NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH LUẬN VĂN THẠC SĨ

Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ tự do Cố định nitrogen – đó là khả năng đồng hóa nitơ phân tử của một số vi sinh vật và dùng nitrogen này để cấu tạo lên tất cả các hợp chất chứa nitr

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

Ngô Thị Hà

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2013

Ngô Thị Hà

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS TĂNG THỊ CHÍNH

Thái Nguyên - 2013

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/

1

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nông nghiệp Sản xuất nông nghiệp là lĩnh vực

sản xuất quan trọng nhất đối với sự phát triển của Việt Nam Trong đó trồng

trọt giữ vai trò quan trọng nhất và một trong số những yếu tố gắn liền với trồng trọt là phân bón nhằm nâng cao năng suất cây trồng cho mùa màng bội thu Theo thống kê của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, mỗi năm Việt Nam sử dụng 2 triệu tấn phân urê, khoảng 600 nghìn tấn phân DAP và một lượng tương đương các loại phân khác [18] Tuy nhiên theo đánh giá của Viện Dinh dưỡng Quốc tế, phân bón chỉ đóng góp khoảng 30 – 35% tổng trọng lượng cây trồng [19] Do đó, nếu sử dụng phân bón hóa học không hợp

lý sẽ gây ô nhiễm môi trường Bên cạnh đó, các sản phẩm phân bón vi sinh cũng có những ưu điểm như: thân thiện với môi trường, giúp cân bằng sinh thái, không nguy hại đối với sức khỏe con người Để hướng tới một nền nông nghiệp xanh thân thiện môi trường thì phân bón vi sinh là lựa chọn hàng đầu Nhưng việc áp dụng các sản phẩm phân bón vi sinh vào nông nghiệp vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn: hiệu quả không tức thì, quy mô sản xuất vẫn chưa đủ đáp ứng, chất lượng sản phẩm chưa ổn định Vì vậy, nghiên cứu để hoàn thiện

và nâng cao chất lượng phân bón vi sinh là việc làm hết sức cần thiết Trong

đó, việc tuyển chọn đánh giá hoạt tính của các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm phân bón vi sinh

Để góp phần phát triển nền nông nghiệp trong nước đồng thời bảo vệ môi trường và hướng tới nghiên cứu loại phân bón cố định đạm tự nhiên, thân thiện với môi trường, giá thành phải chăng chúng tôi tiến hành thực hiện luận

văn tốt nghiệp với tên đề tài: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

lên sinh trưởng của vi khuẩn cố định nitơ tự do phục vụ cho sản xuất chế phẩm vi sinh”

Nội dung nghiên cứu:

- Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định nitơ từ bộ giống của phòng

Vi sinh vật môi trường

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng (nguồn cacbon, nồng độ

cố định nitơ của chủng vi khuẩn cố định nitơ tuyển chọn

- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, độ cấp khí lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính cố định nitơ của chủng vi khuẩn cố định nitơ tuyển chọn

- Tiến hành thử nghiệm trên cây trồng trong phòng thí nghiệm

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:

- Ý nghĩa khoa học:

+ Giúp học viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học

+ Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý và phân tích số liệu, cách trình bày một bài báo cáo khoa học

- Ý nghĩa thực tiễn:

+ Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn cố định nitơ có hoạt tính cố định nitơ cao để sản xuất phân hữu cơ vi sinh

+ Từ các kết quả ban đầu của đề tài sẽ tạo tiền đề cho các nghiên cứu khoa học tiếp theo

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/

3

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ tự do

Cố định nitrogen – đó là khả năng đồng hóa nitơ phân tử của một số vi sinh vật và dùng nitrogen này để cấu tạo lên tất cả các hợp chất chứa nitrogen của tế bào Khả năng này có ở nhiều vi sinh vật sống tự do trong đất và trong

nước: các loài thuộc giống Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus,

Aerobacter, vi khuẩn dinh dưỡng quang năng, vi khuẩn sinh metan, vi khuẩn

khử sulfat, một số Mycobabacterium, Proactinomyces, Actinomyces và nấm,

tảo lam (vi khuẩn lam – ND) v.v Ngoài ra khả năng cố định nitơ còn cả ở vi khuẩn nốt sần (giống Rhizobium) sống cộng sinh trong rễ cây họ đậu có ý nghĩa quan trọng nhất đối với việc làm giàu nitơ cho đất Ngoài vi khuẩn nốt

sần thì các loài trong giống Azotobacter và Clostridium cũng có khả năng cố

định nitơ tự do.[2][3]

1.1.1 Vi khuẩn cố định nitơ hiếu khí (Azotobacter)

Các loài Azotobacter thuộc loài vi sinh vật cố định nitơ hoạt động nhất Trong số các loài Azotobacter đã được miêu tả thì các loài được nghiên cứu nhiều hơn cả là Az chroococcum, Az agilis và Az vinelandii Az

chroococcum là loài chủ yếu đối với đất đồng cỏ Trong ao hồ thường gặp Az agilis Các loài nói trên khác nhau ở đặc điểm sinh trưởng trên môi trường

đặc, ở kích thước, hình thái tế bào và một số đặc điểm sinh lý học Az

chroococcum tạo ra những khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc lan, lúc đầu không màu,

sau đó biến thành màu nâu tối, thậm trí đến đen nhưng không làm nhuộm màu

môi trường khuẩn lạc Đặc điểm của Az vinelandii và Az agilis có khuẩn lạc

trong, nhầy, sinh sắc tố huỳnh quang màu vàng – lục hoặc lam – lục, sắc tố khuếch tán vào môi trường [9][10], [12]

Khi còn non tế bào của Azotobacter có khả năng di động, hình que đầu

tròn, đứng riêng rẽ hay xếp thành từng đôi, đồng chất, tế bào chất nhuộm màu

đồng đều Chiều dài của tế bào thay đổi từ 2 – 3 μm đến 4 - 6μm Các tế bào

của Az agilis có kích thước lớn nhất (5-6μm) Dần các tế bào hình que

chuyển thành hình cầu hay hình bầu dục lớn với đường kính lên tới 4μm, hình dạng không cố định Khi có tiêm mao rụng đi và tế bào trở lên bất động, bọc bao nhầy, tế bào chất xuất hiện cấu tạo dạng hạt, các tế bào tròn có thể phủ

lớp vỏ dày và chuyển thành kén Hình dạng tế bào Azotobacter và chu kì biến

đổi của chúng phụ thuộc vào tuổi của giống và điều kiện phát triển.[25]

Hình1.1 Azotobacter

Tất cả các loài Azotobacter đều sống dị dưỡng Để dùng nguồn cacbon,

chúng sử dụng nhiều nguồn hữu cơ khác nhau – monosaccarit, disaccarit, một

số polysaccarit nhiều rượu, các axit hữu cơ trong đó bao gồm cả các hợp chất

thơm Nguồn nitơ đối với Azotobacter không chỉ là nitơ phân tử mà còn là

muối ammon, nitrat, nitrit, aminoaxit Tùy thuộc vào các hợp chất chứa nitơ

có trong môi trường mà quá trình cố định nitơ trong môi trường sẽ bị ức chế

nhiều hay ít Azotobacter có nhu cầu lớn đối với photpho và canxi Để cố định nitơ phân tử một cách mạnh mẽ chúng cần có molybden và bor Azotobacter

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/

5

Phần lớn Azotobacter chỉ phát triển ở pH lớn hơn 6 vì vậy không gặp chúng ở đất chua Đặc trưng ở đất chua là loài Az indicum Chúng có thể phát

triển trong môi trường có pH bằng 3

Azotobacter cần có độ ẩm cao hơn so với nhiều vi khuẩn khác, vì vậy ít gặp chúng ở vùng khô hạn

Phần lớn các chủng Azotobacter phân lập được từ thiên nhiên có khả

số chủng Azotobacter trong những điều kiện thích hợp có khả năng đồng hoá

Nhiều nghiên cứu cho biết khi phát triển chung với một số vi khuẩn khác Azotobacter sẽ có hoạt động cố định nitơ cao hơn so với nuôi cấy riêng

rẽ Azotobacter sẽ đem một phần nitơ đồng hoá được đưa vào môi trường

Sự phát triển và cố định nitơ của Azotobacter trong đất còn chịu ảnh

hưởng mật thiết của khu hệ các vi sinh vật đất Bên cạnh các nhóm vi sinh vật

có ảnh hưởng tốt đối với sự phát triển của Azotobacter (tổng hợp các chất

hoạt động sinh học, phân giải các thức ăn hữu cơ bền vững) còn có nhiều

nhóm vi sinh vật có khả năng làm ức chế sự phát triển của Azotobacter (cạnh

tranh thức ăn, sản sinh chất kháng sinh,…)

Đã có nhiều công trình nghiên cứu đề cập đến mối quan hệ giữa

Azotobacter và cây trồng Azotobacter thường xuyên có mặt trong vùng rễ cây

trồng với số lượng cao hơn nhiều so với ngoài vùng rễ Số lượng của chúng còn biến đổi phụ thuộc vào từng loại cây, từng giai đoạn phát triển của cây và nhiều yếu tố sinh thái, địa lý khác Người ta đã chứng minh được rằng

Azotobacter không phát triển trên bề mặt rễ mà phát triển trong đất xung

quanh rễ

Azotobacter có tác dụng làm tăng nguồn thức ăn nitơ cho cây trồng

Trung bình khi tiêu thụ hết 1g các chất sinh năng lượng, Azotobacter có khả

năng đồng hoá được khoảng 10-15 mg nitơ phân tử

Phân bón vi sinh vật Azotobacter có thể được coi là phân bón vi sinh

vật được ứng dụng sớm nhất Sau đó trong quá trình nghiên cứu, các nhà khoa

học đã khám phá ra Azotobacter không chỉ có khả năng cố định nitơ mà còn

có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật, một

số vitamin và hoạt chất ức chế sự sinh trưởng của một số vi nấm gây bệnh vùng rễ ở một số cây trồng

Sản phẩm phân bón vi sinh vật cố định nitơ tự do từ chủng vi khuẩn

Azotobacter đã được sản xuất tại Mỹ, Úc Nga và được sử dụng ở nhiều nơi

trên thế giới và đã mang lại hiệu quả kinh tế xã hội tương đối cao Ở Việt Nam, sản phẩm phân bón vi sinh vật chứa vi khuẩn cố định nitơ tự do

(Azotobacter) đã được khảo nghiệm hiệu lực đối với cây trồng trên đồng

ruộng và được đưa vào danh mục các loại phân bón được phép sử dụng tại Việt Nam [26]

1.1.2 Vi khuẩn cố định nitơ kỵ khí Clostridium

Nhiều loại thuộc giống Clostridium có khả năng cố định nitơ không khí: Cl Pastuerianum, Cl Butỷium, Cl Acetobutylicum, Cl Felsineum

Chúng thuộc một nhóm phân loại, nhưng khác nhau về đặc điểm hình thái học

và sinh lý sinh hóa học Cl Pasteurianum có khả năng đồng hóa nitơ phân tử

mạnh mẽ nhất Tế bào là loại trực khuẩn khá lớn, dài 1,5 - 8μm và rộng 0,8 – 1,3μm [7, 8] Đây là nhóm dị dưỡng hóa năng hữu cơ, các nguồn hữu cơ chúng sử dụng: monosaccarit, disaccarit, một số polysaccarit nhiều rượu, các axit hữu cơ trong đó bao gồm cả các hợp chất thơm

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/

7

1.1.3 Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh Rhizobium

Trong các hệ thống cố định nitơ sinh học, cố định nitơ cộng sinh giữa

vi khuẩn nốt sần (Rhizobium) và cây họ đậu là quan trọng nhất, ước tính đạt

trên 80 triệu tấn mỗi năm, tương đương với lượng phân đạm vô cơ trên toàn thế giới sản xuất năm 1990 Trong hệ thống cố định nitơ sinh học này, mỗi nốt sần là một nhà máy phân đạm mini, trong đó cây chủ vừa là chỗ trú ngụ đồng thời cũng là nguồn cung cấp năng lượng cho quá trình cố định nitơ của

vi khuẩn và nhận lại lượng đạm từ quá trình cố định nitơ để cung cấp cho các quá trình tổng hợp đạm trong thân, lá, hoa quả.[3]

Vi khuẩn Rhizobium tồn tại trong đất, có thể xâm nhập vào các lông hút

của rễ cây bộ đậu và kích tác tạo thành nốt sần nên còn được gọi là vi khuẩn nốt sần Giữa cây bộ đậu và vi khuẩn nốt sần hình thành mối quan hệ cộng sinh nghĩa là quan hệ mà cả hai bên đều cần có nhau và dựa vào nhau để phát triển, trong đó vi khuẩn nốt sần tổng hợp đạm từ nitơ trong không khí cung cấp cho cây và ngược lại cây trồng cung cấp các dưỡng chất cần thiết để vi khuẩn nốt sần tồn tại và sinh trưởng.[5]

Hình dáng, kích thước, màu sắc và vị trí của nốt sần trên cây rất khác nhau, phản ánh tình trạng liên kết giữa vi khuẩn nốt sần và hiệu quả cố định nitơ Căn cứ vào hiệu quả cố định nitơ, hai loại nốt sần được phân biệt, đó là nốt sần hữu hiệu và nốt sần vô hiệu

Dựa vào số lượng, kích thước và màu sắc thịt nốt sần, có thể đánh giá được hiệu quả của quá trình cố định nitơ của cây lạc và chủng vi khuẩn tương ứng Rễ cây có mật độ nốt sần hữu hiệu cao, chứng tỏ việc sử dụng phân vi khuẩn nốt sần đã mang lại hiệu quả tốt Số lượng và khối lượng nốt sần được kiểm tra tốt nhất vào thời kì cây ra hoa rộ Để đánh giá tác dụng của biện pháp nhiễm vi khuẩn nốt sần và khả năng nhiễm của vi khuẩn được bón, cần kiểm tra nốt sần ở thời kỳ cây 4-5 tuần tuổi

Vi khuẩn Rhizobium là loại trực khuẩn gram âm không sinh nha bào,

hiếu khí Kích thước tế bào dao động 0,5-1,2.2,0-3,5, khuẩn lạc thuộc nhóm

S, nhày lồi, màu trắng trong hoặc trắng đục, kích thước khuẩn lạc dao động

2,3-4,5mm sau một tuần nuôi trên môi trường thạch Vi khuẩn Rhizobium có

tiên mao, có khả năng di động được, chúng thích hợp ở pH từ 6,5-7,5, nhiệt

lạc sẽ chuyển sang màu nâu nhạt Vi khuẩn Rhizobium gồm nhiều loài khác nhau: Rh.leguminosarum, Rh.phaseoli, Rh.trifolii, Rh.japonicum, Rh.meliloti,

Rh.cicer, Rh.simplese, Rh.vigna, Rh.robinii, Rh.lotus,…

1.2 Quá trình cố định nitơ sinh học

Nitơ là nguyên tố trơ khó liên kết hóa học với các nguyên tố khác, nếu không có chất xúc tác và các điều kiện đặc biệt khác, nó không ngừng bị chuyển hóa trong một chu trình khép kín do tác động sinh học hay hóa học khác nhau Dưới tác động của hoạt động hóa học hoặc sinh học, nitơ phân tử chuyển thành đạm vô cơ, sau chuyển thành đạm thực vật hoặc động vật thông qua quá trình chuyển hóa Một phần đạm thực vật dưới dạng tàn dư và một phần được cây trồng sử dụng, một phần còn lại bị mất do rửa trôi và bay hơi

do hoạt động của vi sinh vật đất có khả năng phân giải đạm Quá trình mất đạm chịu ảnh hưởng lớn bởi các chế độ canh tác

Nitơ đồng thời cũng là yếu tố dinh dưỡng vô cùng quan trọng không chỉ với các sinh vật bậc cao mà cả với các sinh vật nhỏ bé mà mắt thường không nhìn thấy được Trong tự nhiên nitơ phân tử tồn tại dưới dạng khí chiếm 78% thể tích không khí[17], song chất nitơ này lại không thể sử dụng được làm nguồn dinh dưỡng cho sinh vật Để cây trồng có thể sử dụng nguồn tài nguyên này làm chất dinh dưỡng, nitơ không khí phải được chuyển hóa thông qua quá trình cố định nitơ (cố định đạm), trong đó nitơ phân tử được chuyển hóa thành amôni