn đến sự thay đổi tên

và mức độ sử dụng trong việc tách và tinh chế một loạt các loài chất tan, bao gồm cả các phân tử sinh học HPLC được phân biệt với sắc ký lỏng bằng cách sử dụng môi trường chọn lọc về tính chất vật lý của chúng cho pha rắn (tĩnh) mà qua

đó pha động (chất lỏng) di chuyển qua Thông thường HPLC được sử dụng để phân tích Nó chỉ có khả năng tinh sạch lượng nhỏ sản phẩm Do vậy không phù hợp để tinh sạch quy mô lớn

Pha tĩnh phải có diện tích bề mặt / đơn vị cao, thậm chí kích thước, hình dạng, khả năng chống lại tổn thất cơ học và hóa học Tuy nhiên, điều này dẫn đến yêu cầu và chi phí cao Do đó, trong quá trình chuẩn bị trước HPLC, một số độ phân giải thường được bị mất đi do việc sử dụng các hạt pha tĩnh lớn hơn để giảm chi phí vận hành và vốn Đối với các sản phẩm có giá trị rất cao, các cột HPLC quy mô lớn chứa phương tiện phân tích được sử dụng

Sắc ký lỏng protein nhanh (FPLC) là một biến thể của HPLC phù hợp hơn với các quy trình tinh sạch quy mô lớn và sắc

ký ngược pha sẽ được giới thiệu dưới đây

ở đệm A nhưng bị phân ly trong quá trình rửa giải đệm và trở về dung dịch trong đệm B Một hỗn hợp chứa một hoặc nhiều protein quan tâm được hòa tan trong dung dịch đệm A 100% và được bơm vào cột Các protein quan tâm liên kết với nhựa trong khi các thành phần khác được thực hiện trong bộ đệm Tổng tốc độ dòng chảy của bộ đệm được giữ không đổi; tuy nhiên, tỷ lệ của bộ đệm B (bộ đệm "rửa giải" tăng dần từ 0% đến 100% theo sự thay đổi được lập trình về nồng độ ("độ dốc") Dịch chảy qua cột sẽ đi qua hai máy dò đo nồng độ muối (theo độ dẫn) và nồng độ protein (bằng cách hấp thụ tia cực tím ở bước sóng 280nm) Khi mỗi protein được rửa giải, sẽ xuất hiện "đỉnh" nồng độ protein Ở khoảng thời gian xuất hiện đỉnh protein sẽ được thu hồi

Sắc ký ngược pha: Sắc ký ngược pha là loại HPLC có khả năng tăng thời gian lưu khi so sánh với sắc ký pha thông thường Về cơ bản, sự

tăng thời gian lưu này đạt được bằng cách làm cho pha tĩnh không phân cực Để làm điều đó, bề mặt của pha tĩnh silica được sửa đổi thành RMe2SiCl, trong đó R là một nhóm alkyl mạch thẳng như C18H37 hoặc C8H17 Tuy nhiên, do tính chất không phân cực của pha tĩnh, các chất phân tích cực ít hơn trong hỗn hợp mẫu xu hướng có thời gian lưu cao hơn so với sắc ký pha thông thường

Có thể tăng thời gian lưu bằng cách thêm nhiều nước hơn vào pha động, do đó, làm tăng tương tác kỵ nước giữa các chất phân tích không phân cực và pha tĩnh Ngoài ra, pha động của sắc ký pha ngược là cực, rửa trôi các chất phân tích cực trong hỗn hợp mẫu Điều này tạo điều kiện phân tách các chất phân tích không phân cực trong hỗn hợp mẫu Sức căng bề mặt của pha động, độ pH của nó, cũng có ảnh hưởng đến thời gian lưu

Mô hình giải hấp phụ của sắc ký ngược pha ở pha động là nước pH yếu (A) và pha động là dung môi và pH mạnh (B) Khi pha tĩnh có phân cực lớn hơn pha động, nó được gọi là sắc ký pha thông thường Khi ngược lại, nó được gọi là sắc ký pha đảo ngược RPC sử dụng pha rắn như silica được biến đổi để thay thế các nhóm ưa nước bằng chuỗi alkyl kỵ nước Điều này cho phép tách protein theo tính kỵ nước của chúng Các quá trình kỵ nước nhiều liên kết mạnh nhất với pha tĩnh và do

đó được rửa giải muộn hơn so với các protein ít kỵ nước Các nhóm alkyl thường có chiều dài tám hoặc mười tám carbon (C8 và C18) RPC cũng có thể được kết hợp với các kỹ thuật ái lực trong việc tách như protein và peptide

Sắc ký ái lực: Sắc ký ái lực là phương pháp tách các hỗn hợp hóa sinh và dựa trên sự tuơng tác sinh học cụ thể như là giữa kháng nguyên

và kháng thể, enzyme và cơ chất, hoặc receptor và ligand Sắc ký ái lực kết hợp khả năng phân loại kích thước của sắc ký lọc gel với khả năng tạo sắc ký có liên kết nghịch với một tập hợp phân tử Phương pháp sắc ký ái lực có ưu điểm là tính chọn lọc rất cao, có thể dùng để tách phân tử đặc hiệu với số lượng nhỏ trong một hỗn hợp các chất sinh học Sắc ký ái lực thường dùng để tinh sạch một loại enzyme nhất định hoặc tinh chế các protein tái tổ hợp

Cơ cở của phương pháp sắc kí ái lực là quá trình tách dựa vào ái lực khác nhau của các cấu tử lỏng đối với chất hấp phụ rắn, nhờ đó mà các chất được tách riêng theo tuần tự chất có khả năng hấp phụ yếu thì ra trước, chất có khả năng hấp phụ mạnh thì ra sau Trong đó lực hấp phụ bao gồm:

- Lực Van der Waals, là lực tương tác giữa các phân tử;

- Lực tĩnh điện là lực hình thành khí trong phân tử có sẵn điện trường;

- Lực liên kết hóa học, là khi giữa chất hấp phụ và chất bị hấp phụ hình thành lực liên kết hóa học;

- Lực liên kết hydro là khi chất hấp phụ là chất phân cực hấp phụ các chất có nhóm proton

Cấu tạo của hệ thống sắc kí ái lực gồm pha động, là dung dịch chứa chất cần tinh sạch và pha tĩnh là hệ thống ma trận gel, được gắn với các ligand hoạt động đặc hiệu như NHS-, EAH, ECD… bằng liên kết cộng hóa trị Các gel trong pha tĩnh hiện nay thường dùng là sepharose, superpose …

Tinh chế sản phẩm bằng sắc ký ái lực chủ yếu dựa trên sự ràng buộc đặc biệt cao của sản phẩm mong muốn trên phối tử cố định gắn với ma trận trơ (tức là pha tĩnh) trong một cột Hai bên có thể là thụ thể và phối tử, kháng nguyên và kháng thể, hoặc enzyme và cơ chất Chúng kết hợp với nhau thông qua một hoặc nhiều tương tác như tương tác ion, tương tác kỵ nước, liên kết hydro, lực Van der Waals và cầu nối disulfide Sản phẩm mục tiêu được di chuyển qua một lớp ma trận polyme hoặc gel trong đó xảy ra tương tác cụ thể và sản phẩm mục tiêu được liên kết hóa trị với ma trận Mặt khác, các protein khác không có ái lực với ma trận đi qua cột nhanh chóng, sau đó được tách ra Tương tự như sắc ký trao đổi ion, sản phẩm mục tiêu đạt được bằng cách thay đổi nồng độ muối và pH trong bước rửa giải

Có nhiều nhóm phối tử chọn lọc trên vật liệu đính cườm và xốp để liên kết các hợp chất cụ thể Ví dụ, nhựa Sepharose với Concanavalin A cố định có hiệu quả trong việc thu giữ các phân tử sinh học glycosyl hóa bao gồm glycoproxin và glycolipids Do đó, nhựa ConA-Sepharose có thể hữu ích cho việc tinh chế glycopeptide và lipase có bản chất là glycoprotein

ConA-3 KỸ THUẬT HOÀN THIỆN SẢN PHẨM

Giới thiệu chung: Hoàn thiện sản phẩm là các bước quy trình ở giai đoạn cuối để chuẩn bị sản phẩm ở dạng ổn định và thuận tiện cho việc vận

chuyển và lưu trữ Quy trình phổ biến là kết tinh, sấy phun và sấy khô Bảng 9.7 mô tả các quy trình, chất lượng sản phẩm thu được và các hạn chế của kỹ thuật này

Kết tinh Sản phẩm được kết tủa từ dung dịch bão

hòa

Thấp Sử dụng dung môi hoặc muối để thúc đẩy

quá trình kết tinh

Độ nhạy cao của sản phẩm với nhiệt độ, pH

và độ ion của môi trường xung quanh Bản chất dễ vỡ của tinh thể protein do bề mặt protein hình dạng không đều

Bước lọc là cần thiết để tách tinh thể sản phẩm khỏi các tạp chất hòa tan trong dung dịch lỏng

Sấy phun Dịch có nồng độ sản phẩm cao được làm khô

nhanh bằng khí nóng để tạo thành bột khô

VD: trà hòa tan, bột

Thấp-Cao Nhiệt làm biến tính sản phẩm

VD: Caramel hóa tạo nâu

Đông khô Sản phẩm được đông lạnh bằng áp suất và

đá được hình thành được loại bỏ bằng quá trình thăng hoa

Cao Giai đoạn sấy khô được yêu cầu

Sản phẩm đông khô có thể được bù nước nhanh chóng

Chi phí vận hành cao

3.1 Kết tinh: Kết tinh là sự hình thành các hạt rắn trong một pha đồng nhất Nó dựa trên nguyên tắc hòa tan của sản phẩm, liên quan đến

sự thay đổi pha mà chất tan từ dung dịch lỏng được kết tủa thành tinh thể rắn nguyên chất trong dung dịch siêu bão hòa Các tạp chất vẫn hòa tan trong dung dịch lỏng và có thể được loại bỏ bằng bước lọc Kết tinh cung cấp kỹ thuật để có được sản phẩm nguyên chất ở dạng thích hợp để đóng gói và lưu trữ

Kết tinh là phương pháp được thiết lập sử dụng trong việc thu hồi các acid hữu cơ và amino acid, được sử dụng rộng rãi để tinh chế sản phẩm cuối cùng là một loạt các hợp chất

Kết tinh bao gồm hai giai đoạn: hình thành hạt nhân và sự phát triển của tinh thể Để quá trình kết tinh xảy ra, dung dịch phải được bão hòa trước, do đó dung dịch phải chứa nhiều chất hòa tan hơn trong điều kiện bình thường Một số phương

pháp có thể được sử dụng để thu được quá trình siêu bão hòa như bay hơi dung môi, làm mát, phản ứng hóa học và bổ sung dung môi thứ hai để giảm độ hòa tan của chất tan, phân lớp dung môi và thăng hoa cùng với các phương pháp khác Bước đầu tiên của quá trình kết tinh là sự hình thành mầm trong đó các tinh thể được hình thành khi các hạt tập hợp thành cụm Các cụm trở thành hạt nhân ổn định sau khi đạt được kích thước cụm quan trọng Có hai sự hình thành mầm khác nhau: sơ cấp và thứ cấp Hạt nhân sơ cấp là tự phát và đồng nhất trong trường hợp không có các hạt lạ Do đó, với sự có mặt của các hạt ngoại lai, sự hình thành hạt nhân không đồng nhất và sau đó sự hình thành được tạo ra bởi các hạt lạ và xảy ra nồng độ siêu bão hòa thấp hơn so với tạo mầm nguyên sinh đồng nhất Sự tạo mầm thứ cấp xuất hiện khi các tinh thể tồn tại trong dung dịch và nó được gây ra bởi sự va chạm của tinh thể Kiểu hình thành mầm này là cơ chế điển hình trong quá trình kết tinh công nghiệp do nồng độ siêu bão hòa thấp

Bước tiếp theo của quá trình kết tinh là tăng trưởng tinh thể trong đó kích thước hạt nhân tăng sau khi đạt được kích thước cụm tới hạn Tăng trưởng tinh thể là tăng kích thước riêng của nó trong các lớp mỏng Tốc độ tăng trưởng tinh thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố vật lý khác nhau, chẳng hạn như sức căng bề mặt của dung dịch, áp suất, nhiệt độ, tốc độ tinh thể tương đối trong dung dịch, số Reynold và các yếu tố khác

Công nghiệp hóa chất sản xuất 70% tất cả các vật liệu rắn bằng cách kết tinh và kết tủa Việc sử dụng rộng rãi là do nhiệt

độ tác động và tiêu thụ năng lượng trong hoạt động khá thấp Ngoài ra mức độ tinh khiết cao có thể đạt được với một bước duy nhất Kết tinh cũng là một giai đoạn quan trọng chỉ định chất lượng sản phẩm là độ tinh khiết và tính năng xử lý như làm ướt hoặc đóng bánh Quá trình kết tinh thường áp dụng là làm lạnh và kết tinh bay hơi mặc dù các phương pháp khác cũng tồn tại Trong tinh thể kết tinh, làm mát được hình thành bằng cách làm mát dung dịch Trong quá trình kết tinh bay hơi, dung môi được loại bỏ bằng cách bay hơi để tạo thành tinh thể và do đó đòi hỏi nhiều năng lượng hơn so với quá trình kết tinh làm mát Trong quy mô công nghiệp, các lò phản ứng kết tinh có thể là lò phản ứng mẻ hoặc liên tục

Kết tinh là phương pháp xử lý hạ nguồn điển hình cho các sản phẩm chất lượng cao với yêu cầu độ tinh khiết cao Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong sản xuất acid hữu cơ Một trong những acid hữu cơ phổ biến nhất là citric acid, được

sử dụng trong công nghiệp dược phẩm, thực phẩm và đồ uống

Cách thực hiện để kết tinh acid citric: sau khi lên men, nước dùng được lọc và kết tủa bằng Ca(OH)2 ở pH 7,2 và nhiệt độ 70-90°C Tinh thể canxi citrat được hình thành trong phản ứng Sau khi lọc, canxi citrat được phản ứng với sulfuric acid để kết tủa canxi dưới dạng canxi sunfat Citric acid khan được giải phóng (khi phản ứng xảy ra trên 40°C), và sau đó được làm trắng bằng than hoạt tính và kết tinh bằng cách bay hơi Sản phẩm thu được có độ tinh khiết rất cao do kết tinh và do đó phù hợp cho thực phẩm hoặc dược phẩm

Kết tinh cũng được sử dụng trong việc thu hồi amino acid Samejima (1972) đã thực hiện phương pháp này cho kết tinh glutamic acid, lysine và các amino acid khác Sự thu hồi của cephalosporin C dưới dạng muối natri hoặc kali của nó bằng cách kết tinh đã được mô tả bởi Wildfeuer (1985) Trong các sản phẩm phụ lên men 1,3-propanediol (natri succinate và natri sulfat) của quá trình lên men cần phải được loại bỏ trước khi thu hồi 1,3-propanediol

3.2 Sấy: Sấy liên quan đến việc loại bỏ độ ẩm và các hợp chất dễ bay hơi khỏi sản phẩm, nhằm cải thiện tuổi thọ bảo quản của sản

phẩm và để dễ xử lý Sấy phun sử dụng dòng khí nóng để cung cấp nhiệt bằng cách đối lưu để làm bay hơi độ ẩm (độ ẩm tự

do, độ ẩm hút ẩm hoặc kết hợp cả hai) từ dung dịch lỏng Không khí thường được sử dụng làm dòng khí nóng Khí nitơ được sử dụng thay thế cho các sản phẩm nhạy cảm với oxy như dược phẩm

Việc sấy khô bất kỳ sản phẩm nào (bao gồm cả sản phẩm sinh học) thường là giai đoạn cuối cùng của quy trình sản xuất

Nó liên quan đến việc loại bỏ nước cuối cùng hoặc các dung môi khác khỏi sản phẩm, đồng thời đảm bảo rằng có sự hao hụt là tối thiểu về khả năng tồn tại, hoạt động hoặc giá trị dinh dưỡng Mục tiêu của sấy khô bao gồm:

- Chi phí vận chuyển giảm

- Các vật liệu dễ dàng hơn để xử lý và đóng gói

- Vật liệu dễ bảo quan hơn ở trạng thái khô

Sấy được trình bày bao gồm sấy phun, sấy đông khô, sấy tầng sôi

Sấy phun: Sấy phun là kỹ thuật dựa trên sự biến đổi của chất lỏng thành bột khô bằng cách phun trong dòng khí khô nóng thường là

không khí Quá trình sấy phun bao gồm bốn bước cơ bản:

- Phun tơi dịch lỏng,

- Sấy phun thành khí

- Hình thành các hạt khô

- Tách và thu sản phẩm khô từ khí khô

Hình 9.10 cho thấy sơ đồ của quy trình sấy phun thông thường Đầu tiên, chất lỏng được đưa vào buồng sấy bằng bơm nhu động thông qua một bộ phun hoặc vòi phun có thể là một bộ phun quay, vòi áp lực hoặc vòi phun hai chất lỏng và quá trình phun xảy ra bằng cách ly tâm, áp suất hoặc động năng, tương ứng Các giọt nhỏ được tạo ra (thang đo micromet) bị bay hơi nhanh dẫn đến sự hình thành các hạt khô được tách ra khỏi khí khô bằng bộ thổi lốc xoáy hoặc túi lọc đặt trong bộ thu thủy tinh nằm trong đáy thiết bị Dịch lỏng trong sấy phun có thể là dung dịch, huyền phù, nhũ tương, bùn, bột nhão hoặc tan chảy Các sản phẩm rắn thu được sau quá trình có ưu điểm là ổn định hóa học và vật lý cao hơn so với các công thức dạng lỏng Ngoài ra, chúng có thể được sử dụng làm tiền chất để sản xuất các dạng bào chế phù hợp khác như viên nang hoặc viên nén

Hình 6.10 Mô hình sấy sản phẩm

Các cấu hình hoạt động trong sấy phun có thể là vòng hở hoặc vòng kín Cái trước sử dụng không khí làm khí khô không được lưu thông lại, trong khi khí sau là khí trơ (ví dụ nitơ) có cấu hình vòng hở thường được ưa thích trong hầu hết các

trường hợp vì nó hiệu quả và ổn định hơn Tuy nhiên, chế độ vòng kín được sử dụng để ngăn chặn sự pha trộn của khí nổ

và để thao tác các chất nhạy cảm với oxy

Liên quan đến hướng của dòng khí sấy đối với hướng của phun chất lỏng, tồn tại hai khả năng, dòng đồng dòng (cùng hướng) và dòng ngược dòng (ngược chiều) (hình 9.11) Trong trường hợp đầu tiên, sản phẩm cuối cùng tiếp xúc với không khí mát nhất, do đó tốt hơn là sấy khô các vật liệu nhạy cảm với nhiệt (hình 9.11a) Trong trường hợp thứ hai, sản phẩm khô tiếp xúc với không khí nóng nhất và do đó nó không thể được sử dụng với các vật liệu nhạy cảm với nhiệt độ nhưng được mong muốn về hiệu suất nhiệt cao hơn (hình 9.11b) Ngoài ra, có các cấu hình trung gian với dòng chảy hỗn hợp giữa dòng đồng thời và dòng ngược

Hình 6.11 Sơ đồ của dòng chảy đồng dòng (A) và dòng chảy ngược dòng (B)

Các dòng liền thể hiện cho phun tơi dịch lỏng và các đường đứt nét đại diện cho khí khô

Sấy phun được sử dụng rộng rãi để sấy khô các vật liệu sinh học khi nguyên liệu ban đầu ở dạng lỏng hoặc bột nhão Vật liệu được sấy khô không tiếp xúc với các bề mặt gia nhiệt, thay vào đó, nó được phun thành các giọt nhỏ thông qua vòi phun hoặc tiếp xúc với đĩa quay Các giọt này sau đó rơi vào một luồng khí nóng xoắn ốc ở nhiệt 150-250°C Diện tích tiếp xúc bề mặt lớn/ tỷ lệ thể tích của các giọt dẫn đến tốc độ bay hơi nhanh và quá trình sấy sẽ được hoàn thành trong vài giây, với tốc độ sấy và kích thước sản phẩm liên quan trực tiếp đến kích thước giọt được sản xuất bởi phương pháp sấy phun Hiệu ứng làm mát khi bay hơi ngăn chặn vật liệu quá nóng và hư hỏng Tốc độ dòng khí phải được điều tiết cẩn thận

để khí có khả năng chứa độ ẩm cần thiết ở nhiệt độ khí thải không khí mát (75-100°C) Trong hầu hết các quy trình, việc thu hồi các hạt rất nhỏ từ khí thoát ra phải được tiến hành bằng cách sử dụng bộ lọc Điều này đặc biệt quan trọng để thu các hợp chất hoạt tính sinh học Máy sấy phun tia đặc biệt phù hợp để xử lý các vật liệu nhạy cảm với nhiệt Hoạt động ở nhiệt độ khoảng 350°C, thời gian lưu trú là khoảng 0,01 giây do các giọt rất mịn được tạo ra trong vòi phun

Các biến ảnh hưởng đến đặc tính của sản phẩm và có thể điều chỉnh là tham số quá trình, thuộc tính của dịch lỏng và thiết

kế thiết bị Ví dụ, tốc độ dòng chảy cao của dịch lỏng, đường kính vòi phun lớn và nồng độ công thức cao có lợi cho sự hình thành các hạt lớn hơn Ngược lại, sức căng bề mặt thấp, áp suất phun cao và đường kính vòi phun nhỏ làm cho các hạt nhỏ hơn Về hình thái của các hạt, tốc độ bay hơi dung môi nhanh hơn (điểm sôi thấp hơn) thường dẫn đến các hạt xốp hơn do thời gian ngắn hơn cho các giọt co lại Cuối cùng, nhiệt độ cửa thoát khí phụ thuộc vào các biến quá trình khác Máy sấy phun cho hiệu quả kinh tế cao khi xử lý với khối lượng lớn Do nhiệt độ cao của sấy phun, sản phẩm dễ bị suy thoái do nhiệt nên đối với những sản phẩm nhạy cảm, cần tìm giải pháp thay thế

Sấy đông khô: Sấy đông khô là phương pháp sấy được ứng dụng trong sản xuất nhiều sinh phẩm và dược phẩm Các vật liệu đầu tiên được

đông lạnh và sau đó sấy khô bằng cách thăng hoa trong chân không cao, sau đó sấy khô thứ cấp để loại bỏ ẩm Nó phù hợp cho việc sấy khô protein và thuốc nhạy cảm với nhiệt Khi đông khô, nước được loại bỏ dưới dạng hơi bằng cách thăng hoa

từ sản phẩm đông lạnh trong buồng chân không Đông khô tạo ra sản phẩm chất lượng cao nhờ việc bảo tồn cấu trúc tự nhiên và đặc tính của các hoạt chất

Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật này là nó không gây hại cho các vật liệu nhạy cảm với nhiệt

Hạn chế là thường tốn nhiều năng lượng hơn các hình thức sấy khác

Sấy tầng sôi: Sấy tầng sôi là phương pháp sấy được sử dụng ngày càng nhiều trong ngành dược phẩm Không khí nóng được đưa vào

buồng chứa chất rắn, trong đó vật liệu ướt liên tục được thêm vào và vật liệu khô liên tục được lấy ra Nhiệt độ rất cao và tốc độ truyền khối đạt được cho sự bốc hơi nhanh chóng và cho phép toàn bộ nguyên liệu được duy trì trong điều kiện khô ráo

CHƯƠNG 7: LÊN MEN ĐỒ UỐNG CÓ CỒN

NỘI DUNG

1 Công nghệ sản xuất Malt và Bia

2 Công nghệ sản xuất cồn Etylic

3 Công nghệ sản xuất rượu vang

1 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT MALT VÀ BIA

1 Công nghệ sản xuât MALT: (Quy trình sx Malt và chỉ tiêu chất lượng)

1.1 Quy trình sản

xuất malt:

1.2 Chỉ tiêu chất

lượng malt đại

mạch:

2 Công nghệ sản xuất Bia:

2.1 Định nghĩa: Bia là loại nước uống có mùi thơm và vị đắng dễ chịu của hoa hublon, chứa nhiều CO2 và bột và có nồng độ rượu etylic thấp

(trên dưới 5%)

2.2 Phân loại: - Dựa vào màu sắc: bia vàng, bia đen

- Dựa vào công nghệ: bia tươi, bia hơi, bia chai, bia lon

2.3 Nguyên liệu: ‘- Malt đại mạch

‘- Hoa houblon

‘- Nước

‘- Nguyên liệu thay thế: gạo, ngô

‘- Nấm men: